CN113105317B - 山地虎耳草中二芳基壬烷类ⅱ自由基抑制剂及其分离制备工艺和应用 - Google Patents
山地虎耳草中二芳基壬烷类ⅱ自由基抑制剂及其分离制备工艺和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂及其分离制备工艺和应用。具体制备工艺为：提取、在线自由基抑制剂组分筛选、微孔树脂柱中压色谱粗分、在线自由基抑制剂筛选及反相制备柱制备五个步骤。本发明制备工艺中的提取溶剂、微孔树脂柱、反相色谱柱分离溶剂及反相色谱分离用材均可回收利用；原料来源广泛，甲醇室温冷浸提取等工艺步骤均可实现规模化操作，且高压制备色谱分离可以保证产品的纯度大于95％。
Description
技术领域
本发明涉及山地虎耳草中二芳基壬烷类自由基抑制剂分离技术领域，具体涉及山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂及其分离制备工艺和应用。
背景技术
山地虎耳草(Saxif raga montana)，为虎耳草科(Saxif ragaceae)虎耳草属(Saxifraga)的多年生草本植物，藏药名：“寒仁交木”，主要分布在中国陕西、青海、四川西部、云南西北部及西藏东部和南部。主要功效：清热解毒，平肝潜阳。主治肝胆湿热、脾胃湿热，痈肿疮毒用于肝阳上亢所致的头痛。现代药理学研究证明酚类是虎耳草属植物主要活性成分。文献报道，酚类化合物具有良好的清除自由基活性。为了进一步加快山地虎耳草的质量评价、生产销售及相关新药的研发步伐，有必要从中挖掘其潜在的活性成分。
目前，仅有一篇有关山地虎耳草中化学成分(Diversity of chemicalconstituents from Saxifraga montana,Jun-Xi Liu,Duo-Long Di,Yan-Ping Shi,2008,55,863-870)研究报道，该研究利用传统植物化学手段从山地虎耳草中分离鉴定了包括苯丙素类、苯甲酸类、黄酮类、萜类等18个化合物。有关山地虎耳草中自由抑制剂的分离制备工艺及其应用并未见文献报道。因此，亟需建立一种工艺简单、规模化从山地虎耳草中分离制备二芳基壬烷类自由基抑制剂的方法。
发明内容
基于上述技术问题，本发明的目的是提供山地虎耳草中二芳基壬烷类自由基抑制剂及其分离制备工艺和应用。
本发明保护山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂，其中，该二芳基壬烷类自由基抑制剂呈棕色油状，其名称为二芳基壬烷类Saximonsin B自由基抑制剂，其分子式为C21H22O5，其化学结构式为：
本发明保护山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂的分离制备工艺，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：将山地虎耳草全草阴干，粗碎后按料液比1g：5～100mL的甲醇提取，在室温下提取2～4次，每次2～4h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A经减压干燥得山地虎耳草提取物，按聚酰胺的量：山地虎耳草提取物的量＝3:1拌样并减压干燥，即得山地虎耳草提取物拌样样品；
步骤2，在线自由基抑制剂组分筛选：在1g山地虎耳草拌样样品中加入体积浓度为70～90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到山地虎耳草甲醇样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统，筛选山地虎耳草粗样中自由基抑制剂组分，其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水C18(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；
步骤3，微孔树脂柱中压色谱粗分：山地虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第4个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr4，其中，所述微孔树脂柱的中压色谱分离工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为甲醇，色谱条件为0～90min，0～100％B，进样量为35.4g，流速为50mL/min；
步骤4，在线自由基抑制剂筛选：在山地虎耳草目标组分中加入体积浓度为70～90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到山地虎耳草含有目标组分的溶液，即滤液C，取1mL滤液C，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统，筛选山地虎耳草目标组分中自由基抑制剂，其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水C18(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；
步骤5，反相制备柱制备：所述滤液C经反相制备柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr4-2，色谱峰馏分Fr4-2经减压干燥即得纯度大于95％的二芳基壬烷类自由基抑制剂Fr4-2，并命名为Saximonsin B；其中，所述反相制备柱制备的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，反相色谱柱固定相为5μm耐纯水C18，流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，14％B洗脱，进样体积为4mL，流速为19mL/min。
进一步的，所述步骤1、步骤3和步骤5中，减压干燥的条件均为：真空度50～250mbar，温度40～60℃。
进一步的，所述步骤2中，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，5～50％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m。
进一步的，所述步骤4中，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，14％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m。
进一步的，步骤2、步骤4及步骤5所述的耐纯水C18反相色谱柱为耐纯水ReprosilC18反相色谱柱、耐纯水Megres C18反相色谱柱及耐纯水Kromasil 100-5-C18(w)反相色谱柱中的任意一种。
相比于现有的技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明成本低廉、产品纯度高
提取使用的溶剂，微孔树脂柱、反相色谱柱分离所使用的溶剂均可以回收利用；反相色谱分离使用的材料均可以重复利用，回收利用的溶剂和重复利用的分离材料保证了较低廉的分离平均成本，高压制备色谱分离可以保证产品的纯度大于95％。
(2)本发明的制备方法可实现规模化生产需要
原料要求不高、成本低廉，一般野生的或市售的山地虎耳草均可，易于批量备料；甲醇室温冷浸提取，易于操作；分离采用微孔树脂柱粗分，该微孔树脂分离材料可以装于中压柱层析系统中，易于实现规模化；分离纯化中使用的反相制备液相色谱为快速等度方法，也非常适宜规模生产。
附图说明
图1为本发明山地虎耳草总样在线HPLC-DPPH筛选色谱图；
图2为本发明山地虎耳草提取物拌样样品微孔树脂中压色谱分离图；
图3为本发明山地虎耳草目标组分在线HPLC-DPPH筛选色谱图；
图4为本发明山地虎耳草目标组分Fr4反相制备液相色谱分离图；
图5为本发明山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂Fr4-2(Saximonsin B)的纯度及活性验证色谱图；
图6为本发明山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂的高分辨质谱图；
图7为本发明山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂1HNMR核磁图；
图8为本发明山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂13CNMR核磁图；
图9为本发明山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂DEPT核磁图；
图10为本发明山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂HSQC二维核磁图；
图11为本发明山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂HMBC二维核磁图；
图12为本发明山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂H-HCOSY二维核磁图；
图13为本发明山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂NOESY二维核磁图；
图14为本发明山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂红外光谱图；
图15为本发明山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂紫外光谱图；
图16为本发明山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂结构图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂的分离制备工艺，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：取170g山地虎耳草全草阴干，粗碎后按料液比1g：5mL的甲醇提取，在室温下提取4次，每次2h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A经减压干燥得山地虎耳草提取物，按聚酰胺的量：山地虎耳草提取物的量＝3:1拌样并减压干燥，即得山地虎耳草提取物拌样样品；其中，两处减压干燥的条件均为：真空度50mbar，温度40℃，所得山地虎耳草提取物拌样样品70.8g；
步骤2，在线自由基抑制剂组分筛选：在1g山地虎耳草拌样样品中加入体积浓度为90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到山地虎耳草甲醇样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统，筛选山地虎耳草粗样中自由基抑制剂组分(详见附图1)；其中，在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水Reprosil C18(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，5～50％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m；
步骤3，微孔树脂柱中压色谱粗分：山地虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第4个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr42.6g(详见附图2)，其中减压干燥的条件为：真空度50mbar，温度40℃；其中，所述微孔树脂柱的中压色谱分离工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为甲醇，色谱条件为0～90min，0～100％B，进样量为35.4g，流速为50mL/min；
步骤4，在线自由基抑制剂筛选：在山地虎耳草目标组分中加入体积浓度为90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到山地虎耳草含有目标组分的溶液，即滤液C，取1mL滤液C，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统，筛选山地虎耳草目标组分中自由基抑制剂(详见附图3)，其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水Reprosil C18(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，14％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m；
步骤5，反相制备柱制备：所述滤液C经反相制备柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr4-2(详见附图4)，色谱峰馏分Fr4-2经减压干燥即得纯度大于95％的二芳基壬烷类自由基抑制剂Fr4-2(SaximonsinB)41.8mg；其中减压干燥的条件为：真空度50mbar，温度40℃；其中，所述反相制备柱制备的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，反相色谱柱固定相为5μm耐纯水Reprosil C18，流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，14％B洗脱，进样体积为4mL，流速为19mL/min。
实施例2
山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂的分离制备工艺，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：取500g山地虎耳草全草阴干，粗碎后按料液比1g：100mL的甲醇提取，在室温下提取2次，每次4h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A经减压干燥得山地虎耳草提取物，按聚酰胺的量：山地虎耳草提取物的量＝3:1拌样并减压干燥，即得山地虎耳草提取物拌样样品；其中，两处减压干燥的条件均为：真空度250mbar，温度60℃，所得山地虎耳草提取物拌样样品198.5g；
步骤2，在线自由基抑制剂组分筛选：在1g山地虎耳草拌样样品中加入体积浓度为70％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到山地虎耳草甲醇样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统，筛选山地虎耳草粗样中自由基抑制剂组分，其中，在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水Megres C18(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，5～50％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m；
步骤3，微孔树脂柱中压色谱粗分：山地虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第4个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr47.1g，其中减压干燥的条件为：真空度250mbar，温度60℃；其中，所述微孔树脂柱的中压色谱分离工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为甲醇，色谱条件为0～90min，0～100％B，进样量为35.4g，流速为50mL/min；
步骤4，在线自由基抑制剂筛选：在山地虎耳草目标组分中加入体积浓度为70％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到山地虎耳草含有目标组分的溶液，即滤液C，取1mL滤液C，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统，筛选山地虎耳草目标组分中自由基抑制剂，其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水Megres C18(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，14％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m；
步骤5，反相制备柱制备：所述滤液C经反相制备柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr4-2，色谱峰馏分Fr4-2经减压干燥即得纯度大于95％的二芳基壬烷类自由基抑制剂Fr4-2(Saximonsin B)108.5mg；其中减压干燥的条件为：真空度250mbar，温度60℃；其中，所述反相制备柱制备的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，反相色谱柱固定相为5μm耐纯水纯水Megres C18，流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，14％B洗脱，进样体积为4mL，流速为19mL/min。
实施例3
山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂的分离制备工艺，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：取1000g山地虎耳草全草阴干，粗碎后按料液比1g：50mL的甲醇提取，在室温下提取3次，每次3h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A经减压干燥得山地虎耳草提取物，按聚酰胺的量：山地虎耳草提取物的量＝3:1拌样并减压干燥，即得山地虎耳草提取物拌样样品；其中，两处减压干燥的条件均为：真空度100mbar，温度50℃，所得山地虎耳草提取物拌样样品389.4g；
步骤2，在线自由基抑制剂组分筛选：在1g山地虎耳草拌样样品中加入体积浓度为80％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为80.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到山地虎耳草甲醇样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统，筛选山地虎耳草粗样中自由基抑制剂组分，其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水Kromasil 100-5-C18(w)(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，5～50％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m；
步骤3，微孔树脂柱中压色谱粗分：山地虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第4个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr413.6g，其中减压干燥的条件为：真空度100mbar，温度50℃；其中，所述微孔树脂柱的中压色谱分离工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为甲醇，色谱条件为0～90min，0～100％B，进样量为35.4g，流速为50mL/min；
步骤4，在线自由基抑制剂筛选：在山地虎耳草目标组分中加入体积浓度为80％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为80.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到山地虎耳草含有目标组分的溶液，即滤液C，取1mL滤液C，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统，筛选山地虎耳草目标组分中自由基抑制剂，其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水Kromasil100-5-C18(w)(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，14％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m；
步骤5，反相制备柱制备：所述滤液C经反相制备柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr4-2，色谱峰馏分Fr4-2经减压干燥即得纯度大于95％的二芳基壬烷类自由基抑制剂Fr4-2(Saximonsin B)240.1mg；其中减压干燥的条件为：真空度100mbar，温度50℃；其中，所述反相制备柱制备的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，反相色谱柱固定相为5μm耐纯水纯水Kromasil 100-5-C18(w)C18，流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，14％B洗脱，进样体积为4mL，流速为19mL/min。
实施例4
山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂的活性验证：
分别在分离得到的山地虎耳草中二芳基壬烷类Saximonsin B自由基抑制剂中加入色谱甲醇进行溶解，配制样品浓度为0.3mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到山地虎耳草中二芳基壬烷类Saximonsin B自由基抑制剂样品溶液，取1mL样品，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统验证山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂的活性；其中，在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水Reprosil C18反相色谱柱(250×4.6mm，5μm)，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，5～50％B，流动相流速为1.0mL/min，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m，检测波长为517nm，活性验证色谱图(详见附图5)。二芳基壬烷类Saximonsin B自由基抑制剂的质谱图、核磁图、红外光谱图、紫外光谱图及旋光测试图(详见附图6-15)，二芳基壬烷类Saximonsin B化合物的结构图(详见附图16)。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂，其特征在于，该二芳基壬烷类自由基抑制剂呈棕色油状，其名称为二芳基壬烷类Saximonsin B自由基抑制剂，其分子式为C21H22O5，其化学结构式为：
。
2.根据权利要求1所述的山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂的分离制备工艺，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：将山地虎耳草全草阴干，粗碎后按料液比1g：5～100mL的甲醇提取，在室温下提取2～4次，每次2～4h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A经减压干燥得山地虎耳草提取物，按聚酰胺的量：山地虎耳草提取物的量＝3:1拌样并减压干燥，即得山地虎耳草提取物拌样样品；
步骤2，在线自由基抑制剂组分筛选：在1g山地虎耳草拌样样品中加入体积浓度为70～90%的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到山地虎耳草甲醇样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统，筛选山地虎耳草粗样中自由基抑制剂组分，其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水C18 250×4.6mm，5μm反相色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；
步骤3，微孔树脂柱中压色谱粗分：山地虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第4个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr4，其中，所述微孔树脂柱的中压色谱分离工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为甲醇，色谱条件为0～90min，0～100%B，进样量为35.4g，流速为50mL/min；
步骤4，在线自由基抑制剂筛选：在山地虎耳草目标组分中加入体积浓度为70～90%的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到山地虎耳草含有目标组分的溶液，即滤液C，取1mL滤液C，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统，筛选山地虎耳草目标组分中自由基抑制剂，其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水C18 250×4.6mm，5μm反相色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；
步骤5，反相制备柱制备：所述滤液C经反相制备柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr4-2，色谱峰馏分Fr4-2经减压干燥即得纯度大于95%的新的二芳基壬烷类自由基抑制剂Fr4-2，并命名为Saximonsin B；其中，所述反相制备柱制备的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，反相色谱柱固定相为5μm耐纯水C18，流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，14%B洗脱，进样体积为4mL，流速为19mL/min。
3.根据权利要求2所述的山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂的分离制备工艺，其特征在于，所述步骤1、步骤3和步骤5中，减压干燥的条件均为：真空度50～250mbar，温度40～60℃。
4.根据权利要求2所述的山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂的分离制备工艺，其特征在于，所述步骤2中，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，5～50%B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m。
5.根据权利要求2所述的山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂的分离制备工艺，其特征在于，所述步骤4中，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，14%B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m。
6.根据权利要求2所述的山地虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ自由基抑制剂的分离制备工艺，其特征在于，步骤2、步骤4及步骤5所述的耐纯水C18反相色谱柱为耐纯水ReprosilC18反相色谱柱、耐纯水Megres C18反相色谱柱及耐纯水Kromasil 100-5-C18 w 反相色谱柱中的任意一种。
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