CN115073277B - 异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺及其应用 - Google Patents
异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115073277B CN115073277B CN202210656943.4A CN202210656943A CN115073277B CN 115073277 B CN115073277 B CN 115073277B CN 202210656943 A CN202210656943 A CN 202210656943A CN 115073277 B CN115073277 B CN 115073277B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chromatographic
- column
- mobile phase
- component
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000346136 Dracocephalum heterophyllum Species 0.000 title claims abstract description 73
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 title claims abstract description 64
- JZLXEKNVCWMYHI-UHFFFAOYSA-N gingerol Natural products CCCCC(O)CC(=O)CCC1=CC=C(O)C(OC)=C1 JZLXEKNVCWMYHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 52
- 229940123457 Free radical scavenger Drugs 0.000 title claims abstract description 46
- NLDDIKRKFXEWBK-AWEZNQCLSA-N gingerol Chemical compound CCCCC[C@H](O)CC(=O)CCC1=CC=C(O)C(OC)=C1 NLDDIKRKFXEWBK-AWEZNQCLSA-N 0.000 title claims abstract description 45
- 235000002780 gingerol Nutrition 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 84
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 31
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims abstract description 25
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims abstract description 25
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 19
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 19
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims abstract description 4
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims abstract description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 129
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 70
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 63
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 56
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 53
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 37
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 30
- HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N dpph Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1[N]N(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 18
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 18
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 18
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 16
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 15
- CZNLTCTYLMYLHL-UHFFFAOYSA-N [6]-Paradol Chemical compound CCCCCCCC(=O)CCC1=CC=C(O)C(OC)=C1 CZNLTCTYLMYLHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 11
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 10
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical group CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 8
- OQWKEEOHDMUXEO-UHFFFAOYSA-N (6)-shogaol Natural products CCCCCC=CC(=O)CCC1=CC=C(O)C(OC)=C1 OQWKEEOHDMUXEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical group ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- PXBFKEHWQRAQQD-RBUKOAKNSA-N [(3r,5s)-3-acetyloxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)decan-5-yl] acetate Chemical compound CCCCC[C@H](OC(C)=O)C[C@H](OC(C)=O)CCC1=CC=C(O)C(OC)=C1 PXBFKEHWQRAQQD-RBUKOAKNSA-N 0.000 claims description 7
- OQWKEEOHDMUXEO-BQYQJAHWSA-N [6]-Shogaol Chemical compound CCCCC\C=C\C(=O)CCC1=CC=C(O)C(OC)=C1 OQWKEEOHDMUXEO-BQYQJAHWSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000010567 reverse phase preparative liquid chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 4
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 3
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 abstract description 5
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 abstract description 4
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002386 leaching Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 10
- 230000006837 decompression Effects 0.000 description 7
- NLDDIKRKFXEWBK-CQSZACIVSA-N (S)-6-Gingerol Natural products CCCCC[C@@H](O)CC(=O)CCC1=CC=C(O)C(OC)=C1 NLDDIKRKFXEWBK-CQSZACIVSA-N 0.000 description 5
- 230000002292 Radical scavenging effect Effects 0.000 description 5
- MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N diphenyl-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1N=[N+](C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 229930187380 Inophyllum Natural products 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 241000207923 Lamiaceae Species 0.000 description 3
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- -1 DPPH radicals Chemical class 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241001529849 Dracocephalum Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 240000003237 Hedychium spicatum Species 0.000 description 1
- 235000015030 Hedychium spicatum Nutrition 0.000 description 1
- 241001365031 Isodon japonicus Species 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 206010044302 Tracheitis Diseases 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001559 benzoic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007760 free radical scavenging Effects 0.000 description 1
- 235000009569 green tea Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229930015704 phenylpropanoid Natural products 0.000 description 1
- 125000001474 phenylpropanoid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000039 preparative column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013441 quality evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 235000007586 terpenes Nutrition 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C45/00—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
- C07C45/78—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C45/00—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
- C07C45/78—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
- C07C45/79—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by solid-liquid treatment; by chemisorption
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
- C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
- C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
- C07C67/56—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by solid-liquid treatment; by chemisorption
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明公开了异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺及其应用。具体工艺:提取、硅胶柱前处理、微孔树脂柱富集、在线自由基清除剂组分筛选、Diol二醇基柱富集、在线自由基清除剂组分再筛选、Spherical C18色谱柱制备、反相制备柱分离及反相苯基柱液相色谱纯化。制备工艺中的提取溶剂、硅胶柱、微孔树脂柱、Diol二醇基柱、Spherical C18色谱柱和反相色谱柱所使用的溶剂及分离材料均可回收利用;原料成本低,甲醇室温冷浸提取,硅胶和微孔树脂材料可装于中压柱层析系统中,实现规模化操作;高压色谱分离纯化可保证产品纯度大于95%。
Description
技术领域
本发明涉及异叶青兰中天然自由基清除剂分离技术领域,具体涉及异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺及其应用。
背景技术
异叶青兰(Dracocephalum heterophyllum Benth)系唇形科(Labiatae)青兰属(Dracocephalum)植物,藏药名:“吉孜青保”,又名白花夏枯草,分布于山西(神池),内蒙古(大青山),宁夏(贺兰山),甘肃(兰州以西及西南),四川西北部、西部,青海,西藏及新疆(天山),资源丰富。《晶珠本草》中记载异叶青兰治口腔病、牙齿病,清肝热。新疆用全草入药,对治疗慢性气管炎有明显的镇咳平喘作用。现代研究证明异叶青兰中的化学成分主要包括苯丙素类、黄酮类、萜类、甾体类、生物碱类和苯甲酸类。文献报道,姜辣素类化合物具有良好的清除自由基活性。为了进一步加快异叶青兰的质量评价和相关新药的研发步伐,有必要从中挖掘更多的活性成分。
目前,有关异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离制备工艺及其应用并未见文献报道,已有的研究也未做到系统化的研究。因此,亟需建立一种工艺简单、规模化从异叶青兰中分离制备姜辣素类天然自由基清除剂的方法。
发明内容
基于上述技术问题,本发明的目的是提供异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺及其应用。
本发明保护异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺,具体包括如下步骤:
步骤1,提取:将异叶青兰全草阴干,粗碎后按料液比1g:5~100mL的甲醇提取,在室温下提取2~4次,每次8~12h,过滤、合并滤液,即滤液A,该滤液A按硅胶的量:异叶青兰药材的量=1:1~5拌样并减压干燥,即得异叶青兰提取物拌样样品;
步骤2,硅胶柱前处理:异叶青兰提取物拌样样品,该样品经装有硅胶的中压色谱柱分离,经检测波长为210nm的紫外检测器检测,收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分,该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr1;其中,所述硅胶柱分离的工作参数为色谱柱柱长460mm、直径15-49mm,固定相为硅胶,流动相A为甲醇,B为二氯甲烷,色谱条件为0-30min,0% B,30-60min,0-100% B,60-90min,100% B,进样量为20-130g,流速为10-57mL/min;
步骤3,微孔树脂柱富集:Fr1用加入其质量5~10倍的甲醇溶解得到滤液B,滤液B按硅胶的量:样品的量=1:1~1.5拌样并干燥,即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr1拌样样品,该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离,经检测波长为210nm的紫外检测器检测,收集制备色谱图中第四个主要的色谱峰馏分,该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr14;其中,微孔树脂柱分离的工作参数为:色谱柱柱长460mm、直径15-49mm,微孔树脂柱固定相为CHP20P,流动相A为水,B为甲醇,色谱条件为0-150min,20-100%B,150-210min,100% B,进样量为10-55g,流速为10-57mL/min;HPLC分析条件为:ReproSil-PurC18 AQ(250×4.6mm,5μm)色谱柱,检测波长为210nm,流动相A为色谱纯水,流动相B为乙腈溶液,按照0-60min,40-75% B,流动相流速为1.0mL/min;
步骤4,在线自由基清除剂组分筛选:在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr14中加入其质量5~10倍的体积浓度为70~90%的甲醇进行溶解,配制样品浓度为50.0~100.0mg/mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,得到异叶青兰Fr14甲醇样品溶液,即滤液C,取1mL滤液C,利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标成分的组分中自由基清除剂;其中,所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统,第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-PurC18 AQ(250×4.6mm,5μm)色谱柱,检测波长为210nm;第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液,检测波长为517nm;
步骤5,Diol二醇基柱富集:滤液C按硅胶的量:样品的量=1:1~1.5拌样并干燥,即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr14拌样样品,该样品经Diol二醇基中压色谱柱分离,经检测波长为280nm的紫外检测器检测,收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分,该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr141;其中,Diol二醇基柱分离的工作参数为:色谱柱柱长500mm、直径50mm,固定相为Diol,流动相A为正己烷,B为乙酸乙酯,色谱条件为0-90min,0-100%B,检测波长为280nm,进样量为10-60g,流速为57mL/min;
步骤6,在线自由基清除剂组分再筛选:在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr141中加入其质量5~10倍的体积浓度为70~90%的甲醇进行溶解,配制样品浓度为50.0~100.0mg/mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,得到异叶青兰Fr141样品溶液,即滤液D,取1mL滤液D,利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标组分中自由基清除剂色谱峰1-3;其中,所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统,第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-Pur C18AQ(250×4.6mm,5μm)反相色谱柱,检测波长为210nm;第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液,检测波长为517nm;
步骤7,Spherical C18色谱柱制备:滤液D按硅胶的量:样品的量=1:1~1.5拌样并干燥,即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr141拌样样品,该样品经Spherical C18中压色谱柱分离,经检测波长为210nm的紫外检测器检测,收集制备色谱图中第二个主要的色谱峰馏分,该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr1412;其中,SphericalC18色谱柱制备的工作参数为:色谱柱柱长500mm、直径50mm,固定相为Spherical C18,流动相A为水,B为乙醇,色谱条件为0-90min,55-75% B,检测波长为210nm,进样量为10g,流速为57mL/min;
步骤8,反相制备柱分离:在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr1412中加入其质量5~10倍的体积浓度为70~100%的甲醇进行溶解,配制样品浓度为50.0~100.0mg/mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,得到异叶青兰Fr1412样品溶液,即滤液E,取1mL滤液E,使用在线HPLC-DPPH色谱联用系统对滤液E进行分析和活性峰筛选,然后将分析条件进行线性放大,对滤液E进行反相制备色谱柱分离,经检测波长为210nm的紫外检测器检测,收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr14123、Fr14124和Fr14126,经减压干燥分别得到含有目标化合物1的组分Fr14123,含有目标化合物2的组分Fr14124和含有目标化合物3和4的组分Fr14126;
步骤9,Fr1423、Fr1424和Fr1426反相苯基柱液相色谱纯化:分别含有目标化合物1~4的组分Fr14123、Fr14124和Fr14126分别用体积分数为70~100%的甲醇-水溶液溶解,配制样品浓度为20.0~50.0mg/mL,均经0.45μm微孔滤膜过滤,得到滤液,即滤液F、G和H,使用在线HPLC-DPPH色谱联用系统对滤液F、G和H进行分析和活性峰筛选,然后将分析条件进行线性放大,对滤液F、G和H进行反相液相制备色谱纯化,经检测波长为210nm的紫外检测器检测,收集滤液F、G和H制备色谱图中主要的色谱峰馏分,该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95%的自由基清除剂5-methoxy-[6]-gingerol,标记为1号;6-shogaol,标记为2号;6-paradol,标记为3号;Diacetoxy-6-gingerdiol,标记为4号;其中,化学结构式分别为:
进一步的,所述步骤1、步骤2、步骤3、步骤5、步骤7、步骤8和步骤9中,减压干燥的条件均为:真空度100~300mbar,温度45~65℃。
进一步的,所述步骤4和6中,第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为色谱纯水,流动相B为乙腈溶液,按照0-60min,40-75% B,流动相流速为1.0mL/min;第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液浓度为25μg/mL,流动相流速为0.8mL/min;反应环长度为18m。
进一步的,所述步骤8中,在线HPLC-DPPH色谱联用系统,第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-Pur C18 AQ(250×4.6mm,5μm)反相色谱柱,检测波长为210nm,流动相A为色谱纯水,流动相B为乙腈溶液,按照0-60min,55% B洗脱,流速为1.0mL/min;第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液,检测波长为517nm;DPPH溶液浓度为25μg/mL,流动相流速为0.8mL/min;反应环长度为18m;反相制备液相色谱纯化的工作参数为:色谱柱柱长250mm、直径20mm,反相制备柱固定相为5μm的ReproSil-Pur C18 AQ填料,流动相A为色谱纯水,流动相B为乙腈溶液,按照0-60min,55% B洗脱,进样体积为0.5mL,流速为19mL/min。
进一步的,所述步骤9中,在线HPLC-DPPH色谱联用系统,第一台高效液相色谱仪采用Kromasil 100-5Phenyl(250×4.6mm,5μm)反相色谱柱,检测波长为210nm,流动相A为色谱纯水,流动相B为乙腈溶液,组分Fr14123分离的流动相为体积分数40%乙腈-水溶液,洗脱60min,组分Fr14124分离的流动相为体积分数42%乙腈-水溶液,洗脱60min,Fr14126分离的流动相为体积分数38%乙腈-水溶液,洗脱120min,流速均为1.0mL/min;第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液,检测波长为517nm;DPPH溶液浓度为25μg/mL,流动相流速为0.8mL/min;反应环长度为18m;反相制备液相色谱纯化的工作参数为:色谱柱柱长250mm、直径20mm,反相制备柱固定相为5μm的Kromasil 100-5Phenyl填料,组分Fr14123、组分Fr14124和组分Fr14126使用的流动相与在线HPLC-DPPH色谱联用系统中第一台高效液相色谱仪中流动相相同,进样体积均为0.5mL,流速为19mL/min。
相比于现有的技术,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明成本低廉、产品纯度高
使用的提取溶剂,硅胶柱、微孔树脂柱、中压色谱柱(Diol二醇基柱和SphericalC18色谱柱)、反相色谱柱分离和纯化所使用的溶剂均可以回收利用;使用的色谱分离材料(反相制备液相色谱分离材料)均可以重复利用,回收利用的溶剂和重复利用的分离材料保证了分离过程中平均成本比较低廉,高压色谱分离可以保证产品的纯度大于95%。
(2)本发明的制备方法可实现规模化生产需要
原料要求不高、成本低廉,一般野生的或市场上销售的异叶青兰即可,易于批量备料;甲醇室温冷浸提取,易于操作,同时对环境友好;分离采用硅胶柱前处理,微孔树脂柱、Diol二醇基柱和Spherical C18色谱柱富集,硅胶和微孔树脂分离材料可以装于中压柱层析系统中,易于规模化;分离纯化中使用的反相制备液相色谱,为快速的等度方法,非常适宜大规模生产。
附图说明
图1为硅胶柱前处理色谱图;
图2为Fr1组分微孔树脂富集色谱图;
图3为在线自由基清除剂Fr14组分筛选色谱图;
图4为Diol二醇基色谱柱富集色谱图;
图5为在线自由基清除剂Fr141组分再筛选色谱图;
图6为Spherical C18色谱柱分离色谱图;
图7为组分Fr1412的ReproSil-Pur C18 AQ反相分析柱分析及活性色谱图;
图8为组分Fr1412的ReproSil-Pur C18 AQ制备柱制备色谱图;
图9为组分Fr14123的Kromasil 100-5Phenyl反相分析柱分析及活性色谱图;
图10为组分Fr14123的Kromasil 100-5Phenyl制备柱制备色谱图;
图11为组分Fr14124的Kromasil 100-5Phenyl反相分析柱分析及活性色谱图;
图12为组分Fr14124的Kromasil 100-5Phenyl制备柱制备色谱图;
图13为组分Fr14126的Kromasil 100-5Phenyl反相分析柱分析及活性色谱图;
图14为组分Fr14126的Kromasil 100-5Phenyl制备柱制备色谱图;
图15为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂1在线活性验证图谱;
图16为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂2在线活性验证图谱;
图17为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂3在线活性验证图谱;
图18为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂4在线活性验证图谱;
图19为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂1~4化学结构式;
图20为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂1的DPPH自由基清除率实验IC50值拟合曲线图;
图21为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂2的DPPH自由基清除率实验IC50值拟合曲线图;
图22为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂3的DPPH自由基清除率实验IC50值拟合曲线图;
图23为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂4的DPPH自由基清除率实验IC50值拟合曲线图;
图24为异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂1(5-methoxy-[6]-gingerol)的低分辨质谱图;
图25为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂1(5-methoxy-[6]-gingerol)1H NMR核磁;
图26为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂1(5-methoxy-[6]-gingerol)13C NMR核磁图;
图27为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂2(6-shogaol)的低分辨质谱图;
图28为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂2(6-shogaol)1H NMR核磁图;
图29为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂2(6-shogaol)13C NMR核磁图;
图30为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂3(6-paradol)的低分辨质谱图;
图31为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂3(6-paradol)1H NMR核磁图;
图32为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂3(6-paradol)13C NMR核磁图;
图33为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂4(Diacetoxy-6-gingerdiol)的低分辨质谱图;
图34为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂4(Diacetoxy-6-gingerdiol)1H NMR核磁图;
图35为本发明异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂4(Diacetoxy-6-gingerdiol)13C NMR核磁图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺,具体包括如下步骤:
步骤1,提取:将10.0kg异叶青兰全草阴干,粗碎后按料液比1g:20mL的甲醇提取,在室温下提取2次,每次10h,过滤、合并滤液,即滤液A,该滤液A按硅胶的量:异叶青兰药材的量=1:1.15拌样并减压干燥,即得异叶青兰提取物拌样样品2.8kg;其中,减压干燥的条件为真空度150mbar,温度55℃;
步骤2,硅胶柱前处理:异叶青兰提取物拌样样品,该样品经装有硅胶的中压色谱柱分离,经检测波长为210nm的紫外检测器检测,收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分(如附图1所示),该馏分经减压干燥即得205.5g异叶青兰含有目标成分的组分Fr1;其中,减压干燥的条件均为真空度150mbar,温度55℃;硅胶柱分离的工作参数为色谱柱柱长460mm、直径15-49mm,固定相为硅胶,流动相A为甲醇,B为二氯甲烷,色谱条件为0-30min,0% B,30-60min,0-100% B,60-90min,100% B,进样量为20-130g,流速为10-57mL/min;
步骤3,微孔树脂柱富集:Fr1用加入其质量10倍的甲醇溶解得到滤液B,滤液B按硅胶的量:样品的量=1:1.14拌样并干燥,即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr1拌样样品439.53g,该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离,经检测波长为210nm的紫外检测器检测,收集制备色谱图中第四个主要的色谱峰馏分(如附图2所示),该馏分经减压干燥即得44.2g异叶青兰含有目标成分的组分Fr14;其中,微孔树脂柱分离的工作参数为:色谱柱柱长460mm、直径15-49mm,微孔树脂柱固定相为CHP20P,流动相A为水,B为甲醇,色谱条件为0-150min,20-100% B,150-210min,100% B,进样量为50g,流速为57mL/min;其中,减压干燥的条件为真空度150mbar,温度55℃;HPLC分析条件为:ReproSil-Pur C18 AQ(250×4.6mm,5μm)色谱柱,检测波长为210nm,流动相A为色谱纯水,流动相B为乙腈溶液,按照0-60min,40-75% B,流动相流速为1.0mL/min;
步骤4,在线自由基清除剂组分筛选:在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr14中加入其质量7倍的体积浓度为80%的甲醇进行溶解,配制样品浓度为90.0mg/mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,得到异叶青兰Fr14甲醇样品溶液,即滤液C,取1mL滤液C,利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标成分的组分中自由基清除剂(如附图3所示);其中,所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统,第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-Pur C18 AQ(250×4.6mm,5μm)色谱柱,流动相A为色谱纯水,流动相B为乙腈溶液,按照0-60min,40-75% B,流动相流速为1.0mL/min,检测波长为210nm;第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液浓度为25μg/mL,检测波长为517nm,流动相流速为0.8mL/min;反应环长度为18m;
步骤5,Diol二醇基柱富集:滤液C按硅胶的量:样品的量=1:1拌样并干燥,即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr14拌样样品88.4g,该样品经Diol二醇基中压色谱柱分离,经检测波长为280nm的紫外检测器检测,收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分(如附图4所示),该馏分经减压干燥即得9.98g异叶青兰含有目标成分的组分Fr141;其中,减压干燥的条件为:真空度150mbar,温度55℃;Diol二醇基柱分离的工作参数为:色谱柱柱长500mm、直径50mm,固定相为Diol,流动相A为正己烷,B为乙酸乙酯,色谱条件为0-90min,0-100%B,检测波长为280nm,进样量为45g,流速为57mL/min;
步骤6,在线自由基清除剂组分再筛选:在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr141中加入其质量8倍的体积浓度为80%的甲醇进行溶解,配制样品浓度为90.0mg/mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,得到异叶青兰Fr141样品溶液,即滤液D,取1mL滤液D,利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标组分中自由基清除剂色谱峰1-3(如附图5所示);其中,所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统,第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-Pur C18AQ(250×4.6mm,5μm)色谱柱,流动相A为色谱纯水,流动相B为乙腈溶液,按照0-60min,40-75% B,流动相流速为1.0mL/min,检测波长为210nm;第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液浓度为25μg/mL,检测波长为517nm,流动相流速为0.8mL/min;反应环长度为18m;
步骤7,Spherical C18色谱柱制备:滤液D按硅胶的量:样品的量=1:1拌样并干燥,即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr141拌样样品20g,该样品经Spherical C18中压色谱柱分离,经检测波长为210nm的紫外检测器检测,收集制备色谱图中第二个主要的色谱峰馏分(如附图6所述),该馏分经减压干燥即得924mg异叶青兰含有目标成分的组分Fr1412;其中,Spherical C18色谱柱制备的工作参数为:色谱柱柱长500mm、直径50mm,固定相为Spherical C18,流动相A为水,B为乙醇,色谱条件为0-90min,55-75% B,检测波长为210nm,进样量为10g,流速为57mL/min;其中,减压干燥的条件为:真空度150mbar,温度55℃;
步骤8,反相制备柱分离:在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr1412中加入其质量7倍的体积浓度为90%的甲醇进行溶解,配制样品浓度为80.0mg/mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,得到异叶青兰Fr1412样品溶液,即滤液E,取1mL滤液E,使用在线HPLC-DPPH色谱联用系统对滤液E进行分析和活性峰筛选(详见附图7),然后将分析条件进行线性放大,对滤液E进行反相制备色谱柱分离,经检测波长为210nm的紫外检测器检测,收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr14123、Fr14124和Fr14126(详见附图8),经减压干燥分别得到含有目标化合物1的组分Fr14123,质量为102mg,含有目标化合物2的组分Fr14124,质量为78mg,含有目标化合物3和4的组分Fr14126,质量为95mg;其中,减压干燥的条件为:真空度150mbar,温度55℃;在线HPLC-DPPH色谱联用系统,第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-Pur C18 AQ(250×4.6mm,5μm)反相色谱柱,检测波长为210nm,流动相A为色谱纯水,流动相B为乙腈溶液,按照0-60min,55% B洗脱,流速为1.0mL/min;第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液,检测波长为517nm;DPPH溶液浓度为25μg/mL,流动相流速为0.8mL/min;反应环长度为18m;反相制备液相色谱纯化的工作参数为:色谱柱柱长250mm、直径20mm,反相制备柱固定相为5μm的ReproSil-Pur C18 AQ填料,流动相A为色谱纯水,流动相B为乙腈溶液,按照0-60min,55% B洗脱,进样体积为0.5mL,流速为19mL/min;
步骤9,Fr1423、Fr1424和Fr1426反相苯基柱液相色谱纯化:分别含有目标化合物1~4的组分Fr14123、Fr14124和Fr14126分别用体积分数为90%的甲醇-水溶液溶解,配制样品浓度为50.0mg/mL,均经0.45μm微孔滤膜过滤,得到滤液,即滤液F、G和H,使用在线HPLC-DPPH色谱联用系统对滤液F、G和H进行分析和活性峰筛选(如附图9、11和13所示),然后将分析条件进行线性放大,对滤液F、G和H进行反相液相制备色谱纯化,经检测波长为210nm的紫外检测器检测,收集滤液F、G和H制备色谱图中主要的色谱峰馏分(详见附图10、12和14),该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95%的自由基清除剂5-methoxy-[6]-gingerol,标记为1号,质量为7.55mg;6-shogaol,标记为2号,质量为5.33mg;6-paradol,标记为3号,质量为12.55mg;Diacetoxy-6-gingerdiol,标记为4号,质量为5.70mg;其中,化学结构式详见附图19;其中,减压干燥的条件为真空度150mbar,温度55℃;在线HPLC-DPPH色谱联用系统,第一台高效液相色谱仪采用Kromasil 100-5Phenyl(250×4.6mm,5μm)反相色谱柱,检测波长为210nm,流动相A为色谱纯水,流动相B为乙腈溶液,组分Fr14123分离的流动相为体积分数40%乙腈-水溶液,洗脱60分钟,组分Fr14124分离的流动相为体积分数42%乙腈-水溶液,洗脱60分钟,Fr14126分离的流动相为体积分数38%乙腈-水溶液,洗脱120分钟,流速均为1.0mL/min;第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液,检测波长为517nm;DPPH溶液浓度为25μg/mL,流动相流速为0.8mL/min;反应环长度为18m;反相制备液相色谱纯化的工作参数为:色谱柱柱长250mm、直径20mm,反相制备柱固定相为5μm的Kromasil 100-5Phenyl填料,组分Fr14123、组分Fr14124和组分Fr14126使用的流动相与在线HPLC-DPPH色谱联用系统中第一台高效液相色谱仪中流动相相同,进样体积均为0.5mL,流速为19mL/min。
实施例2
异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的活性验证:
分别在分离得到的异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂1~4中加入其质量5倍的色谱甲醇进行溶解,配制样品浓度为0.1mg/mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,得到异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂样品溶液,取1mL样品,利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统验证异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂1~4的活性(如附图15-18所示)。
其中,在线HPLC-DPPH色谱联用系统,第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-PurC18 AQ(250×4.6mm,5μm)反相色谱柱,第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为色谱纯水,流动相B为乙腈溶液,48%乙腈等度洗脱60分钟,流动相流速为1.0mL/min,检测波长为210nm;第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液,DPPH溶液浓度为25μg/mL,流动相流速为0.8mL/min;反应环长度为18m,检测波长为517nm。
从异叶青兰中得到的姜辣素类天然自由基清除剂为5-methoxy-[6]-gingerol(化合物1),6-shogaol(化合物2),6-paradol(化合物3),Diacetoxy-6-gingerdiol(化合物4)结构表征见附图24-35。
实施例3
异叶青兰中得到的姜辣素类天然自由基清除剂的抗氧化活性试验:
DPPH溶液的配制:称取2.5mg DPPH试剂,加100.0mL乙醇溶解,配成浓度为25μg/mL的溶液,并在0-4℃下避光保存。
样品溶液的配制:将分离出的姜辣素类天然自由基清除剂1~4用乙醇配制成1.0mg/mL的母液,然后制备成不同浓度的溶液(0.1,1,10,50,100,500μg/mL)。
在96孔板中加入30μL样品溶液和70μL DPPH溶液。所有测量需做3个平行。然后将混合溶液在黑暗中孵育30分钟。测定混合物在517nm处的紫外吸光度,记为A。每个样品重复3次。DPPH自由基的清除率按下式计算(计算时质量浓度根据分子质量转换为摩尔浓度)。
其中A0为空白组(乙醇)的吸光度,A1为对照组的吸光度,A为样品(姜辣素类自由基清除剂1~4样品溶液30μL和DPPH溶液70μL)的吸光度。
以DPPH自由基的清除率方法检测抗氧化活性,如附图20-23所示,结果显示姜辣素类自由基清除剂1~4的DPPH清除率的IC50值分别为:55.77±2.98μM、67.69±7.95μM、57.86±4.16μM和7.76±1.67μM。表明姜辣素类化合物具有很好的抗氧化作用,可作为天然抗氧化剂。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺,其特征在于,具体包括如下步骤:
步骤1,提取:将异叶青兰全草阴干,粗碎后按料液比1g:5~100mL的甲醇提取,在室温下提取2~4次,每次8~12h,过滤、合并滤液,即滤液A,该滤液A按硅胶的量:异叶青兰药材的量=1:1~5拌样并减压干燥,即得异叶青兰提取物拌样样品;
步骤2,硅胶柱前处理:异叶青兰提取物拌样样品,该样品经装有硅胶的中压色谱柱分离,经检测波长为210nm的紫外检测器检测,收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分,该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr1;其中,所述硅胶柱分离的工作参数为色谱柱柱长460mm、直径15-49mm,固定相为硅胶,流动相A为甲醇,B为二氯甲烷,色谱条件为0-30min,0%B,30-60min,0-100%B,60-90min,100%B,进样量为20-130g,流速为10-57mL/min;
步骤3,微孔树脂柱富集:Fr1用加入其质量5~10倍的甲醇溶解得到滤液B,滤液B按硅胶的量:样品的量=1:1~1.5拌样并干燥,即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr1拌样样品,该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离,经检测波长为210nm的紫外检测器检测,收集制备色谱图中第四个主要的色谱峰馏分,该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr14;其中,微孔树脂柱分离的工作参数为:色谱柱柱长460mm、直径15-49mm,微孔树脂柱固定相为CHP20P,流动相A为水,B为甲醇,色谱条件为0-150min,20-100%B,150-210min,100%B,进样量为10-55g,流速为10-57mL/min;HPLC分析条件为:ReproSil-PurC18AQ 250×4.6mm,5μm色谱柱,检测波长为210nm,流动相A为色谱纯水,流动相B为乙腈溶液,按照0-60min,40-75%B,流动相流速为1.0mL/min;
步骤4,在线自由基清除剂组分筛选:在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr14中加入其质量5~10倍的体积浓度为70~90%的甲醇进行溶解,配制样品浓度为50.0~100.0mg/mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,得到异叶青兰Fr14甲醇样品溶液,即滤液C,取1mL滤液C,利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标成分的组分中自由基清除剂;其中,所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统,第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-Pur C18 AQ 250×4.6mm,5μm色谱柱,检测波长为210nm;第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液,检测波长为517nm;
步骤5,Diol二醇基柱富集:滤液C按硅胶的量:样品的量=1:1~1.5拌样并干燥,即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr14拌样样品,该样品经Diol二醇基中压色谱柱分离,经检测波长为280nm的紫外检测器检测,收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分,该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr141;其中,Diol二醇基柱分离的工作参数为:色谱柱柱长500mm、直径50mm,固定相为Diol,流动相A为正己烷,B为乙酸乙酯,色谱条件为0-90min,0-100%B,检测波长为280nm,进样量为10-60g,流速为57mL/min;
步骤6,在线自由基清除剂组分再筛选:在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr141中加入其质量5~10倍的体积浓度为70~90%的甲醇进行溶解,配制样品浓度为50.0~100.0mg/mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,得到异叶青兰Fr141样品溶液,即滤液D,取1mL滤液D,利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标组分中自由基清除剂色谱峰1-3;其中,所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统,第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-Pur C18AQ250×4.6mm,5μm反相色谱柱,检测波长为210nm;第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液,检测波长为517nm;
步骤7,Spherical C18色谱柱制备:滤液D按硅胶的量:样品的量=1:1~1.5拌样并干燥,即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr141拌样样品,该样品经Spherical C18中压色谱柱分离,经检测波长为210nm的紫外检测器检测,收集制备色谱图中第二个主要的色谱峰馏分,该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr1412;其中,Spherical C18色谱柱制备的工作参数为:色谱柱柱长500mm、直径50mm,固定相为Spherical C18,流动相A为水,B为乙醇,色谱条件为0-90min,55-75%B,检测波长为210nm,进样量为10g,流速为57mL/min;
步骤8,反相制备柱分离:在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr1412中加入其质量5~10倍的体积浓度为70~100%的甲醇进行溶解,配制样品浓度为50.0~100.0mg/mL,经0.45μm微孔滤膜过滤,得到异叶青兰Fr1412样品溶液,即滤液E,取1mL滤液E,使用在线HPLC-DPPH色谱联用系统对滤液E进行分析和活性峰筛选,然后将分析条件进行线性放大,对滤液E进行反相制备色谱柱分离,经检测波长为210nm的紫外检测器检测,收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr14123、Fr14124和Fr14126,经减压干燥分别得到含有目标化合物1的组分Fr14123,含有目标化合物2的组分Fr14124和含有目标化合物3和4的组分Fr14126;
步骤9,Fr1423、Fr1424和Fr1426反相苯基柱液相色谱纯化:分别含有目标化合物1~4的组分Fr14123、Fr14124和Fr14126分别用体积分数为70~100%的甲醇-水溶液溶解,配制样品浓度为20.0~50.0mg/mL,均经0.45μm微孔滤膜过滤,得到滤液,即滤液F、G和H,使用在线HPLC-DPPH色谱联用系统对滤液F、G和H进行分析和活性峰筛选,然后将分析条件进行线性放大,对滤液F、G和H进行反相液相制备色谱纯化,经检测波长为210nm的紫外检测器检测,收集滤液F、G和H制备色谱图中主要的色谱峰馏分,该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95%的自由基清除剂5-methoxy-[6]-gingerol,标记为1号;6-shogaol,标记为2号;6-paradol,标记为3号;Diacetoxy-6-gingerdiol,标记为4号;其中,化学结构式分别为:
2.根据权利要求1所述的异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺,其特征在于,所述步骤1、步骤2、步骤3、步骤5、步骤7、步骤8和步骤9中,减压干燥的条件均为:真空度100~300mbar,温度45~65℃。
3.根据权利要求1所述的异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺,所述步骤4和6中,第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为色谱纯水,流动相B为乙腈溶液,按照0-60min,40-75%B,流动相流速为1.0mL/min;第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液浓度为25μg/mL,流动相流速为0.8mL/min;反应环长度为18m。
4.根据权利要求1所述的异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺,所述步骤8中,在线HPLC-DPPH色谱联用系统,第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-Pur C18 AQ250×4.6mm,5μm反相色谱柱,检测波长为210nm,流动相A为色谱纯水,流动相B为乙腈溶液,按照0-60min,55%B洗脱,流速为1.0mL/min;第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液,检测波长为517nm;DPPH溶液浓度为25μg/mL,流动相流速为0.8mL/min;反应环长度为18m;反相制备液相色谱纯化的工作参数为:色谱柱柱长250mm、直径20mm,反相制备柱固定相为5μm的ReproSil-Pur C18 AQ填料,流动相A为色谱纯水,流动相B为乙腈溶液,按照0-60min,55%B洗脱,进样体积为0.5mL,流速为19mL/min。
5.根据权利要求1所述的异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺,所述步骤9中,在线HPLC-DPPH色谱联用系统,第一台高效液相色谱仪采用Kromasil 100-5Phenyl250×4.6mm,5μm反相色谱柱,检测波长为210nm,流动相A为色谱纯水,流动相B为乙腈溶液,组分Fr14123分离的流动相为体积分数40%乙腈-水溶液,洗脱60min,组分Fr14124分离的流动相为体积分数42%乙腈-水溶液,洗脱60min,Fr14126分离的流动相为体积分数38%乙腈-水溶液,洗脱120min,流速均为1.0mL/min;第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液,检测波长为517nm;DPPH溶液浓度为25μg/mL,流动相流速为0.8mL/min;反应环长度为18m;反相制备液相色谱纯化的工作参数为:色谱柱柱长250mm、直径20mm,反相制备柱固定相为5μm的Kromasil 100-5Phenyl填料,组分Fr14123、组分Fr14124和组分Fr14126使用的流动相与在线HPLC-DPPH色谱联用系统中第一台高效液相色谱仪中流动相相同,进样体积均为0.5mL,流速为19mL/min。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210656943.4A CN115073277B (zh) | 2022-06-10 | 2022-06-10 | 异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210656943.4A CN115073277B (zh) | 2022-06-10 | 2022-06-10 | 异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115073277A CN115073277A (zh) | 2022-09-20 |
CN115073277B true CN115073277B (zh) | 2024-05-03 |
Family
ID=83252309
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210656943.4A Active CN115073277B (zh) | 2022-06-10 | 2022-06-10 | 异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115073277B (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104997840A (zh) * | 2015-07-15 | 2015-10-28 | 中国科学院西北高原生物研究所 | 一种异叶青兰五环三萜类组分的样品前处理方法及其应用 |
US20180271804A1 (en) * | 2017-03-23 | 2018-09-27 | North Carolina Agricultural And Technical State University | 6-shogaol derivatives and activities thereof |
-
2022
- 2022-06-10 CN CN202210656943.4A patent/CN115073277B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104997840A (zh) * | 2015-07-15 | 2015-10-28 | 中国科学院西北高原生物研究所 | 一种异叶青兰五环三萜类组分的样品前处理方法及其应用 |
US20180271804A1 (en) * | 2017-03-23 | 2018-09-27 | North Carolina Agricultural And Technical State University | 6-shogaol derivatives and activities thereof |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Antioxidant properties of gingerol relatedcompounds from ginger;Yuki Masuda et al.;BioFactors;20081206;第21卷(第1-4期);293-296 * |
Magda M Fathy et al..The role of Zingiber officinale in the treatment of Alzheimer's disease: in-vitro and in-vivo evidences.Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences.2015,第6卷(第5期),735-749. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN115073277A (zh) | 2022-09-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111187159B (zh) | 唐古特虎耳草中天然自由基清除剂的分离工艺及其应用 | |
CN111171042B (zh) | 黑虎耳草中天然自由基清除剂的分离制备工艺及其应用 | |
CN107011308A (zh) | 从瓯柑果实中分离纯化多甲氧基黄酮类化合物的方法 | |
CN109851480A (zh) | 一种采用动态轴向压缩柱制备高纯度大麻二酚的方法 | |
CN113817004A (zh) | 一种提取分离乌药叶中黄酮类成分的方法 | |
CN103450145A (zh) | 一种利用高速逆流色谱从苏木中分离制备巴西木素和原苏木素b的方法 | |
CN115073277B (zh) | 异叶青兰中姜辣素类天然自由基清除剂的分离工艺及其应用 | |
CN106496292A (zh) | 一种从栀子中同时制备6个环烯醚萜苷类成分的方法 | |
CN114988979B (zh) | 一种宏量分离制备高纯度番茄红素的方法 | |
CN113105317B (zh) | 山地虎耳草中二芳基壬烷类ⅱ自由基抑制剂及其分离制备工艺和应用 | |
CN113087607B (zh) | 山地虎耳草中新的二芳基壬烷类ⅰ自由基抑制剂及其分离制备工艺和应用 | |
CN114989152B (zh) | 铁皮石斛叶中分离制备两种芹菜素糖苷的方法 | |
CN114414702B (zh) | 一种诃子肉中诃黎勒酸制备方法及其含量测定方法 | |
CN107721857A (zh) | 一种从平卧菊三七中制备高纯度绿原酸的方法 | |
CN111440184A (zh) | 一种制备高纯度鼠尾草酚的方法 | |
CN114634536B (zh) | 异叶青兰中酚类天然自由基清除剂的分离工艺及其应用 | |
CN109142571B (zh) | 一种测定蒽醌类成分含量的方法 | |
CN108341845B (zh) | 山茱萸提取物制备莫诺苷的方法 | |
CN108084241B (zh) | 从羊栖菜中分离制备岩藻甾醇的方法 | |
CN113698442B (zh) | 一种瞿麦中tunicoside B的分离制备方法 | |
CN111187274B (zh) | 一种黑虎耳草中岩白菜素化学对照品的分离制备方法 | |
CN113087749B (zh) | 唐古特虎耳草中一种新的杜鹃素糖苷类自由基抑制剂及其分离制备工艺和应用 | |
CN113087606B (zh) | 唐古特虎耳草中新的二芳基壬烷类ⅳ和ⅲ自由基抑制剂及其分离制备工艺和应用 | |
CN115385927A (zh) | 异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的分离工艺和应用 | |
CN113087608B (zh) | 唐古特虎耳草中新的二芳基壬烷类ⅴ,ⅵ和ⅶ自由基抑制剂及其分离制备工艺和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |