CN113072603B - 唐古特虎耳草中二芳基壬烷类ⅱ和ⅰ自由基抑制剂及其分离制备工艺和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂及其分离制备工艺和应用。具体工艺为：提取、微孔树脂柱粗分、在线自由基抑制剂组分筛选、反相中压色谱柱分离、在线自由基抑制剂筛选及高压制备柱制备等步骤。制得的自由基抑制剂可在制备自由基抑制药物或保健食品中应用，具体作为有效成分按药学上或者食品科学上可接受的任何载体制成各类药用制剂或者保健类食品。工艺中的提取溶剂、微孔树脂柱、反相中压色谱柱分离所使用的溶剂和分离材料均可回收利用；原料来源广泛，甲醇室温冷浸提取、微孔树脂柱粗分及反相中压色谱柱分离等工艺步骤均可实现规模化操作，且高压制备色谱分离可以保证产品的纯度大于95％。
Description
技术领域
本发明涉及唐古特虎耳草中二芳基壬烷类自由基抑制剂分离技术领域，具体涉及唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂及其分离制备工艺和应用。
背景技术
唐古特虎耳草(Saxifraga tangutica Engl.)，别名甘青虎耳草，是虎耳草科(Saxifragaceae)虎耳草属(Saxifraga)的一年生常绿草本植物，藏药名：“松吉蒂”，中药中称之为“迭达”，主要分布在青海、甘肃、西藏、四川以及及不丹与克什米尔地区海拔2900～4900米的针叶林灌丛下。唐古特虎耳草为常用藏药，可全草入药，《中药辞海》记载：其性味微苦、辛、寒。主要功效：清肝利胆，补脾健胃。主治：肝炎，胆囊炎，流行性感冒。现代药理学研究证明酚类是主要活性成分。文献报道，酚类化合物具有良好的清除自由基活性。但目前，仅有本课题发表的8个抗氧化的酚类化合物从唐古特虎耳草中被分离并鉴定(JunDang,Yanduo Tao,Yun Shao,et al.Antioxidative extracts and phenols isolatedfrom Qinghai-Tibet Plateau medicinal plant Saxifraga tanguticaEngl.Industrial Crops and Products,2015,78:13-18)。为了进一步加快唐古特虎耳草的质量评价、生产销售及相关新药的研发步伐，有必要从中挖掘更多的结构新颖的活性成分。
本课题组相关研究已申请了国家发明专利(申请号：202010041021.3)描述了唐古特虎耳草中六种结构已知的没食子酰基类天然自由基清除剂的分离制备工艺及其应用，且截至目前并未涉及二芳基壬烷类自由基抑制剂的文献或专利报道。因此，亟需建立一种工艺简单、规模化从唐古特虎耳草中分离制备二芳基壬烷类自由基抑制剂的方法。
发明内容
基于上述技术问题，本发明的目的是提供唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂及其分离制备工艺和应用。
本发明保护唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂，其中，该二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂呈棕黄色油状，其名称分别为二芳基壬烷类Saxitanside A和Saxitanside C自由基抑制剂，其分子式分别为C27H36O11和C27H34O11，其化学结构式分别为：
本发明保护唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂的分离制备工艺，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：将唐古特虎耳草全草阴干，粗碎后按料液比1g：5～100mL的甲醇提取，在室温下提取2～4次，每次2～4h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按聚酰胺的量：唐古特虎耳草药材的量＝1:5拌样并减压干燥，即得唐古特虎耳草提取物拌样样品；
步骤2，微孔树脂柱粗分：唐古特虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第四个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr4，其中，所述微孔树脂柱的粗分离工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为乙醇，色谱条件为0～120min，0～100％B，120～150min，100％B，进样量为40g，流速为30mL/min；
步骤3，在线自由基抑制剂组分筛选：在所述唐古特虎耳草目标组分Fr4中加入体积浓度为50～100％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为80.0～150.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到唐古特虎耳草目标组分Fr4样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统，筛选唐古特虎耳草目标组分Fr4中自由基抑制剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水C18(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为254nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；
步骤4，反相中压色谱柱分离：唐古特虎耳草目标组分Fr4样品溶液B按聚酰胺的量：唐古特虎耳草Fr4组分样品的量＝1:1拌样并减压干燥，即得唐古特虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有反相填料的中压色谱塔分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第三个和第五个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr4-3和Fr4-5；其中，所述反相中压色谱柱分离的工作参数为：色谱柱柱长500mm、直径50mm，反相中压色谱柱固定相为50μm的Spherical C18，流动相A为水，B为乙腈，色谱条件为0～90min，18～26％B，90～105min，26％B，进样量为18g，流速为57mL/min；
步骤5，在线自由基抑制剂筛选：在唐古特虎耳草目标组分Fr4-3和Fr4-5中分别加入体积浓度为50～100％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为30.0～80.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到唐古特虎耳草目标组分Fr4-3和Fr4-5的溶液，即滤液C和D，分别取1mL滤液C和D，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选唐古特虎耳草目标组分Fr4-3和Fr4-5中自由基抑制剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用亲水色谱柱XION(250×4.6mm，5μm)，检测波长为254nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；
步骤6，高压制备柱制备：所述滤液C和D分别经亲水制备柱分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，分别收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr4-3-3和Fr4-5-1，色谱峰馏分Fr4-3-3经减压干燥即得含有二芳基壬烷类自由基抑制剂Saxitanside C的组分；色谱峰馏分Fr4-5-1经减压干燥即得纯度大于95％的二芳基壬烷类自由基抑制剂Saxitanside A；其中，亲水制备柱分离的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，亲水色谱柱固定相为5μm XION填料，流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，目标组分Fr4-3和Fr4-5分别按照0～60min，92％B和0～30min，91％B等度洗脱，进样体积均为4mL，流速为19mL/min；
步骤7，Fr4-3-3的反相制备液相色谱纯化：含有目标化合物Saxitanside C的组分用体积分数为50～100％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为10.0～40.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液E，滤液E经反相制备液相色谱纯化，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集滤液E制备色谱图中第三个主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分Fr4-3-3-3经减压干燥即得纯度大于95％的二芳基壬烷类自由基抑制剂Saxitanside C；其中，反相制备柱制备的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，反相色谱柱固定相为5μmReproSil C18填料，流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，目标组分Fr4-3-3按照0～32min，16％B等度洗脱，进样体积为1mL，流速为19mL/min。
进一步的，所述步骤1、步骤2、步骤4、步骤6和步骤7中，减压干燥的条件均为：真空度50～250mbar，温度40～60℃。
进一步的，所述步骤3中，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，15～23％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为50μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m。
进一步的，所述步骤5中，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，100～70％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为50μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m。
进一步的，步骤3所述的耐纯水C18反相色谱柱为耐纯水Reprosil C18反相色谱柱或耐纯水Megres C18反相色谱柱。
本发明还保护上述唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂的应用，其中，该二芳基壬烷类Saxitanside A和Saxitanside C自由基抑制剂可在制备自由基抑制药物或保健食品中应用，具体作为有效成分按药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或作为有效成分按食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
相比于现有的技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明成本低廉、产品纯度高
提取使用的溶剂，微孔树脂柱、反相中压色谱柱、亲水制备柱分离所使用的溶剂均可以回收利用；分离使用的材料均可以重复利用，回收利用的溶剂和重复利用的分离材料保证了较低廉的分离平均成本，高压制备色谱分离可以保证产品的纯度大于95％。
(2)本发明的制备方法可实现规模化生产需要
原料要求不高、成本低廉，一般野生的或市售的唐古特虎耳草均可，易于批量备料；甲醇室温冷浸提取，易于操作；采用微孔树脂柱粗分和反相中压色谱柱分离，这种分离材料可以装于中压柱层析系统中，易于实现规模化；纯化中使用的高压亲水或反相等度制备液相色谱为快速的等度方法，也非常适宜规模生产。
附图说明
图1为本发明唐古特虎耳草甲醇提取物微孔树脂分离色谱图；
图2为本发明唐古特虎耳草目标组分Fr4在线HPLC-DPPH筛选色谱图；
图3为本发明唐古特虎耳草目标组分Fr4反相中压色谱柱分离图；
图4为本发明唐古特虎耳草目标组分Fr4-3在线HPLC-DPPH筛选色谱图；
图5为本发明唐古特虎耳草目标组分Fr4-5在线HPLC-DPPH筛选色谱图；
图6为本发明唐古特虎耳草目标组分Fr4-3亲水色谱分析及制备色谱图；
图7为本发明唐古特虎耳草目标组分Fr4-5亲水色谱分析及制备色谱图；
图8为本发明唐古特虎耳草目标组分Fr4-3-3反相色谱分析及制备色谱图；
图9为本发明唐古特虎耳草二芳基壬烷类Saxitanside C(Fr4-3-3-3)的纯度及活性验证色谱图；
图10为本发明唐古特虎耳草二芳基壬烷类Saxitanside A(Fr4-5-1)的纯度及活性验证色谱图；
图11为本发明唐古特虎耳草二芳基壬烷类Saxitanside C自由基抑制剂的质谱图；
图12为本发明唐古特虎耳草二芳基壬烷类Saxitanside C自由基抑制剂的1H NMR核磁图；
图13为本发明唐古特虎耳草二芳基壬烷类Saxitanside C自由基抑制剂的13C NMR核磁图；
图14为本发明唐古特虎耳草二芳基壬烷类Saxitanside C自由基抑制剂的DEPT核磁图；
图15为本发明唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside C自由基抑制剂的HSQC二维核磁图；
图16为本发明唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside C自由基抑制剂的HMBC二维核磁图；
图17为本发明唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside C自由基抑制剂的H-HCOSY的二维核磁图；
图18为本发明唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside C自由基抑制剂的NOESY的二维核磁图；
图19为本发明唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside C自由基抑制剂的红外光谱图；
图20为本发明唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside C自由基抑制剂的紫外光谱图；
图21为本发明唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside C自由基抑制剂的旋光测试图；
图22为本发明唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside C自由基抑制剂的CD测试图；
图23为本发明唐古特虎耳草二芳基壬烷类Saxitanside A自由基抑制剂的质谱图；
图24为本发明唐古特虎耳草二芳基壬烷类Saxitanside A自由基抑制剂的1H NMR核磁图；
图25为本发明唐古特虎耳草二芳基壬烷类Saxitanside A自由基抑制剂的13C NMR核磁图；
图26为本发明唐古特虎耳草二芳基壬烷类Saxitanside A自由基抑制剂的DEPT核磁图；
图27为本发明唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside A自由基抑制剂的HSQC二维核磁图；
图28为本发明唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside A自由基抑制剂的HMBC二维核磁图；
图29为本发明唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside A自由基抑制剂的H-HCOSY的二维核磁图；
图30为本发明唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside A自由基抑制剂的NOESY的二维核磁图；
图31为本发明唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside A自由基抑制剂的红外光谱图；
图32为本发明唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside A自由基抑制剂的紫外光谱图；
图33为本发明唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside A自由基抑制剂的旋光测试图；
图34为本发明唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside A自由基抑制剂的CD测试图；
图35为本发明唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside A和Saxitanside C自由基抑制剂的结构图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂的分离制备工艺，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：将500g唐古特虎耳草全草阴干，粗碎后按料液比1g：5mL的甲醇提取，在室温下提取4次，每次2h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按聚酰胺的量：唐古特虎耳草药材的量＝1:5拌样并减压干燥，其中减压干燥的条件为：真空度50mbar，温度40℃，即得唐古特虎耳草提取物拌样样品160.2g；
步骤2，微孔树脂柱粗分：唐古特虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第四个(Fr4)主要的色谱峰馏分(详见附图1)，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr4，其中减压干燥的条件为：真空度50mbar，温度40℃，得唐古特虎耳草目标组分Fr4样品17.5g；所述微孔树脂柱的粗分离工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为乙醇，色谱条件为0～120min，0～100％B，120～150min，100％B，进样量为40g，流速为30mL/min；
步骤3，在线自由基抑制剂组分筛选：在所述唐古特虎耳草目标组分Fr4中加入体积浓度为50％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为80.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到唐古特虎耳草目标组分Fr4样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统，筛选唐古特虎耳草目标组分Fr4中自由基抑制剂(详见附图2)；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水ReproSil C18(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为254nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，15～23％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为50μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m；
步骤4，反相中压色谱柱分离：唐古特虎耳草目标组分Fr4样品溶液B按聚酰胺的量：唐古特虎耳草Fr4组分样品的量＝1:1拌样并减压干燥，即得唐古特虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有反相填料的中压色谱塔分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第三个和第五个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr4-3和Fr4-5(详见附图3)；其中减压干燥的条件为：真空度50mbar，温度40℃，即得唐古特虎耳草目标组分Fr4-3样品804mg，Fr4-5样品5.2g；所述反相中压色谱柱分离的工作参数为：色谱柱柱长500mm、直径50mm，反相中压色谱柱固定相为50μm的Spherical C18，流动相A为水，B为乙腈，色谱条件为0～90min，18～26％B，90～105min，26％B，进样量为18g，流速为57mL/min；
步骤5，在线自由基抑制剂筛选：在唐古特虎耳草目标组分Fr4-3和Fr4-5中分别加入体积浓度为50％的甲醇进行溶解，配制样品浓度分别为80.0mg/mL和30.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到唐古特虎耳草目标组分Fr4-3和Fr4-5的溶液，即滤液C和D，分别取1mL滤液C和D，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选唐古特虎耳草目标组分Fr4-3和Fr4-5中自由基抑制剂(详见附图4和附图5)；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用亲水色谱柱XION(250×4.6mm，5μm)，检测波长为254nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，100～70％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为50μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m；
步骤6，高压制备柱制备：所述滤液C和D分别经亲水制备柱分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，分别收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr4-3-3和Fr4-5-1(详见附图6和附图7)，色谱峰馏分Fr4-3-3经减压干燥即得含有二芳基壬烷类自由基抑制剂Saxitanside C的组分；色谱峰馏分Fr4-5-1经减压干燥即得纯度大于95％的二芳基壬烷类自由基抑制剂Saxitanside A；其中减压干燥的条件为：真空度50mbar，温度40℃，即分别得唐古特虎耳草目标组分Fr4-3-3样品84.2mg和Fr4-5-1样品4.2g；亲水制备柱分离的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，亲水色谱柱固定相为5μm XION填料，流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，目标组分Fr4-3和Fr4-5分别按照0～60min，92％B和0～30min，91％B等度洗脱，进样体积均为4mL，流速为19mL/min；
步骤7，Fr4-3-3的反相制备液相色谱纯化：含有目标化合物Saxitanside C的组分用体积分数为50％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为40.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液E，滤液E经反相制备液相色谱纯化，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集滤液E制备色谱图中第三个主要的色谱峰馏分(详见附图8)，该色谱峰馏分Fr4-3-3-3经减压干燥即得纯度大于95％的二芳基壬烷类自由基抑制剂Saxitanside C；其中减压干燥的条件为：真空度50mbar，温度40℃，即得唐古特虎耳草目标组分Fr4-3-3-3样品16.8mg；反相制备柱制备的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，反相色谱柱固定相为5μm ReproSil C18填料，流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，目标组分Fr4-3-3按照0～32min，16％B等度洗脱，进样体积为1mL，流速为19mL/min。
上述唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂的应用，其中，该二芳基壬烷类Saxitanside A和Saxitanside C自由基抑制剂可在制备自由基抑制药物或保健食品中应用，具体作为有效成分按药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或作为有效成分按食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
实施例2
唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂的分离制备工艺，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：将1000g唐古特虎耳草全草阴干，粗碎后按料液比1g：100mL的甲醇提取，在室温下提取2次，每次4h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按聚酰胺的量：唐古特虎耳草药材的量＝1:5拌样并减压干燥，其中减压干燥的条件为：真空度250mbar，温度60℃，即得唐古特虎耳草提取物拌样样品319.3g；
步骤2，微孔树脂柱粗分：唐古特虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第四个(Fr4)主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr4，其中减压干燥的条件为：真空度250mbar，温度60℃，得唐古特虎耳草目标组分Fr4样品32.8g；所述微孔树脂柱的粗分离工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为乙醇，色谱条件为0～120min，0～100％B，120～150min，100％B，进样量为40g，流速为30mL/min；
步骤3，在线自由基抑制剂组分筛选：在所述唐古特虎耳草目标组分Fr4中加入体积浓度为100％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为150.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到唐古特虎耳草目标组分Fr4样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统，筛选唐古特虎耳草目标组分Fr4中自由基抑制剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水Megres C18(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为254nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，15～23％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为50μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m；
步骤4，反相中压色谱柱分离：唐古特虎耳草目标组分Fr4样品溶液B按聚酰胺的量：唐古特虎耳草Fr4组分样品的量＝1:1拌样并减压干燥，即得唐古特虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有反相填料的中压色谱塔分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第三个和第五个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr4-3和Fr4-5；其中减压干燥的条件为：真空度250mbar，温度60℃，即得唐古特虎耳草目标组分Fr4-3样品1.4g，Fr4-5样品9.6g；所述反相中压色谱柱分离的工作参数为：色谱柱柱长500mm、直径50mm，反相中压色谱柱固定相为50μm的Spherical C18，流动相A为水，B为乙腈，色谱条件为0～90min，18～26％B，90～105min，26％B，进样量为18g，流速为57mL/min；
步骤5，在线自由基抑制剂筛选：在唐古特虎耳草目标组分Fr4-3和Fr4-5中分别加入体积浓度为100％的甲醇进行溶解，配制样品浓度分别为30.0mg/mL和80.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到唐古特虎耳草目标组分Fr4-3和Fr4-5的溶液，即滤液C和D，分别取1mL滤液C和D，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选唐古特虎耳草目标组分Fr4-3和Fr4-5中自由基抑制剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用亲水色谱柱XION(250×4.6mm，5μm)，检测波长为254nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，100～70％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为50μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m；
步骤6，高压制备柱制备：所述滤液C和D分别经亲水制备柱分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，分别收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr4-3-3和Fr4-5-1，色谱峰馏分Fr4-3-3经减压干燥即得含有二芳基壬烷类自由基抑制剂Saxitanside C的组分；色谱峰馏分Fr4-5-1经减压干燥即得纯度大于95％的二芳基壬烷类自由基抑制剂Saxitanside A；其中减压干燥的条件为：真空度250mbar，温度60℃，即分别得唐古特虎耳草目标组分Fr4-3-3样品148.1mg和Fr4-5-1样品7.8g；亲水制备柱分离的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，亲水色谱柱固定相为5μm XION填料，流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，目标组分Fr4-3和Fr4-5分别按照0～60min，92％B和0～30min，91％B等度洗脱，进样体积均为4mL，流速为19mL/min；
步骤7，Fr4-3-3的反相制备液相色谱纯化：含有目标化合物Saxitanside C的组分用体积分数为100％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为10.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液E，滤液E经反相制备液相色谱纯化，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集滤液E制备色谱图中第三个主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分Fr4-3-3-3经减压干燥即得纯度大于95％的二芳基壬烷类自由基抑制剂Saxitanside C；其中减压干燥的条件为：真空度250mbar，温度60℃，即得唐古特虎耳草目标组分Fr4-3-3-3样品16.8mg；反相制备柱制备的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，反相色谱柱固定相为5μmReproSil C18填料，流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，目标组分Fr4-3-3按照0～32min，16％B等度洗脱，进样体积为1mL，流速为19mL/min。
上述唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂的应用，其中，该二芳基壬烷类Saxitanside A和Saxitanside C自由基抑制剂可在制备自由基抑制药物或保健食品中应用，具体作为有效成分按药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或作为有效成分按食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
实施例3
唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂的分离制备工艺，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：将1200g唐古特虎耳草全草阴干，粗碎后按料液比1g：50mL的甲醇提取，在室温下提取3次，每次3h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按聚酰胺的量：唐古特虎耳草药材的量＝1:5拌样并减压干燥，其中减压干燥的条件为：真空度150mbar，温度50℃，即得唐古特虎耳草提取物拌样样品363.7g；
步骤2，微孔树脂柱粗分：唐古特虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第四个(Fr4)主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr4，其中减压干燥的条件为：真空度150mbar，温度50℃，得唐古特虎耳草目标组分Fr4样品38.3g；所述微孔树脂柱的粗分离工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为乙醇，色谱条件为0～120min，0～100％B，120～150min，100％B，进样量为40g，流速为30mL/min；
步骤3，在线自由基抑制剂组分筛选：在所述唐古特虎耳草目标组分Fr4中加入体积浓度为80％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为100.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到唐古特虎耳草目标组分Fr4样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统，筛选唐古特虎耳草目标组分Fr4中自由基抑制剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水Megres C18(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为254nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，15～23％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为50μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m；
步骤4，反相中压色谱柱分离：唐古特虎耳草目标组分Fr4样品溶液B按聚酰胺的量：唐古特虎耳草Fr4组分样品的量＝1:1拌样并减压干燥，即得唐古特虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有反相填料的中压色谱塔分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第三个和第五个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr4-3和Fr4-5；其中减压干燥的条件为：真空度150mbar，温度50℃，即得唐古特虎耳草目标组分Fr4-3样品1.5g，Fr4-5样品10.7g；所述反相中压色谱柱分离的工作参数为：色谱柱柱长500mm、直径50mm，反相中压色谱柱固定相为50μm的Spherical C18，流动相A为水，B为乙腈，色谱条件为0～90min，18～26％B，90～105min，26％B，进样量为18g，流速为57mL/min；
步骤5，在线自由基抑制剂筛选：在唐古特虎耳草目标组分Fr4-3和Fr4-5中分别加入体积浓度为80％的甲醇进行溶解，配制样品浓度分别为50.0mg/mL和70.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到唐古特虎耳草目标组分Fr4-3和Fr4-5的溶液，即滤液C和D，分别取1mL滤液C和D，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选唐古特虎耳草目标组分Fr4-3和Fr4-5中自由基抑制剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用亲水色谱柱XION(250×4.6mm，5μm)，检测波长为254nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，100～70％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为50μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m；
步骤6，高压制备柱制备：所述滤液C和D分别经亲水制备柱分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，分别收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr4-3-3和Fr4-5-1，色谱峰馏分Fr4-3-3经减压干燥即得含有二芳基壬烷类自由基抑制剂Saxitanside C的组分；色谱峰馏分Fr4-5-1经减压干燥即得纯度大于95％的二芳基壬烷类自由基抑制剂Saxitanside A；其中减压干燥的条件为：真空度150mbar，温度50℃，即分别得唐古特虎耳草目标组分Fr4-3-3样品168.4mg和Fr4-5-1样品9.2g；亲水制备柱分离的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，亲水色谱柱固定相为5μm XION填料，流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，目标组分Fr4-3和Fr4-5分别按照0～60min，92％B和0～30min，91％B等度洗脱，进样体积均为4mL，流速为19mL/min；
步骤7，Fr4-3-3的反相制备液相色谱纯化：含有目标化合物Saxitanside C的组分用体积分数为80％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为30.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液E，滤液E经反相制备液相色谱纯化，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集滤液E制备色谱图中第三个主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分Fr4-3-3-3经减压干燥即得纯度大于95％的二芳基壬烷类自由基抑制剂Saxitanside C；其中减压干燥的条件为：真空度150mbar，温度50℃，即得唐古特虎耳草目标组分Fr4-3-3-3样品30.6mg；反相制备柱制备的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，反相色谱柱固定相为5μmReproSil C18填料，流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，目标组分Fr4-3-3按照0～32min，16％B等度洗脱，进样体积为1mL，流速为19mL/min。
上述唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂的应用，其中，该二芳基壬烷类SaxitansideA和Saxitanside C自由基抑制剂可在制备自由基抑制药物或保健食品中应用，具体作为有效成分按药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或作为有效成分按食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
实施例4
唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂的活性验证：
在分离得到的唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside A和Saxitanside C自由基抑制剂中加入色谱甲醇进行溶解，分别配制样品浓度为0.5mg/mL和0.1mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside A和Saxitanside C样品溶液，取1mL样品，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统验证唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Saxitanside A和Saxitanside C样品的活性；其中，在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水反相色谱柱ReproSil C18(250×4.6mm，5μm)，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，15～23％B，流动相流速为1.0mL/min，检测波长为254nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，DPPH溶液浓度为50μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m，检测波长为517nm，活性验证色谱图(详见附图9和附图10)。二芳基壬烷类Saxitanside A和Saxitanside C自由基抑制剂的质谱图、核磁图、红外光谱图、紫外光谱图、旋光测试图、CD测试图和结构图(详见附图11-35)。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂，其特征在于，该二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂呈棕黄色油状，其名称分别为二芳基壬烷类SaxitansideA和SaxitansideC自由基抑制剂，其分子式分别为C27H36O11和C27H34O11，其化学结构式分别为：
2.根据权利要求1所述的唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂的分离制备工艺，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤1，提取：将唐古特虎耳草全草阴干，粗碎后按料液比1g：5～100mL的甲醇提取，在室温下提取2～4次，每次2～4h，过滤、合并滤液，即滤液A，该滤液A按聚酰胺的量：唐古特虎耳草药材的量＝1:5拌样并减压干燥，即得唐古特虎耳草提取物拌样样品；
步骤2，微孔树脂柱粗分：唐古特虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有微孔树脂的中压色谱分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第四个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr4，其中，所述微孔树脂柱的粗分离工作参数为：色谱柱柱长460mm、直径49mm，微孔树脂柱固定相为CHP20P，流动相A为水，B为乙醇，色谱条件为0～120min，0～100％B，120～150min，100％B，进样量为40g，流速为30mL/min；
步骤3，在线自由基抑制剂组分筛选：在所述唐古特虎耳草目标组分Fr4中加入体积浓度为50～100％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为80.0～150.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到唐古特虎耳草目标组分Fr4样品溶液，即滤液B，取1mL滤液B，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统，筛选唐古特虎耳草目标组分Fr4中自由基抑制剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用耐纯水C18(250×4.6mm，5μm)反相色谱柱，检测波长为254nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；
步骤4，反相中压色谱柱分离：唐古特虎耳草目标组分Fr4样品溶液B按聚酰胺的量：唐古特虎耳草Fr4组分样品的量＝1:1拌样并减压干燥，即得唐古特虎耳草提取物拌样样品，该样品经装有反相填料的中压色谱塔分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集制备色谱图中第三个和第五个主要的色谱峰馏分，该馏分经减压干燥即得目标组分Fr4-3和Fr4-5；其中，所述反相中压色谱柱分离的工作参数为：色谱柱柱长500mm、直径50mm，反相中压色谱柱固定相为50μm的Spherical C18，流动相A为水，B为乙腈，色谱条件为0～90min，18～26％B，90～105min，26％B，进样量为18g，流速为57mL/min；
步骤5，在线自由基抑制剂筛选：在唐古特虎耳草目标组分Fr4-3和Fr4-5中分别加入体积浓度为50～100％的甲醇进行溶解，配制样品浓度为30.0～80.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到唐古特虎耳草目标组分Fr4-3和Fr4-5的溶液，即滤液C和D，分别取1mL滤液C和D，利用在线HPLC-DPPH色谱联用系统筛选唐古特虎耳草目标组分Fr4-3和Fr4-5中自由基抑制剂；其中，所述在线HPLC-DPPH色谱联用系统，第一台高效液相色谱仪采用亲水色谱柱XION(250×4.6mm，5μm)，检测波长为254nm；第二台高效液相色谱仪进甲醇溶解的DPPH溶液，检测波长为517nm；
步骤6，高压制备柱制备：所述滤液C和D分别经亲水制备柱分离，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，分别收集制备色谱图中对应的色谱峰馏分Fr4-3-3和Fr4-5-1，色谱峰馏分Fr4-3-3经减压干燥即得含有二芳基壬烷类自由基抑制剂Saxitanside C的组分；色谱峰馏分Fr4-5-1经减压干燥即得纯度大于95％的二芳基壬烷类自由基抑制剂SaxitansideA；其中，亲水制备柱分离的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，亲水色谱柱固定相为5μm XION填料，流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，目标组分Fr4-3和Fr4-5分别按照0～60min，92％B和0～30min，91％B等度洗脱，进样体积均为4mL，流速为19mL/min；
步骤7，Fr4-3-3的反相制备液相色谱纯化：含有目标化合物Saxitanside C的组分用体积分数为50～100％的甲醇-水溶液溶解，配制样品浓度为10.0～40.0mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液，即滤液E，滤液E经反相制备液相色谱纯化，经检测波长为254nm的紫外检测器检测，收集滤液E制备色谱图中第三个主要的色谱峰馏分，该色谱峰馏分Fr4-3-3-3经减压干燥即得纯度大于95％的二芳基壬烷类自由基抑制剂Saxitanside C；其中，反相制备柱制备的工作参数为：制备柱柱长250mm、直径20mm，反相色谱柱固定相为5μm ReproSilC18填料，流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，目标组分Fr4-3-3按照0～32min，16％B等度洗脱，进样体积为1mL，流速为19mL/min。
3.根据权利要求2所述的唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂的分离制备工艺，其特征在于，所述步骤1、步骤2、步骤4、步骤6和步骤7中，减压干燥的条件均为：真空度50～250mbar，温度40～60℃。
4.根据权利要求2所述的唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂的分离制备工艺，其特征在于，所述步骤3中，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，15～23％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为50μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m。
5.根据权利要求2所述的唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂的分离制备工艺，其特征在于，所述步骤5中，第一台高效液相色谱仪采用的流动相A为水溶液，流动相B为乙腈溶液，按照0～60min，100～70％B，流动相流速为1.0mL/min；第二台高效液相色谱仪所使用的DPPH溶液浓度为50μg/mL，流动相流速为0.5mL/min；反应环长度为15m。
6.根据权利要求2所述的唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂的分离制备工艺，其特征在于，步骤3所述的耐纯水C18反相色谱柱为耐纯水Reprosil C18反相色谱柱或耐纯水Megres C18反相色谱柱。
7.根据权利要求1所述的唐古特虎耳草中二芳基壬烷类Ⅱ和Ⅰ自由基抑制剂，其特征在于，该二芳基壬烷类Saxitanside A和Saxitanside C自由基抑制剂可在制备自由基抑制药物或保健食品中应用，具体作为有效成分按药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂，或作为有效成分按食品科学上可接受的任何载体制成各类保健类食品。
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