KR20150098676A - B형 간염 바이러스에 대한 백신 - Google Patents

B형 간염 바이러스에 대한 백신 Download PDF

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Abstract

서열번호 1 내지 4에 나타낸 서열 중 하나 또는 서열번호 1 내지 4에 나타낸 서열 중 하나와 80% 이상의 동일성을 갖는 서열의 15개 이상의 연속(contiguous) 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 15개 내지 60개 아미노산 길이의 2 이상의 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 각 펩티드가 하나 이상의 CD8+ T-세포 에피토프 및/또는 하나 이상의 CD4+ T-세포 에피토프를 포함하고, 각 펩티드가 인 비트로 분석에서 10에서 하나 이상의 만성적으로 감염된 HBV 개체로부터의 말초혈단핵세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC)에서 반응을 유발하는 것인 약제학적 조성물.

Description

B형 간염 바이러스에 대한 백신{Vaccines against hepatitis B virus}
본 발명은 면역원성 HBV 펩티드 조성물 및 이 조성물을 이용한 HBV의 치료에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스 (Hepatitis B virus: HBV) 감염은 유럽 및 전세계에서 간-관련 이병률 및 사망률의 주요 원인이다. 추정된 650,000명의 개체가 해마다 간부전 또는 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)으로 사망한다. 다수의 국가에서 백신 접종 프로그램이 신생 HBV 감염에서의 감소를 초래했음에도 불구하고, 풍토병 지역으로부터의 HBV 보유자(carrier)의 이주로 인해 만성 B형 간염 (CHB)은 유럽에서 빠르게 성장하는 문제이다.
개념적 관점에서, 만성 HBV 감염은 3개의 상 (또는 면역 반응의 타입)으로 분류될 수 있다: 면역관용(immune tolerant), 면역 활성 및 비활성 만성 보유자. 이 구별되는 만성 감염의 상은 특징적인 혈청학적 패턴과 일치하고 HBV에 대한 환자의 면역반응과 상관관계를 갖는다. 통상적으로, 지속적인 면역 활성 만성 HBV 감염을 갖는 환자가 HBV 치료를 받는다.
만성 B형 간염 (CHB)에 대해 제한된 치료 옵션이 이용가능하다. 인터페론-알파 및 뉴클레오시드/뉴클레오티드 유사체 (NUC)와 같은 항바이러스제에 의한 바이러스 복제의 억제가, 생존을 개선시키는 궁극적인 목표와 함께 만성 HBV 감염으로부터의 이병률 및 사망률을 감소시키는 유일한 방법이다. 그럼에도 불구하고, 혈청 HBsAg의 소실 및 항-HB 항체의 발달 (혈청전환, seroconversion)이 HBV 감염에 대한 성공적인 면역학적 반응의 특징이고 임상적 치유에 가장 근접한 결과이다. 인터페론-알파만이 상대적으로 낮은 비율의 환자 (<10%)에서 유의한 HBsAg 소실을 유도할 수 있었다. 인터페론은 고비용, 불량한 내약성(tolerability)을 갖고 일부 HBV 유전형은 치료에 대해 불량한 반응성을 유지한다.
결과적으로, NUC는 CHB를 치료하기 위해 유럽에서 승인된 5개의 NUC에 의한 주된 치료 전략을 유지한다. 가장 강력하고 바람직한 약물인, 테노포비어(tenofovir) 및 엔테카비어(entecavir)가 거의 모든 환자에서 매우 유리한 부작용 프로파일을 갖고 HBV DNA 억제를 유도할 수 있다. 그러나, 대부분의 국내 및 국제 가이드라인 하에서 다수의 환자를 위해 평생 치료가 요구된다. 매우 소수의 HBeAg-양성 환자만이 수년간의 NUC 치료 후에도 HBeAg를 제거(clear)할 수 있고, HBeAg-음성 환자는 그렇지 않다. 현재 NUC 치료의 장기간 안전성이 알려져 있지 않다. 그러므로, NUC 치료의 즉각적인 중지를 가능하게 하는 개념이 긴급하게 요구된다.
치료용 백신 접종은 질환에 대한 면역 통제를 유도하는 방법으로서 B형 간염을 위한 유망한 개입(intervention)이다. T-세포 반응이 급성 HBV 감염의 제거에 결정적인 것으로 나타났다. 그러나, HBsAg에 기반한 치료용 HBV 백신은 효과적인 항바이러스 치료 하에서도 높은 수준의 순환하는 HBsAg로부터 유도된 면역 관용으로 인하여 이득을 나타내는데 실패하였다.
발명의 요약
본 발명자들은 상이한 HBV 유전형 간 높은 정도의 보존성을 갖고 HBV 단백질의 기타 유사하게 보존된 부위에 비해 예상치 못하게 우수한 면역원성 특성을 갖는 HBV 프로테옴의 부위를 확인하였다. 특히, 본 발명자들은 인 비트로 분석을 이용하여 예상치 못하게, HBV 폴리머라제의 특정 도메인 및 HBV 코어 단백질 내의 펩티드 서열이 상이한 HBV 유전형에 의해 감염된 만성적으로 감염된 HBV 환자로부터의 및/또는 상이한 인종의 만성적으로 감염된 HBV 환자로부터의 PBMC에서 반응을 유발할 수 있다는 것을 보여주었다. 특히, 본 발명자들은 놀랍게도 HBV 폴리머라제의 말단 도메인에서 면역우성(immunodominant) 부위를 확인하였다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 4에 나타낸 서열 중 하나 또는 서열번호 1 내지 4에 나타낸 서열 중 하나와 80% 이상의 동일성을 갖는 서열의 15개 이상의 연속(contiguous) 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 15개 내지 60개 아미노산 길이의 2 이상의 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 각 펩티드가 하나 이상의 CD8+ T-세포 에피토프 및/또는 하나 이상의 CD4+ T-세포 에피토프를 포함하고, 각 펩티드가 인 비트로 분석에서 하나 이상의 만성적으로 감염된 HBV 개체로부터의 말초혈단핵세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC)에서 반응을 유발하는 것인 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 3에 나타낸 서열 중 하나의 15개 이상의 아미노산을 포함하는 하나 이상의 펩티드 및 서열번호 4에 나타낸 서열의 15개 이상의 아미노산을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함할 수 있다.
하나 이상의 상기 펩티드는 서열번호 24 내지 33 중 하나에 나타낸 서열, 또는 서열번호 24 내지 33에 나타낸 서열 중 하나와 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 하나 이상의 상기 펩티드는 순(net) 양전하를 증가시키고 및/또는 상기 펩티드의 소수성을 감소시키기 위하여 N-말단 및/또는 C-말단에 하나 이상의 아미노산(들)을 더 포함할 수 있다. 그러므로 조성물은 서열번호 34 내지 38 중 하나에 나타낸 서열을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있다.
이 조성물은 HBV 표면 단백질로부터 유래된 하나 이상의 펩티드를 더 포함할 수 있다. HBV 표면 단백질로부터 유래된 펩티드는 15개 내지 60개 아미노산 길이일 수 있고 서열번호 55에 나타낸 서열 또는 서열번호 55에 나타낸 서열의 15개 이상의 연속 아미노산과 80% 이상의 동일성을 갖는 서열의 15개 이상의 연속 아미노산 서열을 포함하는 것으로, 상기 펩티드가 하나 이상의 CD8+ T-세포 에피토프 및/또는 하나 이상의 CD4+ T-세포 에피토프를 포함하고 인 비트로 분석에서 하나 이상의 만성적으로 감염된 HBV 개체로부터의 말초혈단핵세포(PBMC)에서 반응을 유발하는 것이다.
이 조성물은 상기 조성물이 상이한 인종의 2 이상의 개체로부터 및 상이한 HBV 유전형에 의해 감염된 2 이상의 개체로부터의 PBMC에서 면역 반응을 유발할 수 있는 것이다.
이 조성물은 (a) HBV 유전형 A에 의해 감염된 개체, HBV 유전형 B에 의해 감염된 개체, HBV 유전형 C에 의해 감염된 개체 및 HBV 유전형 D에 의해 감염된 개체 중 2개체, 3개체 또는 전부로부터의 PBMC에서; 및/또는 HBV에 의해 감염된 동양인(Oriental) 또는 인도인(Indian) 개체, HBV에 의해 감염된 코카시안(Caucasian) 개체 및 HBV에 의해 감염된 아프리카인(Afirican) 또는 아랍인(Arabic) 개체 중 2개체, 3개체 또는 전부로부터의 PBMC에서 면역 반응을 유발할 수 있을 수 있다.
본 발명의 조성물 중 펩티드는 플루오로카본 벡터(fluorocarbon vector)에 연결될 수 있다. 조성물은 HBc, HBe, 또는 HBs 항원 및/또는 보조제(adjuvant)를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 HBV 감염의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한, 특히 HBeAg-음성 환자 또는 HBeAg-양성 환자의 치료를 위한 본 발명의 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 (i) 인터페론-알파 및/또는 뉴클레오시드/뉴클레오티드 유사체 (NUC); 및/또는 (ii) 항-PD1 블로킹 항체, 항-CTLA4 블로킹 항체, 항-PD1L 블로킹 항체, 항-LAG3 블로킹 항체, 항-TIM3 블로킹 항체 및/또는 시클로포스파미드와 조합으로 이용될 수 있다. 이 조성물에 의한 치료는 HBsAg 소실 또는 HBsAg 혈청전환을 야기할 수 있다.
또한, 본 발명은 말기 간 질환 또는 간세포 암종의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 또는 D형 간염 바이러스(hepatitis D virus: HDV) 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물의 치료학적 유효량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 HBV 감염을 치료 또는 예방하는 방법, 및 HBV의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명에 따른 조성물의 용도가 또한 제공된다.
또한, 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나에 나타낸 서열 또는 서열번호 1 내지 4에 나타낸 서열 중 하나와 80% 이상 동일성을 갖는 서열의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 15개 내지 60개 아미노산 길이의 펩티드로서, 상기 펩티드가 하나 이상의 CD8+ T-세포 에피토프 및/또는 하나 이상의 CD4+ T-세포 에피토프를 포함하고, 인 비트로 분석에서 하나 이상의 만성적으로 감염된 HBV 개체로부터의 말초혈단핵세포(PBMC)에서 반응을 유발할 수 있는 것인 펩티드를 제공한다. 이 펩티드는 서열번호 5, 6, 14 또는 15에 나타낸 서열의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 24 내지 38에 나타난 서열 중 하나, 또는 서열번호 24 내지 38에 나타낸 서열 중 하나와 80% 이상 동일성을 갖는 서열을 포함하는 펩티드를 제공한다.
본 발명의 펩티드는 플루오로카본 벡터에 공유적으로 연결될 수 있다.
서열목록의 간단한 설명
서열번호 1 내지 38 및 40 내지 72는 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 HBV 폴리머라제의 서열번호 39에 나타낸 참조 HBV 서열 부위의 아미노산 서열이다.
서열번호 실시예의 참조 가상의( virtual ) HBV 프로테옴 서열의 부위 HBV 단백질
1 풀 2/3 93-186 폴리머라제
2 풀 4 내지 7 211-426 폴리머라제
3 풀 12 및 13 592-700 폴리머라제
4 풀 14 내지 17 703-912 코어
5 풀 2 93-145 폴리머라제
6 풀 3 133-186 폴리머라제
7 풀 5 + 추가 N-말단 잔기 260-326 폴리머라제
8 풀 6 332-384 폴리머라제
9 풀 6/7 332-426 폴리머라제
10 풀 14/15 703-812 코어
11 풀 15/16 749-871 코어
12 풀 16/17 811-912 코어
13 풀 17 859-912 코어
14 풀 25 93-132 폴리머라제
15 풀 26 133-171 폴리머라제
16 풀 28 + 추가 N-말단 잔기 260-301 폴리머라제
17 풀 30 332-378 폴리머라제
18 풀 31 359-398 폴리머라제
19 풀 35 626-663 폴리머라제
20 풀 38 738-775 코어
21 풀 39/40 778-837 코어
22 풀 42 838-878 코어
23 풀 43 859-891 코어
24 P113 96-130 폴리머라제
25 P151 134-168 폴리머라제
26 P277 260-295 폴리머라제
27 P360 342-378 폴리머라제
28 P376 359-398 (393에서 C의 S로의 치환) 폴리머라제
29 P645 627-662 폴리머라제
30 P753 738-770 (743에서 S의 T로의 치환) 코어
31 P797 780-814 (793에서 C의 S로의 치환) 코어
32 P856 839-873 코어
33 P877 860-890 코어
34 P277(K) 260-293 + KKK 코어
35 P645(K) KKK + 627-662 코어
36 P753(K) KK + 738-770 (743에서 S에서 T로) + KKK 코어
37 P797(K) 780-814 (792에서 C에서 S로) +KKK 코어
38 P856(K) 839-873 +KKK 코어
40 풀 1 25-79 폴리머라제
41 풀 4 211-261 폴리머라제
42 풀 7 372-426 폴리머라제
43 풀 8 414-465 폴리머라제
44 풀 9 473-531 폴리머라제
45 풀 10 520-569 폴리머라제
46 풀 11 557-604 폴리머라제
47 풀 12 592-650 폴리머라제
48 풀 13 638-700 폴리머라제
49 풀 14 703-762 코어
50 풀 15 749-812 코어
51 풀 16 811-871 코어
52 풀 18 966-1017 X
53 풀 19 1005-1062 X
54 풀 20 1171-1224 표면
55 풀 21 1241-1296 표면
56 풀 22 1312-1346 표면
57 풀 23 1392-1447 표면
58 풀 24 31-79 폴리머라제
59 풀 27 223-261 폴리머라제
60 풀 28 265-301 폴리머라제
61 풀 29 289-326 폴리머라제
62 풀 32 404-440 폴리머라제
63 풀 33 428-465 폴리머라제
64 풀 34 557-597 폴리머라제
65 풀 36 645-685 폴리머라제
66 풀 37 659-700 폴리머라제
67 풀 39 778-812 코어
68 풀 40 811-837 코어
69 풀 41 811-850 코어
70 풀 44 979-1024 X
71 풀 45 1247-1289 표면
72 풀 46 1399-1439 표면
220 풀 5 265-326 폴리머라제
221 P1266 1252-1284 (1266에서 K에서 R로) 표면
222 P1266(K) KKK+1252-1284 (1266에서 K에서 R로)+KKK 표면
서열번호 39는 폴리머라제의 말단 도메인 (위치 1 내지 181), 폴리머라제의 역전사효소 도메인 (위치 182 내지 549) 폴리머라제의 RNase 도메인 H (위치 550 내지 702), 코어 단백질 (위치 703 내지 914), X 단백질 (위치 915 내지 1068) 및 표면 단백질 (위치 1069 내지 1468)의 선형 공동어셈블리(linear coassembly)에 의해 축조된 가상의 HBV 단백질 서열이다. 프로테옴 서열이 유전형 A, B, C 및 D 공통 서열로부터 생성된 공통 서열의 공통 부분(consensus)으로부터 수득되었다.
서열번호 73 내지 219는 각각의 풀 1 내지 46 내의 짧은 펩티드의 아미노산 서열이다. 서열번호 220는 풀 5의 아미노산 서열이다.
발명의 상세한 설명
펩티드 조성물
본 발명은 집단 커버리지 및 HBV 유전형 커버리지의 관점에서 광범위한 적용가능성을 갖는 다중에피토픽(multiepitopic) CD4+ 및 CD8+ T-세포 면역 반응을 유발할 수 있는 광범위한 면역원성 펩티드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 15개 내지 60개의 아미노산 길이를 갖는 하나 이상의 펩티드를 포함하고, 상기 펩티드가 HBV 폴리머라제의 말단 도메인, HBV 폴리머라제의 역전사효소 도메인, HBV 폴리머라제의 RNase H 도메인 서열 또는 HBV 코어 단백질 중 15개 이상의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 것인 약제학적 조성물을 제공한다. 이 펩티드는 15개 내지 60개의 아미노산 길이를 갖고 서열번호 1 내지 4에 나타낸 서열 중 하나의 15개 이상의 연속 아미노산의 서열을 포함하는 펩티드로부터 선택된다. 이 펩티드는 하나 이상의 CD8+ T-세포 에피토프 및/또는 하나 이상의 CD4+ T-세포 에피토프를 포함한다. 이 펩티드는 인 비트로 분석에서 하나 이상의 만성적으로 감염된 HBV 개체로부터의 말초혈단핵세포(PBMC)에서 반응을 유발한다.
이 조성물은 상기 정의된 특성을 갖는 다수의 펩티드를 포함할 수 있다. 이 조성물은 상이한 인종의 2 이상의 개체로부터 및/또는 상이한 HBV 유전형에 의해 감염된 2 개체로부터의 말초혈단핵세포(PBMC)에서 면역 반응을 유도할 수 있다.
펩티드 서열
본 발명의 조성물은 서열번호 1 내지 4 중 하나로부터의, 20, 25, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35개 이상의 아미노산과 같은, 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함할 수 있다. 서열번호 1, 2 및 3은 HBV 폴리머라제 서열이다. 서열번호 4는 HBV 코어 단백질 서열이다.
이들 부위는 추가로 세분화되어, 본 발명의 조성물에 존재하는 펩티드가 서열번호 5 내지 13 중 하나로부터의, 15, 20, 25, 30, 32, 33, 34 또는 35개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이들 서브부위 내로부터의 펩티드가 서열번호 14 내지 23 중 하나의 서열 내에 있는 서열을 포함한다.
서열번호 1 내지 4 내의 예시적인 짧은 펩티드가 서열번호 80 내지 117 및 142 내지 184에서 나타난다. 바람직한 예시적인 짧은 펩티드가 서열번호 80 내지 83, 86 내지 89, 98 내지 101, 105 내지 112, 146 내지 150, 163 내지 166 및 169 내지 181에서 나타난다. 본 발명의 조성물은 이들 짧은 서열 중 하나 이상을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있다.
이들 HBV 폴리머라제 서열로부터의 특히 바람직한 펩티드는 서열번호 24 내지 29에 나타낸 서열 중 하나를 포함한다. 서열번호 24는 서열번호 1, 5 및 14의 바람직한 부위이다. 서열번호 25는 서열번호 1, 6 및 15의 바람직한 부위이다. 서열번호 26은 서열번호 2, 7 및 16의 바람직한 부위이다. 서열번호 27은 서열번호 2, 8 및 17의 바람직한 부위이다. 서열번호 28은 서열번호 2, 9 및 18의 바람직한 부위이다. 서열번호 29는 서열번호 3 및 19의 바람직한 부위이다.
상기 HBV 코어 단백질 서열 (서열번호 4)로부터의 특히 바람직한 펩티드는 서열번호 30 내지 33에 나타낸 서열 중 하나를 포함한다. 서열번호 30은 서열번호 10 및 20의 바람직한 부위이다. 서열번호 31은 서열번호 11 및 21의 바람직한 부위이다. 서열번호 32는 서열번호 12 및 22의 바람직한 부위이다. 서열번호 33은 서열번호 13 및 23의 바람직한 부위이다.
기타의 바람직한 펩티드가 서열번호 24 내지 33에 나타낸 서열 내에 포함되고 이들 서열 중 하나로부터의 25, 29, 30, 31, 32, 33 또는 34개 이상의 연속 아미노산과 같은, 20개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함한다.
이 조성물은 15개 내지 60개의 아미노산 길이인 하나 이상의 펩티드로서, 상기 펩티드가 HBV 표면 단백질의 15개 이상의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 것인 펩티드를 더 포함할 수 있다. HBV 표면 단백질 펩티드는 일반적으로 15개 내지 60개 아미노산 길이인 것이고 서열번호 55에 나타낸 서열의 15개 이상의 연속 아미노산의 서열을 포함하는 펩티드로부터 선택된다.
HBV 표면 단백질 펩티드는 서열번호 55 중 하나, 및 바람직하게는 서열번호 71로부터의 15, 20, 25, 30, 32, 33, 34 또는 35개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
서열번호 55 및 71 내의 예시적인 짧은 펩티드가 각각 서열번호 204 내지 210 및 205 내지 209에 나타난다. 본 발명의 조성물은 이들 짧은 서열 중 하나 이상을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있다.
이들 HBV 표면 단백질 서열로부터의 특히 바람직한 펩티드는 서열번호 221에 나타낸 서열 중 하나를 포함한다. 서열번호 221은 서열번호 55 및 71의 바람직한 부위이다.
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 추가의 펩티드는 서열번호 1 내지 33, 55, 71 및 221 중 하나에 나타낸 서열 중 하나에서의, 1개 이상, 예를 들면 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환, 부가 또는 결실, 바람직하게는 치환을 포함하는 서열을 포함하는 펩티드이다. 연속 서열 내의 1개, 2개, 3개 또는 그보다 많은 아미노산이 치환될 수 있다. 특정된 서열 내의 치환이 시스테인 잔기를 제거하는 돌연변이를 포함한다. 예를 들면, 시스테인 잔기가 세린 잔기에 의해 치환될 수 있다.
일반적으로 그와 같은 펩티드는 15개 또는 20개 이상, 예를 들면 25, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의, 서열번호 1 내지 33, 55, 71 및 221 중 하나에서의 연속 아미노산, 또는 서열번호 24 내지 33 및 221에 나타낸 서열 중 하나의 전체 길이에 대해 80% 이상의, 예를 들면, 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상의 서열 동일성을 가질 것이다 (예를 들면, National Center for Biotechnology Information (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에서 이용가능한 BLAST 프로그램을 이용하여 결정됨). 그와 같은 펩티드는 HBV 폴리머라제 또는 코어 단백질의 동등 부위 내 HBV 유전형 A, B, C, D, E 또는 F의 아미노산 서열과 매칭되는 서열을 포함한다.
펩티드의 전체 길이가 60개 아미노산을 초과하지 않는 경우, 펩티드가 추가 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 펩티드는 서열번호 1 내지 33, 55, 71 및 221, 바람직하게는 서열번호 24 내지 33 및 221 중 하나에 나타낸 서열 중 하나로부터의 20개 이상, 예를 들면, 25, 29, 30, 31, 32, 33, 34 또는 35개의 연속 아미노산을 포함할 수 있고 15, 20 또는 25개의 아미노산부터 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55 또는 60개 이하의 아미노산까지의 길이를 가질 수 있다.
그러므로, 펩티드는 일반적으로 15개 또는 20개 내지 60개 아미노산, 예를 들면 25개 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 30개 내지 40개 아미노산, 예를 들면, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39개 아미노산의 길이를 갖는다.
펩티드는 추가 서열을 포함할 수 있다. 추가 서열은 펩티드의 제조 또는 제제화를 촉진하거나 펩티드의 안정성을 향상시킬 수 있다. 예를 들면, 펩티드는 일반적으로 N-말단 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 추가 아미노산을 포함하여 펩티드의 순(net) 양전하를 증가시키고 및/또는 펩티드의 소수성을 감소시킬 수 있다. 순 양전하가 증가되어, 펩티드가 7 이상의 등전점을 가질 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 하나 이상의, 예를 들면 2개 또는 3개의 양으로 하전된 아미노산 (아르기닌 및/또는 라이신)이 조성물 중 하나 이상의 펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 부가된다. 예를 들면, 하나 이상의 펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 3개의 라이신 잔기가 부가될 수 있다. 일반적으로 양성 아미노산이 65%를 초과하는 전체 소수성, 0 미만의 순 전하를 갖고 및/또는 소수성 아미노산의 클러스터를 포함하는 펩티드의 말단(들)에 부가된다.
N- 및/또는 C-말단 라이신 잔기를 포함하는 펩티드의 특정한 예가 서열번호 34 내지 38 및 222에 나타난다.
펩티드가 공통 HBV 서열에 존재하지 않는 하나 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. 그와 같은 일례는 무차별(promiscuous) T 보조 에피토프가 (선택적으로 폴리펩티드 링커 또는 스페이서를 통해) 공통 서열에 공유적으로 연결된 융합 펩티드의 사용이다. 예로서, 무차별 T 보조 에피토프가 PADRE 펩티드, 파상풍변성독소(tetanus toxoid) 펩티드 (830-843) 또는 인플루엔자 헤마글루티닌(influenza haemagglutinin), HA(307-319)일 수 있다.
펩티드가 플루오로카본에 연결되는 경우, 펩티드의 말단, 예를 들면, 플루오로카본에 결합되지 않은 말단, 또는 기타 부착부위(attachment)가 변하여, 예를 들면, 마이셀(micelle)의 형성을 통해 플루오로카본-펩티드 구조체의 가용성을 촉진시킬 수 있다. 구조체의 대규모 합성을 촉진시키기 위하여, 펩티드의 N- 또는 C-말단 아미노산 잔기가 변형될 수 있다. 바람직한 펩티드가 펩티다제에 의한 절단에 특히 민감할 경우, 정상 펩티드 결합이 절단가능하지 않은 펩티드 모방체(mimetic)에 의해 대체될 수 있다. 그와 같은 결합 및 합성 방법이 기술분야에 잘 알려져 있다.
펩티드가 천연(native) 펩티드일 수 있다. 펩티드가 인 비보에서 펩티드의 수명, 예를 들면 투여 부위에서의 반감기 또는 지속성을 증가시키도록 또는 펩티드를 항원-제시 세포로 향하게 하도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 면역원성 펩티드가 공유적으로 연결된 인접 아미노산에 있어서 하나 이상의 비-자연 발생 아미노산 및/또는 비-자연 발생 공유 결합을 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 비-표준의, 비-자연 발생 아미노산은 또한, MHC 분자와 상호작용하는 펩티드의 능력을 방해하지 않고 자연 서열을 인식하는 T-세포와의 교차-반응성을 유지할 경우, 면역원성 펩티드에 포함될 수 있다. 프로테아제 또는 화학적 안정성에 대한 펩티드 저항성을 개선시키기 위하여 비-자연 아미노산이 이용될 수 있다. 비-자연적 아미노산의 예는 D-아미노산 및 시스테인 변형을 포함한다.
펩티드가 담체, 예를 들면 단백질 담체 또는 전달 벡터에 결합될 수 있다. 적합한 전달 벡터는 리포펩티드, 예를 들면 모노팔미토일 사슬과 같은 지방산 사슬, 바이로솜(virosome), 리포좀 및 세포 침투 펩티드, 예를 들면 페네트라틴(penetratin) 및 전사의 전사활성자 (TAT)를 포함한다.
본 발명의 조성물 중 하나 이상의, 및 바람직하게는 모든 HBV 펩티드가 바람직하게는 플루오로카본 탄소에 공유적으로 연결된다.
펩티드의 조합
본 발명의 조성물은 다수의 펩티드를 포함할 수 있다. 따라서, 조성물은 각각 전술된 바와 같은 서열번호 1 내지 4 중 하나의 15개 이상의 연속 아미노산의 서열을 포함하는, 2개 이상의, 예를 들면, 3개 이상, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그를 초과하는 펩티드를 포함할 수 있다. 조성물은 추가로 전술된 바와 같은 서열번호 55의 15개 이상의 연속 아미노산의 서열을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 조성물은 서열번호 1 내지 3에 나타낸 서열 중 하나의 15개 이상의 아미노산 및 서열번호 4에 나타낸 서열의 15개 이상의 아미노산을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함할 수 있고, 선택적으로 서열번호 55에 나타낸 서열 중 하나의 15개 이상의 아미노산을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 조성물은 서열번호 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 34에 나타낸 서열 중 하나의 15개 이상의 아미노산 및 서열번호 30 내지 33 및 35 내지 38에 나타낸 서열 중 하나의 15개 이상의 아미노산을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 조성물은 전술된 바와 같은 서열번호 1 및/또는 2 중 하나의 15개 이상의 연속 아미노산의 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드 및 전술된 바와 같은 서열번호 3 또는 4의 15개 이상의 연속 아미노산의 서열을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 조성물은 전술된 바와 같은 서열번호 1 또는 2의 15개 이상의 연속 아미노산의 서열을 포함하는 펩티드 (또는 서열번호 5 및 6의 서열을 포함하는 펩티드) 및 전술된 바와 같은 서열번호 10 내지 13 중 어느 하나의 15개 이상의 연속 아미노산의 서열을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명은 전술된 바와 같은 서열번호 5, 6, 7, 8 및 9 중 2개, 3개, 4개, 5개 또는 전부의 15개 이상의 연속 아미노산의 서열을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있고 및/또는 전술된 바와 같은 서열번호 10 내지 13 중 2개, 3개, 또는 전부의 15개 이상의 연속 아미노산의 서열을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 중에 존재하는 펩티드는 서열번호 24 내지 38에 나타낸 서열 중 하나로 이루어지거나, 필수적으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 조성물 중에 존재하는 HBV 표면 단백질 펩티드는 서열번호 221 및 222에 나타낸 서열 중 하나로 이루어지거나, 필수적으로 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 펩티드, 예를 들면 서열번호 24 내지 38 중 하나에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진, 필수적으로 이루어진, 또는 포함하는 2 이상의 펩티드 및 선택적으로 서열번호 221 또는 222에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진, 필수적으로 이루어진, 또는 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 조성물은 서열번호 24 내지 33 및 221에 나타낸 서열을 포함하는 2개 이상의, 예를 들면 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 펩티드를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 서열번호 24 내지 33 및 221 중 하나를 포함하는 하나 이상의 펩티드가 N- 또는 C-말단 라이신 잔기를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 서열번호 26, 29, 30, 31, 32 및 221를 포함하는 펩티드가 각각 서열번호 34 내지 38 및 222에 나타낸 서열을 가질 수 있다.
예를 들면, 조성물이 서열번호 24, 25, 27, 28, 33, 34, 35, 36, 37 및 38에 나타낸 서열을 포함하는, 이루어지는, 또는 필수적으로 이루어지는 펩티드 중 2개 이상, 예를 들면 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개, 또는 서열번호 24, 25, 28, 33, 34, 36, 37 및 38을 포함하는, 이루어지는, 또는 필수적으로 이루어지는 펩티드 중 2개 이상, 예를 들면 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개를 포함할 수 있다. 이들 펩티드의 가능한 조합이 본 발명의 조성물 중에 존재할 수 있다. 바람직한 조합은 서열번호 24, 25, 28, 33 및 31/37 중 하나 이상, 예를 들면 어느 2개, 어느 3개, 어느 4개 또는 전부, 바람직하게는 서열번호 24 및/또는 25를 포함한다. 예를 들면, 서열번호 24와 33의 조합이 7개 클라스 I 대립유전자 및 7개 클라스 II 대립유전자에 결합하는 에피토프를 함유하는 조성물을 생성한다. 조성물은 추가로 서열번호 221 또는 222를 포함하는, 이루어지는, 또는 필수적으로 이루어지는 펩티드를 포함할 수 있다.
예를 들면, 조성물이 하기 서열: 서열번호 24, 25, 26, 28, 30, 31, 32 및 33을 포함하는 8개 펩티드, 및 선택적으로 서열번호 222를 포함하는 9번째 펩티드를 포함할 수 있다.
펩티드 중 하나, 예를 들면, 서열번호 28을 포함하는 펩티드가 서열번호 27을 포함하는 펩티드에 의해 치환될 수 있고 및/또는 일 펩티드가 서열번호 29를 포함하는 펩티드에 의해 치환될 수 있다. 하나 이상의 펩티드가 전술된 바와 같은 보다 짧은 펩티드, 예를 들면, 그의 전체 길이에 걸쳐 치환된 펩티드의 20개 이상의 연속 아미노산을 갖는 펩티드에 의해 또는 치환된 펩티드의 아미노산 서열에 80% 이상의 동일성을 갖는 펩티드에 의해 치환될 수 있다.
바람직하게는, 조성물은 전술된 바와 같은 HBV 폴리머라제로부터, 보다 바람직하게는 HBV 폴리머라제의 말단 도메인으로부터의 하나 이상의 펩티드를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, HBV 폴리머라제 펩티드는 서열번호 1 내의 하나 이상의 아미노산 서열, 예를 들면 서열번호 5, 6, 14, 15, 24 또는 25 내의 하나 이상의 서열을 포함한다. 예를 들면, 그와 같은 펩티드는 서열번호 80, 81, 82, 83, 86, 87, 88, 89, 24 또는 25 중 하나에 나타낸 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
HBV 유전형
조성물 중 펩티드 서열의 조합이 다수의 HBV 유전형에 존재하는 에피토프, 바람직하게는 CD8+ 및 CD4+ 에피토프를 제공한다. HBV 유전형은 유전형 A, B, C, D, E 및 F를 포함한다. 예를 들면, 긴 펩티드가 2개 이상의 HBV 유전형, 예를 들면 A 및 D (유럽에서 가장 높은 일반적인 유전형) 또는 B 및 C (아시아에서 가장 높은 일반적인 유전형)로부터의 에피토프를 포함한다. 보다 바람직하게는, 조성물이 3개 이상의 HBV 유전형, 예를 들면, A, B 및 C, A, B 및 D, A, C 및 D 또는 B, C 및 D로부터의 에피토프를 포함한다. 가장 바람직하게는, 조성물이 적어도 HBV 유전형 A, B, C 및 D로부터의 에피토프를 포함할 수 있다. 유전형 A, B, C 및 D 중 하나 이상의 조합으로부터의 에피토프의 조합을 포함하는 것 이외에, 조성물이 유전형 E, F 및/또는 G에 대한 에피토프를 포함할 수 있다. 이는 적합한 수단, 예를 들면 본 명세서에 기술된 바와 같은 인 비트로 PBMC 분석을 이용함으로써 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 HBV 유전형 A에 의해 감염된 개체, HBV 유전형 B에 의해 감염된 개체, HBV 유전형 C에 의해 감염된 개체, HBV 유전형 D에 의해 감염된 개체 및 다른 HBV 유전형에 의해 감염된 개체 중 2, 3, 4 또는 전부로부터의 PBMC에서 면역 반응을 유발할 수 있는 조성물을 제공한다.
HBV 유전형 A에 의해 감염된 개체, HBV 유전형 B에 의해 감염된 개체, HBV 유전형 C에 의해 감염된 개체, HBV 유전형 D에 의해 감염된 개체 중 2, 3, 또는 전부에서 면역 반응을 유발할 수 있는 본 발명의 조성물이 하기 그룹 중 2개 이상, 바람직하게는 3개 또는 전부로부터 선택되는 하나 이상의 펩티드를 포함할 수 있다:
(i) 서열번호 14, 15, 20, 21, 67, 22 또는 23의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드;
(ii) 서열번호 14, 17, 18, 21 또는 67의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드;
(iii) 서열번호 14, 16, 60, 19, 20 또는 22의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드; 및
(iv) 서열번호 14, 15, 20, 21, 67, 22 또는 23의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드.
조성물은 서열번호 55 또는 서열번호 71의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드를 더 포함할 수 있다.
예를 들면, 그와 같은 조성물은 하기 그룹 중 2개 이상, 바람직하게는 3개 또는 전부로부터 선택되는 하나 이상의 펩티드를 포함할 수 있다:
(i) 서열번호 20, 21, 67, 22 또는 23의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드;
(ii) 서열번호 17 또는 18의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드;
(iii) 서열번호 16, 60 또는 19의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드; 및
(iv) 서열번호 14 또는 15의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드.
조성물은 서열번호 55 또는 서열번호 71의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드를 더 포함할 수 있다.
특정된 서열의 15개 이상의 아미노산을 포함하는 적합한 펩티드가 본 명세서에 보다 상세하게 기술되고 특히, 표 4에 언급된 서열번호 24 내지 38의 펩티드 및 서열번호 221 및 222의 펩티드를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명의 조성물은 HBV 유전형 A에 의해 만성적으로 감염된 하나 이상의 개체, HBV 유전형 B에 의해 만성적으로 감염된 일 개체, HBV 유전형 C에 의해 만성적으로 감염된 일 개체 및 HBV 유전형 D에 의해 만성적으로 감염된 일 개체로부터의 말초혈단핵세포 (PBMC)에서의 인 비트로 반응을 유발한다. 이는 적합한 방법, 예를 들면 본 명세서의 실시예에 기술된 방법에 의해 결정될 수 있다. 개체는 바람직하게는 2 이상의 상이한 인종으로부터의, 동일한 또는 상이한 인종인 것일 수 있다. 개체는 동일한 또는 상이한 HLA 서브타입, 바람직하게는 2 이상의 상이한 HLA 서브타입인 것일 수 있다.
인종
본 발명은 2 이상의, 예를 들면 3 이상의 상이한 인종의 개체에서 면역 반응을 유발할 수 있는 조성물을 제공한다. 이는 실시예에 기술된 바와 같은 인 비트로 PBMC 분석을 이용하여 평가될 수 있다. 본 발명의 조성물은 HBV에 의해 감염된 동양인 또는 인도인 개체, HBV에 의해 감염된 코카시안 개체 및 HBV에 의해 감염된 아프리카인 또는 아랍인 개체 중 2, 3 또는 전부로부터의 PBMC에서 면역 반응을 유발할 수 있다.
HBV에 의해 감염된 동양인 또는 인도인 개체, HBV에 의해 감염된 코카시안 개체 및 HBV에 의해 감염된 아프리카인 또는 아랍인 개체 중 2, 3 또는 전부에서 면역 반응을 유발할 수 있는 본 발명의 조성물은 하기 그룹 중 2개 이상, 바람직하게는 3개 또는 전부로부터 선택되는 하나 이상의 펩티드를 포함할 수 있다:
(i) 서열번호 14, 16, 60, 17, 18, 20, 21, 67 또는 22의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드;
(ii) 서열번호 14, 15, 19, 20, 22 또는 23의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드; 및
(iii) 서열번호 14, 15, 20, 21, 67, 22 또는 23의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드.
조성물은 서열번호 55 또는 서열번호 71의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드를 더 포함할 수 있다.
예를 들면, 그와 같은 조성물은 하기 그룹 중 2개 이상, 바람직하게는 3개 또는 전부로부터 선택되는 펩티드를 포함할 수 있다:
(i) 서열번호 16, 60, 17, 18의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드;
(ii) 서열번호 14, 15 또는 19의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드; 및
(iii) 서열번호 14, 15, 20, 21, 22 또는 23의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드.
조성물은 서열번호 55 또는 서열번호 71의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드를 더 포함할 수 있다.
특정된 서열의 15개 이상의 아미노산을 포함하는 적합한 펩티드가 본 명세서에 보다 상세하게 기술되고, 특히, 표 4에 언급된 서열번호 24 내지 38의 펩티드 및 서열번호 221 및 222의 펩티드를 포함한다.
에피토프
HLA 클라스 I 및 클라스 II 분자는 다형성을 갖고 그들의 빈도는 인종 그룹 사이에서 변화한다. 대부분의 다형성이 펩티드-결합 부위에 위치하고 그 결과 각 변이체가 특유한 레파토리(repertoire)의 펩티드 리간드에 결합한다고 믿어진다. HLA 다형성이 차등 펩티드 결합을 위한 기초이므로 HLA 다형성이 백신 설계자에 있어서 주된 도전을 나타낸다. 또한, 특이적 HLA 대립유전자가 상이한 인종에서 극적으로 상이한 빈도로 발현된다.
그와 같은 다형성에도 불구하고, HLA 분자가 펩티드의 중복되는 세트에 결합하고, 그러므로, 그에 따라 수퍼타입(supertype)으로 그룹화될 수 있다 (Lund et al (2004) Immunogenetics 55(12):797-810, Sette et al (1999) Immunogenetics 50(3-4):201-212). 수퍼타입은 유사한 펩티드 결합 레파토리를 갖고 결과적으로 펩티드의 중복되는 세트를 공유하는 상이한 HLA 분자의 패밀리로 정의된다. 다시 말해서, 주어진 수퍼타입에 속하는 HLA 대립유전자에 결합하는 펩티드는 나머지 수퍼 타입 구성원(member)에 대한 결합 활성을 나타내는 것처럼 보인다.
상이한 HLA 클라스 II 대립유전자에 있어서 펩티드의 결합 능력이 Texier et al (2000) J Immunol 164:3177-3184, Texier et al (2001) Eur J Immunol 31:1837-1846 and Castelli et al (2002) J Immunol 169:6928-6934에 기술된 바와 같은 각 HLA 클라스 II 대립유전자에 대한 특이적 비오틴화 트레이서(tracer) 펩티드를 이용한 이종 경쟁 분석(heterologous competitive assay)을 이용하여 결정될 수 있다.
9개의 하기 HLA 클라스 II 대립유전자는 Lund et al (2004) Immunogenetics 55(12):797-810 및 Greenbaum et al (2011) Immunogenetics 63(6):325-35에 기술된 바와 같은 서열 분석 및 결합-모티프 특이성에 기초하여 주요 수퍼타입 또는 HLA 클러스터를 나타낸다: HLA-DR1 (α1*01:01;β1*01:01), HLA-DR3 (α1*01:01;β1*01:01), HLA-DR4 (α1*01:01;β1*04:01), HLA-DR7 (α1*01:01;β1*07:01), HLA-DR11 (α1*01:01;β1*11:01), HLA-DR13 (α1*01:01;β1*13:01), HLA-DR15 (α1*01:01;β1*15:01), HLA-DR51 (α1*01:01;β5*01:01) 및 HLA-DP4 (α1*01:03;β1*04:01). 이들 대립유전자는 상이한 인종을 넘어 높은 유병률을 갖는다 (Wilson et al (2001) J Virol. 75(9):4195-4207를 참조한다).
본 발명의 조성물에 존재하는 펩티드는 일반적으로 9개의 주요 HLA 클라스 II 대립유전자 중 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 예를 들면 실시예 10에 기술된 7개의 HLA 클라스 II 대립유전자 중 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상에 결합한다. 조성물에 존재하는 하나 이상의 펩티드는 9개의 주요 HLA 클라스 II 대립유전자 중 4개 이상, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 전부에 또는 실시예 10에 기술된 7개의 HLA 클라스 II 대립유전자 중 4개 이상, 5개, 6개 또는 전부에 결합할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 조성물은 전술된 주요 HLA 클라스 II 대립유전자 중 7개 이상, 8개 이상 또는 9개 전부에, 예를 들면 실시예 10에 기술된 7개의 HLA 클라스 II 대립유전자의 전부에 결합할 수 있는 펩티드를 포함한다.
각 펩티드에 포함된 HLA 클라스 I 결합 레지스터(register)의 수가 빈번하게 발생하는 다양한 HLA 클라스 I 분자에 결합하는 펩티드의 능력을 결정함으로써 결정될 수 있다. HLA 클라스 I 결합이 ProImmune REVEAL® MHC-펩티드 결합 분석 (ProImmune Ltd, Oxford, UK)을 이용하여 측정될 수 있다. REVEALTM MHC 펩티드-결합 분석이 주요 HLA 클라스 I 수퍼타입을 대표하는 HLA-A*0101, HLA-A*0201, HLA-A*0301, HLA-A*2402, HLA-B*0702, HLA-B*0801, HLA-B*3501에 대해 3부(ternary) MHC-펩티드 복합체를 안정화시키는 각 펩티드의 능력을 측정한다. 각 시험 펩티드가 합격/불합격 대조군 펩티드 대비 점수로 주어지고 또한 양성 대조군 펩티드와 비교된다.
HLA 클라스 I 분자가 8개 내지 11개 아미노산의 길이를 갖는 짧은 펩티드에 결합한다. 이론상, 102개의 짧은 펩티드 (27 x 8-mers, 26 x 9-mers, 25 x 10-mers & 24 x 11-mers)가 35-mer 펩티드 서열로부터 유래될 수 있을 것이다. 시험되는 펩티드의 수를 제한하기 위하여, 공용 알고리즘에 기반한 우수한 예측 점수를 갖는 9량체 펩티드 (HLA 클라스 I 결합 펩티드에 있어서 가장 빈번한 길이)를 이용하여 결합 분석이 수행될 수 있다.
하기 HLA 클라스 I 대립유전자가 사람 집단에서 높게 나타나고 (2) 그들은 잘-정의된 HLA 수퍼타입 (http://bioinformatics.nmdp.org/): HLA-A*0101, HLA-A*0201, HLA-A*0301, HLA-A*2402, HLA-B*0702, HLA-B*0801, HLA-B*3501 및 HLA-A*1101에 속한다.
본 발명의 조성물에 존재하는 펩티드는 일반적으로 이들 HLA 클라스 I 대립유전자 중 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상 또는 3개 이상, 예를 들면 상기 열거된 첫 7개 클라스 I 대립유전자에 및 바람직하게는 실시예 9에 언급된 7개의 HLA 클라스 I 대립유전자에 결합하는 보다 짧은 펩티드를 포함한다. 조성물에 존재하는 하나 이상의 펩티드가 7개의 HLA 클라스 I 대립유전자 중 4개 이상, 5개, 6개 또는 전부에 결합하는 보다 짧은 펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 전술된 HLA 클라스 I 대립유전자 중 5개 이상, 6개 이상 또는 7개 전부에 결합할 수 있는 보다 짧은 펩티드를 포함하는 펩티드를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 일반적으로 광범위한 집단 커버리지를 제공하는 상이한 MHC 대립유전자에 결합하는 하나 이상의 T-세포 에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함한다. 조성물은 특정한 인종 그룹에서 또는 다수의 인종 그룹에 걸쳐 매우 빈번한 MHC 대립유전자와 관련된 하나 이상의 MHC 결합 모티프를 포함하는 것으로 알려져 있거나 예측된 펩티드를 포함할 수 있다. 조성물은 1개를 초과하는 대립유전자 변이체(allelic variant)에 결합하는 하나 이상의 무차별 CD4+ 및 CD8+ T-세포 에피토프를 포함할 수 있다. 조성물에서 펩티드 서열의 조합이 상이한 HLA 서브타입에 결합하는 T-세포 에피토프를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명의 조성물이 상이한 HLA 서브타입을 갖는 2 이상의 개체로부터의 말초혈단핵세포 (PBMC)에서 인 비트로 반응을 유발한다. 조성물은 상이한 인종의 개체일 수 있는, 각각 상이한 HLA 유전형을 갖는 3, 4, 5, 6 또는 7 이상의 개체에서 면역반응을 유발할 수 있다.
플루오로카본
플루오로카본은 퍼플루오로카본 또는 혼합된 플루오로카본/히드로카본 라디칼로부터 유래된 하나 이상의 사슬을 포함할 수 있고, 포화 또는 불포화되고, 각 사슬이 3 내지 30개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 따라서, 플루오로카본 부착물(attachment)의 사슬이 일반적으로 포화 또는 불포화되고, 바람직하게는 포화된다. 플루오로카본 부착물의 사슬이 선형 또는 분지형일 수 있으나, 바람직하게는 선형이다. 각 사슬이 일반적으로 3 내지 30개의 탄소 원자, 5 내지 25개의 탄소 원자, 또는 8 내지 20개의 탄소 원자를 갖는다. 펩티드에 플루오로카본 벡터를 공유적으로 연결시키기 위하여, 반응기, 또는 리간드, 예를 들면 -CO-, -NH-, S, O 또는 기타 적합한 기(group)가 벡터에 포함된다. 공유 결합을 달성하기 위한 그와 같은 리간드의 사용이 기술분야에 잘 알려져 있다. 반응기가 플루오로카본 벡터의 임의의 위치에 위치할 수 있다.
플루오로카본 벡터의 펩티드에의 결합이 펩티드의 임의의 부위에 자연적으로 존재하거나 그에 도입되는 -OH, -SH, -COOH 및 -NH2와 같은 작용기를 통해 달성될 수 있다. 그와 같은 연결의 예는 아미드, 히드라존, 디술피드, 티오에테르 및 옥심(oxime) 결합을 포함한다.
선택적으로, 스페이스 요소 (펩티드성 또는 비-펩티드성)가 포함되어 항원-제시 세포 내에서의 가공을 위해 플루오로카본 요소로부터 펩티드의 절단을 허용하고 펩티드의 입체 프레젠테이션(steric presentation)을 최적화할 수 있다. 또한, 스페이서가 포함되어 분자의 합성을 보조하고 그의 안정성 및/또는 가용성을 개선시킬 수 있다. 스페이서의 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 단백질 가수분해 효소에 의해 절단될 수 있는 라이신 또는 아르기닌과 같은 아미노산을 포함한다.
일 구체예에서, 플루오로카본-연결 펩티드가 화학적 구조 CmFn-CyHx-(Sp)-R 또는 그의 유도체를 갖고, 식 중에서 m = 3 내지 30, n < 2m + 1, y = 0 내지 15, x < 2y, (m + y) = 3 내지 30이고 Sp가 선택적인 화학적 스페이스 모이어티이며 R이 면역원성 펩티드일 수 있다. 일반적으로, m 및 n이 관계식 2m-1 < n < 2m + 1를 만족하고, 바람직하게는 n = 2m + 1을 만족한다. 일반적으로, x 및 y가 관계식 2y-2 < x < 2y를 만족하고, 바람직하게는 x = 2y를 만족한다. 바람직하게는 CmFn-CyHx 모이어티가 선형이다.
m이 5 내지 15, 보다 바람직하게는 8 내지 12인 것이 바람직하다. 또한, y가 0 내지 8, 보다 바람직하게는 0 내지 6 또는 0 내지 4인 것이 바람직하다. CmFn-CyHx 모이어티가 포화되고 (즉, n = 2m + 1 및 x = 2y) 선형인 것, 및 m = 8 내지 12이고 y = 0 내지 6 또는 0 내지 4인 것이 바람직하다.
특정한 예에서, 플루오로카본 벡터가 하기 식 중 2H, 2H, 3H, 3H-퍼플루오로언데카노익산(perfluoroundecanoic acid)으로부터 유래된다:
Figure pct00001
따라서, 바람직한 플루오로카본 부착물이 C8F17(CH2)2COOH로부터 유래된 선형의 포화 모이어티 C8F17(CH2)2- 이다.
플루오로카본 부착물의 추가의 예가 하기 식을 갖는다:
각각 C6F13(CH2)2COOH, C7F15(CH2)2COOH, C9F19(CH2)2COOH, C10F21(CH2)2COOH, C5F11(CH2)3COOH, C6F13(CH2)3COOH, C7F15(CH2)3COOH, C8F17(CH2)3COOH 및 C9F19(CH2)3COOH로부터 유래된 C6F13(CH2)2-, C7F15(CH2)2-, C9F19(CH2)2-, C10F21(CH2)2-, C5F11(CH2)3-, C6F13(CH2)3-, C7F15(CH2)3-, C8F17(CH2)3- 및 C9F19(CH2)3-.
플루오로카본 벡터-항원 구조체에 적합한 구조의 바람직한 예가 하기 식을 갖고:
Figure pct00002
식 중에서 Sp 및 R은 상기 정의된 바와 같다. 특정한 구체예에서, Sp는 라이신 잔기로부터 유래되고 화학식 -CONH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-을 갖는다. 바람직하게는 R이 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나, 바람직하게는 R이 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나이다. 각 펩티드의 N-말단 아미노산의 아미노기, 예를 들면, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이, 화학식 -CONH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-의 스페이서 중 C-말단 카르복시기를 갖는 아미드 결합을 형성한다.
본 발명의 문맥상, 플루오로카본 부착물이 변형되어, 결과로 얻은 화합물이 여전히 항원 제시 세포에 펩티드를 운반할 수 있다. 따라서, 예를 들면 여러 불소 원자가 염소, 브롬 또는 요오드와 같은 기타 할로겐 원자로 치환될 수 있다. 또한, 여러 불소 원자를 메틸기로 치환하고 여전히 본 명세서에 기술된 분자의 특성을 보유하는 것이 가능하다.
펩티드가 스페이서 모이어티를 통해 플루오로카본 벡터에 연결될 수 있다. 스페이서 모이어티가 바람직하게는 라이신 잔기이다. 이 스페이서 잔기가 전술된 바와 같은 말단 라이신 잔기 외에 존재하여, 펩티드가, 예를 들면, 총 4개의 N-말단 라이신 잔기를 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 제제는 펩티드가 C-말단 또는 N-말단 라이신 잔기, 바람직하게는 N-말단 라이신 잔기를 갖는 플루오로카본-연결 펩티드를 포함할 수 있다. 펩티드의 말단 라이신이 바람직하게는 화학식 C8F17 (CH2)2COOH를 갖는 플루오로카본에 연결된다. 플루오로카본이 바람직하게는 N-말단 라이신 잔기의 엡실론 사슬에 결합된다.
본 명세서에 기술된 약제학적 조성물이, 선택적으로 고유의 플루오로카본 벡터에 각각 공유적으로 연결된 1 이상, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 또는 그보다 많은 면역원성 펩티드를 포함한다는 것이 고려된다.
펩티드
본 발명은 또한 본 발명의 조성물에 유용한 펩티드를 제공한다. 펩티드는 전술된 펩티드 중 어느 하나일 수 있다. 특히, 본 발명은 서열번호 24 내지 33 및 221에 나타낸 서열 중 하나 또는 서열번호 24 내지 33 및 221에 나타낸 서열 중 하나와 80% 이상 동일한, 예를 들면 85%, 90%, 95% 또는 98% 이상 동일한 서열을 포함하는, 40개, 50개 또는 60개 이하의 아미노산 길이인 펩티드를 제공한다. 펩티드는 전술된 바와 같은 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 특정한 일 구체예에서, 본 발명은 서열번호 34 내지 38 및 222 중 하나에 나타낸 서열을 갖는 펩티드를 제공한다. 특히 바람직한 본 발명의 펩티드는 서열번호 24, 25, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37 및 38에 나타낸 서열을 포함하는, 필수적으로 이루어지는, 또는 이루어진다.
본 발명은 또한 HBV 폴리머라제의 말단 도메인으로부터의 매우 보존된 면역원성 펩티드를 제공한다. 이들 펩티드는 본 발명의 조성물에 관하여 전술된 임의의 HBV 폴리머라제 펩티드일 수 있다. 그와 같은 펩티드는 일반적으로 15개 내지 60개의 아미노산 길이이고 서열번호 1 또는 2의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하고 HBV에 의해 만성적으로 감염된 하나 이상의 개체로부터의 PBMC에서 인 비트로 면역 반응을 유발한다.
펩티드는 전술된 바와 같은 담체에 결합될 수 있다. 바람직한 일 양태에서, 본 발명의 펩티드는 플루오로카본 벡터에 공유적으로 연결된다. 플루오로카본 벡터는 전술된 바와 같을 수 있다.
기타 성분
본 발명의 조성물은 추가의 면역원을 포함할 수 있다. 면역원은 B-세포 항원일 수 있다. B-세포 항원은 HBV에 대한 항체 반응을 자극하는 데 기여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은, 예를 들면, T-세포 반응, 및 B-세포 항원을 자극할 수 있는 하나 이상의 플루오로카본-연결 펩티드를 포함할 수 있다.
B-세포 항원으로 작용하는 적합한 면역원은 B형 간염 표면 항원 (HBsAg) 또는 B형 간염 코어 항원 (HBcAg 또는 HBeAg)과 같은 단백질 항원을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 2 이상의 펩티드, 예를 들면 플루오로카본-연결 펩티드를 포함하고, 보조제(adjuvant) 및/또는 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더 포함하는 조성물을 제공한다. 부형제는 효율적인 동결건조를 위해 필요한 안정화제 또는 벌크화제(bulking agent)일 수 있다. 예는 소르비톨, 만니톨, 폴리비닐피롤리돈 및 그의 혼합물, 바람직하게는 만니톨을 포함한다. 존재할 수 있는 기타의 부형제는 기술분야에 잘 알려져 있는 항산화제와 같은 보존제, 윤활제, 동결보존제 및 결합제를 포함한다.
보조제는 공동-투여된 항원에 대한 면역 반응을 조절할 수 있고 스스로(on its own) 주어질 경우 있다고 하더라도 직접적인 효과를 거의 갖지 않는 제제이다. 그와 같은 보조제는 크기 및/또는 시토카인 프로파일의 측면에서 면역 반응을 증강시킬 수 있다. 보조제의 예는: 박테리아의 천연 성분의 천연 또는 합성 유래 개선물(refinement), 예를 들면 프로인트 보조제 및 그의 유도체, 무라밀디펩티드 (muramyldipeptide: MDP) 유도체, CpG, 모노포스포릴 리피드 A; 기타 알려진 보조제 또는 상승작용제(potentiating agent), 예를 들면 사포닌, 알루미늄 염 및 시토카인; 수중유형 보조제, 유중수형 보조제, 면역자극성 복합체(immunostimulating complex: ISCOMs), 리포솜, 제제화된 나노 및 마이크로-입자; 박테리아 독소 및 톡소이드(toxoid); 이눌린, 특히 감마 이눌린; 및 TLR 효능제(agonist)를 포함한다.
바람직하게는, 보조제는 펩티도글리칸 (예를 들면, TDM, MDP, 무라밀 디펩티드, 무라부티드(Murabutide)); 알룸(alum) 용액 (예를 들면, 알루미늄 히드록시드, ADJUMERTM (폴리포스파젠) 또는 알루미늄 포스페이트 겔); 글루칸; 알가물린(algammulin); 계면활성제 (예를 들면, 스쿠알란, Tween 80, 플루로닉(Pluronic) 또는 스쿠알렌); 칼슘 포스페이트 겔; 박테리아 독소 또는 톡소이드 (예를 들면, 콜레라 홀로톡신, 콜레라-톡신-A1-단백질-A-D-단편 융합 단백질, 콜레라 독소의 서브-유닛 B, 또는 블록 공중합체); 시토카인-함유 리포좀; 유중수형 보조제 (예를 들면, 프로인트 완전 보조제, 프로인트 불완전 보조제 또는 몬타니드(Montanide) 예를 들면, ISA 51 또는 ISA 720); 수중유형 보조제 (예를 들면, MF-59); 이눌린-기반 보조제; 시토카인 (예를 들면, 인터페론-감마; 인터루킨-1베타; 인터루킨-2; 인터루킨-7 또는 인터루킨-12); ISCOMs (예를 들면, 이스코매트릭스(iscomatrix)); 조성물의 마이크로스피어 및 마이크로입자; 및 톨-유사(Toll-like) 수용체 효능제 (예를 들면, CpG, 사람 TLR 1-10의 리간드, 쥐 TLR 1-13의 리간드, ISS-1018, IC31, 이미다조퀴놀린, Poly(I:C), 모노포스포릴 리피드 A, Ribi529, 콜레라 독소, 이열성(heat-labile) 독소, Pam3Cys 또는 플라겔린)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
약제학적 조성물의 제조
본 발명의 약제학적 조성물은, 약제학적 산물을 제제화하는 제1 단계로서 하나 이상의 펩티드, 예를 들면 플루오로카본-연결 펩티드를, 아세트산 또는 기타 용매 중에 가용화함으로써 제조될 수 있다. 블렌드 중 하나 이상의 플루오로카본-연결 펩티드를 분산시키는데 이용될 수 있는 기타 용매의 예는 인산완충용액 (PBS), 프로판-2-올, 터트-부탄올, 아세톤 및 기타 유기 용매를 포함한다. 플루오로카본 벡터-펩티드 컨쥬게이트를 가용화하는 접근법이 WO2012/090002에 기술되어 있다.
출발 물질로 이용되는 펩티드 또는 플루오로카본-연결 펩티드가 일반적으로 건조된다(desiccated). 20개의 아미노산보다 더 짧은 펩티드를 포함하고 및/또는 50% 미만의 소수성 잔기를 갖는 펩티드 및 플루오로카본-연결 펩티드가 아세트산 이외의 용매에 가용화될 수 있다. 펩티드가 20개를 초과하는 아미노산을 갖고 및/또는 50%를 초과하는 소수성 잔기를 가질 경우, 아세트산이 일반적으로 이용된다.
용액 중 플루오로카본-연결 펩티드의 농도는 일반적으로 약 0.1 mM 내지 약 10 mM, 예를 들면 약 0.5 mM, 1 mM, 2 mM, 2.5 mM 또는 5 mM이다. 적합한 농도의 예는 약 10 mg/mL이다.
투입 성분은 분산된 응집체와 함께 원하는 비율로 균질하게 블렌딩되어, 멸균되게 하고 투여를 위한 적합한 포맷으로 존재할 수 있다. 그와 같은 예는 가용화를 촉진하기 위하여 블렌딩 후 또는 희석 후 단계에서 볼텍싱 및/또는 음파처리(sonication)의 도입을 포함할 수 있을 것이다. 제조 공정 흐름의 기타 치환(permutation)은 공정의 조기 단계에 수행되는 멸균 여과 또는 액상의 최종 결과물(presentation)을 허용하는 동결건조의 생략을 포함할 수 있을 것이다.
상이한 펩티드 또는 플루오로카본-연결 펩티드가 각각, 예를 들면 상이한 용매 중에 또는 상이한 아세트산 농도에서 가용화될 경우, 가용화된 펩티드 또는 플루오로카본-연결 펩티드가 블렌딩되어 펩티드 또는 플루오로카본-연결 펩티드의 혼합물을 생성한다.
또한, 추가의 보조제 및/또는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제가 가용화된 펩티드/플루오로카본-연결 펩티드 또는 펩티드/플루오로카본-연결 펩티드의 혼합물에 첨가될 수 있다. 일반적으로, 가용화된 플루오로카본-연결 펩티드가 부형제 및/또는 보조제와 혼합된다.
가용화 및 블렌딩 후 플루오로카본-연결 펩티드(들)의 용액이 희석될 수 있다. 예를 들면, 블렌드가 물에 희석될 수 있다.
펩티드 또는 플루오로카본-연결 펩티드를 함유하는 용액이 바람직하게는 멸균된다. 제제가 전신 사용을 위해 의도될 경우 멸균이 특히 바람직하다. UV 멸균 또는 여과 멸균과 같은 적합한 멸균 수단이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 여과 멸균이 사용된다. 멸균 여과는 0.45 ㎛ 필터 후 0.22 ㎛ 멸균용 등급 필터 트레인(filter train)을 포함할 수 있다.
멸균은 부형제 및/또는 보조제의 첨가 전 또는 후에 수행될 수 있다.
본 발명의 조성물은 건조된, 예를 들면, 동결건조된 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 조성물은 수성 용액, 예를 들면 동결건조물 또는 기타 건조된 제제를 수성 매질 중에 용해시킴으로써 형성된 수성 용액일 수 있다. 수성 용액은 일반적으로 중성의 pH일 수 있다.
제제를 건조시키는 것은 장기 저장을 촉진시킨다. 적합한 건조 방법이 사용될 수 있다. 동결건조가 바람직하나 기타 적합한 건조 방법, 예를 들면 진공 건조, 분사-건조, 분사 동결-건조 또는 유동층 건조가 사용될 수 있다. 건조 과정이 펩티드 또는 플루오로카본-연결 펩티드가 포함된 무정형 케익(amorphous cake)의 형성을 제공할 수 있다.
장기 저장을 위하여, 멸균 조성물이 동결건조될 수 있다. 동결건조는 동결-건조(freeze-drying)에 의해 달성될 수 있다. 동결-건조는 일반적으로 동결 후 건조를 포함한다. 예를 들면, 플루오로카본-연결 펩티드 혼합물이 2시간 동안 -80℃에서 동결되고 24시간 동안 동결 건조 기기에서 동결-건조될 수 있다.
본 발명의 약제학적으로 허용가능한 조성물은 고체 조성물일 수 있다. 플루오로카본-연결 펩티드 조성물은 건조 분말 형태로 수득될 수 있다. 동결건조의 결과로 얻어진 케익이 분말 형태로 분쇄될 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 고체 조성물이 자유 유동성(free-flowing) 입자의 형태를 가질 수 있다. 일반적으로 고체 조성물이 밀봉된 바이알, 앰플 또는 시린지 내 분말로 제공된다. 흡입용일 경우, 분말이 건조 분말 흡입기 중에 제공될 수 있다. 고체 매트릭스가 대안적으로 패치로 제공될 수 있다. 분말이 정제 형태로 압착될 수 있다.
건조된, 예를 들면, 동결건조된, 펩티드 또는 플루오로카본-연결 펩티드 조성물이 투여 전 재구성될 수 있다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "재구성(reconstitution)"은 사용 전 건조된 백신 산물의 용해를 의미하는 것으로 이해된다. 동결건조와 같은 건조 후, 면역원성 펩티드, 예를 들면, 플루오로카본-연결 펩티드 산물이, 바람직하게는 등장성, pH 중성인, 균질한 현탁액으로 재구성된다. 제제가 일반적으로 예를 들면 주사를 위한 물, 히스티딘 완충용액 (예를 들면 28mM L-히스티딘 완충액), 소듐 비카르보네이트, Tris-HCl 또는 인산염완충액 (PBS)의 첨가에 의해 수성상 중에 재구성된다. 재구성된 제제가 일반적으로 멸균 용기, 예를 들면, 바이알, 시린지 또는 저장 또는 투여를 위한 기타 적합한 포맷으로 조제된다.
조성물은 사용 전, 멸균 바이알 또는 시린지와 같은 용기에 저장될 수 있다.
의약 용도
본 발명은 요법에 의해 사람 또는 동물의 신체의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명의 조성물은 HBV 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 이용하기 위해 제공된다. 본 발명의 조성물은 또한 HBV 예방에 유용할 수 있는 면역 반응을 유발한다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 HBV에 의해 감염된 개체를 치료하는 치료용 백신으로 이용하기 위한 것이다. 본 발명의 조성물은 지속적인 만성 HBV 감염을 갖는 환자의 치료에 특히 유용하나, 면역 관용 환자 또는 비활성 만성 보유자를 치료하는데도 사용될 수 있다.
본 발명은 만성 HBV (CHB)의 치료를 위한 파괴적(disruptive) 기법으로서 치료용 백신을 제공한다. 본 발명의 조성물은 항바이러스성 T-세포 반응을 향상시켜 HBV 감염의 자발성 면역 대조군을 야기한다. 이는, 항바이러스성 NUC 요법의 중지를 가능하게 하고 또한 HBV 감염의 혈청학적 치료를 잠재적으로 야기할 수 있을 것이다. HBsAg 감소가 장기간의 개선된 임상 결과의 예측자로 사용된다. HBsAg 수준이 HBV-감염된 간세포의 수와 연결될 수 있고 여러 시토카인에 의해 조절되는 간 내(intrahepatic) cccDNA의 전사 활성에 의해 결정된다. 본 발명의 조성물을 이용한 치료가 HBsAg 소실 또는 HBsAg 혈청전환을 야기할 수 있다.
펩티드 및 본 발명의 조성물은 특히 NUC-치료된 CHB 환자를 치료하는데 유용하다. 또한, 펩티드는 장기 NUC 치료를 제공할 수 없는 개발도상국의 HBeAg-양성 환자를 위한 알맞은(affordable) 치료를 나타낸다. 특히 본 발명의 펩티드 조성물에 의한 NUC-치료된, HBV-DNA 억제된, HBeAg-음성 환자의 백신 접종은 HBsAg 제거(clearance)를 촉진 및 가속화시킨다. 또한, HBeAg-양성 환자가 치료될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물이 HBV의 비활성 담체를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
B형 간염 바이러스 (HBV) 감염은 간-관련 이병률 및 사망률의 주요 원인이다. 본 발명의 조성물은 간부전, 말기 간 질환 및 간세포 암종의 치료에서 사용하기 위해 제공된다.
본 발명의 조성물은, 바이러스성 간염의 가장 중증의 형태이고, 그를 위한 승인된 치료법이 이용가능하지 않으며 HBsAg-양성 개체에서 공동-감염으로서만 발생하는 델타 간염 (hepatitis delta: HDV)을 갖는 환자의 백신 접종에 유용하다.
또한, 본 발명은 HBV 감염, 특히 CHB를 치료 또는 예방하기 위한, 간부전, 말기 간 질환 또는 간세포 암종을 치료 또는 예방하기 위한, 또는 HDV를 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
유사하게, 본 발명은 본 발명의 조성물의 예방적 또는 치료적 양을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상에서 HBV 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 조성물은 제2 치료제 또는 예방제와 조합으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 제2 작용제는 플루오로카본-연결 펩티드가 세포 면역 반응을 자극할 경우 HBV에 대한 면역 반응을 더 자극하기 위하여, 예를 들면, 체액성 면역 반응을 자극하기 위하여 추가의 면역원 (예를 들면 구상 항원 또는 재조합 또는 자연 발생 항원)을 포함할 수 있다. 제2 작용제가 B-세포 항원이라는 것이 이해된다. 적합한 B-세포 항원은 HBsAg, HBcAg 및 HBeAg를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 제2 작용제는 현존하는 HBV 치료적 처치에 사용하는 것으로 알려진 작용제이다. 현존하는 HBV 치료제는 인터페론, 예를 들면 인터페론-알파, 또는 NUC, 예를 들면 엔테카비르 및 테로포비르일 수 있다. HBV 치료적 처치는 억제성(suppressive) 세포 타입을 블로킹하는(blocking) 치료일 수 있다. 그와 같은 블로킹 치료에 유용한 작용제는 항-PD1 블로킹 항체, 항-PD1L 블로킹 항체, 항-LAG3 블로킹 항체, 항-TIM3 블로킹 항체, 항-CTLA4 블로킹 항체 및 시클로포스파미드를 포함한다.
제2 치료제 또는 예방제가 본 발명의 조성물과 함께 이용될 경우, 투여가 동시성인 또는 시간별로 분리된 것일 수 있다. 본 발명의 조성물은 제2 치료제 이전, 그와 함께 또는 그 이후 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 여러 알려진 경로 및 기법을 이용하여 인 비보에서 사람 또는 동물 대상에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 조성물은 주사가능한 용액, 현탁액 또는 에멀전으로 제공될 수 있고, 통상의 바늘 및 시린지를 이용한, 또는 액상 제트 주입 시스템(liquid jet injection)을 이용하여 비경구, 피하, 경구, 상피, 피내, 근육 내, 동맥 내(interarterial), 복강 내, 정맥 내 주사를 통해 투여될 수 있다. 조성물은 피부 또는 점막 조직에 국소적으로, 예를 들면 코로(nasally), 기도내로(intratrachealy), 장으로, 설하로, 직장으로 또는 질내로 투여될 수 있거나, 호흡 또는 폐 투여를 위해 적합한 미세 분할 스프레이(finely divided spray)로 제공될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 조성물은 근육 내로 투여된다.
조성물은 투여 조성물과 양립가능하고 예방적으로 및/또는 치료적으로 효과적일 양으로 대상에게 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여는 "예방적(prophylactic)" 또는 "치료적(therapeutic)" 목적을 위한 것일 수 있다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "치료적(therapeutic)" 또는 "치료(treatment)"는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 감염 또는 재감염의 방지; 증상의 감소 또는 제거; 및 병원균의 감소 또는 완전한 제거. 치료는 예방적으로 (감염 전) 또는 치료적으로 (감염 후) 결과를 가져올 수 있다.
요구될 경우, 담체의 선택은 종종 조성물의 전달 경로의 함수이다. 본 발명 내에서, 조성물은 적합한 투여 경로 및 수단을 위해 제제화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 경구, 안구의, 직장의, 코의, 국소의 (구강 및 설하를 포함), 질의 또는 비경구 (피하, 근육 내, 정맥 내, 피내, 경피를 포함) 투여를 위해 적합한 조성물에 사용되는 것을 포함한다.
조성물은 적합한 형태, 예를 들면 액체, 고체 또는 에어로졸로 투여될 수 있다. 예를 들면, 경구 제제는, 장용으로 코팅되어 활성 성분을 위에서의 분해로부터 보호할 수 있는 에멀전, 시럽 또는 용액 또는 정제 또는 캡슐의 형태를 가질 수 있다. 코 제제(nasal formulation)는 스프레이 또는 용액일 수 있다. 경피 제제는 특정한 전달 시스템에 맞추어질 수 있고 패치를 포함할 수 있다. 주사를 위한 제제는 증류수 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 용매 또는 현탁제 중의 용액 또는 현탁액일 수 있다.
환자에게 투여되는 예방적 또는 치료적 백신의 적절한 투여량은 임상적으로 결정될 것이다. 그러나, 지침으로서, 바람직한 투여 경로에 의존적일 수 있는 적합한 사람의 투여량이 1 내지 1000 ㎍, 예를 들면 약 100 ㎍, 200 ㎍ 또는 500 ㎍일 수 있다. 요구될 경우, 일반적으로 2 내지 12주 간격으로 투여될 면역학적 또는 임상적 효과를 달성하기 위하여 다수의 투여량이 요구될 수 있다. 보다 긴 기간에 걸친 면역 반응의 증강이 요구될 경우, 1개월 내지 5년 간격의 반복된 투여가 적용될 수 있다.
하기 예시가 본 발명을 설명한다.
도 1은 면역 대조군 상에 있는 또는 활성 치료를 겪는 만성 HBV-감염된 대상에서 IFNγ 반응의 비교이다. HBV-유래 중복된 짧은 펩티드 풀 라이브러리 (0.1㎍/펩티드/mL)와의 10일 배양 후, HBV 프로테옴의 특정한 부위를 나타내는 중복된 펩티드의 풀 1 내지 23 중 하나에 의해 18시간의 IFNγ ELISpot 분석에서 PBMC를 재자극하였다 (5㎍/펩티드/mL).
도 2는 감염성 HBV 유전형에 의해 그룹화된 HBV-감염된 대상에서 HBV-유래 짧은 펩티드 풀에 대한 IFNγ 반응의 특이성을 나타낸다. HBV-유래 중복된 짧은 펩티드 풀 라이브러리 (0.1㎍/펩티드/mL)와의 10일 배양 후, HBV 프로테옴의 특정한 부위를 나타내는 중복된 펩티드의 풀 1 내지 23 중 하나에 의해 18시간의 IFNγ ELISpot 분석에서 PBMC를 재자극하였다 (5㎍/펩티드/mL).
도 3은 인종적 배경에 의해 그룹화된 만성 HBV-감염된 대상에서 HBV-유래 짧은 펩티드 풀에 대한 IFNγ 반응을 나타낸다. HBV-유래 중복된 짧은 펩티드 풀 라이브러리 (0.1㎍/펩티드/mL)와의 10일 배양 후, HBV 프로테옴의 특정한 부위를 나타내는 중복된 펩티드의 풀 1 내지 23 중 하나에 의해 18시간의 IFNγ ELISpot 분석에서 PBMC를 재자극하였다 (5㎍/펩티드/mL).
도 4는 HBV 폴리머라제- 및 코어-유래 짧은 펩티드 풀에 의한 자극 후 만성 HBV 및 건강한 대조군 대상으로부터의 PBMC에서의 CD4 및 CD8 T-세포 IFNγ 생산의 대표적인 도트 플롯을 나타낸다. 대상으로부터의 PBMC를 짧은 펩티드 풀 라이브러리 (0.1㎍/펩티드/mL)에 의해 10일 동안 자극한 후, 각각 HBV 폴리머라제 및 코어의 부위를 나타내는 HBV 유래 짧은 펩티드 풀 2 또는 14에 의해 밤새 자극하였다 (5㎍/펩티드/mL). 결과를 IFNγ-생산 세포로서, 부모 CD3/CD4 또는 CD3/CD8 T-세포 집단의 비율로 표현한다. 배양 배지 또는 PMA/이오노마이신에서의 자극을 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용하고 게이팅(gating) 전략은 음성 대조군 IFNγ 생산을 기반으로 하였다.
도 5는 면역 대조군 상에 있는 또는 활성 치료를 겪는 건강한 대상 및 만성 HBV-감염성 HBeAg-음성 대상으로부터의 PBMC에서 35-40mer 펩티드를 나타내는 HBV-유래 짧은 펩티드 풀에 대한 IFNγ 반응의 비교이다. HBV-유래 중복된 짧은 펩티드 풀 라이브러리 (0.1㎍/펩티드/mL)와의 10일 배양 후, 각각 HBV 프로테옴의 35-40mer 부위를 나타내는 중복된 펩티드의 풀 24 내지 46 중 하나에 의해 18시간의 IFNγ ELISpot 분석에서 PBMC를 재자극하였다 (5㎍/펩티드/mL).
도 6은 감염성 HBV 유전형에 의해 그룹화된 HBV-감염된 대상에서 35-40mer 펩티드를 나타내는 HBV-유래 짧은 펩티드 풀에 대한 IFNγ 반응의 특이성을 나타낸다. HBV-유래 중복된 짧은 펩티드 풀 라이브러리 (0.1㎍/펩티드/mL)와의 10일 배양 후, 각각 HBV 프로테옴의 특정한 부위를 나타내는 중복된 펩티드의 풀 24 내지 46 중 하나에 의해 18시간의 IFNγ ELISpot 분석에서 PBMC를 재자극하였다.
도 7은 인종적 배경에 의해 그룹화된 만성 HBeAg-음성 HBV-감염된 대상에서 35-40mer 펩티드를 나타내는 HBV-유래 짧은 펩티드 풀에 대한 IFNγ 반응을 나타낸다. HBV-유래 중복된 짧은 펩티드 풀 라이브러리 (0.1㎍/펩티드/mL)와의 10일 배양 후, 각각 HBV 프로테옴의 35-40mer 부위를 나타내는 중복된 펩티드의 풀 24 내지 46 중 하나에 의해 18시간의 IFNγ ELISpot 분석에서 PBMC를 재자극하였다 (5㎍/펩티드/mL).
도 8은 35-40mer 펩티드를 나타내는 개별적인 짧은 펩티드 풀에 대한 HBV-감염된 대상으로부터의 PBMC에 의한 시토카인 반응의 요약이다. HBV-유래 짧은 펩티드 풀 라이브러리와의 10일 단기 배양 후, 만성 eAg-음성 HBV-감염된 대상 (n=7-14)으로부터의 PMBC를 HBV 펩티드 풀 25, 38, 26, 39, 42, 43, 28 및 31 (펩티드 P113, P753, P151, P797, P856, P877, P277 및 P376을 나타냄) 중 하나와 밤새 5㎍/펩티드/mL의 최종 농도로 배양하였다. CD3, CD4 및 CD8의 세포 외 발현, 뒤이어 IFNγ, IL-2 및 TNFα의 세포 내 발현에 대하여 세포를 염색하였다. 세포를 유세포 분석에 의해 평가하였다. 각 대상에 있어서 시토카인 발현을 배지 음성 대조군으로 표준화하였다. 데이터가 평가된 각 시토카인에 대하여 평균 발현을 나타낸다. 반응의 폭(breadth)이 각 적층된 막대 상에서 나타난다.
도 9는 만성 HBV-감염된 (HBeAg-음성 비활성 보유자 또는 HBeAg-음성 치료 대상)으로부터의 PBMC에서 측정된 IFNγ 스팟 형성 세포의 수 (평균값)를 나타낸다. 9개의 미결합 HBV 펩티드 (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K), NP877 및 NP1266(K)) (0.1㎍/펩티드/mL)와의 10일 배양 후, PBMC를 5㎍/ml의 농도로 개별 펩티드에 의한 18시간 IFNγ ELISpot 분석에서 재자극하였다.
도 10은 만성 HBV-감염된 (HBeAg-음성 비활성 보유자 또는 HBeAg-음성 치료 대상)으로부터의 PBMC에서 측정된 HBV 펩티드에 대한 반응에서 IFNγ ELISpot 분석에 대한 응답 빈도(frequency of responder)를 나타낸다. 9개의 미결합 HBV 펩티드 (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K), NP877 및 NP1266(K)) (0.1㎍/펩티드/mL)와의 10일 배양 후, PBMC를 5㎍/ml의 농도로 개별 펩티드에 의한 18시간 IFNγ ELISpot 분석에서 재자극하였다.
도 11은 감염성 HBV 유전형에 의해 그룹화된 만성 HBV-감염된 대상으로부터의 PBMC에서 측정된 IFNγ 스팟 형성 세포의 수 (평균값)를 나타낸다. 9개의 미결합 HBV 펩티드 (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K), NP877 및 NP1266(K))(0.1㎍/펩티드/mL)와의 10일 배양 후, PBMC를 5㎍/ml 농도로 개별 펩티드에 의한 18시간 IFNγ ELISpot 분석에서 재자극하였다.
도 12는 인종적 배경에 의해 그룹화된 만성 HBV-감염된 대상에서 얻은 PBMC에서 측정된 IFNγ 스팟 형성 세포의 수 (평균값)를 나타낸다. 9개의 미결합 HBV 펩티드 (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K), NP877 및 NP1266(K)) (0.1㎍/펩티드/mL)와의 10일 배양 후, PBMC를 5㎍/ml 농도로 개별 펩티드에 의한 18시간 IFNγ ELISpot 분석에서 재자극하였다.
도 13은 HBV 유래 펩티드에 의한 자극 후 만성 HBV로부터의 PBMC의 시토카인-생산 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 빈도를 나타낸다. 도 13A, 13B, 13C, 13D 및 13E는 각각 HBV 유전형 A, B, C, D 및 비-A/B/C/D에 의해 감염된 개체의 그룹에 대해 얻어진 결과에 해당한다. 9개의 미결합 HBV 펩티드 (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K), NP877 및 NP1266(K)) (0.1㎍/펩티드/mL)와의 10일 배양 후, PBMC를 5㎍/ml 농도로 개별 펩티드에 의한 18시간 IFNγ ELISpot 분석에서 재자극하였다. 결과를 시토카인-생산 세포로서, 부모 CD3/CD4 또는 CD3/CD8 T-세포 집단의 비율로 표현한다. 배양 배지 또는 PMA/이오노마이신에서의 자극을 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용하고 게이팅 전략은 음성 대조군 IFNγ 생산을 기반으로 하였다.
도 14는 FP-02.1 또는 NP02.1에 의해 면역화된 BALB/c 마우스 (n=7)로부터의 비장세포에 의한 IFNγ 생산을 나타낸다. 그래프는 백신의 9개 펩티드 성분에 반응하여 측정된 106개 비장세포 당 IFNγ 스팟-형성 세포의 수를 나타낸다. 대응 표본 t-검정(paired t test)을 이용하여 통계 분석을 수행하였다. ns = 유의하지 않음.
도 15는 FP-02.1 또는 NP02.1에 의해 면역화된 BALB/c 마우스 (n=7)로부터의 비장세포에 의한 IFNγ 생산을 나타낸다. 그래프는 백신의 각 9개 펩티드 성분에 반응하여 측정된 106개 비장세포 당 IFNγ 스팟-형성 세포의 수를 나타낸다. 막대는 각 개별 펩티드에 대한 누적 평균 반응을 나타낸다.
도 16은 FP02.1이 단일 면역화 후 MHC 클라스 I 분자에 의해 제한된 CTL 에피토프에 대한 T 세포 반응을 촉진한다는 것을 나타낸다.
도 17은 FP-02.1 또는 NP02.1에 의해 면역화된 BALB/c 마우스에 의한 IFNγ 생산을 나타낸다. 각 비장세포의 집단에 있어서 9개의 펩티드 혼합물에 반응하여 IFNγ SFC의 수/106 비장세포가 생성되었다.
실시예 1: 사람 PBMC 에서 HBV -유래 짧은 펩티드 풀의 체외( ex vivo ) 면역원성의 평가
방법 및 재료
집단
HBV-감염 대상
임상적으로 만성적 HBV-감염인 것으로 정의된 99명의 대상을 런던 내의 Imperial Healthcare NHS Trust, Chelsea and Westminster Hospital NHS Foundation Trust, 및 Barts and the London NHS Trust의 REC-승인 프로토콜에 등록하였다. 모든 대상으로부터 작성된 사전동의에 따라, 신선한 정맥혈을 수집하고 PBMC 및 혈장을 분리하고 혈액 수집 18시간 이내에 동결보존하였다. 이들 대상은 하기 기준을 따랐다: 양호한 일반 건강, HBV 특이적 치료: 임상적으로 지시된 경우 항바이러스성 뉴클레오시(티)드 유사체 억제제 및/또는 인터페론 치료, 임상적 상태(만성 HBV 감염, HBeAg-음성, 및 ALT 정상적, 지속적 또는 간헐적 상승), HIV-음성, HCV-음성 및 HDV-음성.
건강 통제 대상
17명의 대상으로부터 얻은 동결보존된 PBMC를 CTL Technologies로부터 얻었다. 이들 대상은 하기 기준을 따랐다: 양호한 일반 건강, HBV에 대한 백신을 접종하지 않은, HBV 표면 항원-음성, HBV 코어 항체-음성, HIV-음성 및 HCV-음성.
PBMC 의 단기 배양
각 대상으로부터 얻은 1 바이알(vial)의 PBMC (1x107개 세포 함유)를 해동시키고 Scepter™ automated handheld 세포 계수기를 이용하여 림프구 수를 결정하였다. 24개 웰의 세포 배양 플레이트의 2mL 배양 배지 (CM: 5% human AB 혈청으로 보충된 RPMI-1640 Glutamax)에서 1x106개 세포/mL의 농도로 총 11일 동안 PBMC를 배양하였다. 15-20개의 아미노산 길이를 갖고 10 내지 13개의 아미노산이 중복되는, 최종 농도 0.1㎍/펩티드/mL인, 144개의 중복되는 HBV-유래 짧은 펩티드를 함유하는 펩티드 풀 (서열번호 73 내지 210 및 서열번호 214 내지 219)에 의해 세포를 자극하였다. 4일차에, IL-2 및 IL-15를 각각 10 IU/mL 및 10 ng/mL의 최종 농도로 배양물에 첨가하였다. 10일차에, 세포를 CM에서 2회 세척하고 추가의 1일 동안 10 IU/mL의 IL-2에 의해 배양하였다. 11일차에, 세포를 CM에서 2회 세척하고, 계수하고 사람 IFNγ ELISpot 분석 또는 세포내 시토카인 염색에 포함시켰다.
사람 IFN γ ELISpot 분석
96 웰 멀티스크린 PVDF 필터 플레이트 (Millipore)를 밤새 4℃에서 100 ㎕ (1:80)의 항-인간 IFNγ 포획 mAb에 의해 코팅하였다. 그 후 플레이트를 1% BSA 및 5% 수크로스가 보충된 PBS에 의해 2시간 동안 4℃에서 블로킹하였다. 세포를 3 반복 웰에 5x104 PBMC/웰로 플레이팅하였다. 사용된 최종 항원 농도는 하기와 같았다: 22 HBV-유래 짧은 펩티드 풀 (하기 참조; 22번 풀은 서열번호 212를 갖는 펩티드로 제조될 수 없었고 서열번호 213은 불용성으로 인해 분산될 수 없었다는 것을 주지한다) 및 HIV-3 35-mer 음성 펩티드 대조군: 5㎍/펩티드/mL; PHA 양성 대조군: 1㎍/mL. ELISpot 플레이트를 습한 환경에서 18시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 그 후 플레이트를 세척하고 100 ㎕ (1:80)의 비오틴화 항-인간 IFNγ 검출 mAb (R&D Systems)과 함께 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세척 후, 제조사의 지시사항에 따라 (R&D Systems) 플레이트를 스트렙타비딘-결합 알칼라인 포스파타제 (1:80)와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후 기질 (30분)과 인큐베이션하였다. 자동화 플레이트 계수 시스템 (CTL Europe)을 이용하여 발달된 스팟을 계수하였다.
1 내지 23번 풀에서의 펩티드의 식별
풀 풀에서의 짧은 펩티드의 서열번호
1 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79
2 80, 81, 82, 83, 84, 85
3 86, 87, 88, 89, 90, 91
4 92, 93, 94, 95, 96, 97
5 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104
6 105, 106, 107, 108, 109, 110
7 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117
8 118, 119, 120, 121, 122, 123
9 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130
10 131, 132, 133, 134, 135, 136
11 137, 138, 139, 140, 141
12 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148
13 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156
14 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164
15 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171
16 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178
17 179, 180, 181, 182, 183, 184
18 185, 186, 187, 188, 189, 190
19 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197
20 198, 199, 200, 201, 202, 203
21 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210
22 211, 212, 213
23 214, 215, 216, 217, 218, 219
세포 내 시토카인 염색 분석
세포를 5㎍/펩티드/mL의 최종 농도로 HBV-유래 펩티드 풀로부터의 자극과 함께 5x105개 PBMC/웰로 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 20시간 동안 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 분석의 최종 3시간 동안, PMA/이오노마이신을 각 웰에 첨가하고 Golgi plug를 모든 웰에 첨가하였다. 세포를 수확하고 PBS + 0.1% BSA (세척 완충액)로 세척하고 항-CD3, 항-CD4 및 항-CD8 (BD Biosciences)에 의해 30분 동안 4℃에서 염색하였다. 또 다른 세척 후, 세포를 고정시키고 100㎕의 BD Cytofix/Cytoperm 용액에 의해 20분간 4℃에서 침투화한(permeabilise) 후, 1x BD Perm/Wash 용액으로 2회 세척하였다. 최종적으로, 세포를 항-IL-2-FITC, 항-IFNγ-PE 및 항-TNFα PerCP-Cy5.5 (BD Biosciences)에 의해 30분간 4℃에서 염색하였다. 시료를 FACSCanto II 유세포 분석기 (BD Biosciences) 상에서 수득하였다. 게이팅(gating)은 각 대상에 대해 배지 자극 시료를 기반으로 하였다.
감염성 HBV 유전형 결정
HBV 유전형 분석을 위해 처음에 네스티드(nested) PCR 방법 후 직접 뉴클레오티드 시퀀싱을 이용하였다. 그러나, 다수의 시료 유래 혈장에서의 낮은 바이러스 수치(viral load)로 인해, HBV 유전형은 이 방법을 이용하여 결정될 수 없었다. 뒤이어 IMMUNIS® HBV 유전형 효소 면역분석 (EIA) 키트를 이용하였다. 이 분석은 HBsAg의 PreS2 부위 내 4개의 유전형-의존적 에피토프를 이용하였고, 유전형이 각 에피토프에 특이적인 4개 EIA의 양성/음성 조합에 의해 혈청학적으로 결정되었다.
결과
HBV 프로테옴에서 관심 부위(region of interest)를 확인하는데 있어서 초기 단계는 HBV-미감염의, 백신을 접종하지 않은 건강한 대상으로부터의 PBMC의 IFNγ ELISpot 반응을 질환의 지속적인 대조 상(control phase)에 있는 만성 HBV-감염된 HBeAg 음성 - 비활성 보유자 대상 및 치료하에 있는 만성 HBV-감염된 HBeAg 음성 대상의 것과 비교하는 것이었다. 약 70%의 HBV 프로테옴을 나타내는, 중복된 짧은 펩티드 (10-13개의 아미노산이 중복되는 15-20mer)의 라이브러리에 의한 단기 배양 후, 각각 HBV 폴리머라제, 코어, X 및 표면 항원 내 특정 관심 부위를 나타내는 이들 짧은 펩티드의 풀에 의해 PBMC를 밤새 재자극시켰다. 그 후 인간 IFNγ ELISpot 분석을 이용하여 이들 펩티드 풀에 대한 IFNγ 반응을 평가하였다.
여러 항원성 부위를 나타내는 풀이 만성 HBV 대상에 특이적인 IFNγ 반응을 자극하는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, HBV 폴리머라제의 말단 부위를 나타내는 풀 (풀 2 & 풀 3) 및 HBV 코어의 영역을 나타내는 풀 (풀 14-17)에 의한 자극이 HBV-감염된 대상에서 가장 큰 크기 및 집단 커버리지(coverage)의 IFNγ 반응을 야기하였다 (도 1). 더 낮은 정도로, 풀 4 내지 9 및 풀 11 내지 13이 HBV-특이적 T-세포 반응을 촉진하는 경향이 있다.
짧은 펩티드 풀에 대한 HBV-특이적 반응의 성질에 대한 감염성 HBV 유전형의 역할을 확립하기 위하여, 각 대상에 대해 감염성 HBV 유전형을 결정하였다. 이는 혈장 시료에서 HBV 표면 항원 에피토프 평가를 이용하여 결정되었다. 뒤이어 면역 대조군 및 치료된 HBV-감염 대상으로부터 얻은 PBMC의 IFNγ 반응을 HBV 유전형 A, B, C 및 D에 따라 그룹화하였다. 일부 대상은 분석의 민감도 한계 및 가능한 드문 혈청이 평가됨으로 인해 이들 유전형으로 분류되지 않았다. 그러므로 이들 대상은 이 평가에 포함되지 않았다. 4개 유전형 간 반응 프로파일은 가장 큰 크기의 IFNγ 반응을 나타내는 부위가 통상적으로 HBV 프로테옴의 말단 폴리머라제 및 코어 부위라는 점에서 유사성을 나타내었다 (도 2). 풀 2, 3, 10, 12, 14, 15, 16 및 17이 다수의 유전형에 대해 반응을 제공하는 것으로 보인다.
짧은 펩티드 풀에 대한 HBV-특이적 반응의 성질에 대한 숙주 대상의 유전적 배경의 역할을 확립하기 위하여, 연구의 대상을 인종에 따라 그룹화하였다. 뒤이어 면역 대조군 및 치료된 HBV-감염 대상으로부터 얻은 PBMC의 IFNγ 반응을, 3개의 넓은 인종 그룹, 즉 아프리카인/아랍인, 코카시안 및 동양인/인도인에서 비교하였다. 인종 그룹 간 반응 프로파일이, HBV 프로테옴의 말단 폴리머라제 및 코어 부위로부터의 풀에 대해 발견된, 연관된 높은 집단 커버리지를 갖는, 가장 큰 크기의 IFNγ 반응을 통해 다시 유사성을 나타내었다 (도 3). 면역 대조군 하에 있는 대상에 비해, 코카시안 그룹이, 여러 풀에 대한 평균 크기의 반응이 치료된 그룹의 대상에서 가장 높은 것으로 밝혀진 점에서 나머지 2개의 인종 그룹과 약간 상이한 것으로 나타났다. 풀 2, 3, 10, 14, 15, 16, 17 및 21이 다수의 인종 그룹에서 반응을 촉진하는 경향이 있다.
최종적으로, 짧은 펩티드 풀에 대한 PBMC에 의한 IFNγ 반응의 타입을 추가로 기술하기 위하여, 세포 내 시토카인 염색을 위해 단기 배양 세포를 밤새 재자극하였다. 그 후 유세포 분석에 의해 세포를 CD3, CD4, CD8 및 IFNγ 발현에 대해 평가하였다. 건강한 대상 및 만성 HBV-감염된 대상으로부터 얻은 PBMC의 짧은 펩티드 풀 2 및 14에 대한 IFNγ 반응에 대하여 비교가 이루어졌다 (도 4). 이들은 IFNγ ELISpot 분석에서 가장 강한 HBV-특이적 반응을 유발한 2개의 펩티드 풀이었다. IFNγ ELISpot 분석과 일치하게, 만성 HBV-감염된 대상으로부터 얻은 PBMC에서 특이적으로 증가된 IFNγ 발현이 확인되었다. 또한, 이는 이중의 (dual) CD4 및 CD8 T-세포 반응인 것으로 밝혀졌다.
실시예 2: 사람 PBMC 에서 HBV -유래 덴시겐 ( Densigen )-연관 짧은 펩티드 풀의 체외 면역원성의 평가
방법 및 재료
집단
HBV-감염된 대상
임상적으로 만성적 HBV-감염인 것으로 정의된 104명의 대상을 런던 내의 Imperial Healthcare NHS Trust, Chelsea and Westminster Hospital NHS Foundation Trust, 및 Barts and the London NHS Trust의 REC-승인 프로토콜에 등록하였다. 모든 대상으로부터 작성된 사전동의에 따라, 신선한 정맥혈을 수집하고 PBMC 및 혈장을 분리하고 혈액 수집 18시간 이내에 동결보존하였다. 이들 대상은 하기 기준을 따랐다: 양호한 일반 건강, HBV 특이적 치료: 임상적으로 지시된 경우 항바이러스성 뉴클레오시(티)드 유사체 억제제 및/또는 인터페론 치료, 임상적 상태(만성 HBV 감염, HBeAg-음성, 및 ALT 정상적, 지속적 또는 간헐적 상승), HIV-음성, HCV-음성 및 HDV-음성.
건강 통제 대상
17명의 대상으로부터 얻은 동결보존된 PBMC를 CTL Technologies로부터 얻었다. 이들 대상은 하기 기준을 따랐다: 양호한 일반 건강, HBV에 대한 백신을 접종하지 않은, HBV 표면 항원-음성, HBV 코어 항체-음성, HIV-음성 및 HCV-음성.
PBMC 의 단기 배양
각 대상으로부터 얻은 1 바이알의 PBMC (1x107개 세포 함유)를 해동시키고 Scepter™ automated handheld 세포 계수기를 이용하여 림프구 수를 결정하였다. 24개 웰의 세포 배양 플레이트의 2mL 배양 배지 (CM: 5% 인간 AB 혈청으로 보충된 RPMI-1640 Glutamax)에서 1x106개 세포/mL의 농도로 총 11일 동안 PBMC를 배양하였다. 15-20개의 아미노산 길이를 갖고 10 내지 13개의 아미노산이 중복되는, 최종 농도 0.1㎍/펩티드/mL인, 144개의 중복되는 HBV-유래 짧은 펩티드를 함유하는 펩티드 풀 (서열번호 73 내지 210 및 서열번호 142 내지 147)에 의해 세포를 자극하였다. 4일차에, IL-2 및 IL-15를 각각 10 IU/mL 및 10 ng/mL의 최종 농도로 배양물에 첨가하였다. 10일차에, 세포를 CM에서 2회 세척하고 추가의 1일 동안 10 IU/mL의 IL-2에 의해 배양하였다. 11일차에, 세포를 CM에서 2회 세척하고, 계수하고 사람 IFNγ ELISpot 분석 또는 세포 내 시토카인 염색에 포함시켰다.
사람 IFN γ ELISpot 분석
96 웰 멀티스크린 PVDF 필터 플레이트 (Millipore)를 밤새 4℃에서 100 ㎕ (1:80)의 항-인간 IFNγ 포획 mAb (R&D Systems)에 의해 코팅하였다. 그 후 플레이트를 1% BSA 및 5% 수크로스가 보충된 PBS에 의해 2시간 동안 4℃에서 블로킹하였다. 세포를 3 반복 웰에 5x104 PBMC/웰로 플레이팅하였다. 사용된 최종 항원 농도는 하기와 같았다: 23 HBV-유래 덴시겐-연관 짧은 펩티드 풀 (하기 참조): 5㎍/펩티드/mL; CEF 펩티드 풀 양성 대조군: 1㎍/펩티드/mL; PHA 양성 대조군: 1㎍/mL. ELISpot 플레이트를 습한 환경에서 18시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 그 후 플레이트를 세척하고 100 ㎕ (1:80)의 비오틴화 항-인간 IFNγ 검출 mAb (R&D Systems)과 함께 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세척 후, 제조사의 지시사항에 따라 (R&D Systems) 플레이트를 스트렙타비딘-결합 알칼라인 포스파타제 (1:80)와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후 기질 (30분)과 인큐베이션하였다. 자동화 플레이트 계수 시스템 (CTL Europe)을 이용하여 발달된 스팟을 계수하였다.
풀 풀에서 짧은 펩티드의 서열번호
24 74, 75, 76, 77, 78, 79
25 80, 81, 82, 83
26 86, 87, 88, 89
27 94, 95, 96, 97
28 98, 99, 100, 101
29 102, 103, 104
30 105, 106, 107, 108, 109
31 109, 110, 111, 112
32 116, 117, 118, 119
33 120, 121, 122, 123
34 137, 138, 139, 140
35 146, 147, 148, 149, 150
36 150, 151, 152, 153, 154
37 152, 153, 154, 155, 156
38 163, 164, 165, 166
39 169, 170, 171
40 172, 173
41 172, 173, 174, 175
42 176, 177, 178, 179
43 179, 180, 181
44 187, 188, 189, 190, 191
45 204, 205, 206, 207, 208, 209
46 215, 216, 217, 218
세포 내 시토카인 염색 ( ICS ) 분석
세포를 5㎍/펩티드/mL의 최종 농도로 HBV-유래 펩티드 풀로부터의 자극과 함께 5x105개 PBMC/웰로 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 20시간 동안 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 분석의 최종 3시간 동안, PMA/이오노마이신을 각 웰에 첨가하고 Golgi plug를 모든 웰에 첨가하였다. 세포를 수확하고 PBS + 0.1% BSA (세척 완충액)로 세척하고 항-CD3, 항-CD4 및 항-CD8 (BD Biosciences)에 의해 30분 동안 4℃에서 염색하였다. 또 다른 세척 후, 세포를 고정시키고 100㎕의 BD Cytofix/Cytoperm 용액에 의해 20분간 4℃에서 침투화한 후, 1x BD Perm/Wash 용액으로 2회 세척하였다. 최종적으로, 세포를 항-IL-2-FITC, 항-IFNγ-PE 및 항-TNFα PerCP-Cy5.5 (BD Biosciences)에 의해 30분간 4℃에서 염색하였다. 시료를 FACSCanto II 유세포 분석기 (BD Biosciences) 상에서 수득하였다. 게이팅은 각 대상에 대해 배지 자극 시료를 기반으로 하였다.
감염성 HBV 유전형 결정
HBV 유전형 분석을 위해 처음에 네스티드 PCR 방법 후 직접 뉴클레오티드 시퀀싱을 이용하였다. 그러나, 다수의 시료 유래 혈장에서의 낮은 바이러스 수치로 인해, HBV 유전형은 이 방법을 이용하여 결정될 수 없었다. 뒤이어 IMMUNIS® HBV 유전형 효소 면역분석 (EIA) 키트를 이용하였다. 이 분석은 HBsAg의 PreS2 부위 내 4개의 유전형-의존적 에피토프를 이용하였고, 유전형이 각 에피토프에 특이적인 4개 EIA의 양성/음성 조합에 의해 혈청학적으로 결정되었다.
결과
HBV-유래 짧은 펩티드 풀에 대한 반응의 스크리닝에 뒤이어, 35-40mer의 관심 부위를 확인하였다. 백신에서 35-40mer를 이용할 목적으로 이 부위를 추가로 평가하였다. 추가의 평가는 이전에 단기 배양 후 재자극을 위해 이용되었던 짧은 펩티드 풀의 재설계를 포함하였다. 백신에서 이용될 펩티드를 보다 정확하게 반영하기 위하여, 35-40mer의 관심 부위를 넘어 연장하는 말단의 짧은 펩티드를 풀에서 제거하였다. 펩티드 라이브러리와의 단기 배양 후, 앞서와 같이, 이들 짧은 펩티드 풀을 사람 IFNγ ELISpot 및 ICS 분석에서 재자극을 위해 이용하였다.
풀 24 내지 46에 의한 재자극은, HBV 프로테옴의 말단 폴리머라제 (풀 25 및 풀 26) 유래 부위 및 코어 (풀 38 및 39 및 풀 41 내지 43) 부위에 대한 우성 HBV-특이적 T-세포 반응을 나타내었다 (도 5). 또한, HBV-특이적 반응은 표면 부위 풀 45에 의한 자극을 따르는 것으로 밝혀졌다. 또한, 풀 28, 풀 32, 풀 33, 풀 36 및 풀 37에 해당하는 폴리머라제의 부위는 유의한 T-세포 반응을 제공하였다.
감염성 HBV 유전형에 따라 풀 24 내지 46에 대한 IFNγ ELISpot 반응을 그룹화하였다 (도 6). 풀 27, 28, 29, 32, 35, 36은 각각 유전형 C에 대해 우세한 반응을 제공한다. 풀 25 및 26은 유전형 D에 대해 우세한 반응을 제공한다. 풀 30 및 31은 유전형 B에 대해 우세한 반응을 제공한다. 풀 38, 42, 43 및 44는 유전형 A에 대해 우세한 반응을 제공한다. 일부 풀은 1개를 초과하는 유전형에 대해 반응을 촉진하는 경향이 있다: 풀 26, 32, 33, 36 및 43에 있어서 2개의 유전형, 풀 37, 38, 41 및 42에 있어서 3개의 유전형 또는 풀 25에 있어서 4개의 유전형.
감염성 HBV 유전형에 따라 풀 24 내지 46에 대한 IFNγ ELISpot 반응을 그룹화하였다 (도 7). 풀 28, 29 및 30은 동양인/인도인 인종에서 우세한 반응을 제공한다. 풀 25, 33, 34, 35 및 37은 코카시안에서 우세한 반응을 제공한다. 풀 38, 39, 41, 42 및 43은 아프리카인/아랍인 인종에서 우세한 반응을 제공한다. 일부 풀은 1개를 초과하는 인종 그룹에 있어서 반응을 촉진하는 경향이 있다: 각각의 풀 26, 39 및 43에 있어서 2개의 인종 그룹 또는 풀 25, 38 및 42에 있어서 3개의 인종 그룹.
하기 표 4에 결과를 요약한다.
HBV
프로테옴 부위 		폴리머라제의 말단 도메인 폴리머라제의 역전사효소 도메인 폴리머라제 의 RNase H 도메인 코어 단백질
풀 No . 25 26 28 30 31 35 38 39 42 43
펩티드 P113 P151 P277 P360 P376 P645 P753 P797 P856 P877
서열번호 14
24		 15
25		 16
60 26 34		 17 27 18 28 19
29
35		 20
30 36		 21
67
31
37		 22
32
38		 23
33
유전형 A B C D A D C B B C A C D A B D A C D A D
인종 OI
C AA		 C AA OI OI OI C OI C AA OI AA OI C AA C AA
표 4: 상이한 HBV 유전형 (A, B, C 및 D)에 대한 및 상이한 인종 (OI = 동양인/인도인, C = 코카시안, AA = 아프리카인/아랍인)의 환자에서 HBV 프로테옴 중 선택된 부위 유래 펩티드의 우세한 반응 요약. 부위가 다수의 HBV 유전형 또는 다수의 인종에 대해 면역 반응을 유발할 경우, 우세한 반응이 굵은 글씨로 표시된다.
세포 내 시토카인 염색에 의한 T-세포 반응의 추가 분석을 위하여 8개의 풀을 선택하였다. 7 내지 14명의 대상으로부터의 PMBC (IFNγ ELISpot 분석 후 이용가능한 세포의 수에 따라)를 8개의 풀 중 하나에 의해 밤새 자극시키고 세포 내 IFNγ, TNFα 및 IL-2 발현과 함께 표면 CD3, CD4 및 CD8 발현에 대하여 세포를 염색하였다 (도 8). CD8 및 CD4 T-세포 집단에서 IFNγ 발현이 확인되었고, 펩티드 풀의 5/8 및 8/8에 대한 반응의 해당 폭(breadth)을 평가하였다. 유사하게, 각각 3/8 및 6/8의 펩티드 풀 반응의 폭을 갖는 CD8 및 CD4 T-세포 집단에서 TNFα 발현이 확인되었다. CD8 T-세포가 펩티드 풀 자극 후 IL-2를 발현하지 않는 것으로 확인되었으나, CD4 T-세포는 8개 풀 중 7개에 의한 자극 후 IL-2를 발현하였다.
실시예 3: 플루오로카본 -연결 HBV 펩티드의 제작
서열번호 24, 25, 28, 33, 34, 36, 37 및 38 및 222에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 FMOC (플루오레닐메틸옥시카르보닐 클로리드) 고체상 합성에 의해 합성하였다. 그 후, 플루오로카본-연결 펩티드를 유도하기 위하여 플루오로카본 사슬 (C8F17(CH2)2COOH)을 각 펩티드 중 추가의 N-말단 라이신의 엡실론(epsilon)-사슬에 도입하였다. 정제된 플루오로카본-연결 펩티드 또는 미변형 펩티드를 트리플루오로아세트산 (TFA)의 존재하에서 절단 및 역상-고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의한 최종 정제를 통해 수득하였다. 모든 제제가 90% 이상의 순도를 가졌다.
FA-P113: K(FA)-VGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIK-NH2 (서열번호 24);
FA-P151: K(FA)-PEHVVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASF-NH2 (서열번호 25);
FA-P376: K(FA)-KLHLYSHPIILGFRKIPMGVGLSPFLLAQFTSAISSVVRR-NH2 (서열번호 28);
FA-753(K): K(FA)-KKKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYRKKK-NH2 (서열번호 36);
FA-P856(K): K(FA)-LTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTKKK-NH2 (서열번호 38);
FA-P877: K(FA)-PPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRR-NH2 (서열번호 33);
FA-P277(K): K(FA)-RVSWPKFAVPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDVSAAFYHKKK-NH2 (서열번호 34),
FA-P797(K): K(FA)-SPHHTALRQAILSWGELMTLATWVGSNLEDPASRDKKK-NH2 (서열번호 37);
FA-P1266(K): K(FA)-KKKGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSW WTSLNFLKKK-NH2 (서열번호 222)
NP113: VGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIK (서열번호 24);
NP151: PEHVVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASF (서열번호 25);
NP376: KLHLYSHPIILGFRKIPMGVGLSPFLLAQFTSAISSVVRR (서열번호 28);
NP753(K): KKKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYRKKK (서열번호 36);
NP856(K): LTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTKKK (서열번호 38);
NP877: PPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRR (서열번호 33);
NP277(K): RVSWPKFAVPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDVSAAFYHKKK (서열번호 34),
NP797(K): SPHHTALRQAILSWGELMTLATWVGSNLEDPASRDKKK (서열번호 37);
NP1266(K): KKKGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLKKK (서열번호 222).
실시예 4: 긴 HBV 펩티드 제제화
실시예 3에 기술된 바와 같이 제조된 9개의 플루오로카본-결합 HBV-유래 펩티드로 이루어진 백신 후보물질인 FP02.1을 하기 기술된 바와 같이 제제화하였다. 펩티드 가용화를 위한 조건이 표 5에 기술되어 있다. 요약하면, 각각의 9개 플루오로카본-결합 펩티드를 5ml 유리 바이알에서 중량을 측정하였다. 그 후 각 펩티드를 2 내지 12% 아세트산 수용액에 의해 가용화하여 10mg의 펩티드 농도를 달성하였다. 3.9ml의 10% 아세트산 수용액을 첨가하기 전 150ml의 멸균 용기에서 펩티드 용액 (각 펩티드에 있어서 3.9ml)을 블렌딩하였다. 2분간 자성 교반기에 의해 교반한 후, 39mL의 9.0% 만니톨 수용액을 첨가하였다. 추가의 2분 동안 자성 교반기에 의해 교반한 후, 0.22㎛ 33mm Millex 필터를 이용하여 용액을 여과하였다. 1.2mL의 여과된 용액을 오토클레이브된 2ml 유리 바이알로 옮겼다(dispatch). RP-HPLC에 의해 측정된 여과 회수율은 > 95%였다. 바이알을 -80℃에서 1시간 동안 동결시켰다. 그 후 시료를 36시간 동안 동결-건조시켰다. 질소하에서 동결 건조 통풍을 수행하고 바이알 마개 막기(stoppering)를 400 내지 600 mbar의 압력에서 수행하였다. 펩티드의 양은 펩티드 당 바이알 당 600㎍이었다; 1.2mL로 재구성한 후, 최종 농도가 500㎍/펩티드/ml이었다.
펩티드 총 질량
(mg)		 펩티드 함량 (%) 순(net) 질량
(mg)		 목표 농도
(mg/ml)		 아세트산 (%) 첨가된 부피
FA-P113 46.54 86.8 40.40 20 2 4.040
FA-P151 45.87 88.0 40.37 20 12 4.036
FA-P277(K) 49.76 81.8 40.70 20 4 4.170
FA-P376 47.62 85.3 40.62 20 2 4.062
FA-P797(K) 44.69 92.0 41.11 20 2 4.112
FA-P877 49.25 81.9 40.34 20 2 4.034
FA-P753(K) 47.47 85.1 40.40 20 2 4.040
FA-P1266(K) 45.82 86.4 40.45 20 2 4.046
FA-P856(K) 47.02 86.8 40.81 20 2 4.082
표 5: FP02.1의 제조를 위한 가용화 조건
실시예 5: 바람직한 HBV 펩티드 및 혼합물이 질환 단계, HBV 바이러스의 유전형 및 대상의 인종과 무관하게 만성 HBV 보유자(carrier)에서 면역원성을 갖는다.
방법 및 재료
집단
임상적으로 만성적 HBV-감염인 것으로 정의된 40명의 대상을 런던 내의 Imperial Healthcare NHS Trust, Chelsea and Westminster Hospital NHS Foundation Trust, 및 Barts and the London NHS Trust의 REC-승인 프로토콜에 등록하였다. 모든 대상으로부터 작성된 사전동의에 따라, 신선한 정맥혈을 수집하고 PBMC 및 혈장을 분리하고 혈액 수집 18시간 이내에 동결보존하였다. 이들 대상은 하기 기준을 따랐다: 양호한 일반 건강, HBV 특이적 치료: 임상적으로 지시된 경우 항바이러스성 뉴클레오시(티)드 유사체 억제제 및/또는 인터페론 치료, 임상적 상태(만성 HBV 감염, HBeAg-음성, 및 ALT 정상적, 지속적 또는 간헐적 상승), HIV-음성, HCV-음성 및 HDV-음성.
PBMC 의 단기 배양
각 대상으로부터 얻은 1 바이알의 PBMC (1x107개 세포 함유)를 해동시키고 Scepter™ automated handheld 세포 계수기를 이용하여 림프구 수를 결정하였다. 24개 웰의 세포 배양 플레이트의 2mL 배양 배지 (CM: 5% 사람 AB 혈청으로 보충된 RPMI-1640 Glutamax)에서 1x106개 세포/mL의 농도로 총 11일 동안 PBMC를 배양하였다. 실시예 3에 기술된 9개의 HBV-유래 긴 펩티드의 혼합물에 의해 세포를 자극하였다.
각 펩티드를 0.1㎍/펩티드/mL의 최종 농도로 이용하였다. 4일차에, IL-2 및 IL-15를 각각 10 IU/mL 및 10 ng/mL의 최종 농도로 배양물에 첨가하였다. 10일차에, 세포를 CM에서 2회 세척하고 추가의 1일 동안 10 IU/mL의 IL-2에 의해 배양하였다. 11일차에, 세포를 CM에서 2회 세척하고, 계수하고 사람 IFNγ (인터페론-감마) ELISpot 분석 또는 세포 내 시토카인 염색에 포함시켰다.
사람 IFN γ ELISpot 분석
96 웰 멀티스크린 PVDF 필터 플레이트 (Millipore)를 밤새 4℃에서 100 ㎕ (1:80)의 항-인간 IFNγ 포획 mAb (R&D Systems)에 의해 코팅하였다. 그 후 플레이트를 1% BSA 및 5% 수크로스가 보충된 PBS에 의해 2시간 동안 4℃에서 블로킹하였다. 단기 배양 유래 세포를 3 반복 웰에서 5x104 PBMC/웰로 플레이팅하였다. 사용된 최종 항원 농도는 하기와 같았다: 각 개별 펩티드에 있어서 5㎍/mL; PHA 양성 대조군: 1㎍/mL. ELISpot 플레이트를 습한 환경에서 18시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 그 후 플레이트를 세척하고 100 ㎕ (1:80)의 비오틴화 항-인간 IFNγ 검출 mAb (R&D Systems)과 함께 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세척 후, 제조사의 지시사항에 따라 (R&D Systems) 플레이트를 스트렙타비딘-결합 알칼라인 포스파타제 (1:80)와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후 기질 (30분)과 인큐베이션하였다. 자동화 플레이트 계수 시스템 (CTL Europe)을 이용하여 발달된 스팟을 계수하였다.
세포 내 시토카인 염색 분석
단기 배양 유래 세포를 5㎍/mL의 최종 농도로 HBV-유래 긴 펩티드 (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K), NP877 및 NP1266(K))로부터의 자극과 함께 5x105개 PBMC/웰로 96 웰 둥근 바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 20시간 동안 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 분석의 최종 3시간 동안, PMA/이오노마이신을 각 웰에 첨가하고 Golgi plug를 모든 웰에 첨가하였다. 세포를 수확하고 PBS + 0.1% BSA (세척 완충액)로 세척하고 항-CD3, 항-CD4 및 항-CD8 (BD Biosciences)에 의해 30분 동안 4℃에서 염색하였다. 또 다른 세척 후, 세포를 고정시키고 100㎕의 BD Cytofix/Cytoperm 용액에 의해 20분간 4℃에서 침투화한 후, 1x BD Perm/Wash 용액으로 2회 세척하였다. 최종적으로, 세포를 항-IL-2-FITC, 항-IFNγ-PE 및 항-TNFα PerCP-Cy5.5 (BD Biosciences)에 의해 30분간 4℃에서 염색하였다. 시료를 FACSCanto II 유세포 분석기 (BD Biosciences) 상에서 수득하였다. 게이팅은 각 대상에 대해 배지 자극 시료를 기반으로 하였다.
감염성 HBV 유전형 결정
HBV 유전형 분석을 위해 처음에 네스티드 PCR 방법 후 직접 뉴클레오티드 시퀀싱을 이용하였다. 그러나, 다수의 시료 유래 혈장에서의 낮은 바이러스 수치로 인해, HBV 유전형은 이 방법을 이용하여 결정될 수 없었다. 뒤이어 IMMUNIS® HBV 유전형 효소 면역분석 (EIA) 키트를 이용하였다. 이 분석은 HBsAg의 PreS2 부위 내 4개의 유전형-의존적 에피토프를 이용하였고, 유전형이 각 에피토프에 특이적인 4개 EIA의 양성/음성 조합에 의해 혈청학적으로 결정되었다.
결과
모든 펩티드가 HBeAg-음성 비활성 보유자 및 HBeAg-음성 치료된 대상인 HBV 보유자에서의 검출가능 T 세포 반응을 촉진하였다 (도 9 및 10 참조). 상이한 시험 펩티드 중, NP113, NP151, NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K) 및 NP877이 환자 집단에서 및 가장 높은 비율의 대상에서 가장 높은 수준의 반응을 촉진한다. 놀랍게도, 두 집단에서 NP113 및 NP151에 대한 누적 반응이 2개의 시험 펩티드의 기타 조합에 비해 더 높다. 또한, 두 집단에서 NP113, NP151 및 NP376에 대한 누적 반응이 3개의 시험 펩티드의 기타 조합에 비해 가장 높은 수준의 반응을 유도한다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 모든 시험 펩티드가 모든 4개의 HBV 유전형에 대한 교차-반응성 T-세포 반응을 촉진한다. 펩티드 NP113, NP151, NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K) 및 NP877이 펩티드 NP2777(K) 및 NP1226(K)에 비해 모든 4개의 유전형 A, B, C & D에 있어서 가장 높은 반응을 촉진한다. 놀랍게도, P113이 모든 기타 펩티드에 비해 모든 4개의 유전형에 대한 가장 높은 T 세포 반응을 촉진한다.
도 12는 모든 펩티드가 모든 시험 인종 그룹에 대해 T 세포 반응을 촉진한다는 것을 나타낸다. 펩티드 NP113, NP151, NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K) 및 NP877은 NP277(K) 및 NP1266(K)에 비해 모든 3개의 인종 그룹에 대해 가장 높은 반응을 촉진한다.
또한, 모든 9개의 펩티드가 모든 HBV 유전형에 대한 세포 내 시토카인 염색에 의해 측정된 Th1 시토카인-생성 CD4 및/또는 CD8 T 세포 반응을 촉진하는 능력을 나타낸다 (도 13).
실시예 6: 인 비보에서의 T 세포 반응을 촉진시키는 능력에 있어서 미결합 펩티드 대비 플루오로카본 -결합 펩티드의 우수성
방법 및 재료
FP02.1 (9개의 플루오로카본-결합 펩티드 함유)의 마우스에서의 면역원성을 NP02.1 (9개의 동등한 미결합 펩티드 함유)와 비교하였다. 암컷 BALB/c 마우스 (n = 7/그룹)를 근육 내에서 50 ㎕의 부피 중 펩티드 당 50 ㎍의 투여량으로 FP02.1에 의해 또는 50 ㎕의 부피 중 펩티드 당 43.8 ㎍의 (FP02.1 대비) 등몰(equimolar) 투여량으로 NP02.1 (미결합 HBV 펩티드 (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K), NP877 및 NP1266(K) 함유)에 의해 면역화하였다. 마우스를 0일차에 면역화하고 14일차에 희생시켰다. ELISpot 분석에서 비장세포를 5㎍/mL/펩티드의, 실시예 3에 기술된 9개의 HBV 펩티드의 각 혼합물에 의해 인 비트로에서 18시간 동안 자극하였다.
대안적으로, ELISpot 분석에서 비장세포를 5㎍/mL/펩티드의 9개 개별 펩티드에 의해 인 비트로에서 18시간 동안 자극하였다. IFNγ+ spot 형성 세포 (SFC)의 수를 계수하였다. 그 후 플레이트를 PBS로 세척하고, 제조사의 지시사항에 따라 IFNγ 검출 퍼옥시다제-표지 항체 및 뒤이어 기질과 함께 인큐베이션하였다. 자동화 플레이트 계수 시스템 (CTL Europe)을 이용하여 발달된 스팟을 계수하여 IFNγ+ SFC의 수를 정량하였다.
결과
미결합 펩티드의 동등 혼합물 (NP02.1)에 비해 플루오로카본-결합 펩티드의 혼합물 (FP02.1)에 의해 면역화된 마우스에서 유의하게 높은 크기의 T 세포 반응이 관찰되었다 (도 14 참조). 동계(syngeneic) BALC/C 모델에서의 MHC 제한으로 인해, 백신에 함유된 9개 펩티드 중 4개 (펩티드 NP113, NP151, NP376 및 NP1266(K); 도 15 참조)에 의해 면역 반응이 지배되었다.
FP02.1에 의해 유도된 반응이 펩티드 NP113, NP151, NP376 및 NP1266(K)에 의해 지배되었다. 놀랍게도, 펩티드 P113 및 P376에 대한 면역 반응만이 플루오로카본-결합 펩티드 함유 제제에 의해 관찰되었다 (도 15 참조).
결론적으로, HBV 유래 펩티드 서열에 대한 플루오로카본 벡터의 결합이 동등 미결합 펩티드에 비해 보다 높고 넓은 T 세포 반응을 촉진한다.
실시예 7: 플루오로카본 -결합 펩티드가 CTL / CD8 + T 세포 반응을 촉진한다
방법 및 재료
FP02.1 (9개의 플루오로카본-연결 펩티드 함유)에 의해 유도된 면역 반응의 질을 마우스에서 평가하였다. 암컷 BALB/c 마우스 (n = 7/그룹)을 근육 내에서 50 ㎕의 부피 중 펩티드 당 25 ㎍의 투여량으로 FP02.1에 의해 면역화하였다. 마우스를 0일차에 면역화하고 14일차에 희생시켰다.
ELISpot 분석에서 비장세포를 101 내지 10-9 ㎍/ml의 농도로 펩티드 NP113 유래 CTL 에피토프 (CTL1 KYLPLDKGI) 또는 NP151 유래 CTL 에피토프 (CTL 2 HYFQTRHYL)에 의해 인 비트로에서 18시간 동안 자극하였다. IFNγ+ SFC의 수를 계수하였다. 그 후 플레이트를 PBS로 세척하고, 제조사의 지시사항에 따라 IFNγ 검출 퍼옥시다제-표지 항체 및 뒤이어 기질과 함께 인큐베이션하였다. 자동화 플레이트 계수 시스템 (CTL Europe)을 이용하여 발달된 스팟을 계수하여 IFNγ+ SFC의 수를 정량하였다.
결과
도 16에 나타낸 바와 같이, FP02.1가 단일 면역화 후 MHC 클라스 I 분자에 의해 제한된 CTL 에피토프에 대한 T 세포 반응을 촉진시킨다.
실시예 8: 동일 제제에 함유된 플루오로카본 -펩티드 간 상승효과
방법 및 재료
마우스에 투여된 FA-P113의 면역원성을 단독 또는 기타 플루오로카본-결합 펩티드 (FP02.1)와의 공동-제제화의 일부로서 마우스에서 평가하였다. 암컷 BALB/c 마우스 (n = 7/그룹)을 근육 내에서 50 ㎕의 부피 중 펩티드 당 25 ㎍의 투여량으로 FA-P113 또는 25 ㎍의 투여량으로 FP02.1에 의해 면역화하였다. 마우스를 0일차에 면역화하고 14일차에 희생시켰다. ELISpot 분석에서 비장세포를 5㎍/mL의 NP113 (플루오로카본 벡터에 미결합)에 의해 인 비트로에서 18시간 동안 자극하였다. IFNγ+ SFC의 수를 계수하였다. 그 후 플레이트를 PBS로 세척하고, 제조사의 지시사항에 따라 IFNγ 검출 퍼옥시다제-표지 항체 및 뒤이어 기질과 함께 인큐베이션하였다. 자동화 플레이트 계수 시스템 (CTL Europe)을 이용하여 발달된 스팟을 계수하여 IFNγ+ SFC의 수를 정량하였다.
결과
단독의 FA-P113에 비해 플루오로카본-결합 펩티드의 혼합물 (FP02.1)에 의해 면역화된 마우스에서 보다 높은 크기의 NP-113-특이적 T 세포 반응이 관찰되었다 (도 17 참조).
실시예 9: 바람직한 HBV 펩티드 및 조합이 광범위한 HLA 클라스 I 분자에 결합하는 능력을 갖는 에피토프를 포함한다
방법 및 재료
ProImmune REVEAL 결합 분석을 이용하여 9개의 아미노산의 짧은 펩티드 (HBV 긴 펩티드 NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K), NP877 및 NP1266(K) 유래)의 하나 이상의 MHC 클라스 I 대립유전자에 결합하고 MHC-펩티드 복합체를 안정화시키는 능력을 결정하였다. 검출은 MHC-펩티드 복합체의 천연 구조의 존재 또는 부재에 기초한다. 매우 빈번한 HLA 클라스 I 대립유전자 (HLA-A*0201, A*0301, A*1101, A*2402, B*0702, B*0801, 및 B*3501)를 선택하였다. MHC 분자에 대한 결합을, 매우 강한 결합 특성을 갖는 양성 대조군 펩티드인 알려진 T-세포 에피토프의 결합과 비교하였다. 공통(consensus) HBV 서열에 존재하지 않은 여분의 라이신을 포함하는 것을 제외하고는 각 HBV 펩티드 (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K), NP877 및 NP1266(K))에 대한 모든 잠재적 9량체(nonamer)를 순도 >90%로 합성하였다. 시험 펩티드의 점수를 정량적으로 양성 대조군 펩티드에 의해 생성된 신호의 퍼센트로 기록하고, 펩티드를 추정(putative) 합격 또는 불합격 결과를 갖는 것으로 나타낸다. 우수한 결합자(binder)가 ProImmune에 의해 정의된 양성 대조군 중 점수 45%를 갖는 펩티드인 것으로 고려된다.
결과
표 6에 나타낸 결과가 각 HLA 대립유전자에 있어서 결합 점수 >= 45%를 갖는 각 HBV 긴 펩티드 (NP113, NP151, NP277, NP376, NP753, NP797, NP856, NP877 및 NP1266) 유래 9량체의 수를 나타낸다. 모든 긴 HBV 펩티드가 4개 이상의 대립유전자에 결합하는 능력을 갖는 6개 이상의 에피토프를 함유한다. 6개의 긴 펩티드의 조합이 모든 시험 대립유전자에 결합하는 능력을 갖는 9량체 에피토프를 포함한다.
긴 펩티드 HLA-A*0201 HLA-A*0301 HLA-A*1101 HLA-A*2402 HLA-B*0702 HLA-B*0801 HLA-B*3501 HLA 결합자의 수 (a) 대립유전자의 수
(b)
NP113 2 3 5 3 2 3 2 20 7
NP797(K) 6 1 1 5 4 3 2 22 7
NP151 3 4 3 4 3 4 0 21 6
NP376 8 0 1 10 4 6 6 35 6
NP753(K) 3 0 1 3 1 1 1 10 6
NP1266(K) 6 3 3 9 0 1 2 24 6
NP277(K) 6 0 0 5 3 1 3 18 5
NP856(K) 4 0 0 4 2 1 0 11 4
NP877 2 0 0 2 1 1 0 6 4
표 6: 각 HLA 클라스 I 대립유전자에 있어서 결합 점수 >= 45%를 갖는 각 HBV 긴 펩티드 (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K), NP877 및 NP1266(K)) 유래 9량체의 수. (a)는 각 긴 펩티드에 있어서 검출된 결합 에피토프의 총 수를 나타내고 (b)는 각 긴 펩티드에 있어서 양성 결합이 검출된 대립유전자의 수를 나타낸다
실시예 10: 바람직한 HBV 펩티드 및 조합이 광범위한 HLA 클라스 II 분자에 결합하는 능력을 갖는 에피토프를 포함한다
방법
ProImmune REVEAL® MHC-펩티드 결합 분석을 이용하여 각 HBV 긴 펩티드 (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K), NP877 및 NP1266(K))의 하나 이상의 MHC 클라스 II 대립유전자에 결합하고 MHC-펩티드 복합체를 안정화시키는 능력을 결정하였다. 매우 빈번한 HLA 클라스 II 대립유전자 HLA-DR1 (α1*01:01; β1*01:01), HLA-DR15 (α1*01:01; β1*15:01), HLA-DR3 (α1*01:01; β1*01:01), HLA-DR4 (α1*01:01; β1*04:01), HLA-DR11 (α1*01:01; β1*11:01), HLA-DR13 (α1*01:01; β1*13:01) 및 HLA-DR7 (α1*01:01; β1*07:01)를 선택하였다. 각 펩티드에 대하여 알려진 T-세포 에피토프인 양성 대조군 펩티드 대비 점수를 제공하였다. 시험 펩티드의 점수를 정량적으로 양성 대조군 펩티드에 의해 생성된 신호의 퍼센트로 기록하고, 펩티드를 추정 합격 또는 불합격 결과를 갖는 것으로 나타낸다. 우수한 결합자가 ProImmune에 의해 정의된 양성 대조군 의 점수 >= 15%를 갖는 펩티드인 것으로 고려된다.
결과
표 7의 결과가 다양한 HLA 클라스 II 대립유전자에 대한 각 HBV 긴 펩티드 (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K), NP877 and NP1266(K))의 결합 점수를 나타낸다. 9개의 HBV 펩티드 중 6개가 점수 >= 15%를 갖는 하나 이상의 HLA 대립유전자에 결합한다. NP113, NP151 및 NP376이 3개를 초과하는 상이한 HLA 클라스 II 대립유전자에 결합한다. 놀랍게도, P113이 총 6개의 대립유전자에 결합한다. 펩티드 NP113 및 NP877의 조합이 시험된 모든 HLA 클라스 II 대립유전자에 결합한다.
긴 펩티드 HLA-DR1 (α1*01:01;
β1*01:01)		 HLA-DR15 (α1*01:01;
β1*15:01)		 HLA-DR3 (α1*01:01;
β1*01:01)		 HLA-DR4 (α1*01:01;
β1*04:01)		 HLA-DR11 (α1*01:01;
β1*11:01)		 HLA-DR13 (α1*01:01;
β1*13:01)		 HLA-DR7 (α1*01:01;
β1*07:01)		 대립유전자의 수
(a)
NP113 54.44 28.04 49.98 33.51 52.86 0.00 99.17 6
NP151 14.59 38.96 0.00 74.36 49.16 0.00 19.41 4
NP277(K) 0.49 0.18 0.10 36.19 1.25 0.00 0.01 1
NP376 27.71 6.29 0.00 53.66 31.38 0.00 8.83 3
NP753(K) 0.11 0.00 0.00 0.65 1.51 0.00 0.00 0
NP797(K) 0.20 1.14 0.00 6.65 2.86 0.00 0.01 0
NP856(K) 2.33 5.71 0.13 10.72 0.33 0.00 0.40 0
NP877 0.24 0.09 5.58 0.04 4.98 16.34 2.78 1
NP1266(K) 1.48 0.64 0.00 11.22 21.64 0.00 0.62 1
표 7: 다양한 HLA 클라스 II 분자에 대한 HBV 펩티드의 결합. 양성 결합이 점수 >=15%로 정의되었다. (a)는 각 긴 펩티드에 있어서 양성 결합이 검출된 대립유전자의 수를 나타낸다
SEQUENCE LISTING <110> IMMUNE TARGETING SYSTEMS (ITS) LTD <120> VACCINE <130> N118179A-WO <140> <141> <150> GB1223386.2 <151> 2012-12-24 <160> 222 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV CONSENSUS SEQUENCE <400> 1 Gln Gln Phe Val Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ile Met Pro Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Val Thr Lys Tyr Leu Pro 20 25 30 Leu Asp Lys Gly Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Val Val Asn His 35 40 45 Tyr Phe Gln Thr Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile 50 55 60 Leu Tyr Lys Arg Glu Thr Thr Arg Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro 65 70 75 80 Tyr Ser Trp Glu Gln Glu Leu Gln Ser Cys Trp Trp Leu Gln 85 90 <210> 2 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV CONSENSUS SEQUENCE <220> <221> MISC_FEATURE <222> (183)..(183) <223> C OR S <400> 2 Cys Thr Glu His Gly Glu His His Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro Ala 1 5 10 15 Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr 20 25 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Leu Glu Ala Tyr Phe Lys Asp Cys Val Phe Lys Asp Trp 1 5 10 15 Glu Glu Leu <210> 194 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV CONSENSUS SEQUENCE <400> 194 Tyr Phe Lys Asp Cys Val Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu 1 5 10 15 Ile Arg Leu <210> 195 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV CONSENSUS SEQUENCE <400> 195 Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu Ile Arg Leu Lys Val Phe 1 5 10 15 Val Leu <210> 196 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV CONSENSUS SEQUENCE <400> 196 Glu Leu Gly Glu Glu Ile Arg Leu Lys Val Phe Val Leu Gly Gly Cys 1 5 10 15 Arg His Lys Leu 20 <210> 197 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV CONSENSUS SEQUENCE <400> 197 Leu Lys Val Phe Val Leu Gly Gly Cys Arg His Lys Leu Val Cys Ser 1 5 10 15 Pro Ala Pro Cys 20 <210> 198 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV CONSENSUS SEQUENCE <400> 198 Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln 1 5 10 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Claims (36)

  1. 서열번호 1 내지 4에 나타낸 서열 중 하나 또는 서열번호 1 내지 4에 나타낸 서열 중 하나와 80% 이상의 동일성을 갖는 서열의 15개 이상의 연속(contiguous) 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 15개 내지 60개 아미노산 길이의 2 이상의 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물로서, 각 펩티드가 하나 이상의 CD8+ T-세포 에피토프 및/또는 하나 이상의 CD4+ T-세포 에피토프를 포함하고, 각 펩티드가 인 비트로 분석에서 하나 이상의 만성적으로 감염된 HBV 개체로부터의 말초혈단핵세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC)에서 반응을 유발하는 것인 약제학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 펩티드가 서열번호 1 내지 4에 나타낸 서열 중 하나의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 것인 조성물.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 서열번호 1 내지 3에 나타낸 서열 중 하나의 15개 이상의 아미노산을 포함하는 하나 이상의 펩티드 및 서열번호 4에 나타낸 서열 중 15개 이상의 아미노산을 포함하는 하나 이상의 펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 상기 펩티드가 서열번호 24 내지 33 중 하나에 나타낸 서열, 또는 서열번호 24 내지 33에 나타낸 서열 중 하나와 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조성물.
  5. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 펩티드가 N-말단 및/또는 C-말단에 하나 이상의 추가적인 아미노산을 더 포함하여 그의 순(net) 양전하를 증가시키고 및/또는 상기 펩티드의 소수성을 감소시킨 것인 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 서열번호 34 내지 38 중 하나에 나타낸 서열을 포함하는 펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  7. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 상이한 인종(ethnicity) 중 2 이상의 개체 및 상이한 HBV 유전형에 의해 감염된 2 개체로부터의 PBMC에서 면역 반응을 유발할 수 있는 것인 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 조성물이 하기 중 2 개체, 3 개체, 또는 전부로부터의 PMBC에서 면역 반응을 유발할 수 있는 것인 조성물: HBV 유전형 A에 의해 감염된 개체, HBV 유전형 B에 의해 감염된 개체, HBV 유전형 C에 의해 감염된 개체 및 HBV 유전형 D에 의해 감염된 개체.
  9. 청구항 8에 있어서, 하기 군 중 2 이상으로부터 선택되는 하나 이상의 펩티드를 포함하는 것인 조성물:
    (i) 서열번호 14, 15, 20, 21, 67, 22 또는 23의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드;
    (ii) 서열번호 14, 17, 18, 21 또는 67의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드;
    (iii) 서열번호 14, 16, 60, 19, 20 또는 22의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드; 및
    (iv) 서열번호 14, 20, 21, 67, 22 또는 23의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드.
  10. 청구항 7 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 하기 중 2 개체, 3 개체, 또는 전부로부터의 PMBC에서 면역 반응을 유발할 수 있는 것인 조성물: HBV에 의해 감염된 동양인(Oriental) 또는 인도인(Indian) 개체, HBV에 의해 감염된 코카시안(Caucasian) 개체 및 HBV에 의해 감염된 아프리카인(Afirican) 또는 아랍인(Arabic) 개체.
  11. 청구항 10에 있어서, 하기 군 중 2 이상으로부터 선택되는 하나 이상의 펩티드를 포함하는 것인 조성물:
    (i) 서열번호 14, 16, 60, 17, 18, 20, 21, 67 또는 22의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드;
    (ii) 서열번호 14, 15, 19, 20, 22 또는 23의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드; 및
    (iii) 서열번호 14, 15, 20, 21, 67, 22 또는 23의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드.
  12. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1에 나타낸 서열의 15개 이상의 연속 아미노산의 단편을 포함하는 15개 내지 60개 아미노산 길이의 하나 이상의 펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 서열번호 5, 6, 14 또는 15에 나타낸 서열의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  14. 청구항 12 또는 13에 있어서, 서열번호 80, 81, 82, 83, 86, 87, 88 또는 89 중 하나에 나타낸 서열을 포함하는 펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  15. 청구항 12 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 24 또는 25에 나타낸 서열을 포함하는 펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  16. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 내지 10개의 상기 펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  17. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 24, 25, 27, 28, 33, 34, 35, 36, 37 및 38에 나타낸 서열을 포함하는 10개의 펩티드 중 2개 이상을 포함하는 것인 조성물.
  18. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 55에 나타낸 서열의 15개 이상의 연속 아미노산 서열 또는 서열번호 55에 나타낸 서열의 15개 이상의 연속 아미노산과 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 15개 내지 60개 아미노산 길이의 하나 이상의 펩티드를 더 포함하고, 상기 펩티드가 하나 이상의 CD8+ T-세포 에피토프 및/또는 하나 이상의 CD4+ T-세포 에피토프를 포함하고, 인 비트로 분석에서 하나 이상의 만성적으로 감염된 HBV 개체로부터의 말초혈단핵세포(PBMC)에서 반응을 유발하는 것인 조성물.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 펩티드가 서열번호 221 또는 서열번호 222에 나타낸 서열을 포함하는 것인 조성물.
  20. 청구항 19에 있어서, 서열번호 24, 25, 28, 33, 34, 36, 37, 38 및 222에 나타낸 서열을 포함하는 펩티드를 포함하는 것인 조성물.
  21. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 플루오로카본 벡터(fluorocarbon vector)에 연결된 것인 조성물.
  22. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, HBc, HBe, 또는 HBs 항원을 더 포함하는 것인 조성물.
  23. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제(adjuvant)를 더 포함하는 것인 조성물.
  24. 선행하는 청구항 중 어느 한 항에 있어서, HBV 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것인 조성물.
  25. 청구항 21에 있어서, HBeAg-음성 환자의 치료에 사용하기 위한 것인 조성물.
  26. 청구항 21에 있어서, HBeAg-양성 환자의 치료에 사용하기 위한 것인 조성물.
  27. 청구항 21 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 하기와 함께 청구항 20 내지 22 중 어느 한 항에 따라 사용하기 위한 것인 조성물: (i) 인터페론-알파 및/또는 뉴클레오시드/뉴클레오티드 유사체 (NUC); 및/또는 (ii) 항-PD1 블로킹 항체, 항-PD1L 블로킹 항체, 항-LAG3 블로킹 항체, 항-TIM3 블로킹 항체, 항-CTLA4 블로킹 항체 및/또는 시클로포스파미드.
  28. 청구항 21 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 HBsAg 소실 또는 HBsAg 혈청전환(seroconversion)을 야기하는 것인 조성물.
  29. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 말기 간 질환 또는 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것인 조성물.
  30. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, D형 간염 바이러스(hepatitis D virus: HDV) 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것인 조성물.
  31. 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나에 나타낸 서열 또는 서열번호 1 내지 4에 나타낸 서열 중 하나와 80% 이상 동일성을 갖는 서열의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 15개 내지 60개 아미노산 길이의 펩티드로서, 상기 펩티드가 하나 이상의 CD8+ T-세포 에피토프 및/또는 하나 이상의 CD4+ T-세포 에피토프를 포함하고, 인 비트로 분석에서 하나 이상의 만성적으로 감염된 HBV 개체로부터의 말초혈단핵세포(PBMC)에서 반응을 유발할 수 있는 것인 펩티드.
  32. 청구항 28에 있어서, 서열번호 5, 6, 14 또는 15에 나타낸 서열의 15개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 것인 펩티드.
  33. 서열번호 24 내지 38에 나타낸 서열 중 하나 또는 서열번호 24 내지 38에 나타낸 서열 중 하나와 80% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 펩티드.
  34. 플루오로카본 벡터에 공유적으로 연결된, 청구항 28 내지 30 중 어느 한 항에 따른 펩티드.
  35. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 따른 조성물의 치료학적 유효량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, HBV 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
  36. HBV의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서, 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
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