CN106478419B - 从异叶青兰中分离制备迷迭香酸的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从异叶青兰中分离制备迷迭香酸的方法，该方法包括以下步骤：⑴提取：异叶青兰全草粉末经浸泡、回流提取、减压浓缩，即得异叶青兰乙醇提取物；⑵微孔树脂除杂：所述异叶青兰乙醇提取物经溶解、过滤、上MCI微孔树脂柱、洗脱，收集50%乙醇溶液洗脱物，该50%乙醇溶液洗脱物经减压浓缩，即得迷迭香酸粗提物；⑶亲水制备液相色谱分离纯化：将所述迷迭香酸粗提物经溶解、微孔滤膜过滤后采用亲水液相制备色谱分离纯化，即得纯度大于98%的迷迭香酸。同时，本发明还公开了该迷迭香酸的应用。本发明工艺简单、易于规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种天然活性成分的制备方法与应用，尤其涉及从异叶青兰中分离制备迷迭香酸的方法及其应用。
背景技术
异叶青兰（Dracocephalum heterophyllum Benth）系唇形科青兰属植物，该植物在民间被广泛用于治疗黄疽性发烧、热性病头痛、高血压、淋巴结炎、肺热咳嗽、肝热等多种病症。现代研究表明迷迭香酸(Rosemarinic acid)具有抗氧化、抗病毒、抗菌、抗炎、抗肿瘤、免疫抑制、抗血小板聚集及血栓形成、抗血管形成、抗抑郁、抗神经退行性疾病、抑制肾小球系膜细胞的增殖、抗肝纤维化等药理活性。但至今尚无从异叶青兰中分离制备迷迭香酸单体的方法和有关迷迭香酸在防治肝炎/肝损伤药物中应用的报道。
中国专利CN 1995007 B、CN 101863767 A、CN 104710311 A和CN 101020637 B公开了从迷迭香、夏枯草、薄荷、丹参等植物中分离制备迷迭香酸的工艺及制备方法，但制备工艺繁琐，有机溶剂用量大，迷迭香酸的提取率和纯度均较低。鉴于异叶青兰中含有丰富的迷迭香酸，开发一种从异叶青兰中分离制备迷迭香酸的简单易行、低成本高收率的制备方法非常必要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、易于规模化生产的从异叶青兰中分离制备迷迭香酸的方法。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供该方法获得的迷迭香酸的应用。
为解决上述问题，本发明所述的从异叶青兰中分离制备迷迭香酸的方法，包括以下步骤：
⑴提取：
异叶青兰全草粉末用其质量5~20倍且体积浓度为45~95%的乙醇溶液浸泡10~15小时，在50~75℃温度下回流提取1~3次，每次1~3h，合并得到提取液，该提取液经减压浓缩，即得异叶青兰乙醇提取物；
⑵微孔树脂除杂：
所述异叶青兰乙醇提取物用其质量10~20倍且体积分数为10~20%的乙醇溶液溶解后，过滤得到滤液A；所述滤液A上MCI微孔树脂柱，分别以3倍柱体积的纯水、3倍柱体积且体积浓度为50%的乙醇溶液、3倍柱体积且体积浓度为90%的乙醇溶液洗脱，收集50%乙醇溶液洗脱物，该50%乙醇溶液洗脱物经减压浓缩，即得迷迭香酸粗提物；
⑶亲水制备液相色谱分离纯化：
将所述迷迭香酸粗提物用其质量5~10倍且体积分数为30%~50%的甲醇溶液溶解，然后配制样品浓度为100.0~150.0 mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B；所述滤液B经亲水液相制备色谱分离纯化，即得纯度大于98%的迷迭香酸。
所述步骤⑴和所述步骤⑵中减压浓缩的条件均是指真空度为0.05~0.08 MPa，温度为40~60℃。
所述步骤⑵中异叶青兰乙醇提取物与微孔树脂比例为1g：30 mL。
所述步骤⑶中亲水液相制备色谱分离纯化的工作参数是指色谱柱柱长250mm、直径20mm，亲水制备柱固定相为10μm XAmide或XIon，流动相为体积分数85%~95%的乙腈-水溶液，进样体积为2.0~3.0mL，流速为15 mL/min。
如上所述的从异叶青兰中分离制备迷迭香酸的方法所制得的迷迭香酸在防治肝炎/肝损伤药物中的应用，其特征在于：该异叶青兰迷迭香酸可作为唯一药效成分或药物有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类预防和治疗肝炎/肝损伤的药用制剂。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明原材料分布广泛，资源量丰富，易于批量备料。
2、本发明用乙醇作为提取溶剂，溶剂价格低廉，操作过程简单，易于规模化生产。
3、本发明采用微孔树脂除杂，可有效去除样品中的非目标成分，且树脂柱可以再生循环使用，平均价格低廉。
4、本发明工艺简单、重复性好、质量稳定可控，所得的迷迭香酸纯度达98%以上，经小鼠体内试验，对肝炎/肝损伤具有显著的防治作用。
⑴利用刀豆蛋白酶引起肝脏过度免疫反应来模拟自身免疫失调造成的肝细胞坏死及肝脏组织损伤病理。在该病理模型中，通过检测对照组和异叶青兰迷迭香酸药物组balb/c小鼠转氨酶活性的变化，评价异叶青兰迷迭香酸对自身免疫性肝损伤的药理效应。体内实验分组如表1：
表1
⑵利用联合注射多聚胞苷（Poly I：C）与D型半乳糖氨（D-GalN），诱导小鼠肝组织大面积坏死，从而引起严重的炎症来模拟类似病毒肝炎引发的急性肝炎。在该病理模型中，通过检测对照组及异叶青兰迷迭香酸药物组balb/c小鼠转氨酶活性变化，判断异叶青兰迷迭香酸对急性肝炎的药理效应。体内实验分组如表2：
表2
⑶结论：异叶青兰迷迭香酸对机体自身性免疫反应引起的肝损伤有显著的治疗作用，对病毒性肝炎引发的急性肝炎有明显的抑制作用。具体见附图1和图2。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明异叶青兰中迷迭香酸对自身免疫性肝损伤的治疗作用。
图2 为本发明异叶青兰中迷迭香酸对病毒性肝炎引发的急性肝炎的抑制作用。
具体实施方式
实施例1 从异叶青兰中分离制备迷迭香酸的方法，包括以下步骤：
⑴提取：
1 kg异叶青兰全草粉末用其质量20倍且体积浓度为45%的乙醇溶液浸泡10小时，在75℃温度下回流提取3次，每次1h，合并得到提取液，该提取液于真空度为0.05 MPa、温度为60℃条件下经减压浓缩，即得异叶青兰乙醇提取物103.52g。
⑵微孔树脂除杂：
异叶青兰乙醇提取物用其质量20倍且体积分数为10%的乙醇溶液溶解后，过滤得到滤液A；滤液A上MCI微孔树脂柱，分别以3倍柱体积的纯水、3倍柱体积且体积浓度为50%的乙醇溶液、3倍柱体积且体积浓度为90%的乙醇溶液洗脱，收集50%乙醇溶液洗脱物，该50%乙醇溶液洗脱物于真空度为0.05 MPa、温度为60℃条件下经减压浓缩，即得迷迭香酸粗提物24.37 g。
其中：异叶青兰乙醇提取物与微孔树脂比例为1g：30 mL。
⑶亲水制备液相色谱分离纯化：
将迷迭香酸粗提物用其质量10倍且体积分数为30%的甲醇溶液溶解，然后配制样品浓度为100.0 mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B；滤液B经亲水液相制备色谱分离纯化，即得纯度为98.73%的迷迭香酸10.79 g。
其中：亲水液相制备色谱分离纯化的工作参数是指色谱柱柱长250mm、直径20mm，亲水制备柱固定相为10μm XAmide，流动相为体积分数85%的乙腈-水溶液，进样体积为2.0mL，流速为15 mL/min。
实施例2 从异叶青兰中分离制备迷迭香酸的方法，包括以下步骤：
⑴提取：
10 kg异叶青兰全草粉末用其质量5倍且体积浓度为95%的乙醇溶液浸泡15小时，在50℃温度下回流提取1次，每次3h，合并得到提取液，该提取液于真空度为0.08 MPa、温度为40℃条件下经减压浓缩，即得异叶青兰乙醇提取物992.37 g。
⑵微孔树脂除杂：
异叶青兰乙醇提取物用其质量10倍且体积分数为20%的乙醇溶液溶解后，过滤得到滤液A；滤液A上MCI微孔树脂柱，分别以3倍柱体积的纯水、3倍柱体积且体积浓度为50%的乙醇溶液、3倍柱体积且体积浓度为90%的乙醇溶液洗脱，收集50%乙醇溶液洗脱物，该50%乙醇溶液洗脱物于真空度为0.08 MPa、温度为40℃条件下经减压浓缩，即得迷迭香酸粗提物。
其中：异叶青兰乙醇提取物与微孔树脂比例为1g：30 mL。
⑶亲水制备液相色谱分离纯化：
将迷迭香酸粗提物用其质量5倍且体积分数为50%的甲醇溶液溶解，然后配制样品浓度为150.0 mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B；滤液B经亲水液相制备色谱分离纯化，即得纯度为98.21%的迷迭香酸104.44 g。
其中：亲水液相制备色谱分离纯化的工作参数是指色谱柱柱长250mm、直径20mm，亲水制备柱固定相为10μm XIon，流动相为体积分数95%的乙腈-水溶液，进样体积为3.0mL，流速为15 mL/min。
实施例3 从异叶青兰中分离制备迷迭香酸的方法，包括以下步骤：
⑴提取：
5 kg异叶青兰全草粉末用其质量10倍且体积浓度为70%的乙醇溶液浸泡12小时，在65℃温度下回流提取2次，每次2h，合并得到提取液，该提取液于真空度为0.07MPa、温度为50℃条件下经减压浓缩，即得异叶青兰乙醇提取物497.68g。
⑵微孔树脂除杂：
异叶青兰乙醇提取物用其质量15倍且体积分数为15%的乙醇溶液溶解后，过滤得到滤液A；滤液A上MCI微孔树脂柱，分别以3倍柱体积的纯水、3倍柱体积且体积浓度为50%的乙醇溶液、3倍柱体积且体积浓度为90%的乙醇溶液洗脱，收集50%乙醇溶液洗脱物，该50%乙醇溶液洗脱物于真空度为0.07 MPa、温度为50℃条件下经减压浓缩，即得迷迭香酸粗提物122.31g。
其中：异叶青兰乙醇提取物与微孔树脂比例为1g：30 mL。
⑶亲水制备液相色谱分离纯化：
将迷迭香酸粗提物用其质量8倍且体积分数为40%的甲醇溶液溶解，然后配制样品浓度为125.0 mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B；滤液B经亲水液相制备色谱分离纯化，即得纯度为98.45%的迷迭香酸52.65g。
其中：亲水液相制备色谱分离纯化的工作参数是指色谱柱柱长250mm、直径20mm，亲水制备柱固定相为10μm XAmide，流动相为体积分数90%的乙腈-水溶液，进样体积为2.5mL，流速为15 mL/min。
上述实施例1~3所制得的迷迭香酸在防治肝炎/肝损伤药物中的应用是指：该异叶青兰迷迭香酸可作为唯一药效成分或药物有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类预防和治疗肝炎/肝损伤的药用制剂。
Claims (2)
1.从异叶青兰中分离制备迷迭香酸的方法，包括以下步骤：
⑴提取：
异叶青兰全草粉末用其质量5~20倍且体积浓度为45~95%的乙醇溶液浸泡10~15小时，在50~75℃温度下回流提取1~3次，每次1~3h，合并得到提取液，该提取液经减压浓缩，即得异叶青兰乙醇提取物；
⑵微孔树脂除杂：
所述异叶青兰乙醇提取物用其质量10~20倍且体积分数为10~20%的乙醇溶液溶解后，过滤得到滤液A；所述滤液A上MCI微孔树脂柱，分别以3倍柱体积的纯水、3倍柱体积且体积浓度为50%的乙醇溶液、3倍柱体积且体积浓度为90%的乙醇溶液洗脱，收集50%乙醇溶液洗脱物，该50%乙醇溶液洗脱物经减压浓缩，即得迷迭香酸粗提物；所述异叶青兰乙醇提取物与微孔树脂比例为1g：30 mL；
⑶亲水制备液相色谱分离纯化：
将所述迷迭香酸粗提物用其质量5~10倍且体积分数为30%~50%的甲醇溶液溶解，然后配制样品浓度为100.0~150.0 mg/mL，经0.45μm微孔滤膜过滤，得到滤液B；所述滤液B经亲水液相制备色谱分离纯化，即得纯度大于98%的迷迭香酸；所述亲水液相制备色谱分离纯化的工作参数是指色谱柱柱长250mm、直径20mm，亲水制备柱固定相为10μm XAmide或XIon，流动相为体积分数85%~95%的乙腈-水溶液，进样体积为2.0~3.0mL，流速为15 mL/min。
2.如权利要求1所述的从异叶青兰中分离制备迷迭香酸的方法，其特征在于：所述步骤⑴和所述步骤⑵中减压浓缩的条件均是指真空度为0.05~0.08 MPa，温度为40~60℃。
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