WO2010050181A1 - Ｃ型肝炎ウイルスによる肝癌の発症および再発予防ワクチン - Google Patents

Ｃ型肝炎ウイルスによる肝癌の発症および再発予防ワクチン Download PDF

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recurrence
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伊東恭悟
佐田通夫
由谷茂
山田亮
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株式会社グリーンペプタイド
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    • C12N2770/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to a vaccine for preventing the onset and recurrence of liver cancer in persons infected with hepatitis C virus.
  • Hepatitis C virus is a single-stranded RNA virus belonging to the Flaviviridae family, and it is estimated that about 3% of the world population is seropositive for hepatitis C virus (HCV).
  • HCV World Health Organization. Hepatitis C: global prevalence. Wkly. Epidemiol. Rec. 1997; 72 (46): 341-344).
  • the acute phase of HCV infection is often asymptomatic, but about 70% of seropositive individuals develop chronic infection, and infected patients have progressive liver disease, such as chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. Susceptible (Alter HJ, Seeff LB., Semin Liver Dis. 2000; 20 (1): 17-35; Shimotohno, K., Semin. Cancer Biol. 2000; 10: 233-240).
  • hepatocellular carcinoma occurs at a high rate of 7 to 8% per year, and even in patients with chronic hepatitis, the incidence of hepatocellular carcinoma reaches 2% per year in patients with non-interferon response. It is well known that the higher the patient serum ALT level, the higher the risk of developing liver cancer. This indicates that it is important to converge chronic inflammation of hepatocytes for the prevention of hepatocellular carcinoma.
  • interferon therapy is widely used for patients with chronic hepatitis C, and a total effect of about 30% is obtained as a whole, but the effect varies depending on the virus genotype (genotype) and viral load. .
  • virus genotype gene
  • ribavirin has shown some effect on cases with high viral load, and trials are currently being conducted at each facility.
  • hepatocellular carcinoma is characterized by multicentric growth.
  • hepatocellular carcinoma recurs as long as hepatocyte inflammation continues, and the recurrence rate is extremely high, 20% in one year and 50% in three years.
  • hepatitis C virus a part of the viral protein is degraded in the body of the infected person, and is presented as an antigenic epitope (8-10 amino acids) on the MHC class I molecule on the surface of the virus-infected cell and recognized by CTL. At the same time, it is also displayed on MHC class II molecules and recognized by Th2 cells, leading to antibody production and CTL induction.
  • the present inventors have previously found that IgG reactive with HCV-derived peptides is detected from many HCV-infected persons, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of HCV patients having the corresponding HLA type. Have identified a number of peptides capable of inducing peptide-specific CTLs.
  • An object of the present invention is to provide a method for preventing the onset and recurrence of liver cancer in a person infected with hepatitis C virus and a pharmaceutical composition for use therein.
  • liver cancer caused by HCV infection even if it does not contribute to liver function improvement or viral load reduction by continuous or long-term administration of peptide vaccines to HCV infected individuals. It was found that it can prevent carcinogenesis and recurrence.
  • the present invention provides the following amino acid sequences: YLLPRRGPRL (SEQ ID NO: 1) RYAPACKPL (SEQ ID NO: 2) HYAPRPCGI (SEQ ID NO: 3) VYEAADMIM (SEQ ID NO: 4) VYHGAGSKT (SEQ ID NO: 5)
  • the present invention also provides the following amino acid sequence: YLLPRRGPRL (SEQ ID NO: 1) RYAPACKPL (SEQ ID NO: 2) HYAPRPCGI (SEQ ID NO: 3) VYEAADMIM (SEQ ID NO: 4) VYHGAGSKT (SEQ ID NO: 5)
  • a pharmaceutical composition for preventing recurrence of liver cancer in a person infected with hepatitis C virus which comprises one or more of peptides having the above as an active ingredient.
  • the present invention also provides the following amino acid sequence: YLLPRRGPRL (SEQ ID NO: 1) RYAPACKPL (SEQ ID NO: 2) HYAPRPCGI (SEQ ID NO: 3) VYEAADMIM (SEQ ID NO: 4) VYHGAGSKT (SEQ ID NO: 5)
  • YLLPRRGPRL SEQ ID NO: 1
  • RYAPACKPL SEQ ID NO: 2
  • HYAPRPCGI SEQ ID NO: 3
  • VYEAADMIM SEQ ID NO: 4
  • VYHGAGSKT SEQ ID NO: 5
  • FIG. 1 shows liver function and viral load before, during and at the end of vaccine administration.
  • FIG. 2 shows the carcinogenic effect of vaccine administration.
  • FIG. 3 shows the carcinogenic effect of vaccine administration.
  • FIG. 4 shows the effect of vaccine administration to prevent liver cancer recurrence.
  • FIG. 5 shows the effect of vaccine administration to prevent liver cancer recurrence.
  • FIG. 6 shows the liver cancer recurrence prevention effect by vaccine administration.
  • the present inventors have conducted a hepatitis C virus (HCV) peptide vaccine clinical trial for HCV infection positive and chronic hepatitis / cirrhosis cases.
  • HCV hepatitis C virus
  • the hepatitis C virus-derived peptide (HCV peptide) used in the present invention contains a partial amino acid sequence of a protein derived from hepatitis C virus and can be recognized by blood antibodies of a person infected with hepatitis C virus.
  • the hepatitis C virus-derived peptide according to the present invention is capable of inducing CTL, and the CTL thus induced targets HCV-infected cells and attacks the cells.
  • the peptide (YLLPRRGPRL (SEQ ID NO: 1)) used in the present invention is a peptide derived from the sequence of the HCV core protein. This peptide has a motif corresponding to HLA-A2, but not only from A2, but also from peripheral blood of A24 or A3 supertype HCV infected cytotoxic T cells (CTL) ) Can be strongly induced (WO2007 / 083807).
  • peptides used in the present invention are eliminated from the peripheral blood of HLA-A24 positive individuals. It has been reported that effective cytotoxic T cells (CTL) can be strongly induced (WO2005 / 028503).
  • the peptide of the present invention only needs to have the amino acid sequence described above to the extent that a desired effect can be obtained, and may further include an additional sequence.
  • a person skilled in the art can naturally understand how much sequence is allowed to be added to the N-terminal side and the C-terminal side in order to achieve a desired effect as an antigen peptide. Therefore, for example, an amino acid sequence useful for promoting immunization, an amino acid sequence for facilitating formulation, or a peptide as a fusion protein on the N-terminal side and / or C-terminal side of the peptide according to the present invention.
  • An amino acid sequence convenient for expression or an amino acid sequence convenient for peptide production and purification may be added.
  • the peptide according to the present invention may be chemically modified or a polymer or sugar chain may be added as long as the specificity of binding to the antibody is not lost.
  • the HCV peptide according to the present invention is produced by a usual chemical synthesis method, an enzymatic degradation method of a protein molecule, a gene recombination technique using a host transformed to express a base sequence encoding the target amino acid sequence, and the like. can do.
  • the target peptide When the target peptide is produced by a chemical synthesis method, it can be produced by a conventional method known per se in ordinary peptide chemistry. For example, solid phase synthesis using a peptide synthesizer. Can be synthesized by the method. The crude peptide thus obtained can be purified by purification methods commonly used in protein chemistry, such as salting out, ultrafiltration, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. Can be purified by.
  • a desired peptide is produced by gene recombination technology, for example, a synthesized or cloned DNA fragment encoding the target amino acid sequence is incorporated into an appropriate expression vector, and microorganisms or animal cells are used using this expression vector.
  • the desired peptide can be obtained by transforming and culturing the obtained transformant.
  • expression vectors that can be used plasmids, viral vectors, and the like known in the art can be used.
  • a method for transforming host cells using expression vectors in this peptide production technique known methods such as calcium chloride method, calcium phosphate coprecipitation method, DEAE dextran method, lipofectin method, electroporation method and the like are used. It is possible to select appropriately based on the host cell to be used.
  • the obtained peptide can be purified from the cell extract or culture supernatant recovered from the cultured medium by the purification method described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is useful as a vaccine for preventing carcinogenesis and recurrence of liver cancer caused by HCV infection.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared by appropriately mixing the peptide produced as described above with a pharmaceutically acceptable adjuvant and / or carrier.
  • adjuvants adjuvants that can enhance the immune response, such as Freund's incomplete adjuvant, aluminum hydroxide gel, and the like can be used.
  • a phosphate buffered saline (PBS), a diluent such as distilled water, physiological saline, or the like can be used as the carrier.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered, for example, orally or by a transdermal route such as intravenous administration or subcutaneous administration depending on the form of use.
  • the dosage form include tablets, granules, soft capsules, hard capsules, liquids, oils, and emulsifiers.
  • the dosage of such a pharmaceutical composition may vary depending on the symptoms of the patient to whom it is administered, but in general, 0.1-10 mg of peptide is preferred per day for an adult, and the dosage interval is It is preferable to administer once every few days to several months.
  • peptide reactivity of anti-HCV antibody means that the peptide to be administered is recognized by the anti-HCV antibody present in the blood of the patient.
  • the patient's liver function status, blood antibody titer, blood viral load, etc. can be monitored as appropriate.
  • the antibody titer in a patient's blood can be measured using an antigen-antibody reaction well known in the art.
  • measurement can be performed as follows.
  • the peptide, which is an antigen is bound to a conventional ELISA plate such as a 96 well, and the plate is appropriately blocked to prevent nonspecific adsorption.
  • serum (or plasma) prepared from the patient's blood is appropriately diluted and added to each well of the plate, and reacted for a predetermined time.
  • the plate is washed to remove unbound components, and then an antibody that can bind to a human antibody (for example, a rabbit anti-human Ig antibody) is added.
  • a human antibody for example, a rabbit anti-human Ig antibody
  • gamma chain specific anti-human IgG can be used. After reacting for a predetermined time, the plate is washed, and a detectably labeled antibody (for example, anti-rabbit IgG) is added. Labeling can be performed by methods well known to those skilled in the art using enzymes, fluorescent dyes, chemiluminescent substances, biotin, radiation compounds and the like. After reacting the plate for a predetermined time, the label is detected by adding an appropriate substrate and measuring the decrease of the substrate or the increase of the product, or by measuring the fluorescence, luminescence or radioactivity. In this way, the amount of antibody against a particular peptide in the patient's serum can be determined.
  • a detectably labeled antibody for example, anti-rabbit IgG
  • cytotoxic T cells are induced in HCV-infected persons is determined by preparing peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from HCV-infected persons, culturing with the peptides of the present invention, and then pulsing the same peptides with C1R-A24
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the reactivity to cells, HCV-infected cell lines and the like can be examined by examining IFN- ⁇ production as an index or by 51 Cr release reaction.
  • the MHC restriction of the induced CTL is an inhibition experiment with a monoclonal antibody against MHC class I and CD8, and the peptide specificity is an inhibition experiment with a labeled target cell sensitized with the corresponding peptide (cold target inhibition). Confirmation experiment).
  • hepatitis C peptide vaccines developed for HLA-A24 or -A2 positive HCV infected patients (4 types for HLA-A24 patients, 1 type for HLA-A2 patients), Recognized by peptide-specific IgG antibodies (anti-peptide antibodies) in the patient's serum or killer T cell precursors (abbreviated as “CTLp”) in peripheral blood lymphocytes
  • CTLp serum or killer T cell precursors
  • the peptide is selected, mixed with incomplete Freund's adjuvant, emulsified, and administered.
  • Adverse events safety assessment
  • immunoreactivity due to administration of this drug were investigated.
  • Target cases Patients who met all of the following conditions were included.
  • Performance status is 0 to 1 and ambulatory Possible patients 6) Patients who meet the following criteria in blood and biochemical tests WBC > 2,400 / mm 3 Hb > 8.0g / dl Platelet > 50,000 / mm 3 Serum Creatinine ⁇ 1.4mg / dl Total Bilirubin ⁇ 2.5mg / dl 8) Patients without ascites 9) Patients without hepatic encephalopathy 10) Hepatitis B virus antigen negative patients 11) Patients aged 20 to under 75 12) Regardless of the administration history of interferon and ribavirin.
  • Peptide administered Of the five types of peptides listed in Table 1 below, one type of peptide (1bA2-35) was prepared separately for HLA-A24 positive patients regardless of HLA.
  • IgG anti-peptide antibodies
  • CTLp killer T cell precursors
  • IFA incomplete Freund's Adjuvant
  • HLA-A24 positive cases were 12 patients who received 4 types of peptides for HLA-A24 patients, and there were 38 cases that received 1bA2-35 peptide regardless of HLA. .
  • 3 cases within 6 months after the start of administration 1 case that was discontinued only twice, and echo diagnosis at the time of registration
  • the former was the subject of analysis from the viewpoint of preventing carcinogenesis and the latter from the viewpoint of preventing recurrence.
  • Vaccine administration period The vaccine was administered every other week, and the number of administrations was 6 to 83, with a median of 24 (Tables 2 and 3).
  • the vaccine duration was 2 to 49 months with a median of 14 months.
  • Tables 2 and 3 also show 7 cases of interferon combination and 3 cases of interferon / ribavirin combination after vaccine alone administration.
  • ALT which is a representative liver function marker
  • platelet count or AFP which is a marker related to other disease progressions. Absent.
  • FIG. 1 shows the results before, during and at the end of administration. In each case, ALT decreased by 30% or more at the end of vaccine administration compared to before vaccine start in 13 of 32 cases, and platelets increased by 30% or more in 1 out of 32 cases. Similarly, a decrease of 50% or more in HCV viral load was observed in 3 of 32 cases.
  • the ALT values were analyzed before starting the vaccine, at the end of the vaccine alone and at the end of the vaccine / interferon combination, in 10 cases of vaccine and interferon preparation combination. Although a downward trend was observed at the end of combination, no statistically significant difference was obtained. However, in each case, in 1 of 10 cases, a decrease of 30% or more was observed at the end of combination compared with the end of single vaccine administration.
  • liver cancer occurrence or recurrence prevention effect In 32 cases, there was no liver cancer carcinogenesis or recurrence during the vaccine administration period. Furthermore, there was no liver cancer onset or recurrence at 12 months after the end of the vaccine. However, one case of carcinogenesis occurred 26 months after the end of the vaccine, and one case recurred 15 months after the end of the vaccine. These results suggest that HCV vaccine may prevent the occurrence and recurrence of liver cancer. Therefore, we conducted a statistical comparative study of carcinogenesis or cancer recurrence in the in-hospital control group that did not receive the vaccine for the prevention of carcinogenesis in 27 chronic hepatitis cases and the recurrence prevention effect in 5 cases after liver cirrhosis. .
  • the first day of the vaccine administration was used as the first day, and the date one year after the last administration date of the vaccine was used as the last day to analyze the presence or absence of carcinogenesis within the previous analysis period.
  • the average observation period (median) of 27 cases was 20.5 months (8.5-49 months, closed July 31, 2008). None of the cases had any obvious progression of disease during this observation period.
  • Figure 2 shows retrospective selection of 33 cases that did not show a decrease in viral load after IFN + REV treatment (about 1 year), and started vaccine treatment for 12 cases combined with vaccine treatment and 21 cases not combined with vaccine treatment The results were compared using the day of the survey as the base point and estimated. Therefore, the duration of vaccine administration during the observation period has not continued for a long time and varies from patient to patient.
  • the observation period of 5 cases of liver cirrhosis after surgery for liver cancer registered with HCV vaccine bridge clinical study at Kurume University was 52 months, 51.7 months, 51.7 months, 27.8 months, 15.3 months respectively.
  • the vaccine administration periods were 11.3 months, 10.1 months, 17.4 months, 12 months, 15 and 3 months, respectively.
  • the duration of the immune response due to the HCV vaccine treatment is estimated to be about 1 year in animal models, although it varies depending on the administered protein (including peptide) and adjuvant. Although it is not accurately reported in human results, it is estimated to be about 6 months to 1 year.
  • the first day of the vaccine administration was used as the first day, and the date one year after the last administration date of the vaccine was used as the last day to analyze the presence or absence of carcinogenesis within the previous analysis period.
  • the observation period (median) of 5 cases is 23.3 months, 22.1 months, 29.4 months, 23 months, 27.3 months, 20.5 months (closed on July 31, 2008), and the average observation period (median) is 23.3 months. Months. No cases of recurrence were observed during this observation period.
  • the average period from surgery to the start of vaccine administration in the vaccine administration group was about 2 years. Therefore, excluding cases that recurred within 2 years from the control group (94 cases), the risk rate was low at 0.098 (Fig. 6).
  • the HCV vaccine has an effect of preventing carcinogenesis of liver cancer in HCV1b-positive chronic hepatitis cases and an effect of preventing recurrence of liver cirrhosis cases after liver cancer surgery.
  • the peptide of the present invention is useful for preventing the onset and recurrence of liver cancer.

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Abstract

　以下のアミノ酸配列： YLLPRRGPRL（配列番号１） RYAPACKPL（配列番号２） HYAPRPCGI（配列番号３） VYEAADMIM（配列番号４） VYHGAGSKT（配列番号５） を有するペプチドの１またはそれ以上を有効成分として含有する，Ｃ型肝炎ウイルス感染者において肝癌の発症または再発を予防するための医薬組成物が開示される。さらに，Ｃ型肝炎ウイルス感染者に本発明の医薬組成物を投与することにより肝癌の発症または再発を予防する方法も提供される。

Description

Ｃ型肝炎ウイルスによる肝癌の発症および再発予防ワクチン
関連する出願
　本出願は，日本特許出願２００８－２７６１６３（２００８年１０月２７日出願）に基づく優先権を主張しており，この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
技術分野
　本発明はＣ型肝炎ウイルス感染者において肝癌の発症および再発を予防するためのワクチンに関する。
　Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は，フラビウイルス科に属する１本鎖ＲＮＡウイルスであり，世界の人口の約３％がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対してセロポジティブであると見積もられている（World　Health　Organization.　Hepatitis　C:　global　prevalence.　Wkly.　Epidemiol.　Rec.　1997;　72(46):341-344）。ＨＣＶ感染の急性期はしばしば無症状であるが，セロポジティブの個人の約７０％は慢性感染を発症し，感染した患者は進行性の肝臓病，例えば，慢性肝炎，肝硬変，および肝細胞癌に罹患しやすい（Alter　HJ,　Seeff　LB.,　Semin　Liver　Dis.　2000;　20(1):17-35;　Shimotohno,　K.,　Semin.　Cancer　Biol.　2000;10:233-240）。
　慢性C型肝炎患者においては慢性の炎症が肝細胞において継続している。この炎症の継続は，肝硬変への移行，さらに肝細胞癌発生の起因となる。肝硬変患者では年率7～8%という高率で肝細胞癌の発生を認め，慢性肝炎患者でもインターフェロン不応例では肝細胞癌発生率は年率2%に達する。また，患者血清ALT値が高いほど肝癌の発生リスクが高いことは広く知られている。このことから，肝細胞癌の予防のためには，肝細胞の慢性の炎症を収束させることが重要であることがわかる。
　現在，慢性C型肝炎患者に対してインターフェロン療法が広く行われており，全体では約30%の完全著効が得られているが，ウイルスの遺伝子型（ジェノタイプ），ウイルス量によって効果が異なる。最近，ウイルス量が多い症例に対しインターフェロンとリバビリンとの併用がある程度の効果を示し，現在各施設でトライアルが行われている。しかし，遺伝子組み替えインターフェロン，インターフェロンおよびリバビリン併用療法に不応であった症例に対しては現在のところ新たなる治療法がなく，既存のウルソデキシコール酸，強力ミノファーゲンC，小柴胡湯などによる治療を継続せざるを得ないのが現状である。
　一方，慢性C型肝炎，C型肝硬変に肝細胞癌が合併した症例では，肝細胞癌に対する根治治療が優先されるが，肝細胞癌は、多中心性の発育をすることを特徴とする。即ち，肝細胞の炎症が継続する限り肝細胞癌は再発し，その再発率は1年で20%，　3年で50%と極めて高い。
　これらの，インターフェロン，リバビリン不応症例，肝細胞癌発生治療後症例に対して，慢性炎症の収束、すなわち慢性肝炎に対する新しい治療法の確立が求められている。
　C型肝炎ウイルスは，感染者の体内でウイルス蛋白の一部が分解され，抗原エピトープ（8～10アミノ酸）としてウイルス感染細胞表面のMHCクラスI分子上に提示され、CTLに認識される。また同時にMHCクラスII分子上にも提示され，Th2細胞に認識され，抗体産生，さらにはCTL誘導へとつながる。本発明者らは，先に，ＨＣＶ感染者の多くからＨＣＶ由来のペプチドと反応性を有するＩｇＧが検出されることを見いだし，対応するＨＬＡ型を有するＨＣＶ患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からペプチド特異的ＣＴＬを誘導することができる多数のペプチドを同定した。さらに，このようなＨＣＶ由来ペプチドの投与により，多くの症例でペプチドによる免疫賦活作用やウイルス量の低下が認められた（Takao　Y　et　al.,　Microbiol.　Immunol.,　48(7),　507-517,　2004（非特許文献１）；WO2005/028503（特許文献１）；WO2007/083807（特許文献２）。しかしながら，ＨＣＶ感染者にこれらのペプチドを投与しても，必ずしも肝機能改善やウイルス量の減少が見られない場合もあった。
　本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書に参照として取り込まれる。
WO2005/028503 WO2007/083807 Takao　Y　et　al.,　Microbiol.　Immunol.,　48(7),　507-517,　2004
　本発明は，Ｃ型肝炎ウイルス感染者において肝癌の発症および再発を予防する方法およびこれに用いるための医薬組成物を提供することを目的とする。
　本発明者らは，驚くべきことに，HCV感染者にペプチドワクチンを継続もしくは長期投与することにより，肝機能改善やウイルス量減少には寄与しない場合であっても，ＨＣＶ感染に起因する肝臓癌の発癌や再発を防止しうることを見いだした。
　すなわち，本発明は，以下のアミノ酸配列：
YLLPRRGPRL（配列番号１）
RYAPACKPL（配列番号２）
HYAPRPCGI（配列番号３）
VYEAADMIM（配列番号４）
VYHGAGSKT（配列番号５）
を有するペプチドの１またはそれ以上を有効成分として含有する，Ｃ型肝炎ウイルス感染者において肝癌の発症を予防するための医薬組成物を提供する。
　本発明はまた，以下のアミノ酸配列：
YLLPRRGPRL（配列番号１）
RYAPACKPL（配列番号２）
HYAPRPCGI（配列番号３）
VYEAADMIM（配列番号４）
VYHGAGSKT（配列番号５）
を有するペプチドの１またはそれ以上を有効成分として含有する，Ｃ型肝炎ウイルス感染者において肝癌の再発を予防するための医薬組成物を提供する。
　本発明はまた，以下のアミノ酸配列：
YLLPRRGPRL（配列番号１）
RYAPACKPL（配列番号２）
HYAPRPCGI（配列番号３）
VYEAADMIM（配列番号４）
VYHGAGSKT（配列番号５）
を有するペプチドの１またはそれ以上をＣ型肝炎ウイルス感染者に投与することを含む、Ｃ型肝炎ウイルス感染者において肝癌の発症または再発を予防する方法を提供する。
図１は，ワクチン投与前，投与中及び終了時の肝機能およびウイルス量を示す。 図２は，ワクチン投与による発癌防止効果を示す。 図３は，ワクチン投与による発癌防止効果を示す。 図４は，ワクチン投与による肝臓癌再発防止効果を示す。 図５は，ワクチン投与による肝臓癌再発防止効果を示す。 図６は，ワクチン投与による肝臓癌再発防止効果を示す。
　本発明者らは，HCV感染陽性かつ慢性肝炎・肝硬変症例を対象としてＣ型肝炎ウイルス（HCV）ペプチドワクチン臨床試験を実施してきた。本発明においては，以下の実施例に示されるように，慢性肝炎（２７例）と肝癌術後肝硬変症例（5例）を対象として、同ワクチンによる肝臓癌の発癌もしくは再発防止作用について調べたところ，ワクチン投与期間中〈中央値14ヶ月〉肝臓癌発癌もしくは再発は皆無であった。さらに，ワクチン終了後12ヶ月時点での肝臓癌発癌もしくは再発も皆無であった。しかしながら，ワクチン終了後２６か月で慢性肝炎症例１例において発癌を認め，またワクチン終了後１５ヶ月で肝癌術後肝硬変症例１例の再発が認められた。ワクチン継続投与中の重篤な副作用発生は皆無であり，また肝機能やHCVウイルス量の有意な変動は認められなかった。
　これらの結果から，HCV感染者へのペプチドワクチン継続もしくは長期投与は，肝機能改善やウイルス量減少には寄与しないものの，ＨＣＶ感染に起因する肝臓癌の発癌や再発防止に有用である可能性が示唆された。
　本発明において用いられるＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド（ＨＣＶペプチド）は，Ｃ型肝炎ウイルス由来の蛋白質の部分アミノ酸配列を含み，Ｃ型肝炎ウイルス感染者の血中抗体により認識されることができる。好ましくは，本発明にかかるＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドは，ＣＴＬを誘導することができ，このようにして誘導されたＣＴＬは，ＨＣＶ感染細胞を標的にしてこの細胞を攻撃する。
　本発明において用いられるペプチド（YLLPRRGPRL（配列番号１））は，ＨＣＶコアタンパク質の配列に由来するペプチドである。このペプチドは，ＨＬＡ－Ａ２に対応するモチーフを有しているが，Ａ２のみならず，Ａ２４やＡ３スーパータイプのＨＣＶ感染者の末梢血からも，ウイルス排除に有効な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を強力に誘導できることが報告されている（WO2007/083807）。
　また，本発明において用いられるペプチド（RYAPACKPL（配列番号２），HYAPRPCGI（配列番号３），VYEAADMIM（配列番号４）およびVYHGAGSKT（配列番号５））は，ＨＬＡ－Ａ２４陽性者末梢血よりウイルス排除に有効な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を強力に誘導できることが報告されている（WO2005/028503）。
　本発明のペプチドは，所望の作用効果を奏する程度に上記のアミノ酸配列を有していればよく，付加的な配列がさらに含まれていてもよい。当業者であれば，抗原ペプチドとして所望の作用効果を奏するためには，そのＮ末端側およびＣ末端側にそれぞれどの程度の配列の付加が許容されるかを当然に理解することができる。したがって，例えば，本発明にかかるペプチドのＮ末端側および／またはＣ末端側に，免疫感作を促進するのに有用なアミノ酸配列や，製剤化を容易にするアミノ酸配列や，融合蛋白質としてペプチドを発現させるのに便利なアミノ酸配列や，ペプチドの製造および精製に便利なアミノ酸配列などが付加されていてもよい。また，本発明にかかるペプチドは，抗体との結合の特異性が失われない限り，化学的に修飾されていてもよく，ポリマーや糖鎖が付加されていてもよい。
　本発明にかかるＨＣＶペプチドは，通常の化学的合成法，タンパク質分子の酵素的分解法，目的のアミノ酸配列をコードする塩基配列を発現するように形質転換した宿主を用いる遺伝子組換え技術などにより製造することができる。
　目的とするペプチドを化学的合成法で製造する場合には，通常のペプチド化学においてそれ自体公知の慣用されている手法によって製造することができ，例えば，ペプチド合成機を使用して，固相合成法により合成することができる。このようにして得られた粗ペプチドは，タンパク質化学において通常使用されている精製方法，例えば，塩析法，限外ろ過法，逆相クロマトグラフィー法，イオン交換クロマトグラフィー法，アフィニティークロマトグラフィー法などによって精製することができる。
　一方，所望のペプチドを遺伝子組換え技術で生産する場合には，例えば，合成またはクローニングした目的のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに組込み，この発現ベクターを用いて微生物や動物細胞を形質転換して，得られた形質転換体を培養することによって，所望のペプチドを得ることができる。使用できる発現ベクターとしては，当該技術分野において公知であるプラスミド，ウイルスベクターなどを用いることができる。
　このペプチド生産技術における発現ベクターを用いた宿主細胞の形質転換方法としては，それ自体公知の方法，例えば，塩化カルシウム法，リン酸カルシウム共沈殿法，ＤＥＡＥデキストラン法，リポフェクチン法，エレクトロポレーション法などが使用でき，使用する宿主細胞に基づいて適宜選択するのがよい。得られたペプチドの精製は，培養した培地から回収した細胞抽出液もしくは培養上清から上記精製法により行うことができる。
　本発明の医薬組成物は，ＨＣＶ感染に起因する肝臓癌の発癌および再発を防止するためのワクチンとして有用である。本発明の医薬組成物は，上記のようにして製造したペプチドを，医薬的に許容される補助剤および／または担体と適宜混合することにより調製する。補助剤としては，免疫応答を強化し得るアジュバント，例えばフロイントの不完全アジュバント，水酸化アルミニウムゲルなどを使用することができる。また，担体としては，例えば，リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ），蒸留水などの希釈剤，生理食塩水などを使用することができる。
　本発明の医薬組成物は，その使用形態に応じて，例えば，経口または静脈投与や皮下投与など経皮経路で投与することができる。その剤形としては，例えば，錠剤，顆粒剤，ソフトカプセル剤，ハードカプセル剤，液剤，油剤，乳化剤などが挙げられる。かかる医薬組成物の投与量は，投与する患者の症状などにより，適宜変動し得るが，一般的には，成人に対して１日当たり，ペプチド量として０．１－１０ｍｇが好ましく，投与間隔としては数日ないし数ヶ月に１回投与することが好ましい。また，ペプチドとインターフェロンやリバビリンなどの抗ウイルス剤とを併用してもよい。
　本発明の医薬組成物を投与する前に，患者の血液中に存在する抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性もしくはＣＴＬの存在を測定することが好ましい。ここで，「抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性」とは，投与すべきペプチドが，患者の血液中に存在する抗ＨＣＶ抗体により認識されることをいう。さらに，治療の継続中に，患者の肝機能の状態，血中抗体価，血中ウイルス量等を適宜モニターすることができる。
　患者の血液中の抗体価は，当該技術分野においてよく知られる抗原抗体反応を用いて，測定することができる。例えば，典型的なＥＬＩＳＡ法を用いる場合には，以下のようにして測定を行うことができる。抗原であるペプチドを９６ウエルなどの慣用のＥＬＩＳＡプレートに結合させ，非特異的吸着を防止するためにプレートを適宜ブロッキングする。次に患者の血液から調製した血清(または血漿)を適宜希釈してプレートの各ウエルに加えて，所定時間反応する。プレートを洗浄して未結合成分を除去した後，ヒト抗体と結合しうる抗体（例えばウサギ抗ヒトIg抗体）を加える。ＩｇＧを検出することが望まれる場合には，γ鎖特異的抗ヒトＩｇＧを用いることができる。所定時間反応した後，プレートを洗浄し，検出可能なように標識した抗体（例えば抗ウサギＩｇＧ）を加える。標識は，酵素，蛍光色素，化学発光物質，ビオチン，放射線化合物等を用いて，当業者によく知られる方法により行うことができる。プレートを所定時間反応した後，適当な基質を加えて基質の減少もしくは生成物の増加を測定するか，または蛍光，発光，放射活性を測定することにより，標識を検出する。このようにして，患者の血清における特定のペプチドに対する抗体の量を測定することができる。
　ＨＣＶ感染者において細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されているかどうかは，ＨＣＶ感染者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製し，本発明のペプチドとともに培養した後，同じペプチドをパルスしたＣ１Ｒ－Ａ２４細胞やＨＣＶ感染細胞株などに対する反応性を，ＩＦＮ－γ産生を指標として，あるいは51Ｃｒ遊離反応で調べることにより検査することができる。また，誘導されたＣＴＬのＭＨＣ拘束性はＭＨＣクラスＩ，ＣＤ８に対するモノクローナル抗体による抑制実験で，ペプチド特異性は，対応するペプチドで感作した被標識標的細胞による抑制実験（コールド・ターゲット・インヒビション実験）で確認することができる。
　本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。
　以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。ただし，これらの実施例は本発明をより具体的に説明するために例示的に示したものであり，本発明は実施例により限定されるものではない。
臨床試験の概要
　HLA-A24もしくは-A2陽性のＨＣＶ感染患者を対象として開発した５種類のＣ型肝炎ペプチドワクチン（HLA-A24患者用：4種類，HLA-A2患者用：１種類）の内，患者の血清中にペプチド特異的なIgG抗体（抗ペプチド抗体）の存在が確認されたペプチドもしくは末梢血リンパ球中のキラーT細胞前駆体（Cytotoxic　T　Lymphocytes　precursors,“CTLp”と略す）に認識されるペプチドを選択し、不完全フロイントアジュバントと混合し，エマルジョン化した後投与する。本薬剤投与による有害事象（安全性評価）および免疫反応性について検討した。
対象症例
（選択基準）
　以下の条件をすべて満たす患者を対象とした。
＜慢性肝炎および肝細胞癌治療後患者＞
１）血清学的にC型肝炎ウイルス陽性であることが確認されている肝炎患者で，既存の治療（インターフェロン，リバビリン等）に対して抵抗性を示す患者，あるいは肝細胞癌と組織学的に証明され，局所治療（PEIT、RFA、TAE）や外科療法で，画像上完全に癌が消失している患者
２）血清学的または組織学的にC型肝炎ウイルスの持続感染が確認されている患者（HCV-AbのみならずHCV-RNAが陽性である患者）
３）ワクチン用に準備した４種類（HLA-A24）および１種類（HLA-A2）のペプチドに対する抗ペプチド抗体（IgG）もしくは患者末梢血単核球よりペプチド特異的ＣＴＬの誘導が認められた患者
４）前治療からのwash-out期間は原則として4週間以上とし，前治療の効果や有害事象による影響を持ち越していないと判断される患者
５）Performance　status　(PS)が0～1で外来通院可能な患者
６）血液，生化学検査にて以下の基準を満たす患者
　　WBC＞2,400/mm3
　　Hb＞8.0g/dl
　　Platelet＞50,000/mm3
　　Serum　Creatinine＜1.4mg/dl
　　Total　Bilirubin＜2.5mg/dl
８）腹水が存在しない患者
９）肝性脳症が存在しない患者
10）B型肝炎ウイルス抗原陰性の患者
11）20歳以上75歳未満の患者
12)インターフェロン，リバビリンの投与歴は問わない。
（除外基準）
　以下のいずれかの条件に該当する患者は対象としなかった。
１）重篤な基礎疾患を有する患者（活動性重症感染症，循環器障害，呼吸器障害，腎障害，脳血管障害，免疫不全，血液凝固能障害など）
２）活動性の重複癌を有する患者
３）重篤なアレルギー疾患の既往のある患者，自己免疫性肝炎の患者　
４）妊婦，授乳婦又は妊娠している可能性のある患者および妊娠を希望している患者　
５）その他，試験責任医師又は試験分担医師が本試験の対象として不適当と判断した患者
投与ペプチド：
　下記の表１に記載の５種類のペプチドのうち，HLAに関係なく１種類のペプチド（１ｂA2-35）をHLA-A24陽性患者に対しては別に４種類用意した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　患者血漿中に抗ペプチド抗体(IgG)が存在することが確認される，もしくは末梢血リンパ球中のキラーT細胞前駆体(CTLp)に認識されるペプチドを選択し，反応性の高いものから順に4種類までのペプチドを選択して投与する。3種類のペプチドに反応性が確認された場合は3種類のみ，2種類に対して反応性を示した場合は2種類のみ，1種類のみの場合は当該ペプチドのみを投与した。患者のペプチドワクチン投与前の血漿中抗ペプチド抗体の反応にてペプチドを選択するが，ワクチン前に抗ペプチド抗体を検出できない場合は，末梢血中のCTLp反応の検査結果を待って，ペプチドを選択した。CTL及び抗体の両者が反応するペプチドを第1位とし，抗体のみが反応するペプチド，CTLのみが反応するペプチドをともに第2位として順位をつけた。また，本試験開始後，免疫反応性の変化に応じて，より強い免疫反応性を示す最適なペプチドへ変更することも可能とした。
　使用したペプチドは、GMP　grade：1　vial=100mg：米国Multiple　Peptide　System社製である。各々のペプチドを適当な溶媒で溶解後，等張液（注射用生理食塩水等で希釈し，さらに不完全フロイントアジュバント（Incomplete　Freund's　Adjuvant（IFA）：Montanide　ISA-51VG：フランスSEPPIC社）を加えてエマルジョン化したペプチド懸濁液（0.3mg、1.0mgまたは3.0mg／ペプチド）を使用した。エマルジョン化したペプチド懸濁液は４℃にて保存した。ペプチド懸濁液は、患者の腹部，大腿部や側背部などの皮下組織内に各々別々に注射することによりワクチン接種した。
継続投与試験
　ペプチドワクチン６回投与後については，患者側の希望があり，かつワクチンによる重篤な副作用（CTCAEv3.0にて評価してグレード3以上)や病態進行が認められない症例については，ワクチン投与の継続もしくはワクチンとインターフェロン製剤との併用を可能とした。
解析結果
　HLA-A24陽性症例でHLA-A24患者用ペプチド4種類の中から投与を受けた患者が12例，HLAに関係なく1ｂA2-35ペプチド投与を受けた症例が26例の合計38例である。その中で発癌防止もしくは再発防止効果についての解析可能症例数としては上記38例のうち，投与開始後6ヶ月以内の3例，2回のみで中止された１例，及び，登録時にエコー診断にてspace　of　occupied　legion　(SOL)が存在し，肝臓癌を否定できない症例2例を除く32例とした。32例中慢性肝炎症例が27例であり(表２)，肝臓癌術後の肝硬変症例が5例であり(表３)，前者は発癌防止，後者は再発防止の視点から解析対象とした。前治療としてはインターフェロン(IFN)未投与が2例，IFN無効例６例，IFN／リバビリン(RBV)併用無効24例であった。殆どの症例はHCV１b感染者であり，1例のみHCV2a(症例102)である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
ワクチン投与期間
　ワクチンは隔週投与を原則し投与回数は6回～83回であり中央値は24回であった(表２および３)。ワクチン期間は2ヶ月～49ヶ月であり中央値は14ヶ月であった。なおワクチン単独投与後のインターフェロン併用の7症例及びインターフェロン・リバビリン併用３例についても表２および３に記載した。
肝機能及びＨＣＶウイルス量の変動
　まずワクチン単独投与における各種肝機能の変動を解析した。その結果，３２例全体では有意な増減を認めなかった。つまり，代表的肝機能マーカーであるALTの改善は限定的であり，その他の病態進行に関与するマーカーである血小板数やAFPにおいてもは有意な変動は認められず、ウイルス量の変動も認めていない。開始時と終了時の成績は表２に示す。また図１に投与前，投与中及び終了時の成績を示す。なお、個々の症例ではワクチン開始前に比較してワクチン単独投与終了時ALTの30%以上の低下が32例中13例，また血小板の30%以上増加が32例中1例に認めた。同様にHCVウイルス量の50%以上低下が32例中3例に認められた。
　次にワクチン単独投与後にワクチンとインターフェロン製剤併用症例10例のワクチン開始前，ワクチン単独投与終了時，及びワクチン・インターフェロン併用終了時のALT値を解析した。併用終了時に低下傾向を認めたが，統計学的有意差を得られなかった。但し，個々の症例では10例中1例においてワクチン単独投与終了時に比べて併用終了時に30%以上の低下が認められた。
　また，上記10例の併用開始前と併用終了時HCVウイルス量を比較検討した。併用終了時に低下傾向を認めたが，統計学的有意差を得られなかった。但し，個々の症例では10例中5例においてワクチン単独投与終了時に比べて併用終了時に30%以上の低下がみとめられ，うち2例はウイルスの完全消失例であった(表２のCase1，Case8)。これらより，HCVワクチンは肝機能とウイルス量いずれに対しても統計学的に有意な変動をもたらしていないと判断された。
肝臓癌発生もしくは再発防止効果の解析
　３２症例においてワクチン投与期間中の肝臓癌発癌もしくは再発は皆無であった。さらに，ワクチン終了後12ヶ月時点での肝臓癌発癌もしくは再発も皆無であった。しかしながら，ワクチン終了後26か月で1例の発癌を認め，ワクチン終了後15ヶ月で１例の再発が認められた。これらより，HCVワクチンは肝臓癌の発生及び再発を防止する可能性が示唆された。そこで27例の慢性肝炎症例における発癌予防効果と5例の肝癌術後肝硬変症例における再発防止効果についてワクチン投与を受けなかった院内コントロール群での発癌もしくは癌再発との統計学的比較検討を実施した。
発癌予防効果
　HCVペプチドをうけた27症例の平均観察期間(中央値)は33.8カ月（8.5-55.7カ月，2008年7月31日閉め）であるが，HCVワクチン治療による免疫反応の維持期間は動物モデルでは投与蛋白〈ペプチドを含む〉やアジュバンドにより差異はあるものの約1年と推測されている（Roovand　F,　et　al.,　BBCR.　354:641-649,2007）。ヒトでの成績では正確には報告されていないが6ヶ月～1年程度と推定される（Schlaphoff　V,　et　al.,　Vaccine.　2007　Sep　17;25(37-38):6793-806）。そこでワクチンによる発癌予防効果判定の期間としてはワクチン投与開始日を初日としてワクチン最終投与日から１年経た日にちを最終日としてそれまでの解析期間内のおける発癌の有無を解析した。その場合の27例の平均観察期間(中央値)は20.5カ月（8.5-49カ月，2008年7月31日閉め）であった。この観察期間内において明らかな病態進行を認めた症例は皆無であった。
　但し，その後の追跡調査にてワクチン最終投与日から12ヶ月以上経てからの発癌症例が１例あったが，ワクチン終了後29ヶ月目の肝臓癌の発癌であった。本症例における発癌はワクチン終了後，治療有効期間を過ぎていたためと考察された(表２のcase10)。これらの結果，当該ワクチンは肝機能やウイルス量の変動はきたさずに，免疫能の活性化を介しての発癌予防効果があることが示唆された。
　そこで当院において，2001年12月1日～2005年7月31日までの3年8ヶ月間に標準治療(インターフェロン＋リバビリン，IFN+RBV)抵抗性であったHCV感染患者のうち、追跡可能症例でかつ血小板数13万以下（F3-F4）の計33症例について発癌の有無を検討した。33例中ワクチン継続試験を受けた症例が12例，受けなかった症例が21例であった。年齢，性別や血小板数，観察期間においては統計学的有意差を認めなかった。観察期間を3年と設定した。
　その結果，ワクチン投与無しの21症例中4例(19%)が発癌したが，ワクチン投与ありの12例ではワクチン投与終了後一年以内の発癌はゼロであった(図２)。これらの結果を統計学的(ログランク解析)に解析した場合P=0.116となった。即ち症例数を増加して次相臨床試験に進んだ場合には統計学的有意差が認められる可能性を示す指標であるP<0.2の成績が得られた。
　図２は，IFN+REV治療(約1年)後にウイルス量の低下が認められなかった33症例をレトロスペクティブに選び，ワクチン治療を併用した12例と併用しなかった21例を，ワクチン治療を開始した日を基点とし比較し，推計処理した。従って，観察期間におけるワクチン投与期間は，ずっと投与を続けていたわけではなく患者によって異なっている。
　なお，ワクチン投与群12例の基点をコントロール群と同じくIFN+REV治療開始時点で同様に解析すると，コントロール群と比較して危険率0.132で低値を示した（図３）。
再発予防の検証
　久留米大学でのHCVワクチン橋渡し臨床研究に登録されHCVペプチドをうけた肝癌術後肝硬変５症例の観察期間は各々52カ月，51.7か月，51.7ヶ月，27.8か月，15.3か月であったが，ワクチン投与期間は各々11.3ヶ月，10.1ヶ月，17.4ヶ月，12ヶ月，15,3ヶ月であった。ＨＣＶワクチン治療による免疫反応の維持期間は動物モデルでは投与蛋白〈ペプチドを含む〉やアジュバンドにより差異はあるものの約1年と推測されている。ヒトでの成績では正確には報告されていないが6ヶ月～1年程度と推定される。そこでワクチンによる発癌予防効果判定の期間としてはワクチン投与開始日を初日としてワクチン最終投与日から１年経た日にちを最終日としてそれまでの解析期間内のおける発癌の有無を解析した。その場合の５例の観察期間(中央値)は23.3ヶ月，22.1ヶ月，29.4ヶ月，23ヶ月，27.3ヶ月20.5カ月（2008年7月31日閉め）であり，平均観察期間(中央値)は23.3ヶ月であった。この観察期間内において再発を認めた症例は皆無であった。
　しかしながら，ワクチン終了後に２例がインターフェロン治療をうけたものにそのうち1例に肝臓癌再発が認められた(case　107)。発癌確認時期はエコー上ではワクチン投与終了後15か月，組織診断上ではワクチン投与終了後16ヶ月が経過していた。前述の通り，治療有効期間外の発癌と考察された。
　これらより，HCVワクチンの再発予防効果が示唆されたので、統計学的解析をヒストリカルコントロールとの比較において実施した。久留米大学病院での院内コントロール群は1999年1月から2006年12月までに肝切除術もしくはラジオ波治療をうけた279例を対象とした。その1年再発率は19.8%，2年再発率は47.9%，3年再発率は65.2%，4年再発率は71.3%であった（図４）。
　そこで，コントロール279例とワクチン群5例を2年間観察打ち切りの条件化で統計学的に比較検討した（ログランク解析)。その結果統計学的にはP=0.080を持って，ワクチン群の再発率が低かった（図５）。さらに，経過観察を行い，ワクチン群5例を3年間観察打ち切りの条件で同様に統計学的に比較検討したところ，ｐ＝0.04を持ってワクチン群の再発率が低いという結果となった。
　ワクチン投与群における手術からワクチン投与開始までの期間は，平均して約2年であった。従って，コントロール群から，2年以内に再発した症例を除く(94例)と，危険率0.098で低い結果となった（図６）。
　これらより，当該HCVワクチンはHCV1b陽性の慢性肝炎症例に対しては肝臓癌発癌予防効果があり，かつ肝癌術後肝硬変症例にたいしては再発予防効果のあることが示唆された。
　本発明のペプチドは肝臓癌の発症および再発の予防に有用である。

Claims (3)

  1. 以下のアミノ酸配列：
    YLLPRRGPRL（配列番号１）
    RYAPACKPL（配列番号２）
    HYAPRPCGI（配列番号３）
    VYEAADMIM（配列番号４）
    VYHGAGSKT（配列番号５）
    を有するペプチドの１またはそれ以上を有効成分として含有する，Ｃ型肝炎ウイルス感染者において肝癌の発症を予防するための医薬組成物。
  2. 以下のアミノ酸配列：
    YLLPRRGPRL（配列番号１）
    RYAPACKPL（配列番号２）
    HYAPRPCGI（配列番号３）
    VYEAADMIM（配列番号４）
    VYHGAGSKT（配列番号５）
    を有するペプチドの１またはそれ以上を有効成分として含有する，Ｃ型肝炎ウイルス感染者において肝癌の再発を予防するための医薬組成物。
  3. 以下のアミノ酸配列：
    YLLPRRGPRL（配列番号１）
    RYAPACKPL（配列番号２）
    HYAPRPCGI（配列番号３）
    VYEAADMIM（配列番号４）
    VYHGAGSKT（配列番号５）
    を有するペプチドの１またはそれ以上をＣ型肝炎ウイルス感染者に投与することを含む，Ｃ型肝炎ウイルス感染者において肝癌の発症または再発を予防する方法。
PCT/JP2009/005654 2008-10-27 2009-10-27 Ｃ型肝炎ウイルスによる肝癌の発症および再発予防ワクチン WO2010050181A1 (ja)

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