CN111187159B - 唐古特虎耳草中天然自由基清除剂的分离工艺及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及唐古特虎耳草中天然自由基清除剂分离技术领域，具体涉及唐古特虎耳草中天然自由基清除剂的分离工艺及其应用。其制备方法：提取、微孔树脂柱粗分、在线自由基清除剂组分筛选、反相制备柱制备、Fr1‑1的反相制备液相色谱纯化及Fr1‑3的亲水/反相二维液相色谱纯化六个步骤。本发明成本低廉、产品纯度大于95%；本发明采用的技术手段可进行规模化生产：原料要求不高、成本低廉，易于批量备料；甲醇室温冷浸提取，易于操作；分离采用微孔树脂柱粗分，该微孔树脂分离材料可以装于中压柱层析系统中，易于规模化；分离纯化中使用的反相制备液相色谱或亲水制备液相色谱，为快速的等度方法。
Description
技术领域
本发明涉及唐古特虎耳草中天然自由基清除剂分离技术领域，具体涉及唐古特虎耳草中天然自由基清除剂的分离工艺及其应用。
背景技术
唐古特虎耳草（Saxifraga tangutica Engl.），别名甘青虎耳草，是虎耳草科（Saxifragaceae）虎耳草属（Saxifraga）的一年生常绿草本植物，藏药名：“松吉蒂”，中药中称之为“迭达”，主要分布在青海、甘肃、西藏、四川以及及不丹与克什米尔地区海拔2900~4900米的针叶林灌丛下。唐古特虎耳草为常用藏药，可全草入药，《中药辞海》记载：其性味微苦、辛、寒。主要功效：清肝利胆，补脾健胃。主治：肝炎，胆囊炎，流行性感冒。现代药理学研究证明酚类是主要活性成分。文献报道，酚类化合物具有良好的清除自由基活性。但目前仅有本课题发表的8个抗氧化的酚类化合物从唐古特虎耳草中被分离并鉴定（Jun Dang,Yanduo Tao, Yun Shao, et al. Antioxidative extracts and phenols isolated fromQinghai-Tibet Plateau medicinal plant Saxifraga tangutica Engl. IndustrialCrops and Products, 2015, 78: 13-18）。为了进一步加快唐古特虎耳草的质量评价、生产销售及相关新药的研发步伐，有必要从中挖掘更多的活性成分。
目前，有关唐古特虎耳草中天然自由基清除剂的分离制备工艺及其应用并未见文献报道，已有的研究也未做到系统化的研究。因此，亟需建立一种工艺简单、规模化从唐古特虎耳草中分离制备天然自由基清除剂的方法。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于提供唐古特虎耳草中天然自由基清除剂的分离工艺及其应用。
唐古特虎耳草中天然自由基清除剂的分离工艺，该方法具体包括如下步骤：
步骤1，提取：将唐古特虎耳草全草阴干，粗碎后按料液比1g：5~100mL的甲醇提取，在室温下提取2~4次，每次2~4 h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按聚酰胺的量：唐古特虎耳草药材的量=1:5拌样并减压干燥，即得唐古特虎耳草提取物拌样样品；
步骤2，微孔树脂柱粗分：唐古特虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱塔分离，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分；
步骤3，在线自由基清除剂组分筛选：在所述唐古特虎耳草含有目标成分的组分中加入其质量5~10倍的体积浓度为70~90%的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0~100.0 mg/mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到唐古特虎耳草甲醇样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选唐古特虎耳草含有目标成分的组分中自由基清除剂；
步骤4，反相制备柱制备：所述滤液B经反相色谱柱分离，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr1-1、Fr1-2、Fr1-3和Fr1-4，色谱峰馏分Fr1-1和Fr1-3经减压干燥分别得到含有目标化合物1、2、4和5的组分Fr1-1和Fr1-3，色谱峰馏分Fr1-2和Fr1-4经减压干燥得到纯度大于95%的自由基清除剂Protocatechuicacid，标记为3号和自由基清除剂3-O-galloyl-shikimic acid，标记为6号；
步骤5，Fr1-1的反相制备液相色谱纯化：含有目标化合物1和2的组分用体积分数为0~10%的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为20.0~50.0 mg/mL，均经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液C，滤液C经反相液相制备色谱纯化，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集滤液C制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95%的自由基清除剂Gallic acid，标记为1号和自由基清除剂Gallate-3-O-β-D-glucopyranoside，标记为2号；
步骤6，Fr1-3的亲水/反相二维液相色谱纯化：含有目标化合物4和5的组分Fr1-3用体积分数为50~100%的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为20.0~50.0 mg/mL，均经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液D，滤液D经亲水/反相二维液相色谱纯化，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集滤液D反相制备色谱图中前两个主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95%的自由基清除剂4-O-galloyl-(-)-shikimic acid，标记为4号和自由基清除剂5-O-galloyl-(-)-shikimic aicd，标记为5号。
进一步的，所述步骤3中，在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水C18柱（250×4.6mm，5μm）亲水色谱柱，检测波长为254nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm。
进一步的，所述步骤1、步骤2、步骤4、步骤5和步骤6中，减压干燥的条件均为：真空度50~250 mbar，温度40~60℃。
进一步的，所述步骤2中，微孔树脂柱分离的工作参数为色谱柱柱长460 mm、直径49 mm，微孔树脂柱固定相为HP20SS或CHP20P，流动相A为水，B为乙醇，色谱条件为0~120min，0~100%B，120~150min，100%B，进样量为40g，流速为30 mL/min。
进一步的，所述步骤3中，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为0.2%甲酸-水溶液，流动相B为甲醇溶液，按照0~60min，5~15%B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为50μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15 m。
进一步的，所述步骤4中，反相制备柱制备的工作参数为制备柱柱长250 mm、直径20 mm，反相色谱柱固定相为5 μm耐纯水C18，流动相A为0.2%甲酸-水溶液，流动相B为甲醇溶液，按照0~60min，5~15%B洗脱，进样体积为4 mL，流速为19 mL/min。
进一步的，所述步骤5中，反相制备液相色谱纯化的工作参数是指色谱柱柱长250mm、直径20 mm，反相制备柱固定相为5 μm耐纯水C18，流动相为体积分数100%水溶液，进样体积为5 mL，流速为19 mL/min。
进一步的，所述步骤6中，所述亲水/反相二维液相色谱纯化的工作参数是指色谱柱尺寸均为250×20 mm，亲水制备柱固定相为5 μm两性离子柱Click XION，流动相为92%乙腈-水溶液，进样体积为4 mL，流速为19 mL/min；反相制备柱固定相为5 μm耐纯水C18，流动相为8%甲醇-水溶液，进样体积为4 mL，流速为19 mL/min。
本发明还提供上述所制得的唐古特虎耳草中天然自由基清除剂在制备自由基清除药物或保健食品中的应用，其中，上述制备的自由基抑制剂作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或作为有效成分按常规方法与食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
（1）本发明成本低廉、产品纯度高
使用的提取溶剂，微孔树脂柱、反相色谱柱、亲水色谱柱分离所使用的溶剂均可以回收利用；使用的色谱分离材料（反相制备液相色谱和亲水制备液相色谱分离材料）均可以重复利用，回收利用的溶剂和重复利用的分离材料保证了分离过程中平均成本比较低廉，高压色谱分离可以保证产品的纯度大于95%。
（2）本发明采用的技术手段可进行规模化生产
原料要求不高、成本低廉，一般野生的或市场上销售的唐古特虎耳草即可，易于批量备料；甲醇室温冷浸提取，易于操作；分离采用微孔树脂柱粗分，该微孔树脂分离材料可以装于中压柱层析系统中，易于规模化；分离纯化中使用的反相制备液相色谱或亲水制备液相色谱，为快速的等度方法，非常适宜大规模生产。
附图说明
图1为本发明唐古特虎耳草甲醇提取物微孔树脂分离色谱图；
图2为本发明唐古特虎耳草含有目标成分的组分在线HPLC-DPPH筛选色谱图；
图3为本发明唐古特虎耳草含有目标成分的组分反相制备液相色谱图；
图4为本发明唐古特虎耳草组分Fr1-1反相制备液相色谱图；
图5为本发明唐古特虎耳草组分Fr1-3亲水制备液相色谱图；
图6为本发明唐古特虎耳草组分Fr1-3亲水制备组分二维反相制备液相色谱图；
图7为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂1~6的纯度及活性验证色谱图；
图8为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂1的低分辨质谱图；
图9为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂1 1H NMR核磁图；
图10为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂1 13C NMR核磁图；
图11为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂2的低分辨质谱图；
图12为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂2 1H NMR核磁图；
图13为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂2 13C NMR核磁图；
图14为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂3的低分辨质谱图；
图15为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂3 1H NMR核磁图；
图16为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂3 13C NMR核磁图；
图17为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂4的低分辨质谱图；
图18为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂4 1H NMR核磁图；
图19为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂4 13C NMR核磁图；
图20为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂5的低分辨质谱图；
图21为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂5 1H NMR核磁图；
图22为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂5 13C NMR核磁图；
图23为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂6的低分辨质谱图；
图24为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂6 1H NMR核磁图；
图25为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂6 13C NMR核磁图；
图26为本发明唐古特虎耳草天然自由基清除剂1~6平面结构图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
唐古特虎耳草中天然自由基清除剂的分离工艺，该方法具体包括如下步骤：
步骤1，提取：取500g唐古特虎耳草全草阴干，粗碎后按料液比1g：5mL的甲醇提取，在室温下提取4次，每次2 h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按聚酰胺的量：唐古特虎耳草药材的量=1:5拌样并减压干燥，其中减压干燥的条件为真空度50 mbar，温度40℃，即得唐古特虎耳草提取物拌样样品160.2g；
步骤2，微孔树脂柱粗分：唐古特虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱塔分离，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分（如附图1所示），该馏分经减压干燥即得目标组分1.7g，其中减压干燥的条件为真空度50 mbar，温度40℃；其中，微孔树脂柱分离的工作参数为色谱柱柱长460 mm、直径49 mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为乙醇，色谱条件为0~120min，0~100%B，120~150min，100%B，进样量为40g，流速为30 mL/min。
步骤3，在线自由基清除剂组分筛选：在所述唐古特虎耳草含有目标成分的组分中加入其质量5倍的体积浓度为90%的甲醇进行溶解，配制样品浓度为100.0 mg/mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到唐古特虎耳草甲醇样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选唐古特虎耳草含有目标成分的组分中自由基清除剂（如附图2所示）；其中，在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水Reprosil C18柱（250×4.6mm，5μm）亲水色谱柱，检测波长为254nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为0.2%甲酸-水溶液，流动相B为甲醇溶液，按照0~60min，5~15%B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为50μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15 m；
步骤4，反相制备柱制备：所述滤液B经反相色谱柱分离，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr1-1、Fr1-2、Fr1-3和Fr1-4（如附图3所示），色谱峰馏分Fr1-1和Fr1-3经减压干燥分别得到含有目标化合物1、2、4和5的组分Fr1-1和Fr1-3，色谱峰馏分Fr1-2和Fr1-4经减压干燥得到纯度大于95%的自由基清除剂Protocatechuic acid 23.8 mg，标记为3号和自由基清除剂3-O-galloyl-shikimic acid148.2 mg，标记为6号，其中减压干燥的条件为真空度50 mbar，温度40℃；反相制备柱制备的工作参数为制备柱柱长250 mm、直径20 mm，反相色谱柱固定相为5 μm耐纯水ReprosilC18，流动相A为0.2%甲酸-水溶液，流动相B为甲醇溶液，按照0~60min，5~15%B洗脱，进样体积为4 mL，流速为19 mL/min；
步骤5，Fr1-1的反相制备液相色谱纯化：含有目标化合物1和2的组分用体积分数为0%的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为20.0mg/mL，均经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液C，滤液C经反相液相制备色谱纯化，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集滤液C制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95%的Gallic acid 33.7 mg，标记为1号和自由基清除剂Gallate-3-O-β-D-glucopyranoside22.6 mg，标记为2号（如附图4所示），其中减压干燥的条件为真空度50 mbar，温度40℃；反相制备液相色谱纯化的工作参数是指色谱柱柱长250 mm、直径20 mm，反相制备柱固定相为5 μm耐纯水Reprosil C18，流动相为体积分数100%水溶液，进样体积为5 mL，流速为19 mL/min；
步骤6，Fr1-3的亲水/反相二维液相色谱纯化：含有目标化合物4和5的组分Fr1-3用体积分数为50%的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为20.0mg/mL，均经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液D，滤液D经亲水/反相二维液相色谱纯化（如附图5和6所示），经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集滤液D反相制备色谱图中前两个主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95%的自由基清除剂4-O-galloyl-(-)-shikimicacid 2.7 mg，标记为4号和自由基清除剂5-O-galloyl-(-)-shikimic aicd 5.7 mg，标记为5号；其中减压干燥的条件为真空度50 mbar，温度40℃；所述亲水/反相二维液相色谱纯化的工作参数是指色谱柱尺寸均为250×20 mm，亲水制备柱固定相为5 μm两性离子柱Click XION，流动相为92%乙腈-水溶液，进样体积为4 mL，流速为19 mL/min；反相制备柱固定相为5 μm耐纯水Reprosil C18，流动相为8%甲醇-水溶液，进样体积为4 mL，流速为19mL/min。
上述所制得的唐古特虎耳草中天然自由基清除剂在制备自由基清除药物或保健食品中的应用，其中，上述制备的自由基抑制剂作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或作为有效成分按常规方法与食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
实施例2
唐古特虎耳草中天然自由基清除剂的分离工艺，该方法具体包括如下步骤：
步骤1，提取：取1000g唐古特虎耳草全草阴干，粗碎后按料液比1g：100mL的甲醇提取，在室温下提取2次，每次4 h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按聚酰胺的量：唐古特虎耳草药材的量=1:5拌样并减压干燥，其中减压干燥的条件为真空度250 mbar，温度60℃，即得唐古特虎耳草提取物拌样样品719.3g；
步骤2，微孔树脂柱粗分：唐古特虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱塔分离，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分3.3g，其中减压干燥的条件为真空度250mbar，温度60℃；其中，微孔树脂柱分离的工作参数为色谱柱柱长460 mm、直径49 mm，微孔树脂柱固定相为HP20SS，流动相A为水，B为乙醇，色谱条件为0~120min，0~100%B，120~150min，100%B，进样量为40g，流速为30 mL/min。
步骤3，在线自由基清除剂组分筛选：在所述唐古特虎耳草含有目标成分的组分中加入其质量10倍的体积浓度为70%的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0mg/mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到唐古特虎耳草甲醇样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选唐古特虎耳草含有目标成分的组分中自由基清除剂；其中，在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水Megres C18柱（250×4.6mm，5μm）亲水色谱柱，检测波长为254nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为0.2%甲酸-水溶液，流动相B为甲醇溶液，按照0~60min，5~15%B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为50μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15 m；
步骤4，反相制备柱制备：所述滤液B经反相色谱柱分离，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr1-1、Fr1-2、Fr1-3和Fr1-4，色谱峰馏分Fr1-1和Fr1-3经减压干燥分别得到含有目标化合物1、2、4和5的组分Fr1-1和Fr1-3，色谱峰馏分Fr1-2和Fr1-4经减压干燥得到纯度大于95%的自由基清除剂Protocatechuicacid 45.3 mg，标记为3号和自由基清除剂3-O-galloyl-shikimic acid 295.8 mg，标记为6号，其中减压干燥的条件为真空度250 mbar，温度60℃；反相制备柱制备的工作参数为制备柱柱长250 mm、直径20 mm，反相色谱柱固定相为5 μm耐纯水Megres C18，流动相A为0.2%甲酸-水溶液，流动相B为甲醇溶液，按照0~60min，5~15%B洗脱，进样体积为4 mL，流速为19mL/min；
步骤5，Fr1-1的反相制备液相色谱纯化：含有目标化合物1和2的组分用体积分数为10%的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为50.0 mg/mL，均经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液C，滤液C经反相液相制备色谱纯化，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集滤液C制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95%的自由基清除剂Gallic acid 66.3 mg，标记为1号和自由基清除剂Gallate-3-O-β-D-glucopyranoside 44.6 mg，标记为2号，其中减压干燥的条件为真空度250 mbar，温度60℃；反相制备液相色谱纯化的工作参数是指色谱柱柱长250 mm、直径20 mm，反相制备柱固定相为5 μm耐纯水Megres C18，流动相为体积分数100%水溶液，进样体积为5 mL，流速为19mL/min；
步骤6，Fr1-3的亲水/反相二维液相色谱纯化：含有目标化合物4和5的组分Fr1-3用体积分数为100%的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为50.0 mg/mL，均经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液D，滤液D经亲水/反相二维液相色谱纯化，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集滤液D反相制备色谱图中前两个主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95%的自由基清除剂4-O-galloyl-(-)-shikimic acid 5.3 mg，标记为4号和自由基清除剂5-O-galloyl-(-)-shikimic aicd 11.0 mg，标记为5号；其中减压干燥的条件为真空度250 mbar，温度60℃；所述亲水/反相二维液相色谱纯化的工作参数是指色谱柱尺寸均为250×20 mm，亲水制备柱固定相为5 μm两性离子柱Click XION，流动相为92%乙腈-水溶液，进样体积为4 mL，流速为19 mL/min；反相制备柱固定相为5 μm耐纯水Megres C18，流动相为8%甲醇-水溶液，进样体积为4 mL，流速为19 mL/min。
上述所制得的唐古特虎耳草中天然自由基清除剂在制备自由基清除药物或保健食品中的应用，其中，上述制备的自由基抑制剂作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或作为有效成分按常规方法与食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
实施例3
唐古特虎耳草中天然自由基清除剂的分离工艺，该方法具体包括如下步骤：
步骤1，提取：取1200g唐古特虎耳草全草阴干，粗碎后按料液比1g：100mL的甲醇提取，在室温下提取2次，每次4 h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按聚酰胺的量：唐古特虎耳草药材的量=1:5拌样并减压干燥，其中减压干燥的条件为真空度150 mbar，温度50℃，即得唐古特虎耳草提取物拌样样品863.7g；
步骤2，微孔树脂柱粗分：唐古特虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱塔分离，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分3.9g，其中减压干燥的条件为真空度150mbar，温度50℃；其中，微孔树脂柱分离的工作参数为色谱柱柱长460 mm、直径49 mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为乙醇，色谱条件为0~120min，0~100%B，120~150min，100%B，进样量为40g，流速为30 mL/min。
步骤3，在线自由基清除剂组分筛选：在所述唐古特虎耳草含有目标成分的组分中加入其质量8倍的体积浓度为80%的甲醇进行溶解，配制样品浓度为80.0 mg/mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到唐古特虎耳草甲醇样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选唐古特虎耳草含有目标成分的组分中自由基清除剂；其中，在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水XAqua C18柱（250×4.6mm，5μm）亲水色谱柱，检测波长为254nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为0.2%甲酸-水溶液，流动相B为甲醇溶液，按照0~60min，5~15%B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为50μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15 m；
步骤4，反相制备柱制备：所述滤液B经反相色谱柱分离，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr1-1、Fr1-2、Fr1-3和Fr1-4，色谱峰馏分Fr1-1和Fr1-3经减压干燥分别得到含有目标化合物1、2、4和5的组分Fr1-1和Fr1-3，色谱峰馏分Fr1-2和Fr1-4经减压干燥得到纯度大于95%的自由基清除剂Protocatechuicacid 54.2 mg，标记为3号和自由基清除剂3-O-galloyl-shikimic acid 354.6 mg，标记为6号，其中减压干燥的条件为真空度150 mbar，温度50℃；反相制备柱制备的工作参数为制备柱柱长250 mm、直径20 mm，反相色谱柱固定相为5 μm耐纯水XAquaC18，流动相A为0.2%甲酸-水溶液，流动相B为甲醇溶液，按照0~60min，5~15%B洗脱，进样体积为4 mL，流速为19mL/min；
步骤5，Fr1-1的反相制备液相色谱纯化：含有目标化合物1和2的组分用体积分数为5%的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为30.0 mg/mL，均经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液C，滤液C经反相液相制备色谱纯化，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集滤液C制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95%的自由基清除剂Gallic acid 79.4 mg，标记为1号和自由基清除剂Gallate-3-O-β-D-glucopyranoside 53.1 mg，标记为2号，其中减压干燥的条件为真空度150 mbar，温度50℃；反相制备液相色谱纯化的工作参数是指色谱柱柱长250 mm、直径20 mm，反相制备柱固定相为5 μm耐纯水XAqua C18，流动相为体积分数100%水溶液，进样体积为5 mL，流速为19mL/min；
步骤6，Fr1-3的亲水/反相二维液相色谱纯化：含有目标化合物4和5的组分Fr1-3用体积分数为70%的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为30.0 mg/mL，均经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液D，滤液D经亲水/反相二维液相色谱纯化，经检测波长为254 nm的紫外检测器检测，收集滤液D反相制备色谱图中前两个主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95%的自由基清除剂4-O-galloyl-(-)-shikimic acid 6.2 mg，标记为4号和自由基清除剂5-O-galloyl-(-)-shikimic aicd 12.8 mg，标记为5号；其中减压干燥的条件为真空度150 mbar，温度50℃；所述亲水/反相二维液相色谱纯化的工作参数是指色谱柱尺寸均为250×20 mm，亲水制备柱固定相为5 μm两性离子柱Click XION，流动相为92%乙腈-水溶液，进样体积为4 mL，流速为19 mL/min；反相制备柱固定相为5 μm耐纯水XAqua C18，流动相为8%甲醇-水溶液，进样体积为4 mL，流速为19 mL/min。
上述所制得的唐古特虎耳草中天然自由基清除剂在制备自由基清除药物或保健食品中的应用，其中，上述制备的自由基抑制剂作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或作为有效成分按常规方法与食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
实施例4
唐古特虎耳草中天然自由基清除剂的活性验证
分别在分离得到的唐古特虎耳草天然自由基清除剂1~6中加入其质量4倍的色谱甲醇进行溶解，配制样品浓度为0.2 mg/mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到唐古特虎耳草天然自由基清除剂样品溶液，取1mL样品，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统验证唐古特虎耳草天然自由基清除剂1~6的活性；
其中，在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用两性离子柱Reprosil C18（250×4.6mm，5μm）反相色谱柱，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为0.2%甲酸-水溶液，流动相B为甲醇溶液，按照0~60min，5~15%B，流动相流速为1.0mL/min，检测波长为254nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，DPPH溶液浓度为50μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m，检测波长为517nm，活性验证色谱图（如附图7所示）。
从唐古特虎耳草中得到的天然自由基清除剂Gallic acid，Gallate-3-O-β-D-glucopyranoside，Protocatechuic acid，4-O-galloyl-(-)-shikimic acid，5-O-galloyl-(-)-shikimic aicd，3-O-galloyl-shikimic acid结构表征及结构见附图8-26。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.唐古特虎耳草中天然自由基清除剂的分离工艺，其特征在于：该工艺具体包括如下步骤：
步骤1，提取：将唐古特虎耳草全草阴干，粗碎后按料液比1g：5～100mL的甲醇提取，在室温下提取2～4次，每次2～4h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按聚酰胺的量：唐古特虎耳草药材的量＝1:5拌样并减压干燥，即得唐古特虎耳草提取物拌样样品；
步骤2，微孔树脂柱粗分：唐古特虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱塔分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分；
步骤3，在线自由基清除剂组分筛选：在所述唐古特虎耳草含有目标成分的组分中加入其质量5～10倍的体积浓度为70～90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到唐古特虎耳草甲醇样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选唐古特虎耳草含有目标成分的组分中自由基清除剂；
步骤4，反相制备柱制备：所述滤液B经反相色谱柱分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr1-1、Fr1-2、Fr1-3和Fr1-4，色谱峰馏分Fr1-1和Fr1-3经减压干燥分别得到含有目标化合物1、2、4和5的组分Fr1-1和Fr1-3，色谱峰馏分Fr1-2和Fr1-4经减压干燥得到纯度大于95％的自由基清除剂Protocatechuic acid，标记为3号和自由基清除剂3-O-galloyl-shikimic acid，标记为6号；
步骤5，Fr1-1的反相制备液相色谱纯化：含有目标化合物1和2的组分用体积分数为0～10％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为20.0～50.0mg/mL，均经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液C，滤液C经反相液相制备色谱纯化，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集滤液C制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95％的自由基清除剂Gallicacid，标记为1号和自由基清除剂Gallate-3-O-β-D-glucopyranoside，标记为2号；
步骤6，Fr1-3的亲水/反相二维液相色谱纯化：含有目标化合物4和5的组分Fr1-3用体积分数为50～100％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为20.0～50.0mg/mL，均经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液D，滤液D经亲水/反相二维液相色谱纯化，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集滤液D反相制备色谱图中前两个主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95％的自由基清除剂4-O-galloyl-(-)-shikimic acid，标记为4号和自由基清除剂5-O-galloyl-(-)-shikimic aicd，标记为5号；
其中，所述1-6号自由基清除剂的化学结构式依次为：
2.根据权利要求1所述的唐古特虎耳草中天然自由基清除剂的分离工艺，其特征在于：所述步骤3中，在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水C18柱250×4.6mm，5μm亲水色谱柱，检测波长为254nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm。
3.根据权利要求1所述的唐古特虎耳草中天然自由基清除剂的分离工艺，其特征在于：所述步骤1、步骤2、步骤4、步骤5和步骤6中，减压干燥的条件均为：真空度50～250mbar，温度40～60℃。
4.根据权利要求1所述的唐古特虎耳草中天然自由基清除剂的分离工艺，其特征在于：所述步骤2中，微孔树脂柱分离的工作参数为色谱柱柱长460mm、直径49mm，微孔树脂柱固定相为HP20SS或CHP20P，流动相A为水，B为乙醇，色谱条件为0～120min，0～100％B，120～150min，100％B，进样量为40g，流速为30mL/min。
5.根据权利要求1所述的唐古特虎耳草中天然自由基清除剂的分离工艺，其特征在于：所述步骤3中，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为0.2％甲酸-水溶液，流动相B为甲醇溶液，按照0～60min，5～15％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为50μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m。
6.根据权利要求1所述的唐古特虎耳草中天然自由基清除剂的分离工艺，其特征在于：所述步骤4中，反相制备柱制备的工作参数为制备柱柱长250mm、直径20mm，反相色谱柱固定相为5μm耐纯水C18，流动相A为0.2％甲酸-水溶液，流动相B为甲醇溶液，按照0～60min，5～15％B洗脱，进样体积为4mL，流速为19mL/min。
7.根据权利要求1所述的唐古特虎耳草中天然自由基清除剂的分离工艺，其特征在于：所述步骤5中，反相制备液相色谱纯化的工作参数是指色谱柱柱长250mm、直径20mm，反相制备柱固定相为5μm耐纯水C18，流动相为体积分数100％水溶液，进样体积为5mL，流速为19mL/min。
8.根据权利要求1所述的唐古特虎耳草中天然自由基清除剂的分离工艺，其特征在于：所述步骤6中，所述亲水/反相二维液相色谱纯化的工作参数是指色谱柱尺寸均为250×20mm，亲水制备柱固定相为5μm两性离子柱Click XION，流动相为92％乙腈-水溶液，进样体积为4mL，流速为19mL/min；反相制备柱固定相为5μm耐纯水C18，流动相为8％甲醇-水溶液，进样体积为4mL，流速为19mL/min。
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