CN109925303A - 迷迭香类化合物在防治自身免疫性肝炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种迷迭香类化合物在防治自身免疫性肝炎药物中的应用。迷迭香类化合物可显著降低ConA诱导的肝炎/肝损伤，通过降低血清转氨酶ALT/AST水平，抑制炎性细胞因子的产生，包括肿瘤坏死因子α(TNF‑α)、白细胞介素6(IL‑6)、干扰素‑γ(IFN‑γ)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)，发挥抗炎作用，缓解肝炎/肝损伤。本发明还提供一种防治自身免疫性肝炎的药物，包括迷迭香类化合物。

Description

迷迭香类化合物在防治自身免疫性肝炎药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种迷迭香类化合物在防治自身免疫性肝炎药物中的应用。

背景技术

肝脏(Liver)是最大的消化腺，是体内能量代谢的中心。肝炎(Hepatitis)，指的是各种致病因素对肝细胞的破坏和肝功能受损,常见的致病因素是病毒、细菌、寄生虫、化学毒物、药物、酒精、自身免疫因素等使肝脏细胞受到破坏，肝脏的功能受到损害，引起身体一系列不适症状，以及肝功能指标的异常。根据病因可以分为病毒性、细菌性(如阿米巴)药物性、酒精性、中毒性、自身免疫性、非酒精性脂肪性等。

通常我们生活中所说的肝炎，多数指的是由乙型、丙型等肝炎病毒引起的病毒性肝炎。乙型病毒性肝炎(viral hepatitis B，简称乙肝)系由乙肝病毒(HBV)引起，HBV在正常免疫功能的感染者引起急性病变；在异常免疫功能者则发生慢性肝炎和慢性肝病。HBV不是致细胞病变性病毒，HBV感染后须经宿主的免疫应答引起病变，并使疾病进展。主要经血液传播，母婴传播，性传播，皮肤粘膜破损传播。以乏力、食欲减退、恶心、呕吐、厌油、肝大及肝功能异常为主要临床表现。部分病例有发热和黄疸；少数病例病程迁延转为慢性，或发展为肝硬化甚至肝癌；重者病情进展迅猛可发展为重型肝炎；另一些感染者则成为无症状的病毒携带者。丙型病毒性肝炎(viral hepatitis C，简称丙肝)是一种由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的病毒性肝炎，HCV感染是致病根本原因，在外界因素的影响下，如饮酒，劳累，长期服用有肝毒性的药物等，可促进病情的发展。丙肝的病理改变与乙肝极为相似，以肝细胞坏死和淋巴细胞浸润为主。慢性肝炎可出现汇管区纤维组织增生，严重者可以形成假小叶即成为肝硬化。主要经输血、针刺、吸毒等传播。与乙型肝炎相同，临床上也是以乏力、食欲减退、恶心、呕吐、厌油、肝大及肝功能异常为主要表现。丙型肝炎呈全球性流行，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌。病毒性肝炎一般采用抗病毒治疗，运用干扰素、拉米夫定、泛昔洛韦等药物抑制病毒HBV或HCV。

自身免疫性肝炎(autoimmune hetatitis,AIH)已成为世界范围内发病率较高的肝脏疾病之一。近年来在我国的发病率也日渐增高，成为继病毒性肝炎后第二大肝脏炎症性疾病。自身免疫性肝炎无传染性，遗传易感性被认为是其主要因素，而其他因素可能是在遗传易感性基础上引起机体免疫耐受机制破坏，产生针对肝脏自身抗原的免疫反应，从而破坏肝细胞导致肝脏炎症坏死，并可进展为肝纤维化、肝硬化。其临床特征为不同程度的血清转氨酶升高、高γ-球蛋白血症、自身抗体阳性，组织学特征为以淋巴细胞、浆细胞浸润为主的界面性肝炎。近年来，欧洲，美国和亚洲国家严重自身免疫性肝炎的发病率成明星上升趋势,已发展为肝硬化，肝功能衰竭的主要诱因。对于自身免疫性肝炎的治疗，皮质类固醇单独或联合免疫抑制剂仍为目前临床上主要治疗方法之一，但同时各种药物不良反应所致的急性肝损伤也常见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够有效防治自身免疫性肝炎的化合物及其在防治自身免疫性肝炎药物中的应用。

为实现上述目的，本发明提供一种迷迭香类化合物在防治自身免疫性肝炎药物中的应用。

迷迭香类化合物是一类具有邻二酚羟基及共轭双键的化合物，其中迷迭香酸是其中的一种。迷迭香酸(Rosmarinic acid，RA)是从唇形科植物迷迭香中分离得到的一种水溶性的天然酚酸类化合物，分布较为广泛，主要存在于唇形科、紫草科、葫芦科、椴树科、伞形科的多种植物中，尤以唇型科和紫草科植物中含量最高，如迷迭香，牛至，百里香和其他几种药用植物，草药和香料。药用植物，草药和香料中迷迭香酸的存在具有有益和促进健康的作用。迷迭香酸是一种天然抗氧化剂，具有较强的抗氧化活性，有助于防止自由基造成的细胞受损，因此降低了癌症和动脉硬化的风险。迷迭香酸具有广谱抗微生物活性，对细菌和真菌均有抑制作用。迷迭香酸对枯草杆菌、藤黄细球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及立枯丝球菌等细菌有明显的抑制作用。科学发现迷迭香酸可抑制龋齿链球菌、变异链球菌的生长和生物膜形成，降低它们的葡萄糖基转移酶活性，表明迷迭香酸可用于口腔疾病的预防、治疗。此外还具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的活性，同时还具有较强的抗炎作用。据报道迷迭香酸用于治疗类风湿性关节炎，可通过线粒体诱导活化T细胞凋亡。还有研究发现迷迭香酸可用于防治病毒性肝炎，但其对自身免疫性肝炎的作用还未有研究。自身免疫性肝炎是免疫T细胞介导的慢性肝脏炎症和肝损伤。伴刀豆蛋白A(ConA)诱导的自身免疫性肝炎已广泛用于免疫介导的肝炎药物研究。已经表明ConA激活的CD4+T细胞和巨噬细胞产生损伤肝细胞的细胞因子，包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)，白细胞介素6(IL-6)，干扰素γ(IFN-γ)和其他炎症因子。

本发明使用ConA诱导的肝炎模型证明迷迭香类化合物具有明显治疗自身免疫性肝炎的作用。

较佳地，所述迷迭香类化合物的通式为：

式中，R选自羧基、甲基、乙基、氢、羟基中的一种。

较佳地，所述迷迭香类化合物为迷迭香酸，所述迷迭香酸分离自唇形科植物迷迭香。

本发明还提供一种防治自身免疫性肝炎的药物，包括上述所述的迷迭香类化合物。

本发明提供的迷迭香类化合物可显著降低ConA诱导的肝炎/肝损伤，通过降低血清转氨酶ALT/AST水平，抑制炎性细胞因子的产生，包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)，发挥抗炎作用，缓解肝炎/肝损伤。本发明提供的迷迭香类化合物材料分布广泛，资源量丰富，易于批量备料，其中迷迭香酸作为中草药副作用小，治疗效果显著。

附图说明

图1为实施例1中丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测结果图；

图2为实施例1中天冬氨酸氨基转移酶(AST)检测结果图；

图3为实施例2中注射ConA 8h丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测结果图；

图4为实施例2中注射ConA16h丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测结果图；

图5为实施例2中注射ConA24h丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测结果图；

图6为实施例2中注射ConA8h天冬氨酸氨基转移酶(AST)检测结果图；

图7为实施例2中注射ConA16h天冬氨酸氨基转移酶(AST)检测结果图；

图8为实施例2中注射ConA24h天冬氨酸氨基转移酶(AST)检测结果图；

图9为实施例3中迷迭香酸对ConA诱导的自身免疫性肝炎小鼠存活率结果图；

图10为实施例4中ConA诱导的Balb/c小鼠肝脏组织图；

图11为实施例4中ConA诱导的Balb/c小鼠肝脏组织切片图；

图12为实施例4中ConA诱导的Balb/c小鼠肝脏组织切片荧光显微镜图；

图13为实施例5中肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达水平图；

图14为实施例5中白介素6(IL-6)表达水平图；

图15为实施例5中干扰素γ(IFN-γ)表达水平图；

图16为实施例5中肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)表达水平图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施所述方法是对本发明做的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。本发明的实施例中所用的材料、试剂若无特殊说明皆可从商业途径获得。

以下以迷迭香酸为例进行详细说明。

将无病原体的BALB/c小鼠(7-8周)分成4组，即迷迭香酸空白对照组(RA)，正常对照组(Control)，ConA处理组(ConA)和迷迭香酸预理组(ConA+RA)，每组含有6只小鼠。迷迭香酸分离自唇形科植物迷迭香

实施例1、迷迭香酸防治ConA诱导的急性自身免疫性肝炎的最适浓度

设ConA(15mg/kg)，ConA+RA(30mg/kg)，ConA+RA(60mg/kg)，ConA+RA(120mg/kg)共4组，每组6只小鼠，每只老鼠约18-22g。RA以腹腔注射的方式给药，注射2h后，ConA以尾静脉注射的方式施用，注射剂量15mg/kg。注射ConA后8、16、24h经眼眶静脉丛取血，采血50μL±10μL；室温静置1.5-2h后，3500rpm、5min，将上层血清轻缓移至新EP管，-20℃冻存。使用转氨酶检测试剂盒检测ALT和AST血清水平，ALT：丙氨酸氨基转移酶，AST：天冬氨酸氨基转移酶。检测结果如图1、图2所示，数据表示为平均值±标准误差(n＝6，*P<0.05 for ConA，**P<0.01 for ConA；^#P<0.05 for ConA和ConA+RA(30mg/kg)，^##P<0.01 for ConA和ConA+RA(30mg/kg))。实验结果表明：与ConA组相比，RA预处理的三个浓度(30，60,120mg/kg)均显著降低血清转氨酶ALT/AST水平(*p<0.05,**p<0.01)，同时与ConA+RA(30mg/kg)组相比，ConA+RA(60mg/kg)组和ConA+RA(120mg/kg)的血清转氨酶ALT/AST活性显著下调(^#p<0.05,^##p<0.01)，而ConA+RA(60mg/kg)组与ConA+RA(120mg/kg)组相比，血清转氨酶ALT/AST水平无统计学差异。因此，RA治疗ConA诱导的自身免疫性肝炎的最适剂量为60mg/kg。

实施例2、最适迷迭香酸浓度防治ConA诱导的自身免疫性肝炎的效用

设Control，ConA(15mg/kg)，ConA+RA(60mg/kg)，RA(120mg/kg)共4组，每组6只小鼠，每只老鼠约18-22g。RA/PBS以腹腔注射的方式给药，注射2h后，ConA/PBS以尾静脉注射的方式施用，注射剂量15mg/kg。注射ConA后8h、16h、24h经眼眶静脉丛取血，采血50μL±10μL；室温静置1.5-2h后，3500rpm、5min，将上层血清轻缓移至新EP管，-20℃冻存。使用转氨酶检测试剂盒检测转氨酶ALT和AST血清水平。检测结果如图3-8所示，数据表示为平均值±标准误差(n＝6，*P<0.05，**P<0.01for ConA)。结果显示，ConA诱导的自身免疫性肝炎引起的血清转氨酶水平升高，在16h达到最高。与ConA组相比，Control组，ConA+RA组和RA组均显著下调ConA注射后8、16、24h的血清转氨酶ALT/AST活性(*p<0.05,**p<0.01)。RA作为治疗药物可以有效的缓解ConA诱导的自身免疫性关节炎。

实施例3、迷迭香酸对ConA诱导的自身免疫性肝炎小鼠存活率的影响

设ConA(30mg/kg)，ConA+RA(60mg/kg)，RA(120mg/kg)共3组，每组10只小鼠，每只老鼠约18-22g。RA/PBS以腹腔注射的方式给药，注射2h后，ConA/PBS以尾静脉注射的方式施用，注射剂量30mg/kg。注射ConA后每隔4h观察小鼠一次，28h后安乐死处死剩余存活小鼠，结果如图9所示，存活率(％)数据表示为平均值±标准误差(n＝10,**p<0.01)。实验结果显示，Control组存活率一直为100％，ConA组在ConA以致死剂量注射20h时，存活率降到0％，而ConA+RA组存活率在ConA注射后16h达到60％，此后几小时抑制保持不变直达安乐处死，并且与ConA组相比显著提高存活率(**p<0.01)。RA施用可以有效的提高ConA诱导的肝炎的存活率。

实施例4、ConA诱导的Balb/c小鼠肝细胞凋亡

在ConA注射后24h收集肝组织用于拍照并进行组织病理学研究。将拍照后的肝组织固定在10％缓冲的福尔马林中并包埋在石蜡中，将组织切片并用苏木精和曙红(HE)染色以通过光学显微镜检测炎症和组织损伤的水平。根据制造商的说明书(Promega，USA)，使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP-生物素缺口末端标记(TUNEL)反应测定石蜡包埋的肝组织的DNA片段化，然后通过荧光显微镜检查切片的肝细胞凋亡。图10中肝脏组织获自Control(a)，RA(b)，ConA(c)和ConA+RA(d)组；图11中Control(e)，RA(f)，ConA(g)和ConA+RA(h)组切片使用苏木精-伊红染色，原始放大倍数×200；图12显示TUNEL标记的(绿色)凋亡细胞在肝组织切片中用DAPI(蓝色)复染。TUNEL标记(a，d，g和j)揭示凋亡细胞，而DAPI染色的切片(b，e，h和k)标记细胞核。肝切片中TUNEL/DAPI(c，f，i和l)的共定位。箭头表示ConA组的肝切片(d和f)中的凋亡细胞的聚集体，原始放大倍数×200。结果说明，ConA诱导的肝炎的特征在于炎性浸润和广泛的肝细胞死亡。我们在ConA组中观察到更多的炎性浸润和广泛的肝细胞死亡。相比之下，在ConA+RA组中观察到较少的肝损伤和炎性浸润，并且与ConA组相比，该组中凋亡细胞的数量减少。并且Control组和RA组没有明显的肝损伤(图10)和炎症浸润(图11)和肝细胞死亡(图12)。这些结果表明RA预处理可以有效地防止肝损伤，炎性细胞浸润和肝细胞死亡，从而达到治疗肝炎/肝损伤的目的。

实施例5、自身免疫性肝炎肝脏促炎细胞因子mRNA表达水平检测

设ConA(15mg/kg)、ConA+RA(60mg/kg)、RA(60mg/kg)，共3组。在PBS或ConA(15mg/kg)注射后0、1、3、6和9h对小鼠实施安乐死。每组在每个时间点有三只小鼠。收集肝组织并用液氮研磨成粉末。根据制造商的说明提取总RNA并逆转成cDNA。用于RT-PCR的引物如下表所示：肿瘤坏死因子α(TNF-α)，肿瘤坏死因子相关凋亡配体(TRAIL)，白介素6(IL-6)，干扰素γ(IFN-γ)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。

所有样品一式三份进行测试，细胞因子mRNA表达归一化为GAPDH mRNA。使用比较Ct(ΔCt)方法测定研究组之间基因表达的相对差异，结果如图13-16所示。图中肝组织获取自ConA模型组(ConA)，迷迭香酸预处理组(ConA+RA(60mg/kg))和迷迭香酸空白对照组(RA(60mg/kg))，分别为ConA注射后0、1、3、6、9h。通过RT-PCR检测TNF-α(α)，IL-6(b)，IFN-γ(c)和TRAIL(d)的水平，数据表示为平均值±SEM(n＝3，*P<0.05，**P<0.01)。结果表明：有研究表明在淋巴细胞浸润之前细胞因子的产生达到峰值，说明高细胞因子水平与肝损伤之间的关联。该炎症过程由细胞因子介导，包括IL-6，IFN-γ，TRAIL和TNF-α。我们的研究结果显示，RA预处理(ConA+RA)下调IL-6，IFN-γ，TRAIL和TNF-αmRNA的表达，与ConA处理组相比有显着差异(*p<0.05,**p<0.01)。IL-6和TNF-αmRNA表达在1h达到最高，随后以时间依赖性方式降低，但IFN-γ在6h达到最高，TRAIL在3h达到最高。这些结果表明RA可以通过抑制ConA诱导的肝炎中IL-6，IFN-γ，TRAIL和TNF-α等细胞因子的表达，发挥抗炎作用，缓解自身免疫性肝炎/肝损伤。

其他迷迭香类化合物中由于含有邻二酚羟基和共轭双键，也同样具有上述实施例中记载的效果，在此不一一赘述。

本发明提供的迷迭香类化合物可显著降低ConA诱导的肝炎/肝损伤，通过降低血清转氨酶ALT/AST水平，抑制炎性细胞因子的产生，包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)，发挥抗炎作用，缓解肝炎/肝损伤。本发明提供的迷迭香类化合物材料分布广泛，资源量丰富，易于批量备料，其中迷迭香酸作为中草药副作用小，治疗效果显著。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 江西华普康明生物科技有限公司

<120> 迷迭香类化合物在防治自身免疫性肝炎药物中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tagctcccag aaaagcaagc 20

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<212> DNA

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ttttctggag ggagatgtgg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccctgcttgc aggttaagag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcctaaggt ctttccatcc 20

<210> 5

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<212> DNA

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<210> 6

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<210> 7

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<212> DNA

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<210> 8

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<212> DNA

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<210> 9

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<212> DNA

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

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Claims (4)

1.一种迷迭香类化合物在防治自身免疫性肝炎药物中的应用。

2.如权利要求1所述的迷迭香类化合物在防治自身免疫性肝炎药物中的应用，其特征在于，所述迷迭香类化合物的通式为：

式中，R选自羧基、甲基、乙基、氢、羟基中的一种。

3.如权利要求1所述的迷迭香类化合物在防治自身免疫性肝炎药物中的应用，其特征在于，所述迷迭香类化合物为迷迭香酸，所述迷迭香酸分离自唇形科植物迷迭香。

4.一种防治自身免疫性肝炎的药物，其特征在于：包括如权利要求1-3任一项所述的迷迭香类化合物。