CN1861191A - 人sDR5蛋白作为乙型病毒性肝炎治疗药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人sDR5蛋白的新用途，尤其公开了人sDR5蛋白作为乙型病毒性肝炎特别是急性重症乙型病毒性肝炎保肝治疗药物的应用和人sDR5蛋白在制备阻断乙型病毒性肝炎特别是急性重症乙型病毒性肝炎肝细胞凋亡药物中的应用。其中，所述人sDR5蛋白的有效用量是2－64mg/kg，通过阻断或封闭TRAIL的作用来降低肝细胞凋亡，减轻肝细胞损伤，以达到抗炎保肝作用。本发明的人sDR5蛋白的新用途为通过降低乙肝的肝细胞凋亡、减轻肝细胞损伤，改善预后，又提供了一条应用前景诱人的治疗急性重症乙型病毒性肝炎的途径，为新型药物的开发提供了依据。

Description

人sDR5蛋白作为乙型病毒性肝炎治疗药物的应用

(一)技术领域

本发明涉及人sDR5(可溶性死亡受体5，soluble DR5，简称sDR5)蛋白的用途，尤其涉及人sDR5蛋白作为乙型病毒性肝炎特别是急性重症乙型病毒性肝炎治疗药物的应用。

(二)背景技术

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种世界性疾病，特别是在中国最为常见，发病率高，且呈持续高流行态势，其不仅直接影响人群的健康，甚至还危及人的生命安全，严重影响了人们的生产、生活、工作和学习，所造成的直接和间接的经济损失难以估量。

在我国法定报告的传染病中，多年来乙型病毒性肝炎的发病数和发病率一直高居前列，2005年国家将乙型病毒性肝炎列为四大重点防治的传染病。2006年2月13日卫生部发布了“十一五”全国乙型病毒性肝炎防治规划，该规划分析了乙型病毒性肝炎在我国的流行现状：1992-1995年全国病毒性肝炎血清流行病学调查显示，我国人群乙肝病毒感染率为57.6％，乙肝病毒携带率为9.75％，据此推算全国有6.9亿人曾感染过乙肝病毒，其中1.2亿人长期携带乙肝病毒。据专家估计，目前全国慢性乙肝病患者约有2,000万人，每年有约35万人死于慢性乙肝相关疾病。

乙型病毒性肝炎给病人、家庭、社会造成沉重的经济负担，给社会经济发展带来不容忽视的影响，是许多家庭因病致贫、因病返贫的重要原因，同时也引发出一系列社会问题，是我国现阶段最为突出的公共卫生问题之一。

乙型病毒性肝炎的临床表现多样化，以重症型肝炎和慢性肝炎最为突出。重症型乙型肝炎包括急性重症性肝炎(暴发性肝炎)、亚急性重症性肝炎(亚急性肝坏死)和慢性重症性肝炎，极易发展成坏死性肝硬化，预后极差，病死率高达60-70％以上。

乙型病毒性肝炎与普通肝炎不同，普通肝炎的种类很多，包括药物或化学毒物引起的药物性肝炎或中毒性肝炎；酗酒引起的酒精性肝炎；其他全身性疾病及传染病引起的肝功能异常；自身免疫性肝炎。由于普通肝炎临床表现与乙型病毒性肝炎极为相似，生活和治疗中常与乙型病毒性肝炎混淆，但他们的发病机制迥然不同，因此，两者的治疗措施也明显有别。

乙型病毒性肝炎的发病是乙型肝炎病毒与机体之间相互作用的结果。乙型肝炎病毒属于嗜肝DNA病毒，可选择性地感染肝细胞，诱发肝炎。乙型肝炎病毒的量、毒力和侵入途径与发病有一定关系。小量乙型肝炎病毒往往只引起隐性感染，而大量病毒则可导致严重的病变。肝炎的病变程度和类型与机体的免疫状态也有密切关系。

乙型病毒性肝炎的肝损伤及发病机制简述如下：

(1)肝细胞损伤的机制：乙型肝炎病毒侵入机体后进入肝细胞内复制繁殖，然后以“发芽”形式从肝细胞释出入血。在肝细胞表面则留下病毒抗原成分，此时并不引起明显的肝细胞损伤。病毒入血后，刺激机体免疫系统产生细胞免疫和体液免疫。前者通过杀伤性T细胞及NK细胞等的直接作用和抗体依赖性的细胞毒作用，后者通过产生各种特异性抗体，均能对血中病毒进行反应并加以杀灭。但同时也能对受病毒感染的肝细胞(膜上含病毒抗原成分)进行攻击，使肝细胞受到破坏发生坏死。一般认为，T细胞介导的细胞免疫反应致靶细胞杀伤及诱导凋亡是病毒感染后引起肝细胞损伤的主要因素。

(2)乙型病毒性肝炎的发病机制：上述肝细胞免疫损伤机制可以导致不同类型的乙型病毒性肝炎：①T细胞功能正常，感染病毒量多，毒力强时受感染及免疫损伤的肝细胞多而重，表现为急性重型肝炎；②T细胞功能正常，病毒量较少，毒力较弱则发生急性普通型肝炎；③T细胞功能正常，病毒量甚少，毒力很弱则表现为轻型或亚临床型肝炎；④T细胞功能不足，免疫反应仅能清除部分病毒和损伤部分受感染的肝细胞，未清除的病毒可继续繁殖并感染，反复发生部分肝细胞损伤，结果表现为慢性肝炎；⑤机体免疫功能缺陷，T细胞呈免疫耐受状态，此时病毒与宿主共生。病毒在肝细胞内持续复制，感染的肝细胞也不受免疫损伤，此时则表现为无症状的病毒携带者。

乙型病毒性肝炎的治疗主要包括抗病毒复制【常用药：干扰素(Interferons，IFN)、无环鸟苷(Acyclovir，ACV，国产阿普洛韦)、阿糖腺苷(Ara-A)及单磷酸阿糖腺苷(Ara-AMP)、聚肌胞(PolyI:C)】、提高机体免疫功能【常用药：胸腺肽、白细胞介素2(IL-2)】、保护肝细胞及促进肝细胞再生【常用药：益肝灵、强力宁、齐墩果酸片】等措施。但是，这些治疗措施应用后，虽可抑制HBV复制，但停药后这种抑制作用消失，使原被抑制的指标又恢复到原水平，其原因在于药物没能抑制HBV的超螺旋共价闭合环型DNA(ccc DNA)，故停药后cccDNA重新成为病毒复制中转录的模板，使病毒又得以复制。治疗中有些药物作用较慢，需较长时间才能看到效果。有些药物还伴随着畏寒、发热、头痛、全身酸痛、乏力、白细胞减少、血小板减少等副作用。因此，开发治疗效果好、特异性强、作用快、副作用少的乙型病毒性肝炎治疗药物迫在眉睫。

近来有报道：死亡受体5(Death receptor，DR5)为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的特异性、高亲和力受体之一，与TRAIL结合后可有效激活胞内信号转导途径，诱导细胞发生凋亡反应。DR5主要分布于外周血淋巴细胞和骨骼肌细胞，与TRAIL结合后通过接头分子FADD/MOTRl传递信息，并依赖于caspase家族的级联反应诱导细胞凋亡。全长的DR5含有411个氨基酸，属I型跨膜糖蛋白。可溶性死亡受体5(soluble DR5，sDR5)为DR5不含跨膜区域的可溶性形式，因缺乏跨膜区域不能在细胞膜上表达而被分泌至细胞外。sDR5在正常人外周血中有低水平表达。因其具有与TRAIL配体相结合的胞外段完整结构，可与膜型死亡受体竞争性结合TRAIL分子，从而阻断TRAIL诱导的细胞凋亡反应。

小鼠体内的DR5与人类的DR5高度同源(79％)。

人sDR5蛋白在2000年首先由Song等利用基因工程的方法表达纯化出来，并将其应用于自身免疫性关节炎的研究，发现携载TRAIL基因的重组腺病毒(TRAIL-Ad)可减轻小鼠的实验性关节炎，用人sDR5蛋白阻断TRAIL则会加重关节炎的症状[参见：SongK，Chen Y，Goke R，et al.Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)is an inhibitor of autoimmune inflammation and cell cycle progression.JExp Med，2000；191(7)：1095-1104.]。2002年6月，Zhang等以腺病毒载体介导的TRAIL基因转染BALB/c小鼠，TRAIL在肝细胞内的过度表达可以诱导大量肝细胞的死亡，若给予腺病毒sDR5(AdsDR5)能够有效减弱TRAIL诱导的肝细胞死亡效应[参见：Zhang HG，Xie J，Xu L，et al.Hepatic DR5 induces apoptosis and limits adenovirus genetherapy product expression in the liver.J Virol，2002；76(11)：5692-5700.]。同年11月，Mundt等发现HBV相关的急性肝衰竭的病人肝组织中过度表达DR5，以腺病毒Ad-LacZ诱导小鼠建立非特异性肝炎模型，结果发现腺病毒诱导的肝炎小鼠肝组织DR5的表达上调[参见：Mundt B，Kuhnel F，Zender L，et al.Involvement of TRAIL andits receptors in viral hepatitis.FASEB J，2003；17(1)：94-96.]。

在上述报道的诸项对sDR5的研究中，只是对sDR5参与自身免疫性关节炎和腺病毒介导的非特异性肝炎的情况进行了研究，虽然在腺病毒介导的小鼠肝炎研究中是利用AdsDR5基因中和TRAIL的作用，但仅只限于非特异性肝炎，腺病毒介导的非特异性肝炎与HBV介导的肝脏特异性乙型病毒性肝炎的发病机制及治疗方案均有所不同，上述报道未见有人sDR5蛋白对HBV介导的肝脏特异性乙型病毒性肝炎作用的提示。

急性重症性乙型肝炎(暴发性肝炎)的发生与肝细胞的过度凋亡密切相关，针对凋亡发生的信号传导通路，利用sDR5与膜型DR5竞争结合TRAIL，使TRAIL不能启动凋亡的发生，可减轻肝细胞损伤程度从而改善病人的预后。

经权威机构检索查新，利用人sDR5蛋白作为乙型病毒性肝炎治疗药物，通过阻断或封闭TRAIL的作用来降低肝细胞凋亡，减轻肝细胞损伤的研究，目前国内外尚未见报道。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供人sDR5蛋白的新用途，即人sDR5作为乙型病毒性肝炎特别是急性重症乙型病毒性肝炎保肝治疗药物的应用。

本发明涉及的人sDR5蛋白作为乙型病毒性肝炎治疗药物的应用。

其中：所述人sDR5蛋白优选作为急性重症乙型病毒性肝炎治疗药物的应用。

在上述的应用中：减轻肝细胞损伤的人sDR5蛋白用量是2-64mg/kg。

其中：明显减轻肝细胞损伤的人sDR5蛋白用量是4-32mg/kg，最佳用量是16mg/kg。

本发明涉及的人sDR5蛋白在制备阻断乙型病毒性肝炎肝细胞凋亡药物中的应用。

其中：所述人sDR5蛋白优选在制备阻断急性重症乙型病毒性肝炎肝细胞凋亡药物中的应用。

在上述的应用中：阻断肝细胞凋亡的人sDR5蛋白用量是2-64mg/kg。

其中：明显阻断肝细胞凋亡的人sDR5蛋白用量是4-32mg/kg，最佳用量是16mg/kg。

上述人sDR5蛋白通过阻断或封闭TRAIL的作用来降低肝细胞凋亡，减轻肝细胞损伤，以达到抗炎保肝作用。

本发明的人sDR5蛋白的新用途为通过降低乙型病毒性肝炎的肝细胞凋亡、减轻肝细胞损伤，改善预后，又提供了一条应用前景诱人的治疗急性重症乙型病毒性肝炎的途径，为新型药物的开发提供了依据。

为了更好地理解本发明的实质及本发明所述人sDR5蛋白的作用效果，下面以人sDR5蛋白的动物实验及结果，来进一步阐述其在阻断肝细胞凋亡，减轻肝细胞损伤方面的作用。

人sDR5蛋白的制备：

常规方法活化含pGAPZ_αA-sDR5和空载体pGAPZ_αA的毕赤酵母菌株，并大量扩增含sDR5的毕赤酵母菌株GS115菌株(参见：Song K，Chen Y，Goke R，et al.Tumor necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)is an inhibitor of autoimmuneinflammation and cell cycle progression.J Exp Med，2000；191(7)：1095-1104)，收集培养上清，利用ProBond^TM亲和层析柱纯化重组sDR5蛋白。获得纯化的重组人sDR5蛋白，SDS-PAGE(见附图1)、Western Blot(见附图2)检测纯化产物的纯度；Folin-酚比色法测定纯化后人sDR5蛋白的浓度(见附图3)；用MTT法检测纯化的人sDR5蛋白对TRAIL诱导人宫颈癌细胞系HeLa细胞凋亡作用的阻断效应(见附图4)。

转化阳性的毕赤酵母GS115菌株可成功表达分子量大小为26kD的sDR5蛋白，纯化后的sDR5蛋白经鉴定，结果显示获得了高纯度的重组人sDR5蛋白，蛋白产量达20μg/ml；经体外活性检测，结果显示纯化的人sDR5蛋白可部分阻断TRAIL诱导的HeLa细胞凋亡，阻断率最高达53.6％。经上述验证后，纯化的人sDR5蛋白-80℃保存，备用。

急性乙型病毒性肝炎小鼠动物模型的制备：

经QIAGEN质粒大量提取试剂盒纯化重组质粒pcDNA3-HBV1.1(参见：张秋，孙汶生，高立芬等.TRAIL诱导HBV转染肝癌细胞BEL-7402凋亡的作用及机制研究.中华微生物学和免疫学杂志，2005；25(5)：357-362.)，以生理盐水调整浓度为20～50μg/ml。

实验用小鼠为SPF级BALB/c小鼠，4～6周龄，雄性，体重18～22g，由山东大学实验动物中心提供，饲养条件按照SPF级动物标准执行。

尾静脉高压注射：先将所述小鼠置于高温环境，使尾静脉扩张；注射前用乙醚麻醉，观察小鼠反射情况；5秒内将1.4～2.0ml重组质粒pcDNA3-HBV1.1液体经尾静脉匀速注射入小鼠体内，小鼠置于25～28℃环境中观察。

成功经尾静脉高压注射重组质粒pcDNA3-HBV1.1后；经血清谷丙转氨酶(ALT)(见附图5)、乙肝表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)测定(见附图6)，实时定量PCR检测HBV DNA(见附图7)以及肝脏病理(见附图8)等实验，结果显示：尾静脉高压注射pcDNA3-HBV1.1后的小鼠血清ALT在8小时达到800u，24小时为350u；HBsAg、HBeAg第1天最高，主要表达HBsAg，可达1.5，以后逐渐下降，7天后消失；血清中检测到HBV DNA；肝脏组织切片显示病毒性肝炎病理改变。以上结果证实：小鼠急性乙型病毒肝炎动物模型建立成功。

利用细胞生物学和分子生物学的方法，进行如下实验：研究人sDR5蛋白对乙型病毒性肝炎小鼠肝脏损伤的影响。

将人sDR5蛋白溶于生理盐水中，参考该蛋白在小鼠实验性关节炎中的使用剂量[参见：Song K，Chen Y，Goke R，et  al.Tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand(TRAIL)is an inhibitor of autoimmune inflammationand cell cycle progression.J Exp Med，2000；191(7)：1095-1104.]，本发明中设计了1-64mg/kg的系列梯度：1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、16mg/kg、32mg/kg、64mg/kg，分别将人sDR5蛋白在上述动物模型制备之前24小时或模型制备的同时腹腔注射给小鼠，24小时后再重复注射一次，并设立乙型病毒性肝炎模型组及不同剂量的人sDR5蛋白提前治疗组、不同剂量的人sDR5蛋白同时治疗组、美能治疗组[阳性药物对照组，生产厂家：日本米诺发源制药有限公司(原日本美能发源制药公司)MinophagenPharmaceutical Co.，Tokyo，Japan；批号：90902B]、不同剂量的人sDR5对照组、不同剂量的人白蛋白对照组、空载体对照组、正常BALB/c小鼠对照组(生理盐水对照组)等一系列实验及对照组，于不同时间点采血并定期处死小鼠，分别检测小鼠血清ALT、HBV表面抗原、e抗原及抗体、HBV DNA含量、肝组织HBV核心抗原、TRAIL及DR5的表达、脾脏TRAIL的表达及肝组织损伤情况。

结果显示：模型组的ALT于8小时达到最高(820±138u)，以后逐渐降低，10天后降至正常范围；人sDR5蛋白提前治疗组：8小时为452±13.8u，24小时为178±9.2u，4天为151±7.8u，在以上时间点人sDR5蛋白治疗组ALT显著低于模型组，10天后即降至正常范围；美能治疗组：8小时为389±15.2u，24小时为137±11.6u，4天为142±14.5u，在以上时间点美能治疗组ALT显著低于模型组，10天后即降至正常范围，美能治疗组在以上时间点ALT略低于人sDR5蛋白治疗组，但两组之间无显著性差异，实验中仅给药两次，在第二次给药后第4天时仍可显著降低ALT的水平，但第7天、10天时由于药物在体内衰减导致ALT的变化趋势与模型组相同；人sDR5蛋白同时治疗组：8小时测定ALT结果与模型组无显著性差异(800±129u)，24小时明显下降(345±58u)；人白蛋白对照组变化趋势与模型组相同，而人sDR5蛋白对照组、空载体对照组、生理盐水对照组与正常小鼠无显著差异(见附图9)。肝脏组织切片HE染色也显示人sDR5蛋白治疗组，特别是人sDR5蛋白提前治疗组，可明显减轻急性肝炎模型中肝细胞的损伤及炎症反应：模型组表现为肝组织弥漫性淋巴细胞浸润，部分有中性粒细胞浸润，肝细胞呈气球样变，部分细胞有坏死表现；人sDR5蛋白提前治疗组和美能治疗组仅见部分肝细胞呈嗜酸性变，无明显肝组织炎性改变，两组之间无显著性差异(见附图10)。但人sDR5蛋白对HBV抗原、抗体的表达及HBV DNA含量并无影响。通过免疫组化及流式细胞术检测，显示人sDR5蛋白治疗组肝脏、脾脏TRAIL的表达低于模型组，而肝脏DR5的表达在治疗组与模型组无显著性差异。通过TUNEL染色，经流式细胞仪检测显示人sDR5蛋白提前治疗组肝细胞的凋亡率显著低于模型组(见附图11)。本实验选择了1-64mg/kg(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、16mg/kg、32mg/kg、64mg/kg)的人sDR5蛋白作为实验剂量，实验结果说明人sDR5蛋白经过两次腹腔注射，在2-64mg/kg的实验量时，尤其是4-64mg/kg的量时，人sDR5蛋白可阻断TRAIL引起的肝细胞凋亡，从而减轻乙型病毒性肝炎中的肝脏损伤。实验结果显示，人sDR5蛋白在16-64mg/kg时可显著减轻乙型病毒性肝炎中的肝脏损伤，但各组之间无显著性差异，说明人sDR5蛋白的剂量在16-64mg/kg时已达到饱和状态，再增加人sDR5蛋白的剂量也不会增加其效应，反而可能会由于剂量增加而引起副作用，根据以上实验结果，4-32mg/kg的人sDR5蛋白的剂量浓度作为治疗乙型病毒性肝炎优选的有效剂量较为合适。

由上述实验及其结果，可以得出如下结论：

人sDR5蛋白可明显减轻急性乙型病毒性肝炎小鼠的肝脏炎症，具体表现在ALT降低，肝脏病理切片无明显炎症表现，而且提前注射治疗组效果更好。通过机制研究发现，人sDR5蛋白治疗组肝细胞凋亡率明显低于模型组，并且免疫组化和流式细胞术结果显示治疗组肝组织和脾脏中TRAIL的表达较模型组减少。美能作为目前公认的乙型病毒性肝炎的最佳保肝药物，人sDR5蛋白的治疗效果与美能相比无显著性差异。这一结果表明TRAIL诱导的肝细胞凋亡在HBV感染后引起的肝细胞损伤过程中起重要作用，人sDR5蛋白可通过封闭或阻断TRAIL的效应而对肝细胞起保护作用，而且在治疗剂量范围内无任何毒副作用，因此，人sDR5蛋白将在制备治疗乙型病毒性肝炎特别是急性重症乙型病毒性肝炎的药物中有很大的应用价值，具有极其诱人的开发应用前景。

(四)附图说明

图1 各洗脱梯度产物SDS-PAGE电泳图

其中：1为低分子量蛋白Marker，2为350mmol/L洗脱液，3为200mmol/L洗脱液，4为100mmol/L洗脱液，5为50mmol/L洗脱液

图2 各洗脱梯度Western Blot显色结果

其中：1为50mmol/L洗脱液，2为100mmol/L洗脱液，3为200mmol/L洗脱液，4为350mmol/L洗脱液

图3 Folin-酚比色法绘制标准蛋白浓度曲线

图4 纯化的人sDR5蛋白对TRAIL诱导Hela细胞凋亡的阻断效应

图5 血清谷丙转氨酶(ALT)测定结果

图6 ELISA检测HBV抗原(HBsAg、HBeAg)

图7 实时定量PCR检测HBV DNA含量

图8 肝脏组织切片HE染色观察病理变化

可见肝组织弥漫性淋巴细胞浸润，部分有中性粒细胞浸润；肝细胞呈气球样变，部分细胞有坏死表现

图9 各组小鼠ALT测定结果

其中：模型为模型组，白蛋白为16mg/kg白蛋白对照组，sDR5为16mg/kg人sDR5蛋白提前治疗组，美能为10mg/kg美能治疗组

图10 各组小鼠肝脏病理切片HE染色

模型组表现为肝组织弥漫性淋巴细胞浸润，部分有中性粒细胞浸润，肝细胞呈气球样变，部分细胞有坏死表现；16mg/kg的人sDR5蛋白提前治疗组仅见部分肝细胞呈嗜酸性变，无明显肝组织炎性改变；10mg/kg美能治疗组肝组织无明显炎症改变。

其中：A1为空载体对照组，A2为模型组，A3为16mg/kg 人sDR5蛋白提前治疗组，A4为10mg/kg美能治疗组

图11 TUNEL染色检测各组小鼠肝细胞的凋亡水平

其中：A1、A2为模型组，B1、B2为16mg/kg人sDR5蛋白提前治疗组，C1、C2为正常BALB/c小鼠对照组

(五)具体实施方式

实施例1：人sDR5蛋白的纯化

常规方法活化含pGAPZ_αA-sDR5和空载体pGAPZ_αA的毕赤酵母菌株，并大量扩增含sDR5的毕赤酵母菌株GS115菌株(参见：Song K，Chen Y，Goke R，et al.Tumor necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)is an inhibitor of autoimmuneinflammation and cell cycle progression.J Exp Med，2000；191(7)：1095-1104)，分别取pGAPZ_αA-sDR5和空载体pGAPZ_αA转化阳性的酵母菌，培养24小时，取上清3L，经Beckman离心机低温高速离心(4℃，8000rpm，15min)后，上清经中空纤维超滤器(超滤膜截流量为3kDa)超滤浓缩20倍。

ProBond^TM亲和层析柱经20mmol/L Na₃PO₄，500mmol/L NaCl(pH 7.2～7.6)结合缓冲液平衡后，将已与7倍体积结合缓冲液混合的上述样品过柱，清洗缓冲液(pH 6.0)洗柱去除未结合的杂蛋白成分，最后分别以50mmol/L，100mmol/L，200mmol/L，350mmol/L含咪唑的洗脱缓冲液梯度洗脱，收集各洗脱产物。

纯化后人sDR5蛋白的浓度为4mg/ml，3L酵母菌培养上清共可获得目的蛋白60mg，该酵母菌蛋白产量约为20μg/ml。

实施例2：制备乙型病毒性肝炎小鼠动物模型，采用细胞生物学和分子生物学的方法，进行如下实验：研究人sDR5蛋白对乙型病毒性肝炎小鼠肝脏损伤的影响。

(1)分别设立正常BALB/c小鼠对照组(生理盐水对照组)、七个剂量的人白蛋白对照组、七个剂量的人sDR5蛋白对照组、空载体对照组、乙型病毒性肝炎模型组、模型建立前24小时应用美能的治疗组、模型建立前24小时应用七个剂量的人sDR5蛋白治疗组、模型建立的同时应用七个剂量的人sDR5蛋白治疗组，参考sDR5在小鼠实验性关节炎中的使用剂量[参见：Song K，Chen Y，Goke R，et al.Tumor necrosisfactor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)is an inhibitor of autoimmuneinflammation and cell cycle progression.J Exp Med，2000；191(7)：1095-1104.]，实验设计了1-64mg/kg的系列梯度：1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、16mg/kg、32mg/kg、64mg/kg。

每组小鼠数为15只，实验均重复三次，具体实验方法及结果详见下列叙述。

正常BALB/c小鼠对照组是尾静脉高压注射生理盐水1.4～2.0ml；人白蛋白对照组是腹腔注射人白蛋白1-64mg/kg(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、16mg/kg、32mg/kg、64mg/kg)，24小时后重复一次；人sDR5蛋白对照组是腹腔注射人sDR5蛋白1-64mg/kg(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、16mg/kg、32mg/kg、64mg/kg)，24小时后重复一次；空载体对照组是尾静脉高压注射20～50μg/ml的空载体质粒DNApcDNA3 1.4～2.0ml；乙型病毒性肝炎模型组是尾静脉高压注射20～50μg/ml的重组质粒DNA pcDNA3-HBV1.1 1.4～2.0ml；模型建立前24小时应用美能的治疗组是首先腹腔注射美能10mg/kg[生产厂家：日本米诺发源制药有限公司(原日本美能发源制药公司)Minophagen Pharmaceutical Co.，Tokyo，Japan；批号：90902B]，24小时后重复注射相应剂量的美能并同时经尾静脉高压注射重组质粒DNA pcDNA3-HBV1.1；模型建立前24小时应用人sDR5蛋白七个剂量的治疗组是首先分别腹腔注射人sDR5蛋白1-64mg/kg(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、16mg/kg、32mg/kg、64mg/kg)，24小时后重复注射相应剂量的人sDR5蛋白并同时经尾静脉高压注射重组质粒DNApcDNA3-HBV1.1；模型建立的同时应用人sDR5蛋白七个剂量的治疗组是首先分别腹腔注射人sDR5蛋白1-64mg/kg(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、8mg/kg、16mg/kg、32mg/kg、64mg/kg)，并同时经尾静脉高压注射重组质粒DNA pcDNA3-HBV1.1，24小时后再重复注射一次人sDR5蛋白。

在本发明中，对比实验选用美能作为人sDR5蛋白的阳性对照治疗药物。美能是复方甘草甜素的商品名(英文名：StrongerNeo-MinophagenC，SNMC)，美能是由甘草甜素一胺、半胱氨酸和甘氨酸等组成的复合物，具有抗炎、调节免疫、保护肝细胞膜、类固醇样作用和抑制病毒增殖、灭活病毒的作用，可明显降低转氨酶，保护肝细胞，并无明显毒副作用。美能是最先由日本于1948年开发的以甘草酸(甘草甜素)为主要成分的静脉和口服制剂。由于SNMC具有抗变态反应、抗炎作用，当时主要用在皮肤科领域治疗多种过敏性皮肤疾患。1958年，日本医生山本夫将SNMC尝试性地用于慢性肝炎患者的治疗，结果肝功能指标BSP(溴磺酞)值得到了明显改善(当时尚无转氨酶测定)。此后，SNMC在日本作为肝病用药受到重视，人们对其作了大量的基础和临床研究。1977年，日本肝病专家铃木宏教授采用严格的随机双盲对照法验证了SNMC对慢性肝炎的疗效，证实SNMC能够有效降低ALT、AST和γ-GTP。随后于1986年，日野邦彦又从肝病理组织学上验证了SNMC治疗慢性肝炎的确切疗效。2002年，熊田博光又报道了长期应用SNMC对500多例慢性丙型肝炎治疗的远期疗效结果，发现用药15年后SNMC可使慢性丙型肝炎的肝癌发生率减少50％以上。由于SNMC的疗效得到肝病理学的验证支持，而且有长达22年的远期疗效研究，可以说SNMC是所有保肝药中疗效最肯定、研究最深入的一种，在国内外作为慢性肝炎的有效药物在临床上已应用多年，取得良好疗效。目前，美能在临床上正作为乙型病毒性肝炎的最佳肝保护剂广泛应用。美能的最大临床用量是2mg/kg，静脉注射，在本发明的预实验中设立了1-20mg/kg的系列梯度，综合评价发现最佳作用剂量为10mg/kg，经腹腔注射给药。

(2)经内眦静脉窦取血：

分别于模型建立的第1、4、7、10天将小鼠用乙醚麻醉，使用1ml注射器由内眦静脉窦取血0.2～0.5ml，常规离心，分离血清，-20℃保存，用于各项指标的检测。

(3)处死小鼠：

分别于模型建立的第1、4、7、10天将小鼠摘眼球取血、颈椎脱臼处死。分别取上述各组小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺脏及胸腺，-80℃保存，备用。

(4)血清谷丙转氨酶(ALT)测定：

利用丙氨酸氨基转移酶试剂盒(ALT/GPT，赖氏法，潍坊3V生物工程有限公司)建立标准曲线并进行样品测定。样品OD值超过标准曲线范围则将样品稀释后再进行测定。

ALT检测结果显示：模型组的ALT于8小时达到最高(820±138u)，以后逐渐降低，10天后降至正常范围；模型建立前24小时应用人sDR5蛋白的治疗组，人sDR5蛋白在1mg/kg时对ALT无明显影响，人sDR5蛋白在2mg/kg时ALT水平略有降低，但与模型组相比无显著性差异，人sDR5蛋白在4-64mg/kg时可显著降低ALT的水平，并且随着人sDR5蛋白实验剂量增加，ALT水平有降低趋势，但在16-64mg/kg的量时各组之间ALT水平无显著性差异，提示人sDR5蛋白在16-64mg/kg的量时已达到饱和状态，再增加人sDR5蛋白的作用剂量也不会提高其降低ALT的效应，因此，人sDR5蛋白在16mg/kg附近的量时应为最佳作用剂量，ALT 8小时为452±13.8u，24小时为178±9.2u，4天为151±7.8u，在以上时间点人sDR5蛋白治疗组ALT显著低于模型组，10天后即降至正常范围；美能治疗组：8小时为389±15.2u，24小时为137±11.6u，4天为142±14.5u，在以上时间点美能治疗组ALT显著低于模型组，10天后即降至正常范围，美能治疗组在以上时间点ALT略低于人sDR5蛋白治疗组，但两组之间无显著性差异，实验中仅给药两次，在第二次给药后第4天时仍可显著降低ALT的水平，但第7天、10天时由于药物在体内衰减导致ALT的变化趋势与模型组相同；模型建立的同时应用人sDR5蛋白的治疗组：8小时测定ALT结果与模型组相比无显著性差异(800±129u)，24小时明显下降(345±58u)；人白蛋白对照组变化趋势与模型组相同，说明人sDR5蛋白的作用是特异性的；空载体对照组、生理盐水对照组与正常小鼠无显著差异。各组小鼠ALT测定结果见图9。

(5)肝脏HE染色观察病理变化：

各组小鼠肝脏组织进行冰冻切片，常规HE染色，显微镜下观察：模型组可见肝组织弥漫性淋巴细胞浸润，部分有中性粒细胞浸润，肝细胞呈气球样变，部分细胞有坏死表现；人sDR5蛋白提前治疗组在1mg/kg时对肝脏炎症反应无明显影响，人sDR5蛋白在2mg/kg时，肝脏炎症反应与肝细胞损伤有所减轻，但与模型组相比无显著性差异，人sDR5蛋白在4-64mg/kg时肝组织中炎性细胞浸润及肝细胞损伤程度显著减轻，人sDR5蛋白在16mg/kg的治疗剂量时达最佳作用效果，表现为肝组织无明显炎性改变，仅见部分肝细胞呈嗜酸性变，人sDR5蛋白在16-64mg/kg时各组之间肝组织病理变化无显著性差异，该结果也提示人sDR5蛋白在16-64mg/kg的作用剂量时达到饱和状态，使用64mg/kg以上的人sDR5蛋白不会达到更好的抗炎保肝作用，反而可能会引起对肝脏或全身的毒副作用，但在本实验所用实验剂量范围内未见明显的副作用；美能治疗组未见明显的炎症反应，与人sDR5蛋白提前治疗组相比无显著性差异；而人sDR5蛋白同时治疗组与模型组相比无明显差异。各组小鼠病理切片结果见图10。

(6)ELISA检测HBV抗原、抗体表达水平：

利用HBsAg、HBeAg及相应抗体的ELISA试剂盒进行检测，严格按照说明书操作，以酶标仪于450nm处测OD值。

ELISA结果显示：模型组小鼠血清HBsAg、HBeAg第1天最高，HBsAg可达1.5；以后逐渐下降，7天后消失，HBsAb的表达7天后测定阳性。模型组和人sDR5蛋白治疗组小鼠血清HBV抗原、抗体的表达水平无显著差异。

(7)肝脏免疫组化检测HBV核心抗原、TRAIL表达情况：

上述各组小鼠肝脏组织常规进行冰冻切片，分别利用HBcAg及TRAIL的一抗、辣根过氧化物酶标记的二抗进行染色，底物为OPD，阳性染色为棕黄色。

免疫组化结果显示：模型组第1-4天HBcAg阳性的细胞约(8±1)％，之后逐渐消失；模型组TRAIL染色阳性的细胞明显多于对照组和人sDR5蛋白治疗组。

(8)实时定量PCR检测HBV DNA含量：

模型组及实验组小鼠血清标本，利用乙型肝炎病毒(HBV)荧光定量PCR试剂盒(上海申友生物技术有限责任公司)检测HBV DNA。

首先标本裂解(直接裂解法)：取20μl裂解缓冲液加入0.5ml离心管后，再分别加入20μl血清标本、阴性对照、临界对照、阳性对照，混匀。沸水浴10分钟，14000rpm离心10分钟，取上清2μl做PCR反应。

设定如下程序：

保温	40次循环	保温
			37℃2分钟94℃3分钟	①94℃10秒  ②55℃30秒③72℃40秒	25℃恒温

55℃时收集荧光信号，以BIO-RAD iCycler检测荧光(美国伯乐公司)。每次试验均做标准曲线，将曲线相关系数控制在0.99以上。

实时定量PCR检测结果显示：模型组小鼠于第1天HBV DNA的拷贝数高达2.67×10⁵，第4天明显下降至3.85×10³，显著高于HBV转基因小鼠复制水平(P＜0.05)。模型组和治疗组HBV DNA的复制水平无显著差异。

(9)流式细胞术检测脾细胞TRAIL和肝细胞DR5的表达水平：

上述各组小鼠肝脏和脾脏分别置于含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中，利用200目铜网研磨，并以400目铜网过滤，计数1×10⁶个细胞，以PBS洗两次，分别采用间接标记法检测肝细胞表面DR5的表达及脾脏细胞表面TRAIL的表达。

流式细胞术检测结果显示：各组小鼠肝脏组织细胞DR5蛋白的表达无显著性差异，而脾细胞表面TRAIL的表达在模型组(12.1％)明显高于其他各组(1.8-5.5％)。

(10)TUNEL荧光染色原位检测肝组织细胞凋亡情况，流式细胞术检测肝细胞凋亡率：

利用TUNEL标记试剂盒，分别将各组小鼠肝组织石蜡包埋切片和新鲜肝细胞进行TUNEL染色，荧光显微镜观察肝组织细胞凋亡情况，流式细胞仪测定肝细胞凋亡率。

凋亡检测结果显示：人sDR5蛋白提前治疗组在1mg/kg时对肝细胞凋亡无影响，人sDR5蛋白在2mg/kg时可降低肝细胞凋亡率，但与模型组相比无显著性差异，人sDR5蛋白在4-64mg/kg时可显著降低肝细胞凋亡，并且随着人sDR5蛋白的剂量增加，肝细胞凋亡减轻，但人sDR5蛋白在16-64mg/kg时各组之间肝细胞凋亡率无显著性差异，说明人sDR5蛋白在16-64mg/kg时达到饱和状态，再增加作用剂量也不会增强人sDR5蛋白降低肝细胞凋亡的效果，因此，16mg/kg的治疗剂量应为最佳作用剂量；模型组肝细胞的凋亡率为15.5±2.8％；16mg/kg人sDR5蛋白提前治疗组为4.5±2.3％；正常对照组为1.2±0.6％。

TUNEL染色检测各组小鼠肝细胞凋亡的结果见图11。

(11)实验数据统计学处理：

上述实验数据以平均值±标准误差表示，经t检验：P＜0.05表示有明显差异。

通过上述实验及其结果，可以得出如下结论：

人sDR5蛋白用量在2-64mg/kg时，可减轻急性乙型病毒性肝炎小鼠的肝脏炎症，人sDR5蛋白用量在4-64mg/kg时，特别是在16mg/kg用量时，可明显减轻急性乙型病毒性肝炎小鼠的肝脏炎症。具体表现在ALT水平降低，肝脏病理切片炎症反应和肝细胞损伤减轻，肝细胞凋亡降低。而且提前注射治疗组效果更好。人sDR5蛋白在有效剂量范围内提前治疗可显著改善乙型病毒性肝炎小鼠的肝脏损伤和炎症反应，其治疗效果与最佳作用剂量的美能无显著性差异，而且人sDR5蛋白在治疗剂量范围内未发现任何毒副作用。

通过机制研究发现，人sDR5蛋白治疗组肝细胞凋亡率明显低于模型组，并且免疫组化和流式细胞术结果显示治疗组肝组织和脾脏中TRAIL的表达较模型组减少，这一结果表明TRAIL诱导的肝细胞凋亡在HBV感染后引起的肝细胞损伤过程中起重要作用，人sDR5蛋白可通过封闭或阻断TRAIL的效应而对肝细胞起保护作用，且在治疗剂量范围内无任何毒副作用。根据以上结果进行综合评定，人sDR5蛋白在2-64mg/kg时，特别是4-64mg/kg时具有明显的保肝作用，但在16-64mg/kg时保肝作用无显著性差异，提示人sDR5蛋白在16-64mg/kg的量时已达到饱和状态，再增加人sDR5蛋白的作用剂量也不会提高其保肝效应，因此选择4-32mg/kg的人sDR5蛋白作为治疗乙型病毒性肝炎的有效保护剂量较为经济，其中，16mg/kg的人sDR5蛋白浓度量应为治疗乙型病毒性肝炎的最佳剂量。通过与阳性对照药物美能对比发现，人sDR5蛋白在治疗剂量范围内可显著减轻肝脏损伤和炎症反应，在16mg/kg时的保肝作用与最佳治疗剂量的美能无显著性差异。然而，美能作为目前公认的为数不多的安全、有效、最有价值的保肝药物仍可引起如：休克、过敏样症状，增大药量或长期连续使用，可出现重度低血钾症、增加低血钾症发生率，血压上升、钠及液体贮留、浮肿、体重增加等假性醛固酮增多症状等毒副作用，而人sDR5蛋白在本发明中所用的实验剂量范围内未发现任何毒副作用。并且美能是进口药物，价格昂贵(20ml:40mg/支，市场零售价27元左右，慢性肝病建议用量40-60ml/日)，需要每天给药，这必然会增加乙型病毒性肝炎患者家庭的经济负担，并可引起不同程度的并发症，而人sDR5蛋白作为基因工程产品，生产工艺简单，价格便宜，无毒副作用，可明显减轻患者家庭和社会的经济负担，解决我国目前存在的严重公共卫生问题。

总之，本发明涉及的人sDR5蛋白将在制备治疗乙型病毒性肝炎特别是急性重症乙型病毒性肝炎的药物中有很大的应用价值，具有极其诱人的开发应用前景。

Claims (9)

1.人sDR5蛋白作为乙型病毒性肝炎治疗药物的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征是：所述人sDR5蛋白作为急性重症乙型病毒性肝炎治疗药物的应用。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征是：减轻肝细胞损伤的人sDR5蛋白用量是2-64mg/kg。

4.如权利要求3所述的应用，其特征是：明显减轻肝细胞损伤的人sDR5蛋白用量是4-32mg/kg。

5.人sDR5蛋白在制备阻断乙型病毒性肝炎肝细胞凋亡药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征是：所述人sDR5蛋白在制备阻断急性重症乙型病毒性肝炎肝细胞凋亡药物中的应用。

7.如权利要求5或6所述的应用，其特征是：阻断肝细胞凋亡的人sDR5蛋白用量是2-64mg/kg。

8.如权利要求7所述的应用，其特征是：明显阻断肝细胞凋亡的人sDR5蛋白用量是4-32mg/kg。

9.如权利要求5或6所述的应用，其特征是：所述人sDR5蛋白通过阻断或封闭TRAIL的作用来降低肝细胞凋亡，减轻肝细胞损伤，以达到抗炎保肝作用。

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