CN115385927A - 异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的分离工艺和应用 - Google Patents

异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的分离工艺和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的分离工艺及其应用。具体制备工艺：提取、硅胶柱前处理、微孔树脂柱富集、在线自由基清除剂组分筛选、Diol二醇基柱富集、在线自由基清除剂组分再筛选、反相制备柱制备及反相制备液相色谱纯化。制得的异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂作为有效成分按药学上或者食品科学上可接受的任何载体制成各类药用制剂或者保健类食品。制备工艺中的提取溶剂、硅胶柱、微孔树脂柱、Diol二醇基柱、反相色谱柱所使用的溶剂及分离材料均可回收利用；原料成本低，甲醇室温冷浸提取，硅胶和微孔树脂分离材料可装于中压柱层析系统中，实现规模化操作；高压色谱分离纯化可以保证产品的纯度大于95％。

Description

异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的分离工艺和 应用
技术领域
本发明涉及异叶青兰中天然自由基清除剂分离技术领域，具体涉及异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的分离工艺和应用。
背景技术
异叶青兰(Dracocephalum heterophyllum Benth)系唇形科 (Labiatae)青兰属(Dracocephalum)植物，藏药名：“吉孜青保”，又名白花夏枯草，分布于辽宁、内蒙古、河北、山西、甘肃、西藏及青海等地，资源非常丰富。《晶珠本草》中记载异叶青兰治口腔病、牙齿病，清肝热。现代研究证明异叶青兰中的化学成分主要包括苯丙素类、黄酮类、萜类、多糖和木脂素类。文献报道，呋喃香豆素类化合物具有良好的清除自由基活性。为了进一步加快异叶青兰的质量评价和相关新药的研发步伐，有必要从中挖掘更多的活性成分。
目前，有关异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的分离制备工艺及其应用并未见文献报道，已有的研究也未做到系统化的研究。因此，亟需建立一种工艺简单、规模化从异叶青兰中分离制备呋喃香豆素类天然自由基清除剂的方法。
发明内容
基于上述技术问题，本发明的目的是提供异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的分离工艺和应用。
本发明保护异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的分离工艺，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：将异叶青兰全草阴干，粗碎后按料液比1g：5～100 mL的甲醇提取，在室温下提取2～4次，每次8～12h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按硅胶的量：异叶青兰药材的量＝1:1～5拌样并减压干燥，即得异叶青兰提取物拌样样品；
步骤2，硅胶柱前处理：异叶青兰提取物拌样样品，该样品经装有硅胶的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr1；其中，所述硅胶柱分离的工作参数为色谱柱柱长460mm、直径15-49mm，固定相为硅胶，流动相A 为甲醇，B为二氯甲烷，色谱条件为0-30min，0％B，30-60min， 0-100％B，60-90min，100％B，进样量为20-130g，流速为10-57 mL/min；
步骤3，微孔树脂柱富集：Fr1用加入其质量5～10倍的甲醇溶解得到滤液B，滤液B按硅胶的量：样品的量＝1:1～1.5拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr1拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第四个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr14；之后取Fr1及Fr11-15样品适量加入甲醇配成50～100mg/mL的甲醇溶液在高效液相色谱仪上进行分析；其中，微孔树脂柱分离的工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径15-49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为甲醇，色谱条件为0-150min，20-100％B，150-210min，100％B，进样量为10-55g，流速为10-57mL/min；HPLC分析条件为：ReproSil-Pur C18 AQ(250×4.6mm，5μm)色谱柱，检测波长为210 nm，流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min， 40-75％B，流动相流速为1.0mL/min；
步骤4，在线自由基清除剂组分筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr14中加入其质量5～10倍的体积浓度为70～90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr14甲醇样品溶液，即滤液C，取1mL滤液C，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标成分的组分中自由基清除剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-PurC18 AQ(250×4.6mm，5 μm)色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；
步骤5，Diol二醇基柱富集：滤液C按硅胶的量：样品的量＝1:1～1.5 拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr14拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离，经检测波长为280nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr142；其中，Diol二醇基柱分离的工作参数为：色谱柱柱长500mm、直径50mm，固定相为Diol，流动相A为正己烷，B为乙酸乙酯，色谱条件为0-90min， 0-100％B，检测波长为280nm，进样量为60g，流速为57mL/min；
步骤6，在线自由基清除剂组分再筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr142中加入其质量5～10倍的体积浓度为70～90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr142样品溶液，即滤液D，取1mL滤液D，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标组分中自由基清除剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-Pur C18 AQ(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；
步骤7，反相制备色谱柱制备：所述滤液D经反相制备色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr1423、Fr1424和Fr1425，经减压干燥分别得到含有目标化合物1的组分Fr1423，含有目标化合物2和3的组分Fr1424和含有目标化合物4的组分Fr1425；其中，反相制备柱制备的工作参数为：ReproSil-PurC18 AQ反相制备柱柱长250mm、直径20mm，固定相为5μm，流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照 0-60min，40-75％B洗脱，进样体积为0.5mL，流速为19mL/min；
步骤8，Fr1423、Fr1424和Fr1425反相制备液相色谱纯化：分别含有目标化合物1-4的组分Fr1423、Fr1424和Fr1425分别用体积分数为70～100％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为20.0～50.0 mg/mL，均经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液E、F和G，使用在线HPLC-DPPH色谱联用系统对滤液E、F和G进行分析和活性峰筛选，然后将分析条件进行线性放大，对滤液E、F和G进行反相液相制备色谱纯化，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液E、F和G制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95％的自由基清除剂isodemethylfuropinarine，标记为1号；demethylfuropinarine，标记为2号；alloimperatorin，标记为3号；alloisoimperatorin，标记为4号；其中，化学结构式分别为：
Figure RE-GDA0003832380940000051
进一步的，所述步骤1、步骤2、步骤3、步骤5、步骤7和步骤 8中，减压干燥的条件均为：真空度100～300mbar，温度45～65℃。
进一步的，所述步骤4和6中，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，40-75％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.8mL/min；反应环长度为18m。
进一步的，所述步骤8中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用7-X10(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm，流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液或乙醇溶液，组分Fr1423分离的流动相为体积分数15％乙腈-水溶液，组分Fr1424分离的流动相为体积分数35％乙醇-水溶液，Fr1425 分离的流动相为体积分数30％乙腈-水溶液，流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm； DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.8mL/min；反应环长度为18m；反相制备液相色谱纯化的工作参数为：色谱柱柱长250mm、直径20mm，反相制备柱固定相为5μm的7-X10填料，组分Fr1423、组分Fr1424和组分Fr1425使用的流动相与在线HPLC-DPPH色谱联用系统中第一台高效液相色谱仪中流动相相同，进样体积均为1.0 mL，流速为19mL/min。
本发明还保护上述异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的应用，其中，该异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂在制备自由基清除药物或保健食品中应用，具体作为有效成分按药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或作为有效成分按食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
相比于现有的技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明成本低廉、产品纯度高
使用的提取溶剂，硅胶柱、微孔树脂柱、Diol二醇基柱、反相色谱柱分离和纯化所使用的溶剂均可以回收利用；使用的色谱分离材料 (反相制备液相色谱分离材料)均可以重复利用，回收利用的溶剂和重复利用的分离材料保证了分离过程中平均成本比较低廉，高压色谱分离可以保证产品的纯度大于95％。
(2)本发明的制备方法可实现规模化生产需要
原料要求不高、成本低廉，一般野生的或市场上销售的异叶青兰即可，易于批量备料；甲醇室温冷浸提取，易于操作，同时对环境友好；分离采用硅胶柱前处理，微孔树脂柱和Diol二醇基柱富集，硅胶和微孔树脂分离材料可以装于中压柱层析系统中，易于规模化；分离纯化中使用的反相制备液相色谱，为快速的等度方法，非常适宜大规模生产。
附图说明
图1为硅胶柱前处理色谱图；
图2为Fr1组分微孔树脂富集色谱图；
图3为Fr1组分及Fr11-15的HPLC分析图；
图4为在线自由基清除剂Fr14组分筛选色谱图；
图5为Diol二醇基色谱柱富集色谱图；
图6为在线自由基清除剂Fr142组分再筛选色谱图；
图7为组分Fr142分析色谱图；
图8为组分Fr142反相制备柱ReproSil-Pur C18 AQ制备色谱图；
图9为组分Fr142和Fr1423，Fr1424，Fr1425的HPLC分析图；
图10为组分Fr1423的7-X10反相柱的分析和活性色谱图；
图11为组分Fr1424的7-X10反相柱的分析和活性色谱图；
图12为组分Fr1425的7-X10反相柱的分析和活性色谱图；
图13为组分Fr1423的7-X10反相柱制备液相色谱纯化色谱图；
图14为组分Fr1424的7-X10反相柱制备液相色谱纯化色谱图；
图15为组分Fr1425的7-X10反相柱制备液相色谱纯化色谱图；
图16为天然自由基清除剂1(Fr14233)在线活性验证图谱；
图17为天然自由基清除剂2(Fr14241)在线活性验证图谱；
图18为天然自由基清除剂3(Fr14242)在线活性验证图谱；
图19为天然自由基清除剂4(Fr14251)在线活性验证图谱；
图20为本发明天然自由基清除剂1-4化学结构式；
图21为天然自由基清除剂1(Fr14233)的DPPH自由基清除率实验IC50值拟合曲线图；
图22为天然自由基清除剂2(Fr14241)的DPPH自由基清除率实验IC50值拟合曲线图；
图23为天然自由基清除剂3(Fr14242)的DPPH自由基清除率实验IC50值拟合曲线图；
图24为天然自由基清除剂4(Fr14251)的DPPH自由基清除率实验IC50值拟合曲线图；
图25为异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂1(Fr14233) 体外分子对接Nrf2蛋白预测氧化损伤通路模型；
图26为异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂2(Fr14241) 体外分子对接Nrf2蛋白预测氧化损伤通路模型；
图27为异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂3(Fr14242) 体外分子对接Nrf2蛋白预测氧化损伤通路模型；
图28为异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂4(Fr14251) 体外分子对接Nrf2蛋白预测氧化损伤通路模型；
图29为本发明异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂1-4 体外保护H2O2氧化损伤实验；
图30为异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂1(isodemethylfuropinarine)的低分辨质谱图；
图31为本发明异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂1(isodemethylfuropinarine)1H NMR核磁；
图32为本发明异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂1(isodemethylfuropinarine)13C NMR核磁图；
图33为本发明异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂1(isodemethylfuropinarine)HMBC图谱；
图34为本发明异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂2(demethylfuropinarine)的低分辨质谱图；
图35为本发明异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂2(demethylfuropinarine)1H NMR核磁图；
图36为本发明异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂2(demethylfuropinarine)13C NMR核磁图；
图37为本发明异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂2(demethylfuropinarine)HMBC图谱；
图38为本发明异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂3 (alloimperatorin)的低分辨质谱图；
图39为本发明异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂3 (alloimperatorin)1H NMR核磁图；
图40为本发明异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂3 (alloimperatorin)13C NMR核磁图；
图41为本发明异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂3 (alloimperatorin)HMBC图谱；
图42为本发明异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂4(alloisoimperatorin)的低分辨质谱图；
图43为本发明异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂4(alloisoimperatorin)1H NMR核磁图；
图44为本发明异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂4(alloisoimperatorin)13C NMR核磁图；
图45为本发明异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂4(alloisoimperatorin)HMBC图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的分离工艺，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：将10.0kg异叶青兰全草阴干，粗碎后按料液比 1g：8mL的甲醇提取，在室温下提取3次，每次12h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按硅胶的量：异叶青兰药材的量＝1:1.15 拌样并减压干燥，即得异叶青兰提取物拌样样品2.8kg；其中，减压干燥的条件均为：真空度100mbar，温度45℃；
步骤2，硅胶柱前处理：异叶青兰提取物拌样样品，该样品经装有硅胶的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分(如附图1所示)，该馏分经减压干燥即得205.5g异叶青兰含有目标成分的组分Fr1；其中，减压干燥的条件均为：真空度100mbar，温度45℃；硅胶柱分离的工作参数为色谱柱柱长460mm、直径49mm，固定相为硅胶，流动相A为甲醇，B为二氯甲烷，色谱条件为0-30min，0％B，30-60min， 0-100％B，60-90min，100％B，进样量为65g，流速为57mL/min；其中，减压干燥的条件均为：真空度100mbar，温度45℃；
步骤3，微孔树脂柱富集：Fr1用加入其质量5倍的甲醇溶解得到滤液B，滤液B按硅胶的量：样品的量＝1:1.14拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr1拌样样品439.53g，该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第四个主要的色谱峰馏分(如附图2所示)，该馏分经减压干燥即得44.2g异叶青兰含有目标成分的组分Fr14；之后取Fr1及Fr11-15样品适量加入甲醇配成50mg/mL的甲醇溶液在高效液相色谱仪上进行分析(如附图3所示)；其中，微孔树脂柱分离的工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为甲醇，色谱条件为0-150min， 20-100％B，150-210min，100％B，进样量为50g，流速为57mL/min；其中，减压干燥的条件均为：真空度100mbar，温度45℃；HPLC分析条件为：ReproSil-Pur C18 AQ，250×4.6mm，5μm色谱柱，检测波长为210nm，流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照 0-60min，40-75％B，流动相流速为1.0mL/min；
步骤4，在线自由基清除剂组分筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr14中加入其质量10倍的体积浓度为90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr14甲醇样品溶液，即滤液C，取1mL滤液C，利用在线 HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标成分的组分中自由基清除剂(如附图4所示)；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-Pur C18 AQ(250×4.6 mm，5μm)色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min， 40-75％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.8mL/min；反应环长度为18m；
步骤5，Diol二醇基柱富集：滤液C按硅胶的量：样品的量＝1:1.5 拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr14拌样样品74g，该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离，经检测波长为280nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二个主要的色谱峰馏分(如附图5所示)，该馏分经减压干燥即得4.4g异叶青兰含有目标成分的组分Fr142；其中，减压干燥的条件均为：真空度100mbar，温度45℃； Diol二醇基柱分离的工作参数为：色谱柱柱长500mm、直径50mm，固定相为Diol，流动相A为正己烷，B为乙酸乙酯，色谱条件为0-90min，0-100％B，检测波长为280nm，进样量为60g，流速为57 mL/min；
步骤6，在线自由基清除剂组分再筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr142中加入其质量10倍的体积浓度为90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr142样品溶液，即滤液D，取1mL滤液D，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标组分中自由基清除剂色谱峰1-3(如附图6所示)；其中，所述在线HPLC-DPPH 色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-Pur C18 AQ(250 ×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，40-75％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.8 mL/min；反应环长度为18m；
步骤7，反相制备色谱柱制备：1mL滤液D使用HPLC与步骤6中第一台HPLC相同的条件进行分析，如附图7所示，色谱条件线性放大将剩余滤液D经反相制备色谱柱分离，经检测波长为210nm 的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr1423、 Fr1424和Fr1425，经减压干燥分别得到含有目标化合物1(峰1)的组分Fr1423(209mg)，含有目标化合物2和3(峰2)的组分Fr1424 (286mg)和含有目标化合物4(峰3)的组分Fr1425(85mg)(如附图8所示)，制备得到的组分Fr1423、Fr1424和Fr1425与Fr142 使用相同条件进行HPLC再分析对比，如附图9所示，确定三个组分为含有目标化合物的组分；其中，反相制备柱制备的工作参数为： ReproSil-Pur C18 AQ反相制备柱柱长250mm、直径20mm，固定相为5μm，流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min， 40-75％B洗脱，进样体积为0.5mL，流速为19mL/min；减压干燥的条件均为：真空度100mbar，温度45℃；
步骤8，Fr1423、Fr1424和Fr1425反相制备液相色谱纯化：分别含有目标化合物1-4的组分Fr1423、Fr1424和Fr1425分别用体积分数为80％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为50.0mg/mL，均经 0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液E、F和G，使用在线 HPLC-DPPH色谱联用系统对滤液E、F和G进行分析和活性峰筛选，如附图10-12所示，然后将分析条件进行线性放大，对滤液E、F和 G进行反相液相制备色谱纯化，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液E、F和G制备色谱图中主要的色谱峰馏分(如附图 13-15所示)，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95％的自由基清除剂isodemethylfuropinarine，标记为1号，质量为5.90mg； demethylfuropinarine，标记为2号，质量为2.27mg；alloimperatorin，标记为3号，质量为9.03mg；alloisoimperatorin，标记为4号，质量为2.49mg，化学结构式详见附图20；其中，减压干燥的条件为：真空度100mbar，温度45℃；在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用7-X10(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm，流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液或乙醇溶液，组分Fr1423分离的流动相为体积分数15％乙腈-水溶液，组分Fr1424分离的流动相为体积分数35％乙醇-水溶液，Fr1425分离的流动相为体积分数30％乙腈-水溶液，流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm； DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.8mL/min；反应环长度为18m；反相制备液相色谱纯化的工作参数为：色谱柱柱长250mm、直径20mm，反相制备柱固定相为5μm的7-X10填料，组分Fr1423、组分Fr1424和组分Fr1425使用的流动相与在线HPLC-DPPH色谱联用系统中第一台高效液相色谱仪中流动相相同，进样体积均为1.0mL，流速为19mL/min。
上述异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂在制备自由基清除药物或保健食品中应用，具体作为有效成分按药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或作为有效成分按食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
实施例2
异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的活性验证：
分别在分离得到的异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂 1～4中加入其质量4倍的色谱甲醇进行溶解，配制样品浓度为0.2 mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂样品溶液，取1mL样品，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统验证异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂1～4的活性(如附图16-19所示)。
其中，在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用两性离子柱Reprosil C18(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，40-60％B，流动相流速为1.0mL/min，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，DPPH 溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.8mL/min；反应环长度为18m，检测波长为517nm。
从异叶青兰中得到的呋喃香豆素类天然自由基清除剂isodemethylfuropinarine(化合物1)，demethylfuropinarine(化合物2)，alloimperatorin(化合物3)，alloisoimperatorin(化合物4)结构表征见附图30-45。
实施例3
异叶青兰中得到的呋喃香豆素类天然自由基清除剂的抗氧化活性试验：
DPPH溶液的配制：将2.5mg DPPH溶解在100.0mL乙醇(25 μg/mL)中，并在0-4℃下避光保存。
样品溶液的配制：将分离的抗氧化呋喃香豆素天然自由基清除剂 1-4用乙醇配制成1.0mg/mL的母液，然后制备成不同浓度的溶液 (0.1,1,10,50,100,500μg/mL)。
在96孔板中加入30μL每种测试抗氧化呋喃香豆素溶液和70μL DPPH溶液。所有测量需做3个平行。然后将混合溶液在黑暗中孵育 30分钟。测定混合物在517nm处的紫外吸光度，记为A。每个样品重复3次。DPPH自由基的清除率按下式计算。
Figure RE-GDA0003832380940000171
其中A0为空白组(乙醇)的吸光度，A1为对照组的吸光度，A 为样品(各呋喃香豆素溶液30μL和DPPH溶液70μL)的吸光度。
以DPPH自由基的清除率方法检测抗氧化活性，如附图21-24所示，结果显示四个呋喃香豆素类化合物的DPPH清除率的IC50值分别为：284.33±63.14μM、228.81±42.91μM、115.36±4.14μM和 130.62±24.98μM。表明呋喃香豆素类化合物具有很好的抗氧化作用，可作为天然抗氧化剂。
实施例4
分子对接评估预测异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的抗氧化活性潜在通路靶标：
使用AutoDock用于评估分离得到的化合物1-4(Fr14233、 Fr14241、Fr14242和Fr14251)与Nrf2受体之间的潜在相互作用。 Nrf2的晶体结构(PDB ID：4IQK)从RCSB蛋白质数据库(https://www.rcsb.org/)下载得到。在对接之前把受体中水分子和离子去除，然后添加极性氢原子和科尔曼电荷。AutoGrid程序用于设置网格框。使用拉马克遗传算法4.2进行分子对接最优化计算，得到 100个多肽与小分子构象的值，其中构象表现出最小结合能的模型使用Discovery Studio 2020对结果进行可视化和分析。
对接结果为四个化合物和Nrf2的结合能值分别为-7.19 Kcal/mol、-7.25Kcal/mol、-7.46Kcal/mol和-7.49Kcal/mol。每个结合位姿和对接位姿的2D结构图如附图25-28所示。化合物4(Fr14251) 与结合袋残基具有最佳结合效果，结合能值为四个化合物中的最低值。它位于被Val512、Val606、Gly367、Arg415、Ala556和Val463 氨基酸残基包围的口袋中(附图28)。Val512、Val606和Gly367与 Fr14251形成常规的氢键相互作用。Arg415和Ala556是氨基酸残基烷基相互作用。只有Val463氨基酸残基通过碳氢键相互作用。Fr14242位于被这些氨基酸残基包围的口袋中(附图27)。这些氨基酸(Val465、 Val418、Gly464、Ala36和Val512)通过五种力(常规氢键、碳氢键、π-σ、烷基和π-烷基)与Fr14242结合，如附图27所示。Fr14233位于被多个氨基酸(Val606、Gly367和Val512)包围的口袋中(附图 25)。如附图26所示，Fr14242周围的氨基酸在Fr14233的基础上增加了两个氨基酸残基(Ala556和Gly462)，它们通过碳氢键和烷基相互作用。四种呋喃香豆素的最低预测结合能从理论水平初步验证了 Fr14233、Fr14241、Fr14242和Fr14251在Nrf2中的抗氧化作用，初步预测Nrf2通路可能是抗氧化活性发挥作用的潜在信号通路。
实施例5
异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的体外活性验证：
实验方法：体外培养L02细胞株，定期换液、传代，将对数生长期细胞用胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25％胰蛋白酶，0.02％EDTA)分离消化成单细胞悬液，让细胞贴壁12小时后用20μM的天然自由基清除剂1-4替换细胞培养基20小时。将细胞接种在96孔板(0.5×104个细胞/孔)中，并暴露于100μL H2O2(1mM)中4小时(100μL 培养基用于对照)，通过SRB测定确定细胞活力；将细胞在24孔板 (5×104个细胞/孔)中培养并暴露于H2O2(1mM)中4小时，收集并裂解细胞，按照南京建成生物工程研究所生产商说明书进行检测丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性；将细胞在6孔板(2×105个细胞/孔)中培养并暴露于H2O2(1mM)中3小时，收集并裂解细胞，进行蛋白质印迹以分析Nrf2的表达。
实验结果：对从异叶青兰甲醇提取物分离得到的呋喃香豆素素类天然自由基清除剂1-4进行抑制L02细胞MDA、SOD和Nrf2表达的影响。化合物1-4对细胞无毒性，且能一定程度的提高细胞活力，增加细胞密度，使受损伤的细胞形态有所恢复，如附图29A和29B所示。化合物1-4对细胞进行预处理后，可以看出细胞内MDA的含量减少(附图29C)，SOD水平增加(附图29D)，提高Nrf2水平的表达(附图29E)。化合物1在细胞实验中无显著性差异，但是从图中可以看出化合物1对氧化应激损伤仍有一定的保护效果。这些数据表明Nrf2信号传导可能参与化合物1-4对H2O2诱导的氧化应激的保护作用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的分离工艺，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：将异叶青兰全草阴干，粗碎后按料液比1g：5～100mL的甲醇提取，在室温下提取2～4次，每次8～12h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按硅胶的量：异叶青兰药材的量＝1:1～5拌样并减压干燥，即得异叶青兰提取物拌样样品；
步骤2，硅胶柱前处理：异叶青兰提取物拌样样品，该样品经装有硅胶的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第一个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr1；其中，所述硅胶柱分离的工作参数为色谱柱柱长460mm、直径15-49mm，固定相为硅胶，流动相A为甲醇，B为二氯甲烷，色谱条件为0-30min，0％B，30-60min，0-100％B，60-90min，100％B，进样量为20-130g，流速为10-57mL/min；
步骤3，微孔树脂柱富集：Fr1用加入其质量5～10倍的甲醇溶解得到滤液B，滤液B按硅胶的量：样品的量＝1:1～1.5拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr1拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第四个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr14；之后取Fr1及Fr11-15样品适量加入甲醇配成50～100mg/mL的甲醇溶液在高效液相色谱仪上进行分析；其中，微孔树脂柱分离的工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径15-49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为甲醇，色谱条件为0-150min，20-100％B，150-210min，100％B，进样量为10-55g，流速为10-57mL/min；HPLC分析条件为：ReproSil-Pur C18 AQ(250×4.6mm，5μm)色谱柱，检测波长为210nm，流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，40-75％B，流动相流速为1.0mL/min；
步骤4，在线自由基清除剂组分筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr14中加入其质量5～10倍的体积浓度为70～90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr14甲醇样品溶液，即滤液C，取1mL滤液C，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标成分的组分中自由基清除剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-Pur C18 AQ(250×4.6mm，5μm)色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；
步骤5，Diol二醇基柱富集：滤液C按硅胶的量：样品的量＝1:1～1.5拌样并干燥，即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr14拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱柱分离，经检测波长为280nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第二个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得异叶青兰含有目标成分的组分Fr142；其中，Diol二醇基柱分离的工作参数为：色谱柱柱长500mm、直径50mm，固定相为Diol，流动相A为正己烷，B为乙酸乙酯，色谱条件为0-90min，0-100％B，检测波长为280nm，进样量为60g，流速为57mL/min；
步骤6，在线自由基清除剂组分再筛选：在所述异叶青兰含有目标成分的组分Fr142中加入其质量5～10倍的体积浓度为70～90％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为50.0～100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到异叶青兰Fr142样品溶液，即滤液D，取1mL滤液D，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选异叶青兰含有目标组分中自由基清除剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用ReproSil-Pur C18 AQ(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；
步骤7，反相制备色谱柱制备：所述滤液D经反相制备色谱柱分离，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr1423、Fr1424和Fr1425，经减压干燥分别得到含有目标化合物1的组分Fr1423，含有目标化合物2和3的组分Fr1424和含有目标化合物4的组分Fr1425；其中，反相制备柱制备的工作参数为：ReproSil-Pur C18 AQ反相制备柱柱长250mm、直径20mm，固定相为5μm，流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，40-75％B洗脱，进样体积为0.5mL，流速为19mL/min；
步骤8，Fr1423、Fr1424和Fr1425反相制备液相色谱纯化：分别含有目标化合物1-4的组分Fr1423、Fr1424和Fr1425分别用体积分数为70～100％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为20.0～50.0mg/mL，均经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液E、F和G，使用在线HPLC-DPPH色谱联用系统对滤液E、F和G进行分析和活性峰筛选，然后将分析条件进行线性放大，对滤液E、F和G进行反相液相制备色谱纯化，经检测波长为210nm的紫外检测器检测，收集滤液E、F和G制备色谱图中主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分经减压干燥即得纯度大于95％的自由基清除剂isodemethylfuropinarine，标记为1号；demethylfuropinarine，标记为2号；alloimperatorin，标记为3号；alloisoimperatorin，标记为4号；其中，化学结构式分别为：
Figure FDA0003688360640000041
2.根据权利要求1所述的异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的分离工艺，其特征在于，所述步骤1、步骤2、步骤3、步骤5、步骤7和步骤8中，减压干燥的条件均为：真空度100～300mbar，温度45～65℃。
3.根据权利要求1所述的异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的分离工艺，其特征在于，所述步骤4和6中，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液，按照0-60min，40-75％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.8mL/min；反应环长度为18m。
4.根据权利要求1所述的异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的分离工艺，其特征在于，所述步骤8中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用7-X10(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为210nm，流动相A为色谱纯水，流动相B为乙腈溶液或乙醇溶液，组分Fr1423分离的流动相为体积分数15％乙腈-水溶液，组分Fr1424分离的流动相为体积分数35％乙醇-水溶液，Fr1425分离的流动相为体积分数30％乙腈-水溶液，流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪进乙醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；DPPH溶液浓度为25μg/mL，流动相流速为0.8mL/min；反应环长度为18m；反相制备液相色谱纯化的工作参数为：色谱柱柱长250mm、直径20mm，反相制备柱固定相为5μm的7-X10填料，组分Fr1423、组分Fr1424和组分Fr1425使用的流动相与在线HPLC-DPPH色谱联用系统中第一台高效液相色谱仪中流动相相同，进样体积均为1.0mL，流速为19mL/min。
5.根据权利要求1-4任意一项所分离的异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂的应用，其特征在于，该异叶青兰中呋喃香豆素类天然自由基清除剂在制备自由基清除药物或保健食品中应用，具体作为有效成分按药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或作为有效成分按食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
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