CN114634536B - 异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的分离工艺及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的分离工艺及其应用。具体制备工艺为：提取、硅胶柱前处理、在线自由基清除剂组分筛选、微孔树脂柱富集、在线自由基清除剂组分再筛选、亲水制备柱制备及反相制备液相色谱纯化七个步骤。制得的异叶青兰中酚类天然自由基清除剂可作为有效成分按药学上或者食品科学上可接受的任何载体制成各类药用制剂或者保健类食品。本发明制备工艺中的提取溶剂、微孔树脂柱、反相色谱柱、亲水色谱柱分离所使用的溶剂及分离材料均可回收利用；原料成本低，乙醇室温冷浸提取、及微孔树脂柱富集、硅胶和微孔树脂分离材料可以装于中压柱层析系统中，可实现规模化操作；且高压色谱分离纯化可以保证产品的纯度大于95％。

Description

异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的分离工艺及其应用
技术领域
本发明涉及异叶青兰中天然自由基清除剂分离技术领域，具体涉及异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的分离工艺及其应用。
背景技术
异叶青兰(Dracocephalum heterophyllum Benth)系唇形科(Labiatae)青兰属(Dracocephalum)植物，藏药名：“吉孜青保”，又名白花夏枯草，分布于辽宁、内蒙古、河北、山西、甘肃、西藏及青海等地，资源非常丰富。《晶珠本草》中记载异叶青兰治口腔病、牙齿病，清肝热。现代研究证明异叶青兰中的化学成分主要包括苯丙素类、黄酮类、萜类和酚类。文献报道，酚类化合物具有良好的清除自由基活性。但目前仅有本课题发表的8个抗氧化的酚类化合物从异叶青兰中被分离并鉴定(Jun Dang,Li Zhang,Yun Shao,etal.Preparative isolation of antioxidative compounds from Dracocephalumheterophyllum using off-line two-dimensional reversed-phase liquidchromatography/hydrophilic interaction chromatography guided by on-line HPLC-DPPH assay,2018,1095:267-274)。为了进一步加快异叶青兰的质量评价和相关新药的研发步伐，有必要从中挖掘更多的活性成分。
目前，有关异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的分离制备工艺及其应用并未见文献报道，已有的研究也未做到系统化的研究。因此，亟需建立一种工艺简单、规模化从异叶青兰中分离制备酚类天然自由基清除剂的方法。
发明内容
基于上述技术问题，本发明的目的是提供异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的分离工艺及其应用。
本发明保护异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的分离工艺，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：将异叶青兰全草阴干，粗碎后按料液比1g：5～100mL的甲醇提取，在室温下提取2～4次，每次8～12h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按硅胶的量：异叶青兰药材的量＝1:2～5拌样并减压干燥，即得异叶青兰提取物拌样样品；
步骤2，硅胶柱前处理：异叶青兰提取物拌样样品，该样品经装有硅胶的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr2；其中，所述硅胶柱分离的工作参数为色谱柱柱长460mm、直径15-49mm，固定相为硅胶，流动相A为甲醇，B为二氯甲烷，色谱条件为0-30min，0％B，30-60min，0-100％B，60-90min，100％B，进样量为20-130g，流速为10-57mL/min；
步骤3，在线自由基清除剂组分筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr2中加入其质量5～10倍的体积浓度为70～90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr2甲醇样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标成分的组分中自由基清除剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水Reprosil C18柱(250×4.6mm，5μm)色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；
步骤4，微孔树脂柱富集：滤液B按硅胶的量：异叶青兰药材的量＝1:1～1.5拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr2拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第三个和第五个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr23和Fr25；其中，微孔树脂柱分离的工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径15-49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为甲醇，色谱条件为0-120min，0-100％B，120-150min，100％B，进样量为15-90g，流速为10-57mL/min；
步骤5，在线自由基清除剂组分再筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr23和Fr25中加入其质量5～10倍的体积浓度为70～90％的甲醇-水溶液进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr23和Fr25甲醇样品溶液，即滤液B和滤液C，取1mL滤液B和滤液C，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标组分中自由基清除剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用Click XIon柱(250×4.6mm，5μm)亲水色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；
步骤6，亲水制备柱制备：所述滤液B和滤液C经亲水色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr239、Fr255和Fr258，经减压干燥分别得到含有目标化合物1的组分Fr239，含有目标化合物2的组分Fr255和含有目标化合物3和4的组分Fr258；其中，亲水制备柱制备的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，亲水制备柱固定相为5μm两性离子柱Click XION，流动相A为0.1％三氟乙酸-水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，100-60％B洗脱，进样体积为5.0mL，流速为19mL/min；
步骤7，Fr239、Fr255和Fr258反相制备液相色谱纯化：分别含有目标化合物1-4的组分Fr239、Fr255和Fr258分别用体积分数为70～100％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为20.0～50.0mg/mL，均经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液D、E和F，滤液D、E和F经反相液相制备色谱纯化，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液D、E和F制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95％的自由基清除剂decaffeoylverbascoside，标记为1号；rosmarinic acid，标记为2号；acteoside，标记为3号；2'-O-acetylplantamajoside，标记为4号；其中，化学结构式分别为：
Figure GDA0004066729550000051
进一步的，所述步骤1、步骤2、步骤4、步骤6和步骤7中，减压干燥的条件均为：真空度100～300mbar，温度45～65℃。
进一步的，所述步骤3中，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，0-100％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.8mL/min；反应环长度为15m。
进一步的，所述步骤5中，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为0.1％三氟乙酸-水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0-30min，100-60％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.8mL/min；反应环长度为15m。
进一步的，所述步骤7中，反相制备液相色谱纯化的工作参数为：色谱柱柱长250mm、直径20mm，反相制备柱固定相为5μm苯基填料，流动相A为0.1％三氟乙酸/水溶液，流动相B为乙腈溶液，组分Fr239分离的流动相为体积分数5％乙腈-三氟乙酸/水溶液，组分Fr255分离的流动相为体积分数20％乙腈-三氟乙酸/水溶液，Fr258分离的流动相为体积分数17％乙腈-三氟乙酸/水溶液，进样体积均为5.0mL，流速为19mL/min。
本发明还保护上述异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的应用，其中，该异叶青兰中酚类天然自由基清除剂可在制备自由基清除药物或保健食品中应用，具体作为有效成分按药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或作为有效成分按食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
相比于现有的技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明成本低廉、产品纯度高
使用的提取溶剂，硅胶柱、微孔树脂柱、反相色谱柱、亲水色谱柱分离所使用的溶剂均可以回收利用；使用的色谱分离材料(反相制备液相色谱和亲水制备液相色谱分离材料)均可以重复利用，回收利用的溶剂和重复利用的分离材料保证了分离过程中平均成本比较低廉，高压色谱分离可以保证产品的纯度大于95％。
(2)本发明的制备方法可实现规模化生产需要
原料要求不高、成本低廉，一般野生的或市场上销售的异叶青兰即可，易于批量备料；乙醇室温冷浸提取，易于操作，同时对环境友好；分离采用硅胶柱前处理，微孔树脂柱富集，硅胶和微孔树脂分离材料可以装于中压柱层析系统中，易于规模化；分离纯化中使用的反相制备液相色谱，为快速的等度方法，非常适宜大规模生产。
附图说明
图1为本发明异叶青兰乙醇提取物硅胶柱前处理色谱图；
图2为本发明异叶青兰含有目标成分的组分Fr2在线HPLC-DPPH筛选色谱图；
图3为本发明异叶青兰含有目标成分的组分Fr2微孔树脂柱富集色谱图；
图4为本发明异叶青兰含有目标成分的组分Fr23和Fr25在线HPLC-DPPH筛选色谱图；
图5为本发明异叶青兰含有目标成分的组分Fr23和Fr25亲水制备液相色谱图；
图6为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂1反相制备液相色谱图；
图7为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂2反相制备液相色谱图；
图8为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂3-4反相制备液相色谱图；
图9为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂1-4纯度及活性验证色谱图；
图10为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂1的低分辨质谱图；
图11为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂11H NMR核磁；
图12为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂113C NMR核磁图；
图13为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂2的低分辨质谱图；
图14为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂21H NMR核磁图；
图15为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂213C NMR核磁图；
图16为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂3的低分辨质谱图；
图17为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂31H NMR核磁图；
图18为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂313C NMR核磁图；
图19为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂4的低分辨质谱图；
图20为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂41H NMR核磁图；
图21为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂413C NMR核磁图；
图22为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂decaffeoylverbascoside的化学结构式；
图23为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂rosmarinic acid的化学结构式；
图24为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂acteoside的化学结构式；
图25为本发明异叶青兰中酚类天然自由基清除剂2'-O-acetylplantamajoside的化学结构式。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的分离工艺，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：取120.0g异叶青兰全草阴干，粗碎后按料液比1g：5mL的甲醇提取，在室温下提取3次，每次12h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按硅胶的量：异叶青兰药材的量＝1:2拌样并减压干燥，即得异叶青兰提取物拌样样品48.2g；其中，减压干燥的条件均为：真空度100mbar，温度45℃；
步骤2，硅胶柱前处理：异叶青兰提取物拌样样品，该样品经装有硅胶的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二个主要的色谱峰馏分(如附图1所示)，该馏分经减压干燥即得10.8g异叶青兰含有目标成分的组分Fr2；其中，减压干燥的条件均为：真空度100mbar，温度45℃；硅胶柱分离的工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径49mm，固定相为硅胶，流动相A为甲醇，B为二氯甲烷，色谱条件为0-30min，0％B，30-60min，0-100％B，60-90min，100％B，进样量为48.2g，流速为57mL/min；
步骤3，在线自由基清除剂组分筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr2中加入其质量10倍的体积浓度为70％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr2甲醇样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标成分的组分中自由基清除剂(如附图2所示)；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水Reprosil C18柱(250×4.6mm，5μm)色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，0-100％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.8mL/min；反应环长度为15m；
步骤4，微孔树脂柱富集：滤液B按硅胶的量：异叶青兰药材的量＝1:1拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr2拌样样品22.0g，该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第三个和第五个主要的色谱峰馏分(如附图3所示)，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr23(331.0mg)和Fr25(536.0mg)；其中，减压干燥的条件均为：真空度100mbar，温度45℃；微孔树脂柱分离的工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为甲醇，色谱条件为0-120min，0-100％B，120-150min，100％B，进样量为22g，流速为57mL/min；
步骤5，在线自由基清除剂组分再筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr23和Fr25中加入其质量10倍的体积浓度为70％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr23和Fr25甲醇样品溶液，即滤液B和滤液C，取1mL滤液B和滤液C，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标组分中自由基清除剂(如附图4所示)；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用Click XIon柱(250×4.6mm，5μm)亲水色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为0.1％三氟乙酸-水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0-30min，100-60％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.8mL/min；反应环长度为15m；
步骤6，亲水制备柱制备：所述滤液B和滤液C经亲水色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr239、Fr255和Fr258(如附图5所示)，经减压干燥分别得到含有目标化合物1的组分Fr239(50.63mg)，含有目标化合物2的组分Fr255(39.77mg)和含有目标化合物3和4的组分Fr258(159.60mg)；其中，减压干燥的条件均为：真空度100mbar，温度45℃；亲水制备柱制备的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，亲水制备柱固定相为5μm两性离子柱Click XION，流动相A为0.1％三氟乙酸-水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，100-60％B洗脱，进样体积为5.0mL，流速为19mL/min；
步骤7，Fr239、Fr255和Fr258反相制备液相色谱纯化：分别含有目标化合物1-4的组分Fr239、Fr255和Fr258分别用体积分数为80％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为20.0mg/mL，均经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液D、E和F，滤液D、E和F经反相液相制备色谱纯化，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液D、E和F制备色谱图中主要的色谱峰馏分(如附图6-8所示)，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95％的自由基清除剂decaffeoylverbascoside(8.08mg)，标记为1号；rosmarinic acid(9.76mg)，标记为2号；acteoside(16.09mg)，标记为3号；2'-O-acetylplantamajoside(8.75mg)，标记为4号(化学结构式详见附图22-25)；其中，减压干燥的条件均为：真空度100mbar，温度45℃，反相制备液相色谱纯化的工作参数为：色谱柱柱长250mm、直径20mm，反相制备柱固定相为5μm苯基填料，流动相A为0.1％三氟乙酸/水溶液，流动相B为乙腈溶液，组分Fr239分离的流动相为体积分数5％乙腈-三氟乙酸/水溶液，组分Fr255分离的流动相为体积分数20％乙腈-三氟乙酸/水溶液，Fr258分离的流动相为体积分数17％乙腈-三氟乙酸/水溶液，进样体积均为5.0mL，流速为19mL/min。
上述异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的应用，其中，该异叶青兰中酚类天然自由基清除剂可在制备自由基清除药物或保健食品中应用，具体作为有效成分按药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或作为有效成分按食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
实施例2
异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的分离工艺，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：取500.0g异叶青兰全草阴干，粗碎后按料液比1g：50mL的甲醇提取，在室温下提取4次，每次10h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按硅胶的量：异叶青兰药材的量＝1:3拌样并减压干燥，即得异叶青兰提取物拌样样品268g；其中，减压干燥的条件均为：真空度200mbar，温度55℃；
步骤2，硅胶柱前处理：异叶青兰提取物拌样样品，该样品经装有硅胶的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得45g异叶青兰含有目标成分的组分Fr2；其中，减压干燥的条件均为：真空度200mbar，温度55℃；所述硅胶柱分离的工作参数为色谱柱柱长460mm、直径15mm，固定相为硅胶，流动相A为甲醇，B为二氯甲烷，色谱条件为0-30min，0％B，30-60min，0-100％B，60-90min，100％B，进样量为20g，流速为10mL/min；
步骤3，在线自由基清除剂组分筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr2中加入其质量8倍的体积浓度为80％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为80.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr2甲醇样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标成分的组分中自由基清除剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水Reprosil C18柱(250×4.6mm，5μm)色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，0-100％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.8mL/min；反应环长度为15m；
步骤4，微孔树脂柱富集：滤液B按硅胶的量：异叶青兰药材的量＝1:1.2拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr2拌样样品99.0g，该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第三个和第五个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr23(1.4g)和Fr25(2.2g)；其中，减压干燥的条件均为：真空度200mbar，温度55℃；微孔树脂柱分离的工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径15mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为甲醇，色谱条件为0-120min，0-100％B，120-150min，100％B，进样量为15g，流速为10mL/min；
步骤5，在线自由基清除剂组分再筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr23和Fr25中加入其质量8倍的体积浓度为80％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为80.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr23和Fr25甲醇样品溶液，即滤液B和滤液C，取1mL滤液B和滤液C，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标组分中自由基清除剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用Click XIon柱(250×4.6mm，5μm)亲水色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为0.1％三氟乙酸-水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0-30min，100-60％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.8mL/min；反应环长度为15m；
步骤6，亲水制备柱制备：所述滤液B和滤液C经亲水色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr239、Fr255和Fr258，经减压干燥分别得到含有目标化合物1的组分Fr239(214.1mg)，含有目标化合物2的组分Fr255(163.2mg)和含有目标化合物3和4的组分Fr258(655.1mg)；其中，减压干燥的条件均为：真空度200mbar，温度55℃；亲水制备柱制备的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，亲水制备柱固定相为5μm两性离子柱Click XION，流动相A为0.1％三氟乙酸-水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，100-60％B洗脱，进样体积为5.0mL，流速为19mL/min；
步骤7，Fr239、Fr255和Fr258反相制备液相色谱纯化：分别含有目标化合物1-4的组分Fr239、Fr255和Fr258分别用体积分数为90％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为30.0mg/mL，均经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液D、E和F，滤液D、E和F经反相液相制备色谱纯化，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液D、E和F制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95％的自由基清除剂decaffeoylverbascoside(34.17mg)，标记为1号；rosmarinic acid(40.05mg)，标记为2号；acteoside(66.04mg)，标记为3号；2'-O-acetylplantamajoside(35.92mg)，标记为4号；其中，减压干燥的条件均为：真空度200mbar，温度55℃，反相制备液相色谱纯化的工作参数为：色谱柱柱长250mm、直径20mm，反相制备柱固定相为5μm苯基填料，流动相A为0.1％三氟乙酸/水溶液，流动相B为乙腈溶液，组分Fr239分离的流动相为体积分数5％乙腈-三氟乙酸/水溶液，组分Fr255分离的流动相为体积分数20％乙腈-三氟乙酸/水溶液，Fr258分离的流动相为体积分数17％乙腈-三氟乙酸/水溶液，进样体积均为5.0mL，流速为19mL/min。
上述异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的应用，其中，该异叶青兰中酚类天然自由基清除剂可在制备自由基清除药物或保健食品中应用，具体作为有效成分按药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或作为有效成分按食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
实施例3
异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的分离工艺，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：取1.2kg异叶青兰全草阴干，粗碎后按料液比1g：100mL的甲醇提取，在室温下提取2次，每次8h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按硅胶的量：异叶青兰药材的量＝1:5拌样并减压干燥，即得异叶青兰提取物拌样样品965g；其中，减压干燥的条件均为：真空度300mbar，温度65℃；
步骤2，硅胶柱前处理：异叶青兰提取物拌样样品，该样品经装有硅胶的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得108g异叶青兰含有目标成分的组分Fr2；其中，减压干燥的条件均为：真空度300mbar，温度65℃；所述硅胶柱分离的工作参数为色谱柱柱长460mm、直径36mm，固定相为硅胶，流动相A为甲醇，B为二氯甲烷，色谱条件为0-30min，0％B，30-60min，0-100％B，60-90min，100％B，进样量为130g，流速为30mL/min；
步骤3，在线自由基清除剂组分筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr2中加入其质量5倍的体积浓度为90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr2甲醇样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标成分的组分中自由基清除剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水Reprosil C18柱(250×4.6mm，5μm)色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，0-100％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.8mL/min；反应环长度为15m；
步骤4，微孔树脂柱富集：滤液B按硅胶的量：异叶青兰药材的量＝1:1.5拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr2拌样样品270.0g，该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第三个和第五个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr23(3.3g)和Fr25(5.4g)；其中，减压干燥的条件均为：真空度300mbar，温度65℃；微孔树脂柱分离的工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径15-49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为甲醇，色谱条件为0-120min，0-100％B，120-150min，100％B，进样量为90g，流速为30mL/min；
步骤5，在线自由基清除剂组分再筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr23和Fr25中加入其质量5倍的体积浓度为90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr23和Fr25甲醇样品溶液，即滤液B和滤液C，取1mL滤液B和滤液C，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标组分中自由基清除剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用Click XIon柱(250×4.6mm，5μm)亲水色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为0.1％三氟乙酸-水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0-30min，100-60％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.8mL/min；反应环长度为15m；
步骤6，亲水制备柱制备：所述滤液B和滤液C经亲水色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr239、Fr255和Fr258，经减压干燥分别得到含有目标化合物1的组分Fr239(506.3mg)，含有目标化合物2的组分Fr255(397.7mg)和含有目标化合物3和4的组分Fr258(1.60g)；其中，减压干燥的条件均为：真空度300mbar，温度65℃；亲水制备柱制备的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，亲水制备柱固定相为5μm两性离子柱Click XION，流动相A为0.1％三氟乙酸-水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，100-60％B洗脱，进样体积为5.0mL，流速为19mL/min；
步骤7，Fr239、Fr255和Fr258反相制备液相色谱纯化：分别含有目标化合物1-4的组分Fr239、Fr255和Fr258分别用体积分数为95％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为50.0mg/mL，均经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液D、E和F，滤液D、E和F经反相液相制备色谱纯化，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液D、E和F制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95％的自由基清除剂decaffeoylverbascoside(80.8mg)，标记为1号；rosmarinic acid(97.6mg)，标记为2号；acteoside(16.1mg)，标记为3号；2'-O-acetylplantamajoside(87.5mg)，标记为4号；其中，减压干燥的条件均为：真空度300mbar，温度65℃，反相制备液相色谱纯化的工作参数为：色谱柱柱长250mm、直径20mm，反相制备柱固定相为5μm苯基填料，流动相A为0.1％三氟乙酸/水溶液，流动相B为乙腈溶液，组分Fr239分离的流动相为体积分数5％乙腈-三氟乙酸/水溶液，组分Fr255分离的流动相为体积分数20％乙腈-三氟乙酸/水溶液，Fr258分离的流动相为体积分数17％乙腈-三氟乙酸/水溶液，进样体积均为5.0mL，流速为19mL/min。
上述异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的应用，其中，该异叶青兰中酚类天然自由基清除剂可在制备自由基清除药物或保健食品中应用，具体作为有效成分按药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或作为有效成分按食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
实施例4
异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的活性验证：
分别在分离得到的异叶青兰中酚类天然自由基清除剂1～4中加入其质量4倍的色谱甲醇进行溶解，配制样品浓度为0.2mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰中酚类天然自由基清除剂样品溶液，取1mL样品，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统验证异叶青兰中酚类天然自由基清除剂1～4的活性(如附图9所示)。
其中，在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用两性离子柱Reprosil C18(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为0.1％三氟乙酸-水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，0-100％B，流动相流速为1.0mL/min，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.8mL/min；反应环长度为15m，检测波长为517nm，活性验证色谱图(如附图9所示)。
从异叶青兰中得到的酚类天然自由基清除剂decaffeoylverbascoside(化合物1)，rosmarinic acid(化合物2)，acteoside(化合物3)，2'-O-acetylplantamajoside(化合物4)结构表征及结构图见附图10-25。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的分离工艺，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：将异叶青兰全草阴干，粗碎后按料液比1g：5～100mL的甲醇提取，在室温下提取2～4次，每次8～12h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按硅胶的量：异叶青兰药材的量＝1:2～5拌样并减压干燥，即得异叶青兰提取物拌样样品；
步骤2，硅胶柱前处理：异叶青兰提取物拌样样品，该样品经装有硅胶的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr2；其中，所述硅胶柱分离的工作参数为色谱柱柱长460mm、直径15-49mm，固定相为硅胶，流动相A为甲醇，B为二氯甲烷，色谱条件为0-30min，0％B，30-60min，0-100％B，60-90min，100％B，进样量为20-130g，流速为10-57mL/min；
步骤3，在线自由基清除剂组分筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr2中加入其质量5～10倍的体积浓度为70～90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr2甲醇样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标成分的组分中自由基清除剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水Reprosil C18柱(250×4.6mm，5μm)色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；
步骤4，微孔树脂柱富集：滤液B按硅胶的量：异叶青兰药材的量＝1:1～1.5拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr2拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第三个和第五个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr23和Fr25；其中，微孔树脂柱分离的工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径15-49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为甲醇，色谱条件为0-120min，0-100％B，120-150min，100％B，进样量为15-90g，流速为10-57mL/min；
步骤5，在线自由基清除剂组分再筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr23和Fr25中加入其质量5～10倍的体积浓度为70～90％的甲醇-水溶液进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr23和Fr25甲醇样品溶液，即滤液B和滤液C，取1mL滤液B和滤液C，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标组分中自由基清除剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用Click XIon柱(250×4.6mm，5μm)亲水色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；
步骤6，亲水制备柱制备：所述滤液B和滤液C经亲水色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr239、Fr255和Fr258，经减压干燥分别得到含有目标化合物1的组分Fr239，含有目标化合物2的组分Fr255和含有目标化合物3和4的组分Fr258；其中，亲水制备柱制备的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，亲水制备柱固定相为5μm两性离子柱Click XION，流动相A为0.1％三氟乙酸-水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，100-60％B洗脱，进样体积为5.0mL，流速为19mL/min；
步骤7，Fr239、Fr255和Fr258反相制备液相色谱纯化：分别含有目标化合物1-4的组分Fr239、Fr255和Fr258分别用体积分数为70～100％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为20.0～50.0mg/mL，均经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液D、E和F，滤液D、E和F经反相液相制备色谱纯化，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液D、E和F制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95％的自由基清除剂decaffeoylverbascoside，标记为1号；rosmarinic acid，标记为2号；acteoside，标记为3号；2'-O-acetylplantamajoside，标记为4号；其中，化学结构式分别为；
Figure FDA0004066729540000031
Figure FDA0004066729540000041
2.根据权利要求1所述的异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的分离工艺，其特征在于，所述步骤1、步骤2、步骤4、步骤6和步骤7中，减压干燥的条件均为：真空度100～300mbar，温度45～65℃。
3.根据权利要求1所述的异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的分离工艺，其特征在于，所述步骤3中，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，0-100％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.8mL/min；反应环长度为15m。
4.根据权利要求1所述的异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的分离工艺，其特征在于，所述步骤5中，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为0.1％三氟乙酸-水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0-30min，100-60％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.8mL/min；反应环长度为15m。
5.根据权利要求1所述的异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的分离工艺，其特征在于，所述步骤7中，反相制备液相色谱纯化的工作参数为：色谱柱柱长250mm、直径20mm，反相制备柱固定相为5μm苯基填料，流动相A为0.1％三氟乙酸/水溶液，流动相B为乙腈溶液，组分Fr239分离的流动相为体积分数5％乙腈-三氟乙酸/水溶液，组分Fr255分离的流动相为体积分数20％乙腈-三氟乙酸/水溶液，Fr258分离的流动相为体积分数17％乙腈-三氟乙酸/水溶液，进样体积均为5.0mL，流速为19mL/min。
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