CN103665094A

CN103665094A - 一种从丹参中提取纯化丹参酮类单体化合物的制备方法

Info

Publication number: CN103665094A
Application number: CN201310498053.6A
Authority: CN
Inventors: 徐德锋
Original assignee: NANJING HOPE-PHARM Co Ltd
Current assignee: NANJING HOPE-PHARM Co Ltd
Priority date: 2013-10-22
Filing date: 2013-10-22
Publication date: 2014-03-26

Abstract

本发明公开了一种从丹参中提取纯化丹参酮类单体化合物的制备方法，其过程包括：将丹参经水洗净、粉碎、用醇-酸水溶液进行多级逆流萃取、大孔树脂柱层析，用乙醇-水溶液梯度洗脱，收集洗脱液，减压蒸发浓缩、真空干燥即得到有效成分的丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮。本发明的优点在于用醇-酸水溶液进行多级逆流萃取，使用大孔树脂可反复利用，以乙醇-水溶液作为溶剂，经济实用，可以方便高效地获取高纯度丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮单体化合物，各单体化合物纯度达95%以上，工艺简单、操作简便，成本低，适于批量生产。

Description

一种从丹参中提取纯化丹参酮类单体化合物的制备方法

技术领域

本发明属于中药植物化学领域，具体涉及到一种从中药丹参中提取纯化丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮单体化合物的制备方法。

背景技术

丹参又名赤参，紫丹参，红根等。为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）的干燥根及根茎。始载于《神农本草经》，味苦，微寒，无毒。归心、肝经。有活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神等功效，在临床主要用于治疗心血管、高血压、脑缺血等疾病。近年发现丹参可用于治疗慢性肝炎、早期肝硬化、尿毒症等，其主要化学成分为两大类，即水溶性丹参酚酸类和脂溶性丹参酮(Tanshinone)类。后者主要含有丹参酮I (Tanshinone I)、丹参酮IIA(Tanshinone IIA)和隐丹参酮(Cryptotanshinone)等邻醌结构丹参酮类化合物。丹参酮类化合物主要针对心血管系统疾病的治疗作用，使病人冠脉血流量明显增加，冠脉阻力明显下降，改善了心肌功能，在治疗冠心病、缓解心绞痛方面取得了明显的效果。该丹参酮类化合物还具有抗菌消炎作用，对革兰氏阳性球菌、痤疮棒状杆菌、金黄色葡萄球菌具有极强的抗菌活性；该丹参酮类化合物还对非小细胞肺癌、卵巢癌，结肠癌、中枢神经癌等肿瘤有显著的抑制作用。最近报道隐丹参酮可通过雄激素受体信号通路抑制前列腺癌肿瘤细胞的增长作用（Defeng Xu, et. al. Cancer Letters. 316 (1), 11-22（2012）），报道隐丹参酮对前列腺癌DU145细胞株有抑制作用（Shin D S, et. al., Cancer Res. 69(1): 193-202（2009），还可降低孕期高雄激素血症大鼠雄性子代的雄激素合成（李喜鹤等，中国中西医结合杂志28(11): 1001-1004（2008））。

本发明涉及丹参酮类单体化合物，包含丹参酮类单体化合物为丹参酮I、丹参酮IIA、和隐丹参酮，其化学结构式如下：

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几种丹参酮化学结构式

随着人们对丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮等丹参酮类化合物的生物活性及功能应用研究，对上述丹参酮类单体化合物的纯化分离具有重大意义。

目前，丹参酮类化合物的提取方法是采用中药丹参为原材料进行提取，要得到丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮等单体化合物通常采用硅胶柱层析的方法取得。中国专利（CN 1394870A）公开了一种以高速逆流色谱法（HSCCC）从中药丹参中提取丹参酮化合物的方法；中国专利（CN 101411745A）公开了一种以渗漉法和大孔吸附树脂法结合起来从中药丹参中提取纯化得总丹参酮类化合物，由于上述专利均使用大量有机溶剂，操作流程较多，可获得的丹参酮类单体化合物比例低，生产成本高等技术问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供一种从丹参中提取纯化丹参酮类单体化合物的制备方法，利用丹参酮类化合物在弱酸条件下具有良好稳定的物化性质，采用在弱酸条件下的多级逆流萃取法和大孔吸附树脂分离纯化相结合技术制备丹参酮类单体化合物，工艺简单、操作简便，成本低，能够实现批量生产丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮三种单体化合物。

为了达到以上技术效果，本发明的技术方案如下：

一种从丹参中提取纯化丹参酮类单体化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A：将丹参药材粉碎成丹参粉，加入4-8倍的70%-95%体积浓度的醇-酸水溶液，进行多级逆流萃取提取2-6小时，提取液过滤后在30-60℃度下减压浓缩得丹参酮粗品；

步骤B：大孔吸附树脂分离纯化：将上述丹参酮粗品加入到大孔吸附树脂层析柱中进行梯度洗脱，洗脱液分别收集、进行TLC跟踪，得到丹参酮I洗脱液、丹参酮IIA洗脱液和隐丹参酮洗脱液，分别减压浓缩后分别得丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮。

所述醇-酸水溶液为甲醇-磷酸水溶液、乙醇-磷酸水溶液、异丙醇-磷酸水溶液、甲醇-甘氨酸水溶液、乙醇-甘氨酸水溶液、异丙醇-甘氨酸水溶液、甲醇-丙氨酸水溶液、乙醇-丙氨酸水溶液或异丙醇-丙氨酸水溶中的一种或几种；所述醇-酸水溶液的PH值为4.0-6.5；更优选的所述醇-酸水溶液的PH值为4.5-5.5。

所述减压浓缩的真空度为0.05-0.1MPa。

所述丹参粉的粒度为20-60目。作为更优选，丹参粉的粒度为40-50目。

所述大孔吸附树脂为D101型或DM-301型大孔吸附树脂。

所述梯度洗脱中丹参酮粗品上样量与大孔吸附树脂质量比为1:30-100。

所述中洗脱液梯度设置分别为体积浓度分别为48-52%的乙醇-水溶液，58-62%的乙醇 - 水溶液，68-72% 的乙醇 - 水溶液，78-82% 的乙醇 - 水溶液和 88-92% 的乙醇 - 水溶液。

本发明与现有技术相比有如下有益效果：

本发明提供了一种从丹参中提取纯化丹参酮类单体化合物的制备方法，利用丹参酮类化合物在弱酸条件下具有良好稳定的物化性质，采用在醇-酸水溶液进行多级逆流萃取法，醇-酸水溶液能够在提取时保护丹参的有效成分，大大提高丹参药材中有效成分的提取率，大孔吸附树脂分离纯化采用的D101型及DM-301型大孔吸附树脂均可反复利用，以乙醇 - 水溶液作为溶剂，经济实用，可以方便高效地获取高纯度丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮单体化合物，各单体化合物纯度达95%以上，工艺简单、操作简便，成本低，适于批量生产。

具体实施方式

下面将结合具体实施例来详细说明本发明的技术方案，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明的技术方案，但并不作为对本发明的限定。

实施例一：

将丹参药材粉碎成40-50目丹参粉，称取120克丹参粉，装入多级逆流萃取装置中，再加入1200 ml的80%的乙醇-磷酸水溶液进行逆流萃取5小时，萃取后进行过滤，在真空（0.05-0.1MPa）下浓缩，50℃左右减压浓缩得丹参酮粗品6.8克。

取柱长为450 mm，内径为45 mm的玻璃色谱柱，装350 ml D101大孔吸附树酯，将上述丹参酮粗品上样于层析柱柱顶，然后分别用流动相50%、60%、70%、80%、90%的乙醇-水溶液进行梯度洗脱，TLC板跟踪，在真空（0.05-0.1MPa）下浓缩，用无水乙醇带水，分别得到0.19克丹参酮I（纯度95.5%）、0.42克丹参酮IIA（纯度97.8%）和0.25克隐丹参酮（纯度97.1%）。

其核磁共振解析如下：

丹参酮I：mp：230～231℃，¹H NMR（400 MHz，CDCl₃）, δ：9.22 (d. 1H, J=8.7Hz), 8.28(d, 1H, J=8.6Hz), 7.78(d, 1H, d, J=8.6 Hz), 7.31～7.63 (m. 2H), 7.28(s, 1H), 2.67(s, 3H), 2.27(s, 3H) 。

¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃）, δ：183.5, 175.6, 161.2, 142.0, 135.2, 133.6, 133.0, 132.7, 130.7, 129.6, 128.3, 124.7, 123.1, 121.8, 120.5, 118.7, 19.9, 8.8。

丹参酮ⅡA：mp：201～203℃，¹H NMR（400 MHz，CDCl₃）。δ: 7.61 (d, 1H, J=8.4 Hz), 7.52 (d, 1H, J=8.4 Hz), 7.22 (m. 1H), 3.16 (t, 2H), 2.24 (s, 3H), 1.77 (m, 2H), 1. 62 (m, 2H), 1.29 (s, 6H) 。

¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃）, δ: 183.7, 175.8, 150.1, 144.5, 141.3, 133.4, 127.4, 126.4, 121.1, 120.2, 37.8, 34.6, 31.8, 29.9, 19.1, 8.8。

隐丹参酮：mp：184～185℃, ¹H NMR（400 MHz，CDCl₃）。δ: 7.62 (d, 1H, J=8.2 H), 7.48 (d, 1H, J=8.2 Hz), 4.87 (m, 1H), 4.33 (s, 1H), 3.57 (m, 1H), 3.19 (t, 2H), 1.77 (m, 2H), 1.64 (m, 2H), 1.29 (s, 3H), 1.28 (s, 6H) 。

¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃）, δ: 184.2, 175.7, 170.8, 152.4, 143.7, 132.6, 128.4, 126.2, 122.5, 118.3, 81.4, 37.9, 35.1, 34.6, 32.1, 29.7, 29.4, 19.0, 18.8。

实施例二：

将丹参药材粉碎成40-50目丹参粉，称取120克丹参粉，装入多级逆流萃取装置中，再加入1200 ml的80%的甲醇-甘氨酸水溶液，进行多级逆流萃取4小时，对萃取物进行过滤，滤液在真空（0.05-0.1MPa）下浓缩，55℃左右减压浓缩得丹参酮粗品6.5克。

取柱长为450 mm，内径为45 mm的玻璃色谱柱，装250 ml DM301大孔吸附树酯，将上述丹参酮粗品样品上样于层析柱柱顶，然后分别用流动相50%、60%、70%、80%、90%的乙醇-水溶液进行梯度洗脱，TLC板跟踪，在真空（0.05-0.1MPa）下浓缩，用无水乙醇带水，分别得到0.18克丹参酮I（纯度97.5%）、0.39克丹参酮IIA（纯度98.1%）和0.22克隐丹参酮（纯度98.1%）。

实施例三：

将丹参药材粉碎成40-50目的丹参粉，称取120克丹参粉，装入多级逆流萃取装置中，再加入1200 ml的80%的异丙醇-丙氨酸水溶液，进行常温多级逆流萃取6小时，取出萃取物进行过滤，滤液在真空（0.05-0.1MPa）下浓缩，30℃左右减压浓缩得丹参酮粗品6.9克。

取柱长为450 mm，内径为45 mm的玻璃色谱柱，装350 ml D101大孔吸附树酯，将上述丹参酮粗品上样于层析柱柱顶，然后分别用流动相50%、60%、70%、80%、90%的乙醇-水溶液进行梯度洗脱，TLC板跟踪，在真空（-0.6-0.1MPa）下浓缩，用无水乙醇带水，分别得到0.37克丹参酮IIA（纯度97.4%）、0.24克隐丹参酮（纯度96.9%）和0.20克丹参酮I（纯度96.8%）。

本发明采用多级逆流萃取工艺制备纯化丹参酮类单体化合物，用甲醇-磷酸、乙醇-磷酸、异丙醇-磷酸、甲醇-甘氨酸、乙醇-甘氨酸、异丙醇-甘氨酸、甲醇-丙氨酸、乙醇-丙氨酸或异丙醇-丙氨酸的水溶液配制的醇-酸水溶液，对丹参粉进行多级逆流萃取提取获得丹参酮粗品，再选用 D101 型大孔吸附树脂或 DM-301 型大孔吸附树酯进行分离纯化获得高纯的丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮单体化合物，工艺流程简单，可操作性强，成本低，提取率高，适用于批量生产。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种从丹参中提取纯化丹参酮类单体化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种从丹参中提取纯化丹参酮类单体化合物的制备方法，其特征在于：所述醇-酸水溶液为甲醇-磷酸水溶液、乙醇-磷酸水溶液、异丙醇-磷酸水溶液、甲醇-甘氨酸水溶液、乙醇-甘氨酸水溶液、异丙醇-甘氨酸水溶液、甲醇-丙氨酸水溶液、乙醇-丙氨酸水溶液或异丙醇-丙氨酸水溶中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的一种从丹参中提取纯化丹参酮类单体化合物的制备方法，其特征在于：所述减压浓缩的真空度为0.05-0.1MPa。

4.根据权利要求1所述的一种从丹参中提取纯化丹参酮类单体化合物的制备方法，其特征在于：所述丹参粉的粒度为20-60目。

5.根据权利要求1所述的一种从丹参中提取纯化丹参酮类单体化合物的制备方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂为D101型或DM-301型大孔吸附树脂。

6.根据权利要求1所述的一种从丹参中提取纯化丹参酮类单体化合物的制备方法，其特征在于：所述梯度洗脱中丹参酮粗品上样量与大孔吸附树脂质量比为1:30-100。

7.根据权利要求2所述的一种从丹参中提取纯化丹参酮类单体化合物的制备方法，其特征在于：所述醇-酸水溶液的PH值为4.0-6.5。

8.根据权利要求1-7任一项所述的一种从丹参中提取纯化丹参酮类单体化合物的制备方法，其特征在于：所述中洗脱液梯度设置分别为体积浓度分别为48-52%的乙醇-水溶液，58-62%的乙醇 - 水溶液，68-72% 的乙醇 - 水溶液，78-82% 的乙醇 - 水溶液和 88-92% 的乙醇 - 水溶液。