JP2004508320A - ペプチドおよび核酸組成物を用いるb型肝炎ウイルスに対する細胞性免疫応答の誘導 - Google Patents
ペプチドおよび核酸組成物を用いるb型肝炎ウイルスに対する細胞性免疫応答の誘導 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、HBVに対して指向されるエピトープベースのワクチンを開発するために、抗原がT細胞によって認識される機構についての本発明者らの知識を使用する。より詳細には、本出願は、薬学的組成物、ならびにHBV感染の予防および処置における使用の方法についての本発明者らの発見を伝達する。
Description
【0001】
(連邦政府によって援助された研究および開発)
本発明は、一部、国立衛生研究所の助成の下で米国政府によって資金援助された。米国政府は、本発明の特定の権利を有する。
【0002】
(索引)
I. 発明の背景
II. 発明の概要
III.図面の簡単な説明
IV. 発明の詳細な説明
A.定義
B.HBVに対するCTL応答およびHTL応答の刺激
C.HLA分子に対するペプチドエピトープの結合親和性
D.ペプチドエピトープ結合モチーフおよびスーパーモチーフ
1.HLA−A1スーパーモチーフ
2.HLA−A2スーパーモチーフ
3.HLA−A3スーパーモチーフ
4.HLA−A24スーパーモチーフ
5.HLA−B7スーパーモチーフ
6.HLA−B27スーパーモチーフ
7.HLA−B44スーパーモチーフ
8.HLA−B58スーパーモチーフ
9.HLA−B62スーパーモチーフ
10.HLA−A1モチーフ
11.HLA−A2.1モチーフ
12.HLA−A3モチーフ
13.HLA−A11モチーフ
14.HLA−A24モチーフ
15.HLA−DR−1−4−7スーパーモチーフ
16.HLA−DR3モチーフ
E.ワクチンの増大する集団適用範囲
F.免疫応答刺激ペプチドアナログ
G.スーパーモチーフまたはモチーフを含有するエピトープについての、疾患関連抗原由来のタンパク質配列のコンピュータスクリーニング
H.ペプチドエピトープの調製
I.T細胞応答を検出するためのアッセイ
J.免疫応答を評価するためのペプチドエピトープの使用
K.ワクチン組成物
1.ミニ遺伝子ワクチン
2.CTLペプチドとヘルパーペプチドとの組合わせ
L.治療目的または予防目的のためのワクチンの投与
M.キット
V. 実施例
VI. 特許請求の範囲
VII.要約
【0003】
(I.発明の背景)
B型肝炎ウイルス(HBV)による慢性的感染は、世界人口の少なくとも5%が罹患し、肝炎および肝細胞癌の主要な原因である(Hoofnagle,J.、N.Engl.J.Med.323:337、1990;Fields,B.およびKnipe,D.、In:Fields Virology 2:2137、1990)。世界保健機構は、B型肝炎を、慢性肺疾患に迫る、AIDSより広まっている世界的な主たる死因に挙げている。慢性HBV感染は無症状のキャリアー段階から継続的な肝細胞壊死および炎症に及び、肝細胞癌につながり得る。
【0004】
HBVに対する免疫応答は、B型肝炎感染を抑制する上で重要な役割を果たしていると信じられている。ヌクレオカプシドコア、ポリメラーゼおよび表面抗原を含むHBVの様々な領域に対する体液性および細胞性応答が同定されてきた。T細胞仲介免疫、特にクラスIヒト白血球抗原(HLA)拘束(restricted)細胞傷害性Tリンパ球(CTL)は、確立したHBV感染と戦うのに不可欠だと信じられている。
【0005】
クラスIヒト白血球抗原(HLA)分子は、ほとんど全ての有核細胞の表面上で発現する。CTLは、クラスIHLA分子との複合体の形態で、様々な抗体の細胞内プロセシングに由来するペプチド断片を認識する。次いでこの認識は、直接的にHLA−ペプチド複合体を有する細胞の破壊またはウイルス複製を阻害する非破壊的機構(例えば、インターフェロンの産生)の活性化をもたらす。
【0006】
いくつかの研究は、自己制限的急性肝炎と多特異的なCTL応答との関連を強調している(Penna,A.ら、J.Exp.Med.174:1565、1991;Nayersina,R.ら、J.Immunol.150:4659、1993)。慢性HBV感染の自発的およびインターフェロン関与除去U(clearance)も活発なCTL応答の復帰と関連している(Guidotti,L.G.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3764、1994)。こうしたケースのすべてでCTL応答はポリクローナルであり、HBVエンベロープ、コアおよびポリメラーゼ抗原を含む多数のウイルスタンパク質に特異的である。対照的に、慢性肝炎患者では、通常、CTL活性は存在しないか弱く抗原的に制限されている。
【0007】
HBV感染の軽減におけるCTLの決定的役割は、HBVトランスジェニックマウスを用いた研究によってさらに明確にされてきた。HBVゲノムについてトランジェニックなマウスへのHBV−特異的CTLの養子免疫伝達はウイルス複製の抑制をもたらした。この効果は主として、非溶解性でリンホカインベースのメカニズムによって仲介された(Guidotti,L.G.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3764、1994;Guidotti,L.G.、Guilhot,S.およびChisari,F.V.、J.Virol.68:1265、1994;Guidotti,L.G.ら、J.Virol.69:6158、1995;Gilles,P.N.、Fey,G.およびChisari,F.V.、J.Virol.66:3955、1992)。
【0008】
HLAクラスI拘束応答の場合と同様に、HLAクラスII拘束T細胞応答は、通常、急性肝炎患者で検出され、慢性肝炎患者では存在しないか弱い(Chisari,F.V.およびFerrari,C.、Annu.Rev.Immunol.13:29、1995)。HLAクラスII応答は、ヘルパーT細胞(HTL)の活性化と結びついている。ヘルパーTリンパ球は、クラスIIHLA分子を認識し、ウイルス増殖を抑えるサイトカイン分泌を通じて直接にHBV感染の除去に寄与する(Franco,A.ら、J.Immunol.159:2001、1997)。しかし。疾病解決におけるその主要な役割は、ウイルス特異的CTLおよびB細胞の活性化および拡大の誘導によって仲介されていると信じられている。
【0009】
HBV感染で観察される異種免疫応答を考慮すると、複数のエピトープに対して同時に指向される多特異的な細胞性免疫応答の誘導が、HBVに対する有効なワクチンの開発のために重要であると思われる。しかし、HBV感染を除去する患者に見られる応答に対応する免疫応答を誘発する、ワクチンの実施形態を確立する必要性が存在する。エピトープベースなワクチンが有用と思われる。
【0010】
適切な技術の開発の際に、エピトープベースワクチンの使用は、現在のワクチンを超えたいくつかの利点を有する。このようなエピトープベースワクチンに含まれるためのエピトープは、ウイルスまたは腫瘍関連抗原の保存領域から選択されるべきで、これによって逸脱変異体(escape mutant)の可能性が減少する。抗原全体の使用に対するエピトープベースアプローチの利点は、抗原全体に対する免疫応答が抗原の可変領域に対して大きく向けられ、変異に起因する免疫の逸脱を可能にするという証拠が存在することである。さらに、抗原全体に存在し得る免疫抑制性エピトープは、エピトープベースワクチンの使用で回避され得る。
【0011】
さらに、エピトープベースワクチンのアプローチでは、選択されるエピトープ(CTLおよびHTL)を組み合わせる能力、さらに、エピトープの組成を改変する能力があり、例えば免疫原性を増大させる。従って、免疫応答は、必要に応じて、標的疾患のために調節され得る。従来のアプローチでは、同様の応答操作は可能ではない。
【0012】
エピトープベースの免疫刺激ワクチンの別の主要な利点は、その安全性にある。感染因子またはタンパク質抗原全体(これは、それ自身の固有の生物学的活性を有し得る)によって生じる起こり得る病理学的な副作用が排除される。
【0013】
エピトープベースワクチンはまた、同じ病原由来の複数の選択された抗原に対する免疫応答を指向し、そしてこれに焦点を合わせる能力を提供する。従って、特定の病原に対する免疫応答における患者間の可変性は、ワクチン組成物中の病原から、複数の抗原由来のエピトープを包含することによって軽減され得る。「病原」は、感染因子または腫瘍関連分子であり得る。
【0014】
しかし、広範に有効なエピトープベースの免疫療法の開発の最も手強い障壁の1つは、HLA分子の極度の多型性である。現在まで、有効で遺伝的に偏りのない集団をカバーすることは、非常に複雑な課題であった;そのような適用範囲には、各個々のHLA対立遺伝子と対応するHLA分子に特異的であるエピトープが使用されることが必要であり、その結果、人種的に多様な集団をカバーするために実施不可能なほど多数のエピトープが使用されなければならない。従って、エピトープベースワクチンの使用のために複数のHLA抗原分子によって結合されるペプチドエピトープの開発の必要性が存在する。多数のHLA抗原分子が結合すればするほど、ワクチンによる集団のカバー範囲の幅が大きくなる。
【0015】
さらに、本明細書中でより詳細に記載するように、例えば複数のHLA抗原に結合し得るペプチドが免疫応答を刺激する親和性でそのような結合をするように、ペプチド結合特性を調節する必要性が存在する。免疫原性と相関する親和性で2つ以上のHLA対立遺伝子によって拘束されたエピトープの同定は、十分な集団のカバー範囲を提供するために、かつ、多様な集団セグメントにおいて自己制限的急性肝炎において見られる自然免疫応答または慢性HBV感染の自発的除去の自然免疫応答を誘発する十分な効力の応答の誘発刺激を可能にするために重要である。このような応答はまた、エピトープの広範な配列を標的にすることができる。本明細書中に開示される技術は、このような好ましい免疫応答について提供される。
【0016】
この節において提供される情報は、本出願の出願日における当該技術分野の現在理解されている水準を開示することが意図される。本出願の優先日の後に生じた情報がこの節に含まれる。従って、この節の背景は、いずれにしても本発明の優先日を画することを意図していない。
【0017】
(II.発明の概要)
本発明は、例えば、HBVに対して指向されるエピトープベースワクチンを開発するために、抗原がT細胞に認識される機構についての本発明者らの知識を適用する。より詳細には、本出願は、特定のエピトープ薬学的組成物ならびにHBV感染の防止および処置における使用方法についての本発明者らの発見を伝達する。
【0018】
適切な技術の開発の際に、エピトープベースワクチンの使用は、特にワクチン組成物中の抗原全体の使用と比較した場合に、現在のワクチンよりいくつかの利点を有する。抗原全体に対する免疫応答は、抗原の可変領域に対して大きく向けられ、変異に起因する免疫の逸脱を可能にする、という証拠が存在する。エピトープベースワクチンに含ませるためのエピトープは、ウイルスまたは腫瘍関連抗原の保存領域から選択され、これによって逸脱変異体の可能性が減少する。さらに、抗原全体に存在し得る免疫抑制性エピトープは、エピトープベースワクチンの使用で回避され得る。
【0019】
エピトープベースワクチンアプローチのさらなる利点は、選択されるエピトープ(CTLおよびHTL)を組合わせる能力、さらに、エピトープの組成を変える能力であり、例えば増大した免疫原性を増大させる。従って、免疫応答は、必要に応じて、標的疾患のために調節され得る。従来のアプローチでは、同様の応答操作は可能ではない。
【0020】
エピトープベースの免疫刺激ワクチンの別の主要な利点は、その安全性にある。それ自身の固有の生物学的活性を有し得る感染因子またはタンパク質抗原全体によって生じる、起こり得る病理学的な副作用が排除される。
【0021】
エピトープベースワクチンはまた、同じ病原由来の複数の選択された抗原に対する免疫応答に向けられ、そしてこれに焦点を合わせる能力を提供する。従って、特定の病原に対する免疫応答における患者間の可変性は、ワクチン組成物中の病原由来の複数の抗原由来のエピトープを包含することによって軽減され得る。「病原」は、感染因子または腫瘍関連分子であり得る。
【0022】
しかし、広範に有効なエピトープベースの免疫療法の開発の最も手強い障壁の1つは、HLA分子の極度の多型性である。現在まで、有効で遺伝的に偏りのない集団をカバーすることは、非常に複雑な課題であった;そのようなカバーには、各個々のHLA対立遺伝子と対応するHLA分子に特異的であるエピトープが使用されることを必要となり、その結果、人種的に多様な集団をカバーするために実施不可能なほど多数のエピトープが使用されなければならない。従って、エピトープベースワクチンの使用のために複数のHLA抗原分子によって結合されるペプチドエピトープの必要性が存在する。多数のHLA抗原分子が結合すればするほど、ワクチンによる集団のカバー範囲の幅が大きくなる。
【0023】
さらに、本明細書中でより詳細に記載するように、例えば複数のHLA抗原に結合し得るペプチドが免疫応答を刺激する親和性でそのような結合をするように、ペプチド結合特性を調節する必要性が存在する。免疫原性と相関する親和性で1つ以上のHLA対立遺伝子によって拘束されるエピトープの同定は、十分な集団のカバー範囲を提供するために、かつ、多様な集団セグメントにおける感染を防止または清澄するために十分な効力の応答の誘発を可能にするために重要である。このような応答はまた、エピトープの広範な配列を標的にすることができる。本明細書中に開示される技術は、このような好ましい免疫応答について提供される。
【0024】
好ましい実施形態において、本発明のワクチン組成物に包含するためのエピトープは、モチーフまたはスーパーモチーフを有するエピトープの存在について既知の抗原のタンパク質配列を評価するプロセスによって選択される。次いで、モチーフまたはスーパーモチーフを有するエピトープに対応するペプチドは合成され、選択されるモチーフを認識するHLA分子に結合する能力について試験する。中程度または高い親和性、すなわち、HLAクラスI分子について500nM以下、あるいはHLAクラスII分子について1000nM以下のIC50(またはKD値)、で結合するこれらのペプチドは、CTLまたはHTL応答を誘導する能力についてさらに評価される。免疫原性ペプチドは、ワクチン組成物に包含するために選択される。
【0025】
スーパーモチーフを有するペプチドは、HLAスーパータイプファミリー内の複数の対立遺伝子に結合する能力についてさらに試験され得る。さらに、ペプチドエピトープは、結合親和性および/またはHLAスーパータイプ内の複数の対立遺伝子に結合する能力を改変するためにアナログ化(analogued)され得る。
【0026】
本発明はまた、既知のHLA型を有する患者におけるHBVワクチンの免疫原活性をモニタリングするための方法を含む実施形態を含み、この方法は、患者由来のTリンパ球サンプルを、この患者に存在する少なくとも1つのHLA対立遺伝子の産物に結合する表VI〜表XXまたは表XXIIに記載されるアミノ酸配列からなるHBVエピトープを本質的に含むペプチド組成物と共にインキュベートする工程と、このペプチドに結合するTリンパ球の存在を検出する工程とを包含する。好適な実施形態では、ペプチドは、テトラマー複合体を含み得る。
【0027】
本発明のペプチドを定義するための代替的様式は、特定の対立遺伝子特異的HLA分子または対立遺伝子特異的HLA分子群への結合と相関する、長さ、一次構造、取り得る二次構造および/または三次構造、または荷電などの物理的性質を列挙することである。ペプチドを定義するためのさらなる様式は、HLA結合ポケットの物理的特性、またはいくつかの対立遺伝子特異的HLA結合ポケットによって共有される特性(例えば、ポケットの配置および電荷分布)を列挙すること、ならびにペプチドがこれらのポケットに一致および結合することを説明することである。
【0028】
以下の議論から明らかなように、他の方法および実施形態も意図される。さらに、本明細書中に記載されるいずれかの方法によって生成される新規な合成ペプチドも本発明の一部である。
【0029】
(IV.発明の詳細な説明)
本発明のペプチドおよび対応する核酸組成物は、CTLまたはHTLいずれかの応答の生成を刺激することによって、HBVに対する免疫応答を刺激するために有用である。ネイティブなHBVアミノ酸配列から直接的または間接的に誘導されるペプチドは、HLA分子に結合し得、HBVに対する免疫応答を刺激し得る。HBVおよびその改変体由来の完全なポリタンパク質配列は、Genbankから得られ得る。ペプチドはまた、以下に提供される開示から明らかであるように、これまで未知のHBVの改変体についてその後に発見され得る配列情報から容易に決定され得る。
【0030】
本発明のペプチドは、以下に議論されるように多くの方法において同定されてきた。さらに、改変された免疫原性を示すペプチドアナログを作製するために特定のアミノ酸残基を改変することによって、アナログペプチドが誘導され、HLA分子についての結合活性が調節されてきた。さらに、本発明は、多数のHLA抗原と相互作用することができるエピトープベースワクチンがこれまでのワクチンより集団の広いカバーを提供することを可能にする、組成物および組成物の組合せを提供する。
【0031】
IV.A.定義
本発明は、アルファベット順に列挙された以下の定義を参照することにより効果的に理解されすることができる。
【0032】
「コンピュータ」または「コンピュータシステム」は、一般に以下を含む:プロセッサ;少なくとも1つの情報格納/検索装置(例えば、ハードドライブ、ディスクドライブまたはテープドライブなど);少なくとも1つの入力装置(例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーンまたはマイクロフォンなど);およびディスプレイ構造。さらに、コンピュータは、ネットワークとつながった通信路を含んでもよい。このようなコンピュータは、上記のものより多いものまたは少ないものを含み得る。
【0033】
本明細書において「構築物(construct)」は、一般に天然に存在しない組成物を指す。構築物は合成技術、例えば、組換えDNA調製および発現、または核酸もしくはアミノ酸の化学合成技術によって合成することができる。構築物はまた、一方の材料を別の材料に添加または関係させてその形態では天然に存在しない結果とすることによっても合成できる。
【0034】
「交差反応性結合」は、ペプチドが2つ以上のHLA分子により結合されることを示す;類義語は、変性結合(degenerate binding)である。
【0035】
「潜在エピトープ(cryptic epitope)」は、単離されたペプチドで免疫されることにより応答を誘発するが、該応答は、エピトープを含む無傷のタンパク質全体が抗原として使用される場合にはインビトロで交差反応性でない。
【0036】
「優性エピトープ」は、ネイティブな抗原全体で免疫する際に免疫応答を誘導するエピトープである(例えば、Sercarzら、Annu.Rev.Immunol.11:729−766、1993を参照のこと)。このような応答は、単離されたペプチドエピトープとインビトロで交差反応性である。
【0037】
特定のアミノ酸配列に関して、「エピトープ」は、特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、またはT細胞のコンテクストにおいて、T細胞レセプター(TCR)タンパク質および/または主要組織適合遺伝子複合体(MHC)レセプターによる認識に必要なアミノ酸残基のセットである。インビボまたはインビトロでの免疫系環境において、エピトープは、免疫グロブリン、TCRまたはHLA分子により認識される部位をともに形成する分子の集合的な特徴(一次ペプチド構造、二次ペプチド構造および三次ペプチド構造、ならびに電荷など)である。この開示を通して、エピトープおよびペプチドは、しばしば交換可能に用いられる。
【0038】
本発明のエピトープおよび追加のアミノ酸を含むタンパク質またはペプチド分子は、なお本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。ある実施形態において、本発明のペプチドの長さに対しては制限がある(さもなければ、構築物ではない)。長さが制限された実施形態は、本発明のエピトープを含むタンパク質/ペプチドがネイティブな配列と100%同一性を有する領域(すなわち、連続した一続きのアミノ酸)を含む場合に起こる。例えば天然分子全体に対し、解釈(reading)からエピトープの定義を避けるために、ネイティブなペプチド配列と100%同一性を有する任意の領域の長さに対して制限がある。従って、本発明のエピトープを含むペプチドおよびネイティブなペプチド配列と100%同一性を有する領域(さもなければ、構築物ではない)について、ネイティブな配列に対して100%同一性を有する領域は、一般に以下の長さを有する:600アミノ酸以下、しばしば500アミノ酸以下、しばしば400アミノ酸以下、しばしば250アミノ酸以下、しばしば100アミノ酸以下、しばしば85アミノ酸以下、しばしば75アミノ酸以下、しばしば65アミノ酸以下、およびしばしば50アミノ酸以下。ある実施形態において、本発明の「エピトープ」は、5アミノ酸に至るまでの任意の増分(49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5)において、ネイティブなペプチド配列に対して100%同一性を有する51アミノ酸未満の領域を有するペプチドにより含まれる。
【0039】
従って、600アミノ酸より長いペプチドまたはタンパク質配列は、それらがネイティブなペプチド配列と100%同一性を有する600個のアミノ酸を超える任意の連続する配列を含まない(さもなければ、構築物ではない)限り、本発明の範囲内にある。ネイティブな配列に対応する5つ以下の連続する残基を有する任意のペプチドについては、本発明の範囲内に入れるために、そのペプチドの最大長さに対する制限はない。CTLエピトープが、8アミノ酸残基に至るまでの任意の増分において600残基長未満であることは現在好ましい。
【0040】
「ヒト白血球抗原」または「HLA」は、ヒトクラスIまたはクラスII主要組織適合遺伝子複合体(MHC)タンパク質である(Stitesら、IMMUNOLOGY、第8版、Lange Publishing、Los Altos、CA(1994)を参照のこと)。
【0041】
「HLAスーパータイプまたはファミリー」は、本明細書中で使用される場合、共有のペプチド結合特異性に基づいて分類されるHLA分子のセットを記載する。特定のアミノ酸モチーフを有するペプチドに対して幾分類似した結合親和性を共有するHLAクラスI分子は、HLAスーパータイプに分類される。HLAスーパーファミリー、HLAスーパータイプファミリー、およびHLAxx様スーパータイプ分子(ここで、xxは、特定のHLA型を示す)という用語は、類義語である。
【0042】
本開示全体を通して、結果は「IC50」によって表される。IC50は、参照ペプチドの結合の50%阻害が観察される、結合アッセイにおけるペプチド濃度である。このアッセイが行われる条件(すなわち、制限されたHLAタンパク質および標識ペプチド濃度)が与えられると、これらの値は、KD値に近似する。結合を決定するためのアッセイは、以下に詳細に記載される(例えば、PCT公開WO94/20127およびWO94/03205)。IC50値は、アッセイ条件が変化する場合、しばしば劇的に変化し得、使用される特定の試薬(例えば、HLAの調製物など)に依存することは注意すべきである。例えば、過剰な濃度のHLA分子は、所与のリガンドの見かけの測定されたIC50を増大させる。
【0043】
あるいは、結合は、参照ペプチドに対して表される。特定のアッセイがより感度が高くなるか、またはより感度が低くなる場合、試験されたペプチドのIC50はいくらか変化し得るが、参照ペプチドに対する結合は、有意には変化しない。例えば、参照ペプチドのIC50が10倍増大する条件下でのアッセイ実施では、試験ペプチドのIC50値も約10倍シフトする。従って、曖昧さを回避するために、ペプチドが良好な、中程度の、弱い、またはネガティブなバインダーである否かの評価は、一般に、標準的なペプチドのIC50に対するそのIC50に基づく。
【0044】
結合はまた、他のアッセイ系を用いて決定され得る。これらのアッセイ系としては、以下を用いるものが挙げられる:生細胞(例えば、Ceppelliniら、Nature 339:392、1989;Christnickら、Nature 352:67、1991;Buschら、Immunol.2:443、19990;Hillら、J.Immunol.147:189、1991;del Guercioら、J.Immunol.154:685、1995)、界面活性剤溶解物を用いる無細胞系(例えば、Cerundoloら、J.Immunol.21:2069、1991)、固定化された精製MHC(例えば、Hillら、J.Immunol.152、2890、1994;Marshallら、J.Immunol.152:4946、1994)、ELISA系(例えば、Reayら、EMBO J.11:2829、1992)、表面プラズモン共鳴(例えば、Khilkoら、J.Biol.Chem.268:15425、1993);高フラックス可溶性相アッセイ(Hammerら、J.Exp.Med.180:2353、1994)、およびクラスI MHC安定化またはアセンブリの測定(例えば、Ljunggrenら、Nature 346:476、1990;Schumacherら、Cell 62:563、1990;Townsendら、Cell 62:285、1990;Parkerら、J.Immunol.149:1896、1992)。
【0045】
本明細書中で使用される、HLAクラスI分子に関する「高親和性」は、50nM以下のIC50またはKD値を有する結合として規定される;「中程度の親和性」は、約50nMと約500nMとの間のIC50またはKD値を有する結合である。HLAクラスII分子に対する結合に関する「高親和性」は、100nM以下のIC50またはKD値を有する結合として規定される;「中程度の親和性」は、約100nMと約1000nMとの間のIC50またはKD値を有する結合である。
【0046】
2つ以上のペプチド配列のコンテクストにおける「同一性の」またはパーセント「同一性」という用語は、配列比較アルゴリズムを用いてまたは手動アラインメントおよび目視により測定される比較ウィンドウでの最大の対応について比較及びアラインしたとき、同じ2つ以上の配列または部分配列あるいは同じアミノ酸残基を特定の割合有する2つ以上の配列または部分配列をいう。
【0047】
「免疫原性ペプチド」または「ペプチドエピトープ」は、ペプチドがHLA分子に結合し、CTLおよび/またはHTL応答を誘導するような、対立遺伝子特異的モチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドである。従って、本発明の免疫原性ペプチドは適切なHLA分子に結合することができ、その後に免疫原性ペプチドが由来する抗原に対する細胞傷害性T細胞の応答またはヘルパーT細胞の応答を誘導することができる。
【0048】
「単離された」または「生物学的に純粋な」という句は、通常は、物質がそのネイティブな形態で見出される場合に、この物質に付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質をいう。従って、本発明に従って単離されたペプチドは、好ましくは、それらのインサイチュ環境において、ペプチドと通常関連する物質を含まない。
【0049】
「連結する」または「結合する」とは、当業界で知られているペプチドを機能的に連結する任意の方法をいい、組換え融合、共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合および静電的結合を含むが、これらに限定されない。
【0050】
「主要組織適合遺伝子複合体」または「MHC」は、生理学的免疫応答を担う細胞相互作用の制御において役割を果たす一群の遺伝子である。ヒトにおいて、MHC複合体はHLA複合体としても公知である。MHC複合体およびHLA複合体の詳細な記載については、Paul、FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY、第3版、Raven Press、New York、1993を参照のこと。
【0051】
用語「モチーフ」とは、特定のHLA分子により認識される規定の長さのペプチド、通常は、クラスI HLAモチーフについては約8〜約13アミノ酸のペプチドおよびクラスII HLAモチーフについては約6〜約25アミノ酸のペプチドにおける残基のパターンをいう。ペプチドモチーフは、通常、各ヒトHLA対立遺伝子によりコードされる各タンパク質に対して異なり、一次および二次アンカー残基のパターンが異なる。
【0052】
「ネガティブ結合残基」または「有害残基(deleterious residue)」は、ペプチドエピトープのある位置(通常、一次アンカー位置ではない)に存在する場合にペプチドの該ペプチドの対応するHLA分子に対する結合親和性の減少を生じさせるアミノ酸である。「有害残基」でない残基はすべて「非有害残基」である。
【0053】
「非ネイティブ」配列または「構築物」とは、天然において見出されない、すなわち、「天然に存在しない」配列をいう。このような配列としては、例えば、脂質化ペプチドそうでなければ改変されたペプチド、およびネイティブなタンパク質配列において連続していないエピトープを含むポリエピトープ組成物が挙げられる。
【0054】
用語「ペプチド」は、本明細書中で「オリゴペプチド」と互換的に使用され、通常、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって互いに連結された一連の残基(通常、L−アミノ酸)を意味する。実施形態によっては、本発明の好ましいCTL誘導オリゴペプチドは、長さが13残基以下であり、通常、約8残基と約11残基との間で構成され、好ましくは9または10残基である。実施形態によっては、好ましいHTL誘導オリゴペプチドは、長さが約50残基未満であり、通常、約6残基と約30残基との間で構成され、より通常は、約12残基と約25残基との間で構成され、しばしば、約15残基と約20残基との間で構成される。
【0055】
「薬学的に許容可能な」とは、一般に、非毒性の、不活性かつ/または生理学的適合性の組成物をいう。
【0056】
「一次アンカー残基」は、免疫原性ペプチドとHLA分子との間の接触点を提供すると理解されているペプチド配列に沿った特定の位置でのアミノ酸である。規定された長さのペプチド内の1〜3つ(通常、2つ)の一次アンカー残基は、一般に、免疫原性ペプチドについて「モチーフ」を規定する。これらの残基は、HLA分子のペプチド結合溝と最近接で適合し、その側鎖は、結合溝自体の特定のポケットに埋め込まれていることが理解される。1つの実施形態において、一次アンカー残基は、本発明の9残基のペプチドの二位(アミノ末端位置から)およびカルボキシ末端位置に位置する。各モチーフおよびスーパーモチーフの一次アンカー位置は、表1に示される。例えば、アナログペプチドは、これらの一次アンカー位置における特定の残基の存在または非存在を変更することによって作製され得る。そのようなアナログは、特定のモチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を細かく調節するために使用される。
【0057】
「不規則な認識(promiscuous recognition)」は、異なるペプチドが多数のHLA分子のコンテクストにおいて同じT細胞クローンにより認識されることである。不規則な結合は、交差反応性結合と類語である。
【0058】
「防御免疫応答」または「治療免疫応答」とは、感染因子または腫瘍抗原由来の抗原に対するCTLおよび/またはHTL応答をいう。この応答は、疾患症状または進行を予防するか、または少なくとも部分的に停止する。この免疫応答はまた、ヘルパーT細胞の刺激により促進される抗体応答を含み得る。
【0059】
用語「残基」とは、アミド結合またはアミド結合ミメティックによってオリゴペプチド中に取りこまれているアミノ酸またはアミノ酸ミメティックをいう。
【0060】
「二次アンカー残基」は、ペプチド結合に影響し得る、ペプチド中の一次アンカーの位置以外の位置のアミノ酸である。二次アンカー残基は、1つの位置におけるアミノ酸のランダムな分布によって予測されるよりも、結合ペプチドの中で有意に高い頻度で生じる。この二次アンカー残基は、「二次アンカー位置」で生じるといわれる。二次アンカー残基は、高い親和性結合ペプチドの中で高い頻度で存在する残基と同定され得るか、あるいは高い親和性結合で会合する他の残基と同定され得る。例えば、アナログペプチドは、これらの二次アンカー位置における特定の残基の存在または非存在を変更することによって作製され得る。そのようなアナログは、特定のモチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を精密に調節するために使用される。
【0061】
「亜優性エピトープ(subdominant epitope)」は、エピトープを含む抗原全体で免疫した際にほとんどまたは全く応答を引き起こさないエピトープであるが、単離ペプチドで免疫することによって応答が得られ、この応答(潜在エピトープの場合とは異なる)はタンパク質全体を用いてインビトロまたはインビボでの応答をリコールする場合に検出される。
【0062】
「スーパーモチーフ」は、2つ以上のHLA対立遺伝子によりコードされるHLA分子により共有されるペプチド結合特異性である。好ましくは、スーパーモチーフを有するペプチドは、2つ以上のHLA抗原により、(本明細書中で規定される)高親和性または中程度の親和性で認識される。
【0063】
「合成ペプチド」とは、化学合成または組換えDNA技術のような方法を用いた人工ペプチドをいう。
【0064】
本明細書中で用いられる「ワクチン」は、1つ以上の本発明のペプチドを含む組成物である。本発明のワクチンの多くの実施形態が存在する(例えば、1つ以上のペプチドのカクテル;ポリエピトープペプチドにより構成された本発明の1つ以上のエピトープ;あるいはこのようなペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸(例えば、ポリエピトープペプチドをコードするミニ遺伝子)によるもの)。「1つ以上のペプチド」は、1〜150の任意の全単位整数、例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、または150以上の本発明のペプチドを含み得る。このペプチドまたはポリペプチドは、例えば、脂質化(lipidation)、標的化配列または他の配列の付加によって、任意選択により改変することができる。本発明のHLAクラスI結合ペプチドは、HLAクラスII結合ペプチドと混合されるか連結されて、細胞傷害性Tリンパ球およびヘルパーTリンパ球の両方の活性化を促進し得る。ワクチンはまた、ペプチドパルス化抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)を含み得る。
【0065】
ペプチド化合物を記載するために用いた名称は、各アミノ酸残基のアミノ基が左(N末端)に示され、カルボキシル基が右(C末端)に示される、従来の慣行に従う。アミノ酸残基位置がペプチドエピトープにおいて言及される場合、それらは、アミノからカルボキシルの方向に番号付けされ、1位はアミノ末端に最も近い位置である。本発明の選択された特定の実施形態を示す式において、アミノ末端基およびカルボキシル末端基は、他に特定されなければ、それらが生理学的pH値において呈する形態にある。アミノ酸構造式において、各残基は、一般に標準的な3文字または1文字表記により示される。アミノ酸残基のL形態は、大文字の1文字記号または最初が大文字の3文字記号により示される。そしてD形態を有するこれらのアミノ酸のD形態は、小文字の1文字記号または小文字の3文字記号により示される。グリシンは、不斉炭素原子を有さず、単に「Gly」または「G」と示される。アミノ酸の記号を以下に示す。
【0066】
【表1】
【0067】
IV.B.HBVに対するCTL応答およびHTL応答の刺激
T細胞が抗原を認識する機構は、過去十年の間に詳細に示されてきた。本発明者らの免疫系の新たな理解に基づいて、本発明者らは、広範な集団においてHBV感染に対する治療的または予防的免疫応答を誘導し得る有効なペプチドエピトープワクチン組成物を創造した。本願組成物の価値および有効性の理解のために、免疫学関連技術の簡単な総説を提供する。
【0068】
HLA分子とペプチド抗原の複合体は、HLA拘束T細胞により認識されるリガンドとして働く(Buus,S.ら、Cell 47:1071、1986;Babbitt,B.P.ら、Nature 317:359、1985;Townsend,A.およびBodmer,H.、Annu.Rev.Immunol.7:601、1989;Germain,R.N.、Annu.Rev.Immunol.11:403、1993)。単一のアミノ酸置換抗原アナログの研究および内因的に結合し天然でプロセシングされたペプチドの配列決定を通して、HLA抗原分子に対する特異的結合に必要なモチーフに対応する重要な残基が同定され、本明細書中に記載され、そして表I、IIおよびIIIに示される(例えば、Southwoodら、J.Immunol.160:3363、1998;Rammenseeら、Immunogenetics 41:178、1995;Rammenseeら、SYFPEITHI(ウェブを介して以下にアクセスすること:http://134.2.96.221/scripts.hlaserver.dll/home.htm);Sette,A.およびSidney,J.Curr.Opin.Immunol.10:478、1998;Engelhard,V.H.、Curr.Opin.Immunol.6:13、1994;Sette,A.およびGrey,H.M.、Curr.Opin.Immunol.4:79、1992;Sinigaglia,F.およびHammer,J.Curr.Biol.6:52、1994;Ruppertら、Cell 74:929−937、1993;Kondoら、J.Immunol.155:4307−4312、1995;Sidneyら、J.Immunol.157:3480−3490、1996;Sidneyら、Human Immunol.45:79−93、1996;Sette,A.およびSidney,J.Immunogenetics(印刷中)、1999もまた参照のこと)。
【0069】
さらに、HLA−ペプチド複合体のX線結晶解析により、対立遺伝子特異的様式でペプチドリガンドが保有する残基と適応するHLA分子のペプチド結合窪み(peptide binding cleft)内のポケットが明らかになった;次に、これらの残基によってこれらの残基が存在するペプチドのHLA結合能力が決定される(例えば、Madden,D.R.Annu.Rev.Immunol.13:587、1995;Smithら、Immunity 4:203、1996;Fremontら、Immunity 8:305、1998;Sternら、Structure 2:245、1994;Jones,E.Y.Curr.Opin.Immunol.9:75、1997;Brown,J.H.ら、Nature 364:33、1993;Guo,H.C.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8053、1993;Guo,H.C.ら、Nature 360:364、1992;Silver,M.L.ら、Nature 360:367、1992;Matsumura,M.ら、Science 257:927、1992;Maddenら、Cell 70:1035、1992;Fremont,D.H.ら、Science 257:919、1992;Saper,M.A.、Bjorkman,P.J.およびWiley,D.C.、J.Mol.Biol.219:277、1991を参照のこと)。
【0070】
従って、クラスIおよびクラスIIの対立遺伝子特異的HLA結合モチーフ、またはクラスIスーパーモチーフの規定は、特定のHLA抗原を結合する能力を有するタンパク質内の領域の同定を可能にする(例えば、Sette,A.およびGrey,H.M.、Curr.Opin.Immunol.4:79、1992;Sinigaglia,F.およびHammer,J.、Curr.Biol.6:52、1994;Engelhard、V.H.,Curr.Opin.Immunol.6:13、1994;Kast,W.M.ら、J.Immunol.、152:3904、1994も参照)。
【0071】
さらに、ペプチドとHLAとの間の相互作用の親和性を定量する様々なアッセイが確立された。こうしたアッセイは、例えば、IC50値、抗原提示阻害の測定(Sette.ら、J.Immunol.141:3893、1991)、インビトロアセンブリアッセイ(Townsendら、Cell 62:285、1990)解離率測定(Parkerら、J.Immunol.149:1896−1904、1992)およびRMA.Sなどの変異細胞を用いたFACS−ベースアッセイ(Meliefら、Eur.J.Immunol.21:2963、1991)。
【0072】
本発明者らは、結合親和性と免疫原性との相関が、候補ペプチドを評価する場合に考慮されるべき重要な因子であることを見出した。従って、モチーフ検索とHLA−ペプチド結合アッセイとの組合せにより、エピトープベースワクチンの候補が同定された。それらの結合親和性を決定した後、さらなる確認作業を行って、これらのワクチン候補の中で、抗原性および免疫原性の点で好ましい特徴を有するエピトープを選択し得る。種々のストラテジーを利用して、免疫原性を評価し得る。これらのストラテジーとしては、以下が挙げられる:
1)正常個体由来の初代T細胞培養物の評価(例えば、Wentworth,P.A.ら、Mol.Immunol.32:603、1995;Celis,E.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2105、1994;Tsai,V.ら,J.Immunol.158:1796、1997;Kawashima,I.ら、Human Immunol.59:1、1998);この手順は、正常被験体由来のPBLを、インビトロで抗原提示細胞の存在下で数週間にわたり試験ペプチドで刺激することを包含する。このペプチドに特異的なT細胞は、この期間に活性化され、そして例えば、ペプチド感作標的細胞に伴う51Cr放出アッセイを用いて検出される。
2)HLAトランスジェニックマウスの免疫(Wentworth,P.A.ら、J.Immunol.26:97、1996;Wentworth,P.A.ら、Int.Immunol.8:651、1996;Alexander,J.ら、J.Immunol.159:4753、1997);この方法において、不完全フロイントアジュバント中のペプチドをHLAトランスジェニックマウスの皮下に投与する。免疫して数週間後に、脾細胞を取り出し、そしてインビトロで約1週間にわたり試験ペプチドの存在下で培養する。ペプチド特異的T細胞は、例えば、ペプチド感作標的細胞および内因的に生成した抗原を発現する標的細胞に伴う51Cr放出アッセイを用いて検出される。
3)感染から回復した免疫個体、および/または慢性的に感染した患者からのリコールT細胞応答の実証(Rehermann,B.ら、J.Exp.Med.181:1047、1995;Doolan,D.L.ら、Immunity 7:97、1997;Bertoni,R.ら、J.Clin.Invest.100:503、1997;Threlkeld,S.C.ら、J.Immunol.159:1648、1997;Diepolder,H.M.ら、J.Virol.71:6011、1997)。このストラテジーを適用する際に、リコール応答は、例えば、感染を通じて天然に抗原に曝され、従って、「天然に」免疫応答を生成した被験体由来のPBLを培養することによって検出される。被験体由来のPBLを、インビトロで試験ペプチドおよび抗原提示細胞(APC)の存在下で1〜2週間の間培養して、「ナイーブな」T細胞と比較して、「記憶」T細胞の活性化を可能にする。培養期間の終わりに、T細胞活性を、ペプチド感作された標的、T細胞増殖、またはリンホカイン放出を伴う51Cr放出を含むT細胞活性についてのアッセイを用いて検出する。
【0073】
以下は、本発明のペプチドエピトープおよび対応する核酸を記載する。
【0074】
IV.C.HLA分子に対するペプチドエピトープの結合親和性
ここに示すように、高度なHLA多型は、ワクチン開発へのエピトープベースのアプローチと共に考慮すべき重要な因子である。この因子に取り組むために、高いかまたは中程度の親和性で複数のHLA分子に結合し得るペプチドを同定する工程を包含するエピトープの選択が好ましくは使用され、最も好ましくは、これらのエピトープは、高いかまたは中程度の親和性で2つ以上の対立遺伝子特異的HLA分子に結合する。
【0075】
ワクチン組成物のための目的のCTL誘導ペプチドとしては、好ましくは、IC50またはクラスI HLA分子に対する結合親和性の値が500nM以下であるペプチドが挙げられる。HTL誘導ペプチドとしては、好ましくは、IC50またはクラスII HLA分子に対する結合親和性の値が1000nM以下であるペプチドが挙げられる。例えば、ペプチド結合は、インビトロにおいて候補ペプチドが精製HLA分子に結合する能力を試験することによって評価される。次いで、高いかまたは中程度の親和性を示すペプチドは、さらなる分析のために考察される。選択されたペプチドは、スーパータイプファミリーの他のメンバーについて試験される。好ましい実施形態において、交差反応結合を阻害するペプチドは、次いで、ワクチンまたは細胞スクリーニング分析において使用される。
【0076】
本明細書に開示するように、高いHLA結合親和性は、より大きな免疫原性と相関している。より大きな免疫原性は、いくつかの異なる様式において明確であり得る。免疫原性は、免疫応答が少しでも誘発されるか否か、および任意の特定の応答の効力に対応する。例えば、ペプチドは、強力な応答を生成する場合を除いて、集団の多様なアレイにおける免疫応答を引き起こし得る。これらの原理に従って、90%近い高結合ペプチドは、中程度の親和性で結合するペプチドの約50%と対照してみると、免疫原性であることが見出されている。さらに、高結合親和性ペプチドは、より強力な免疫原性応答を引き起こす。結果として、高親和性結合ペプチドが使用される場合、ペプチドは同様の生物学的効果を引き起こす必要はあまりない。従って、本発明の好ましい実施形態において、高結合エピトープが特に望ましい。
【0077】
HLAクラスI分子に対する結合親和性と結合抗原上の別個のペプチドエピトープの免疫原性との間の関係は、本発明者によって当該分野で初めて決定された。結合親和性と免疫原性との間の相関は、2つの異なる実験的なアプローチで分析された(Setteら、J.Immunol.153:5586−5592、1994)。第1のアプローチにおいて、10,000倍の範囲を超えるHLA結合親和性の範囲の潜在性あるエピトープの免疫原性が、HLA−A*0201トランスジェニックマウスにおいて分析された。第2のアプローチにおいて、約100個の異なるB型肝炎ウイルス(HBV)由来潜在的エピトープ(全てが、A*0201結合モチーフを保有する)の抗原性は、急性肝炎の患者由来のPBL(末梢血リンパ球)を使用することによって評価された。これらのアプローチに従って、約500nM(好ましくは、IC50値が500nM以下)の親和性閾値はペプチドエピトープがCTL応答を引き起こす能力を決定することが決定された。これらのデータは、天然でプロセシングされたペプチドおよび合成T細胞エピトープに対するクラスI結合親和性の測定について当てはまる。これらのデータはまた、T細胞応答の具現における決定因子の選択の重要な役割を示す。
【0078】
HLAクラスII DR分子の状況における免疫原性に関連する親和性閾値も示されている(Southwoodら、J.Immunology 160:3363−3373、1998、および1998年5月29日出願の米国特許出願番号60/087192)。DR結合親和性の生物学的に有意な閾値を規定するために、32個のDR拘束エピトープのそれらの拘束エレメントに対する結合親和性のデータベースが集計された。これらの場合の約半分(32個のエピトープのうち15個)において、DR拘束は高結合親和性(すなわち、IC50値が100nM以下の結合親和性値)に関連していた。これらの場合の残りの半分(32個のうちの16個)において、DR拘束は中程度の親和性(100〜1000nM範囲の結合親和性値)に関連していた。32個の場合のうちただ1つにおいて、DR制限は1000nM以上のIC50に関連していた。従って、1000nMは、DR分子の状況における免疫原性に関連する親和性閾値として定義され得る。
【0079】
HLA分子に対するペプチドの結合親和性は、以下の実施例1のように決定され得る。
【0080】
IV.D.ペプチドエピトープ結合モチーフおよびスーパーモチーフ(Supermotif)
この数年間で、大部分のHLAクラスIおよびおそらくクラスII分子が、ペプチド結合レパートリーが大きく重複すること及び主要なペプチド結合ポケットのコンセンサス構造によって特徴付けられる比較的わずかなスーパータイプに分類することができることを示す証拠が蓄積されている。
【0081】
HLA分子ポケット分析について、結晶学的研究(Guo,H.C.ら、Nature 360:364、1992;Saper,M.A.、Bjorkman,P.J.およびWiley,D.C.、J.Mol.Biol.219:277、1991;Madden,D.R.、Garboczi,D.N.およびWiley,D.C.、Cell 75:693、1993)において記載されるようなHLAクラスI分子のBおよびFポケットを含む残基が、Parhamらのデータベースから集計された(Parham,P.、Adams,E.J.、およびArnett,K.L.、Immunol.Rev.143:141、1995)。これらの分析において、残基9、45、63、66、67、70および99は、Bポケットを構成すると考えられ、ペプチドリガンドの2位における残基に対する特異性を決定すると考えられた。同様に、残基77、80、81および116は、Fポケットの特異性を決定すると考えられ、HLA分子により結合されたペプチドリガンドのC末端残基に対する特異性を決定すると考えられた。
【0082】
単一のアミノ酸置換抗原アナログの研究、および内因的に結合し天然でプロセシングされたペプチドの配列決定を通して、HLA分子に対する対立遺伝子特異的結合に必要な重要な残基が同定された。これらの残基の存在は、HLA分子に対する結合親和性と相関する。高いかまたは中程度の親和性結合に相関するモチーフおよび/またはスーパーモチーフの同定は、ワクチンに含有させるための免疫原性ペプチドエピトープの同定に関する重要な問題である。Kastら(J.Immunol.152:3904−3912、1994)は、モチーフ保有ペプチドは、対立遺伝子特異的HLAクラスI分子に結合するエピトープの90%を構成することを示した。この研究において、9個のアミノ酸長かつ8個のアミノ酸が重なる全ての可能なペプチド(240個のペプチド)(これはヒト乳頭腫ウイルス属16型のE6およびE7タンパク質の配列全体をカバーする)は、異なる人種間で高頻度で発現される5個の対立遺伝子特異的HLA分子への結合について評価された。この偏りのないペプチドのセットは、HLAクラスIモチーフの予測値の評価を可能にした。240個のペプチドのセットから、高いかまたは中程度の親和性を有する対立遺伝子特異的HLA分子に結合する22個のペプチドが同定された。これらの22個のペプチドのうち、20個(すなわち、91%)はモチーフを保有していた。従って、この研究は、ワクチンに含有させるためのペプチドエピトープの同定のためのモチーフの値を説明し、モチーフベースの同定技術の適用は潜在性あるエピトープの90%のスクリーニングを排除する。
【0083】
このようなペプチドエピトープは、以下に記載される表で同定される。HLAクラスIエピトープのための表1は対立遺伝子特異的HLAクラスI分子と中程度のまたは高い親和性で結合するペプチドの90%以上を含む。
【0084】
本発明のペプチドはまた、MHCクラスII DR分子に結合するエピトープを含み得る。クラスIとクラスIIのHLA分子間の顕著な相違は、クラスI分子に結合するペプチドについては厳格なサイズ制限が存在するものの、ペプチドのN末端およびC末端に対する、モチーフのサイズおよび結合フレームの位置の両方におけるより大きな程度の異質性がクラスIIペプチドリガンドについては示され得ることである。この異質性の増加は、クラスIの対応物と異なり両端で開いているクラスII分子の結合溝の構造に由来する。DRB*0101ペプチド複合体の結晶学的分析(例えば、Madden,D.R.Ann.Rev.Immunol.13:587、1995を参照のこと)は、DRB*0101と複合化したペプチドの1位および位置6を占める残基がDRBa*0101分子上の2つの相補的なポケットに結合し、P1位置が最も重要なアンカー残基および最も深い疎水性ポケットに対応することを示した。他の研究はまた、P6位置を様々な他のDR分子に結合する重要なアンカー残基として指摘した。
【0085】
従って、本発明のペプチドは、いくつかのHLA特異的アミノ酸モチーフの任意の1つによって同定される(例えば、表I−IIIを参照のこと)。モチーフの存在がいくつかの対立遺伝子特異的HLA抗原に結合する能力と対応する場合、これはスーパーモチーフと称される。特定のアミノ酸モチーフを有するペプチドに結合する対立遺伝子特異的HLA分子は、包括的にHLA「スーパーモチーフ」と称される。
【0086】
以下に記載されるペプチドモチーフおよびスーパーモチーフは、本発明のペプチドの同定および使用のためのガイダンスを提供する。
【0087】
それぞれのスーパーモチーフまたはモチーフを保有するペプチドエピトープの例は、各モチーフまたはスーパーモチーフの説明において示されるような表に挙げられる。これらの表は、ペプチドエピトープのいくつかについての結合親和性比のリストを含む。この比は以下の式を使用することによって、IC50に変換され得る:標準ペプチドのIC50/比=試験ペプチド(すなわち、ペプチドエピトープ)のIC50。クラスIペプチドに対する結合親和性を決定するために使用される標準ペプチドのIC50値は、表IVに示される。クラスIIペプチドに対する結合親和性を決定するために使用される標準ペプチドのIC50値は、表Vに示される。結合アッセイのための標準として使用されるペプチドは、標準の例であり;代替の標準ペプチドはまた、このような分析を実施する場合に使用され得る。
【0088】
各表に列挙されるペプチドエピトープ配列を得るために、20個のHBV株(HPBADR、HPBADRlCG、HPBADRA、HPBADRC、HPBADRCG、HPBCGADR、HPBVADRM、HPBADW、HPBADW1、HPBADW2、HPBADW3、HPBADWZ、HPBHEPB、HPBVADW2、HPBAYR、HPBV、HPBVAYWC、HPBVAYWCI、NAD HPBVAYWE)から得たタンパク質配列データが、指定されたスーパーモチーフまたはモチーフの存在について評価された。ペプチドエピトープも保存性に基づいて評価された。保存性の基準は、ペプチドの配列全体が、特定のタンパク質について利用可能な配列の75%において全体的に保存されていることを必要とする。選択されたペプチドエピトープの保存百分率は表に示される。頻度、すなわち、この20個の株のうち全体的に保存されるペプチド配列が同定された株の数も示される。表中の「第1位置」のカラムは、エピトープの最初のアミノ酸残基に対応するHBVタンパク質のアミノ酸位置を示す。「アミノ酸の数」は、エピトープ配列中の残基の数を示す。
【0089】
CTL誘導ペプチドエピトープを示すHLAクラスIモチーフ
以下に示されるHLAクラスIペプチドエピトープスーパーモチーフおよびモチーフの一次アンカー残基を表Iに要約する。表I(a)に記載されるHLAクラスIモチーフは本願特許請求の範囲に記載された本発明に最も関連するものである。一次および二次アンカー位置は表IIに要約される。HLAクラスIスーパータイプファミリーを含む対立遺伝子特異的HLA分子は表VIに列挙される。
【0090】
IV.D.1.HLA−A1スーパーモチーフ
HLA−A1スーパーモチーフは、エピトープの2位における小さな(TまたはS)または疎水性の(L、I、VまたはM)一次アンカー残基及びエピトープのC末端位における芳香族の(Y、FまたはW)一次アンカー残基のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。A1スーパーモチーフ(すなわち、HLA−A1スーパータイプ)に結合するHLA分子の対応するファミリーは、少なくともA*0101、A*2601、A*2602、A*2501、およびA*3201からなる(例えば、DiBrino,M.ら、J.Immunol.151:5930、1993;DiBrino,M.ら、J.Immunol.152:620、1994;Kondo,A.ら、Immunogenetics 45:249、1997を参照のこと)。A1スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的HLA分子は、表VIに示される。個々のHLAタンパク質の各々に結合するペプチドは、一次および/または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフに対して指定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0091】
A1スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表VIIに記載される。
【0092】
IV.D.2.HLA−A2スーパーモチーフ
対立遺伝子特異的HLA−A2.1分子に対する一次アンカーの特異性(Falkら、Nature 351:290−296、1991;Huntら、Science 255:1261−1263、1992)、およびHLA A2ファミリー内の交差反応結合(Fruciら、Human Immunol.38:187−192、1993;Tanigakiら、Human Immunol.39:155−162、1994)が記載されている。本発明者らは、複数の対立遺伝子特異的HLA A2分子への交差反応結合を決定するさらなる一次アンカー残基を規定した(Del Guercioら、J.Immunol.154:685−693、1995)。HLA−A2スーパーモチーフは、エピトープの2位に一次アンカー残基としてのL、I、V、M、A、TまたはQ及びエピトープのC末端位に一次アンカー残基としてのL、I、V、M、AまたはTを有するペプチドリガンドを含む。
【0093】
HLA分子の対応するファミリー(すなわち、これらのペプチドに結合するHLA−A2スーパータイプ)は、少なくともA*0201、A*0202、A*0203、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207、A*0209、A*0214、A*6802、およびA*6901からなる。A2スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的HLA分子は、表VIに示される。以下に詳細に説明されるように、個々の対立遺伝子特異的HLA分子の各々への結合は、一次アンカーおよび/または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはこのスーパーモチーフに対して指定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0094】
A2スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表VIIIに記載される。2位において一次アンカー残基V、A、TまたはQを含み、C末端位においてL、I、V、AまたはTを含むモチーフは、本願の特許請求の範囲に記載された発明に特に最も関連するものである。
【0095】
IV.D.3.HLA−A3スーパーモチーフ
HLA−A3スーパーモチーフは、エピトープの2位における一次アンカーとしてのA、L、I、V、M、SまたはT及びエピトープのC末端(すなわち、9マーの9位)における一次アンカーとしての正電荷の残基RまたはKのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。A3スーパーモチーフに結合するHLA分子(HLA−A3スーパータイプ)の対応するファミリーの例示的なメンバーは、少なくともA*0301、A*1101、A*3101、A*3301およびA*6801を含む。A3スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的HLA分子は、表VIに示される。以下で詳細に説明されるように、個々の対立遺伝子特異的HLAタンパク質の各々に結合するペプチドは、ペプチドの一次および/または二次アンカー位置におけるアミノ酸の置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0096】
A3スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表IXに記載される。
【0097】
IV.D.4.HLA−A24スーパーモチーフ
HLA−A24スーパーモチーフは、エピトープの2位における一次アンカーとしての芳香族残基(F、WまたはY)及びエピトープのC末端位における一次アンカーとしての疎水性残基(Y、F、L、I、VまたはM)のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。A24スーパーモチーフ(すなわち、A24スーパータイプ)に結合するHLA分子の対応するファミリーは、少なくともA*2402、A*3001およびA*2301を含む。A24スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的HLA分子は、表VIに示される。対立遺伝子特異的HLA分子の各々に結合するペプチドは、一次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0098】
A24スーパーモチーフを含む代表的ペプチドエピトープは、表Xに記載される。
【0099】
IV.D.5.HLA−B7スーパーモチーフ
HLA−B7スーパーモチーフは、エピトープの2位における一次アンカーとしてのプロリン及びエピトープのC末端位における一次アンカーとしての疎水性または脂肪族のアミノ酸(L、I、V、M、A、F、WまたはY)を保有するペプチドによって特徴付けられる。B7スーパーモチーフに結合するHLA分子(すなわち、HLA−B7スーパータイプ)の対応するファミリーは、B*0702、B*0703、B*0704、B*0705、B*1508、B*3501、B*3502、B*3503、B*3504、B*3505、B*3506、B*3507、B*3508、B*5101、B*5102、B*5103、B*5104、B*5105、B*5301、B*5401、B*5501、B*5502、B*5601、B*5602、B*6701、およびB*7801を含む少なくとも26個のHLA−Bタンパク質からなる(例えば、Sidneyら、J.Immunol.154:247、1995;Barberら、Curr.Biol.5:179、1995;Hillら、Nature 360:434、1992;Rammenseeら、Immunogenetics 41:178、1995を参照のこと)。B7スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的HLA分子は、表VIに示される。以下に詳細に説明されるように、個々の対立遺伝子特異的HLAタンパク質の各々に結合するペプチドは、ペプチドの一次および/または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0100】
B7スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表XIに記載される。
【0101】
IV.D.6.HLA−B27スーパーモチーフ
HLA−B27スーパーモチーフは、エピトープの2位における一次アンカーとしての正電荷の残基(R、HまたはK)及びエピトープのC末端位における一次アンカーとしての疎水性の残基(F、Y、L、W、M、I、AまたはV)のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。B27スーパーモチーフ(すなわち、B27スーパータイプ)に結合するHLA分子の対応するファミリーの例示的なメンバーは、少なくともB*1401、B*1402、B*1509、B*2702、B*2703、B*2704、B*2705、B*2706、B*3801、B*3901、B*3902、およびB*7301を含む。B27スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的HLA分子は、表VIに示される。対立遺伝子特異的HLA分子の各々に結合するペプチドは、一次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0102】
B27スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表XIIに記載される。
【0103】
IV.D.7.HLA−B44スーパーモチーフ
HLA−B44スーパーモチーフは、エピトープの2位における一次アンカーとしての負電荷の残基(DまたはE)及びエピトープのC末端位における一次アンカーとしての疎水性残基(F、W、Y、L、I、M、VまたはA)のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。B44スーパーモチーフ(すなわち、B44スーパータイプ)に結合するHLA分子の対応するファミリーの例示的なメンバーは、少なくともB*1801、B*1802、B*3701、B*4001、B*4002、B*4006、B*4402、B*4403、およびB*4006を含む。対立遺伝子特異的HLA分子の各々に結合するペプチドは、一次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0104】
IV.D.8.HLA−B58スーパーモチーフ
HLA−B58スーパーモチーフは、エピトープの2位における一次アンカー残基としての小さな脂肪族残基(A、SまたはT)及びエピトープのC末端位における一次アンカー残基としての芳香族または疎水性残基(F、W、Y、L、I、V、MまたはA)のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。B58スーパーモチーフ(すなわち、B58スーパータイプ)に結合するHLA分子の対応するファミリーの例示的なメンバーは、少なくともB*1516、B*1517、B*5701、B*5702、およびB*5801を含む。B58スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的HLA分子は、表VIに示される。対立遺伝子特異的分子の各々に結合するペプチドは、一次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0105】
B58スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表XIIIに記載される。
【0106】
IV.D.9.HLA−B62スーパーモチーフ
HLA−B62スーパーモチーフは、エピトープの2位における一次アンカーとしての極性の脂肪族残基Qまたは疎水性の脂肪族残基(L、V、M、またはI)及びエピトープのC末端位における一次アンカーとして、疎水性残基(F、W、Y、M、I、V、LまたはA)のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。B62スーパーモチーフ(すなわち、B62スーパータイプ)に結合するHLA分子の対応するファミリーの例示的なメンバーは、少なくともB*1501、B*1502、B*1513、およびB*5201を含む。B62スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的HLA分子は、表VIに示される。対立遺伝子特異的HLA分子の各々に結合するペプチドは、一次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0107】
B62スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表XIVに記載される。
【0108】
IV.D.10.HLA−A1モチーフ
対立遺伝子特異的HLA−A1モチーフは、エピトープの2位における一次アンカー残基として、のT、SまたはM及びエピトープのC末端位における一次アンカー残基としてのYのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。代替の対立遺伝子特異的A1モチーフ(すなわち、「サブモチーフ」)は、2位よりむしろ3位における一次アンカー残基によって特徴付けられる。このサブモチーフは、エピトープの3位における一次アンカー残基としてのD、E、AまたはS及びC末端位における一次アンカー残基としてのYの存在によって特徴付けられる。伸長したサブモチーフは、3位におけるDの存在およびC末端位におけるA、I、LまたはFの存在によって特徴付けられる。HLA A1に結合するペプチドは、一次および/または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0109】
A1モチーフのいずれかを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表XVに記載される。2位にT、SまたはMを、およびC末端位にYを含むこれらのエピトープはまた、表VIIに列挙されるHLA−A1スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープの表に含まれる。
【0110】
IV.D.11.HLA−A2.1モチーフ
対立遺伝子特異的HLA−A2.1モチーフは、9個のアミノ酸エピトープの2位における一次アンカー残基としてのLまたはM及び9個のアミノ酸エピトープのC末端位における一次アンカー残基としてのLまたはVのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられることが決定された(Falkら、Nature 351:290−296、1991)。さらに、A2.1モチーフは、9個のアミノ酸ペプチドの2位においてIを含み、C末端においてIまたはAをさらに含むことが決定された(Huntら、Science 255:1261−1263、March 6、1992)。さらに、A2.1対立遺伝子特異的モチーフは、C末端位にTを含むことが見出された(Kastら、J.Immunol.152:3904−3912、1994)。続いて、本発明者らによって、A2.1対立遺伝子特異的モチーフは、V、A、TまたはQをエピトープの2位に一次アンカー残基としてさらに含むことが規定され、MをC末端位に一次アンカー残基として含むことが規定されている。従って、HLA−A2.1モチーフは、L、I、V、M、A、TまたはQを有するペプチドリガンドをエピトープの2位に一次アンカー残基として含み、L、I、V、M、AまたはTを、エピトープのC末端位における一次アンカー残基として含む。HLA−A2.1モチーフの一次アンカー位置を特徴付ける好ましくかつ寛容される残基は、A2スーパーモチーフを示す好ましい残基と同一である(関連のデータの総説については、例えば、Del Guercioら、J.Immunol.154:685−693、1995;Sidneyら、Immunol.Today 17:261−266、1996;SetteおよびSidney、Curr.Opin.in Immunol.10:478−482、1998を参照のこと)。A2.1モチーフを特徴付ける二次アンカー残基は、本明細書中で開示されるように、さらに定義されている。これらは、表IIに開示される。HLA−A2.1分子に結合するペプチドは、一次および/または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0111】
A2.1モチーフを含む代表的ペプチドエピトープは、表VIIに記載される。一次アンカー残基V、A、TまたはQを2位に含み、L、I、V、AまたはTをC末端位に含むA2.1モチーフは、本明細書中で、特許請求の範囲に記載された発明に特に最も関連するものである。
【0112】
IV.D.12.HLA−A3モチーフ
対立遺伝子特異的HLA−A3モチーフは、エピトープの2位における一次アンカー残基としてのL、M、V、I、S、A、T、F、C、GまたはD及びエピトープのC末端位における一次アンカー残基としてのK、Y、R、H、FまたはAのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。HLA−A3に結合するペプチドは、一次および/または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0113】
代表的なA3モチーフを含むペプチドエピトープは、表XVIに記載される。A3スーパーモチーフを含むペプチドエピトープも表IXに列挙される。
【0114】
IV.D.13.HLA−A11モチーフ
対立遺伝子特異的HLA−A11モチーフは、エピトープの2位における一次アンカー残基としてのV、T、M、L、I、S、A、G、N、C、DまたはF及びエピトープのC末端位における一次アンカー残基としてのK、R、YまたはHのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。HLA−A11に結合するペプチドは、一次および/または2次アンカー位置における置換によって、好ましくはモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0115】
A11モチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、表XVIIに記載され、A3対立遺伝子特異的モチーフを含むペプチドエピトープも、A3およびA11モチーフの一次アンカー特異性間の広範な重なりのため、この表に示される。さらに、A3スーパーモチーフを含むペプチドエピトープも表IXに列挙される。
【0116】
IV.D.14.HLA−A24モチーフ
対立遺伝子特異的HLA−A24モチーフは、エピトープの2位における一次アンカー残基としてのY、F、W、またはM及びエピトープのC末端位置における一次アンカー残基としてのF、L、I、またはWのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。HLA−A24分子に結合するペプチドは、一次および/または二次のアンカー位置における置換によって、好ましくはモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0117】
A24モチーフを含む代表的ペプチドエピトープは、表XVIIIに示される。これらのエピトープはまた、表X、HLA−A24スーパーモチーフ保有エピトープにも列挙される。
【0118】
HLAクラスII HTLエピトープを示すモチーフ
以下に描写したHLAクラスIIスーパーモチーフおよびモチーフの一次および二次のアンカー残基は、表IIIに要約される。
【0119】
IV.D.15.HLA−DR−1−4−7スーパーモチーフ
モチーフは、3つの共通のHLAクラスII対立遺伝子特異的HLA分子(HLA DRB1*0401、HLA DRB1*0101、およびHLA DRB1*0701)に結合するペプチドについても同定された。包括的に、これらのモチーフ由来の共通の残基は、HLA DR−1−4−7スーパーモチーフを示す。これらのDR分子に結合するペプチドは、エピトープの1位における一次アンカー残基としての大きな芳香族残基または疎水性残基(Y、F、W、L、I、V、またはM)及びエピトープの6位における一次アンカー残基としての小さな非電荷残基(S、T、C、A、P、V、I、L、またはM)によって特徴付けられるスーパーモチーフを保有する。これらのHLA型の各々についての対立遺伝子特異的二次効果および二次アンカーも同定されている。これらは、表IIIにおいて示される。HLA−DR4、DR1、および/またDR7に結合するペプチドは、一次および/または二次のアンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0120】
保存されたペプチドエピトープ(すなわち、分析のために使用された20のHBV株において保存率75%)は、DR−1−4−7スーパーモチーフを含む9残基のコアに対応し(ここで、モチーフの1位は9残基のコアの1位にある)、表XIXaにおいて示される(例えば、Madden,Annu.Rev.Immunol.13:587−622、1995も参照のこと)。15アミノ酸残基長のそれぞれの例示的なペプチドエピトープ(その各々は、保存された9残基のコアを含む)も表の「a」節において示される。例示的な15残基のスーパーモチーフ保有ペプチド(ペプチド数により命名されている)についての交差反応結合データは、表XIXbにおいて示される。
【0121】
IV.D.16.HLA−DR3モチーフ
2つの代替的なモチーフ(すなわち、サブモチーフ)は、HLA−DR3分子に結合するペプチドエピトープを特徴付ける。第1のモチーフ(サブモチーフDR3A)において、大きな疎水性残基(L、I、V、M、F、またはY)はアンカー1位に存在し、Dはエピトープのカルボキシル末端方向4位にアンカーとして存在する。
【0122】
代替のDR3サブモチーフは、エピトープのカルボキシル末端方向6位における正電荷の存在によって、アンカー1位における大きな疎水性残基、および/または4位における負に荷電したアンカー残基またはアミド様アンカー残基の欠失をもたらす。従って、代替の対立遺伝子特異的DR3モチーフ(サブモチーフDR3B)について、L、I、V、M、F、Y、A、またはYはアンカー1位に存在し;D、N、Q、E、S、またはTはアンカー4位に存在し;K、R、またはHはアンカー6位に存在する。HLA−DR3に結合するペプチドは、一次および/または二次のアンカー位置における置換によって、好ましくはモチーフのために特定したそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0123】
DR3Aサブモチーフを含む9残基のコア(ここで、モチーフの1位は9残基のコアの1位にある)に対応する保存されたペプチドエピトープ(すなわち、分析のために使用された20のHBV株において保存率75%の配列)は、表XXaにおいて示される。15アミノ酸残基長のそれぞれの例示的なペプチドエピトープ(その各々は、保存された9残基のコアを含む)も表XXaにおいて示される。表XXbは、例示的なDR3サブモチーフA保有ペプチド(ペプチド番号によって命名)の結合データを示す。
【0124】
DR3Bサブモチーフを含む9残基コアおよびDR3サブモチーフ−Bエピトープを含む例示的な15マーのペプチドそれぞれに対応する保存されたペプチドエピトープ(すなわち、分析のために使用された20のHBV株において保存率75%)は、表XXcにおいて示される。表XXdは、例示的なDR3サブモチーフB保有ペプチド(ペプチド番号によって命名)の結合データを示す。
【0125】
本明細書中の表に示されているHLAクラスIまたはクラスIIのペプチドエピトープの各々は、それだけで本願の発明実施態様であるとみなす。さらに、各々のペプチドエピトープが、任意の他のペプチドエピトープと組み合わせて使用してもよいことも本願の発明実施態様である。
【0126】
IV.E.ワクチンの拡大された集団適用範囲
広範な集団適用範囲を有するワクチンが好ましい。なぜなら、このワクチンは、より商業的に実行可能であり、一般的にほとんどの人々に適用可能であるからである。広範な集団適用範囲は、全体で考慮した場合に集団のほとんどに存在するHLA対立遺伝子に結合するペプチドエピトープを選択することを介して、本発明のペプチド(およびこのようなペプチドをコードする核酸組成物)を用いて得ることができる。表XXIは、様々な人種におけるHLAクラスIスーパータイプの全体の頻度(表XXIa)、ならびにA2スーパータイプ、A3スーパータイプ、およびB7スーパータイプによって達成される組み合わされた集団適用範囲(表XXIb)を列挙する。このA2スーパータイプ、A3スーパータイプ、およびB7スーパータイプは、5つの主な人種の各々において40%を超える平均値でそれぞれ存在する。80%より多い範囲は、これらのスーパーモチーフの組合せを用いて達成される。これらの結果は、効果的かつ人種的に偏りのない集団適用範囲が制限された数の交差反応性ペプチドを使用した際に達成されることを示唆する。これらの3つの主なペプチド特異性を用いて達した集団適用範囲は大きいが、適用範囲を95%以上の集団適用範囲に達するように拡大することができ、さらなるスーパーモチーフ保有ペプチドまたは対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの使用の際の正確な多特異性応答をより容易に達成する。
【0127】
B44スーパータイプ、A1スーパータイプ、およびA24スーパータイプは、これらの主な人種集団において平均25%〜40%の範囲内で存在する(表XXIa)。全体的にみてあまり普及したものではないが、少なくとも1つの主な人種集団においてB27スーパータイプ、B58スーパータイプ、およびB62スーパータイプは各々25%を超える頻度で存在する(表XXIa)。表XXIbは、同定されたHLAスーパータイプの5つの主な人種における組み合わせた推定普及率を要約する。A2範囲、A3範囲、およびB7範囲がA1スーパータイプ、A24スーパータイプおよびB44スーパータイプを含むことまたは本明細書中に記載されるスーパータイプ全てを含むことにより得られる適用範囲の拡大が示されている。6つの最も頻度の高いスーパータイプ由来のエピトープを含むことによって、99%の平均集団適用範囲が5つの主な人種について得られる。
【0128】
A2スーパータイプ、A3スーパータイプおよびB7スーパータイプの上記の定義と共に本明細書中に示されるデータは、A29、B8、およびB46の除外が可能である全ての抗原が全部で9つのHLAスーパータイプに分類することができることを示す。6つの最も共通するスーパータイプに焦点を合わせると、主な人種集団すべての98%以上をカバーする集団適用範囲が与えられる。
【0129】
IV.F.免疫応答刺激ペプチドアナログ
スーパーファミリーの全ての対立遺伝子のうちの適切な交差反応性を有するペプチドが上記のスクリーニング方法によって同定されるが、交差反応性は常に完全とは限らず、その場合に、ペプチドの交差反応をさらに増加させる方法は有用であり得る;ペプチドの他の特性を改変するためにそのような方法も使用することができる。所与のモチーフまたはスーパーモチーフ内のHLA対立遺伝子のためのペプチドの交差反応を支配する一般的ルールを確立したならば、より広範な(さもなければ改変された)HLA結合能力を達成するために興味あるペプチドの構造の改変(すなわち、アナログ化)を行うことができる。より具体的には、(既知のT細胞エピトープおよび適当なスーパーモチーフを含むより伸長されたペプチドセットの双方の中で)最も広範な交差反応パターンを示すペプチドが、本明細書中の教示に従って作製され得る。
【0130】
使用したストラテジーは、特定のHLA分子への結合と相関するモチーフまたはスーパーモチーフを利用する。モチーフまたはスーパーモチーフは一次アンカーを有することによって定義されるが、二次アンカーを改変することもできる。アナログペプチドは、一次アンカー、二次アンカーにおいて、または一次アンカー位置および二次アンカー位置においてアミノ酸残基を置換することによって作製され得る。一般的には、アナログは、すでにモチーフまたはスーパーモチーフを保有するペプチドについて作製される。HLAクラスIおよびHLAクラスII結合ペプチドについて規定されているスーパーモチーフおよびモチーフの好ましい二次アンカー残基は、表IIおよびIIIにそれぞれ示される。
【0131】
本発明の多数のモチーフまたはスーパーモチーフについて、それぞれのモチーフまたはスーパーモチーフを結合するHLAスーパータイプの対立遺伝子特異的HLA分子またはメンバーに結合することが有害である残基が規定される(表IIおよびIII)。従って、結合が有害である残基の除去が、本発明に従って実行され得る。例えば、A3スーパータイプの場合、このような有害な残基を有する全てのペプチドが分析されたペプチドの集団から除去されると、交差反応性率が22%から37%に上昇する(例えば、Sidney,J.ら、Hu.Immunol.45:79、1996を参照のこと)。従って、所定のスーパーモチーフ内のペプチドの交差反応性を改善する1つのストラテジーは、単に、ペプチド内に存在する1つ以上の有害な残基を除去し、(ペプチドのT細胞認識に影響を与えない)小さな「中性」残基(例えば、Ala)を置換することである。ペプチド内の有害な残基の除去と共に、スーパーファミリー内の複数の対立遺伝子に対して高い親和性結合に関連する残基が挿入される場合、交差反応の増強が期待されるであろう。
【0132】
ワクチンとして使用される場合、アナログペプチドが、インビボでネイティブエピトープに対するCTL応答を実際に誘発する(またはクラスIIエピトープの場合、野生型ペプチドと交差反応するヘルパーT細胞を誘発する)ことを確実にするために、アナログペプチドを用いて適切なHLA対立遺伝子の個体からインビトロでT細胞を免疫することができる。その後、免疫された細胞の、野生型ペプチドに感作した標的細胞の溶解を誘導する能力が評価される。内因的に産生された抗原もが関連するT細胞によって認識されるか否かを確立するために、適切な遺伝子で感染またはトランスフェクトした抗原提示細胞として、あるいはクラスIIエピトープのみの場合はタンパク質抗原全体を用いてパルスされた抗原提示細胞として使用することが望ましい。
【0133】
適当な数の交差反応細胞結合因子を確実にする本発明の別の実施形態は、弱く結合するペプチドのアナログを作製することである。500〜5000nMの結合親和性を示し、かつ、1つまたは両方の位置において適用可能であるが最適下限の一次アンカーを有するクラスIペプチドは、それぞれのスーパータイプに従い好ましいアンカー残基を置換することによって「固定」することができる。次いで、このアナログペプチドは、交差結合活性について試験され得る。
【0134】
効果的なペプチドアナログを作製するための別の実施形態は、液体環境下でのペプチド安定性または可溶性に対して悪影響を有する残基の置換を含む。この置換は、ペプチドエピトープのいずれかの位置で生じ得る。例えば、システイン(C)は、α−アミノ酪酸を優先して置換され得る。この化学的性質のために、システインは、ジスルフィド架橋を形成する性向を有し、そしてペプチドを構造的に十分に改変し、結合能力を減少する。αアミノ酪酸でのCの置換は、この問題を多少とも解決するだけでなく、ある例(概説:A.Setteら、Persistent Viral Infections,R.AhmedおよびI.Chen編、John Wiley & Sons、英国(1999)を参照のこと)において結合能力および交差結合能力を実際に改善する。システインのα−アミノ酪酸での置換は、ペプチドエピトープのいずれかの残基(すなわち、アンカー位置または非アンカー位置のいずれか)において生じ得る。
一般的には、CTLおよびHTL応答は、全ての可能なエピトープに対して指向されない。それどころか、それらは、少数の「免疫優性(immunodominant)」決定基に制限される(Zinkernagelら、Adv.Immunol.27:5159、1979;Benninkら、J.Exp.Med.168:1935−1939(1988);Rawleら、J.Immunol.146:3977−3984(1991))。免疫優性(Benacerrafら、Science 175:273−279(1972))は、所定のエピトープの特定のHLAタンパク質を選択的に結合する能力(決定基選択理論)(Vitielloら、J.Immunol.131:1635(1983);Rosenthalら、Nature 267:156−158(1977))または既存のTCR(T細胞レセプター)特異性(レパートリー理論)によって選択的に認識する能力(Klein,J.、IMMUNOLOGY,THE SCIENCE OF SELFNONSELF DISCRIMINATION、John Wiley & Sons、New York、270−310頁(1982))のいずれかによって説明され得る。ほとんどがプロセシング事象と関連している追加の因子は、多くの潜在的な決定基のいずれが免疫優性として提示されるかについて厳密な免疫原性を超えて決定することにおいて、重要な役割をも果たし得ることが証明された(Sercarzら、Annu.Rev.Immunol.11:729−766(1993))。
【0135】
優性および亜優性の概念は、感染病および癌の両方の免疫療法と関係する。例えば、慢性ウイルス疾患の経過において、亜優性エピトープの補充は、特に、優性CTL特異性または優性HTL特異性がウイルス機構および他の機構の機能的寛容、抑制、変異によって不活化されている場合、感染を取り除くことに成功するために重要であり得る(Francoら、Curr.Opin.Immunol.7:524−531(1995))。癌抗原および腫瘍抗原の場合、最も高い結合親和性ペプチドの少なくともいくつかを認識するCTLは、機能的に不活化され得る。このような場合、より低い結合親和性ペプチドは、優先的に認識される。
【0136】
特に、公知の非ウイルス腫瘍関連抗原(TAA)由来の有意な数のエピトープが、中程度の親和性(50〜500nMの範囲のIC50)でHLAクラスIに結合することが注目されている。例えば、腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)またはCTLによって認識される15個の公知のTAAペプチドのうち8個が、50〜500nM範囲で結合することが見出されている。(これらのデータは、ペプチドとして認識される公知のウイルス抗原の90%が50nM未満のIC50を有するHLAと結合したが、50〜500nM範囲においては約10%のみが結合したという評価とは対称的である(Setteら、J.Immunol.、153:558−5592(1994))。癌の環境において、この現象は、推定ではT細胞寛容事象による、最も高い結合ペプチドのいくつかを認識するCTLの排除または機能的阻害によるものであろう。
【0137】
理論に拘束されることを意図するものではないが、優性エピトープに対するT細胞がクローン的に欠失され得るので、亜優性エピトープの選択によって残っているT細胞を補充することが可能となり、次いで、これは治療的応答を導くと考えられる。しかし、HLA分子の亜優性エピトープへの結合は、しばしば、優性のエピトープに対してよりも活動的ではない。従って、1つ以上のHLA分子に対する特定の免疫原性エピトープの結合親和性を調節し、それによって、ペプチドによって誘発される免疫応答を調節できる必要性がある。従って、より活動的な応答を誘発するアナログペプチドを調製することが求められている。この能力は、ペプチドベースのワクチンおよび治療剤の有用性を非常に増強する。
【0138】
代表的なアナログペプチドは、表XXIIに示される。表は、適切な場合、アナログペプチドおよびモチーフまたはスーパーモチーフの長さもしくは配列を示す。「固定された命名」の列にある情報は、それぞれのアナログについての示された位置番号において置換された残基を示す。
【0139】
IV.G.スーパーモチーフまたはモチーフを含有するペプチドについての、疾患関連抗原由来タンパク質配列のコンピュータスクリーニング
標的抗原におけるスーパーモチーフ保有エピトープまたはモチーフ保有エピトープを同定するために、ネイティブなタンパク質配列(例えば、腫瘍関連抗原)、または感染生物由来の配列、または移植のためのドナー組織由来の配列を、例えば、知的計算またはコンピュータなどのコンピュータ計算手段を用いてスクリーニングし、配列内のスーパーモチーフまたはモチーフの存在を決定する。ネイティブなペプチドの分析から得られた情報が、ネイティブなペプチドの状態を評価するために直接使用され得るか、またはペプチドエピトープを生成するために引き続き利用され得る。
【0140】
本願のスーパーモチーフまたはモチーフの発現のためのタンパク質配列を迅速にスクリーニングすることを可能にするコンピュータプログラムは、本発明により包含され、アナログペプチドの生成を可能にするプログラムも同様に含まれる。これらのプログラムは、任意の同定されたアミノ酸配列を分析するかまたは、未知の配列に関して操作し、そして同時に配列を決定し、そしてそのモチーフ保有エピトープを同定することが実行され;アナログが、その上、同時に決定され得る。一般的に、同定された配列は、病原性生物または腫瘍関連ペプチド由来である。例えば、本明細書中で考慮される標的分子は、すべてのHBVタンパク質(例えば、表面、コア、ポリメラーゼおよびX)が挙げられる。
【0141】
同じ標的タンパク質の複数の改変体の配列が入手できる場合、それらの保存に基づいてペプチドを選択することもできる。保存率について現在好ましい基準は、ペプチドの配列全体が、特定のタンパク質について評価された配列の75%が合計で保存されることを規定している。保存のこの規定は、本明細書中で使用されている。
【0142】
ペプチド結合の予測のために利用される選択基準は、実際の結合と最も効果的に相関するために、可能な限り正確であることが重要である。適切な一次アンカーの存在に基づいて、例えば、HLA−A*0201に結合するペプチドの予測は、約30%の割合でポジティブである(Ruppert,J.ら、Cell 74:929、1993)。しかし、広範囲のペプチド−HLA結合データベースを分析することにより、本発明者らは、一次アンカー残基単独の存在に基づく同定に対して、予測値を劇的に増大する多数の対立遺伝子特異的多項式アルゴリズムを開発した。これらのアルゴリズムは、正確な一次アンカーの存在または非存在を考慮するだけでなく、(異なる位置における異なるアミノ酸の影響を説明するために)二次アンカー残基のポジティブな存在または有害な存在も考慮に入れる。このアルゴリズムは、本質的に、ペプチドHLA相互作用の全体の親和性(またはΔG)がこの型の一次多項式関数として近似され得るという前提に基づき:
ΔG=a1i×a2i×a3i...×ani
ここで、ajiは、n個のアミノ酸のペプチドの配列に沿った、所定の位置(i)における所定のアミノ酸(j)の存在の効果を示す係数である。この方法の重要な仮定は、各位置における効果が、本質的に、各他の位置の効果と独立していることである。この仮定は、ペプチドがHLA分子に結合し、かつ、本質的に伸長したコンホメーションのT細胞により認識されることを示す研究により立証される。特定のアルゴリズム係数の誘導が、Gulukotaら(Gulukota,K.ら、J.Mol.Biol.267:1258、1997)に記載されている。
【0143】
特定のモチーフをも利用する、好ましいペプチド配列を同定するためのさらなる方法は、神経回路網の使用および分子モデルプログラムの使用を含む(例えば、Milikら、Nature Biotechnology 16:753、1998;Altuviaら、Hum.Immunol.58:1、1997;Altuviaら、J.Mol.Biol.249:244、1995;Buus,S.Curr.Opin.Immunol.11:209−213、1999;Brusic,V.ら、Bioinformatics 14:121−130、1998;Parkerら、J.Immunol.152:163、1993;Meisterら、Vaccine 13:581、1995;Hammerら、J.Exp.Med.180:2353、1994;Sturnioloら、Nature Biotechnol.17:555 1999を参照のこと)。
【0144】
例えば、A*0201モチーフペプチドのセットにおいて、少なくとも1つの好ましい二次アンカー残基を含むペプチドの69%が、任意の有害な二次アンカー残基の存在を回避しながら、500nM未満のIC50を有するA*0201を結合することが示されている(Ruppert,J.ら、Cell 74:929、1993)。これらのアルゴリズムは、カットオフスコアが、所望の通り、より高いかまたはより低い予測結合特性を有するペプチドセットを選択するように調節され得る点でも柔軟である。
【0145】
ペプチドエピトープを同定するためのコンピュータスクリーニングを利用することにおいて、タンパク質配列または翻訳された配列のすべてが、モチーフを探索するために開発されたソフトウェア(例えば、[FINDPATTERNS]プログラム(Devereuxら、Nucl.Acids Res.12:387−395、1984)またはMotifSearch 1.4ソフトウェアプログラム(D.Brown、San Diego、CA))を使用して分析され、適切なHLA結合モチーフを含む潜在的なペプチド配列を同定し得る。当業者に理解されるように、既知または未知のペプチド配列に関連して本発明のモチーフを実行するために使用され得るコンピュータプログラミングソフトウェアおよびハードウェアオプションの大きなアレイが、利用可能である。次いで、同定されたペプチドは、カスタマイズされた多項式アルゴリズムを使用してスコアされ、特異的なHLAクラスI対立遺伝子またはクラスII対立遺伝子を結合するそれらペプチドの能力を予測する。
【0146】
上記の手順に従って、HLAスーパータイプ群または対立遺伝子特異的HLA分子を結合し得るHBVペプチドおよびそのアナログが同定された(表VII−XX;表XXII)。
【0147】
IV.H.ペプチドエピトープの調製
本発明のペプチドは、組換えDNA技術または化学合成により、あるいは天然の供給源(例えば、ネイティブな腫瘍または病原性生物)から合成的に調製され得る。ペプチドエピトープは、個々に合成され得るか、またはポリエピトープペプチドとして合成され得る。このペプチドは、好ましくは、他の天然の宿主タンパク質およびそのタンパク質フラグメントを実質的に含まないが、いくつかの実施形態において、このペプチドは、ネイティブなフラグメントまたは粒子に合成的に結合され得る。
【0148】
本発明のペプチドは、種々の長さとすることができ、それらの中和(荷電していない)形態または塩の形態のいずれかとすることができる。本発明のペプチドは、グリコシル化、側鎖の酸化またはリン酸化などの改変がされていないか、あるいは該ペプチドがこれらの改変を含み、本明細書中に記載されるように、改変がペプチドの生物学的活性を破壊しない条件に供される。
【0149】
可能な場合、ポリエピトープの構築において用い得たのと同様に、約8個〜約13個のアミノ酸残基、しばしば8個〜11個、好ましくは9個〜10個のアミノ酸残基の長さに、本発明のHLAクラスI結合ペプチドエピトープを最適化することが所望され得る。HLAクラスII結合ペプチドエピトープは、約6〜約30アミノ酸長の長さ、好ましくは約13個と約20個の残基との間に、最適化され得る。ペプチドエピトープは、関連HLA分子に結合する内因的にプロセシングされた病原体由来ペプチドまたは腫瘍細胞ペプチドとサイズが比例していることが好ましいが、本発明のエピトープを含むペプチドの同定および調製も本明細書中に記載される技術を使用して実行され得る。
【0150】
代替の実施形態において、本発明のエピトープが、ポリエピトープペプチドとしてまたはポリエピトープペプチドをコードするミニ遺伝子として、連結され得る。
【0151】
別の実施形態において、高濃度のクラスIエピトープおよび/またはクラスIIエピトープを含むネイティブなペプチド領域を同定することが好まれる。このような配列は、一般に、この配列が1個のアミノ酸長あたり最も多数のエピトープを含むことに基づいて、選択される。エピトープは、入れ子型(nested)または重複する様式で存在し得ることが理解され、例えば、10個のアミノ酸長のペプチドは9個のアミノ酸長エピトープを2つおよび10個のアミノ酸長のエピトープを1つ含むことができ;細胞内プロセシングに際して、各エピトープは、そのようなペプチドの投与の際にHLA分子により曝露されかつ結合され得る。このより大きい、好ましくは複数のエピトープのペプチドが、合成的により、組換えにより、またはネイティブな供給源からの切断を介して生成され得る。
【0152】
本発明のペプチドは、広範な種々の方法において調製され得る。好ましい比較的短いサイズのため、従来の技術に従って溶液中または固体支持体上でペプチドを合成することができる。種々の自動合成装置が市販され、公知のプロトコルに従って使用され得る(例えば、Stewart & Young、SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS、2D.ED.、Pierce Chemical Co.、1984を参照のこと)。さらに、個々のペプチドエピトープが化学的連結を使用して結合され、本発明の範囲内になおある、より大きいペプチドを産生し得る。
【0153】
あるいは、目的の免疫原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を、発現ベクター中に挿入するかあるいは適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトし、発現のための適切な条件下で培養する、組換えDNA技術を用いることができる。これらの方法は一般に当該分野で公知であり、Sambrookら、MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、New York(1989)に一般に記載される。従って、本発明の1つ以上のペプチド配列を含む組換えポリペプチドが、適切なT細胞エピトープを提示するために使用され得る。
【0154】
本明細書中で実行される好ましい長さのペプチドエピトープについての配列をコードするヌクレオチドが、化学的技術(例えば、Matteucciら、J.Am.Chem.Soc.103:3185(1981)のリン酸トリエステル法)により合成され得る。ペプチドアナログは、ネイティブなペプチド配列をコードする塩基を適切かつ所望の核酸塩基に置換することにより、簡単に作製することができ;例示的な核酸置換は、本明細書中のモチーフ/スーパーモチーフにより規定されるアミノ酸をコードする核酸置換である。次いで、適切なリンカーを用いてコード配列を提供し、当該分野で市販されている発現ベクターに連結し、所望の融合タンパク質を産生するためにそのベクターを用いて適切な宿主を形質転換する。多数のこのようなベクターおよび適切な宿主系が、現在入手できる。融合タンパク質の発現のために、コード配列は、操作可能に連結される開始コドンおよび停止コドン、プロモーター領域およびターミネーター領域ならびに所望の細胞性宿主における発現のための発現ベクターを提供する通常の複製系を用いて提供される。例えば、細菌性宿主と互換性のあるプロモーター配列が、所望のコード配列の挿入のための都合の良い制限部位を含むプラスミドに提供される。得られた発現ベクターは、適切な細菌性宿主に形質転換される。もちろん、酵母細胞宿主、昆虫細胞宿主または哺乳動物細胞宿主も、適切なベクターおよびコントロール配列を使用して、使用され得る。
【0155】
IV.I.T細胞応答を検出するためのアッセイ
一旦HLA結合ペプチドが同定されると、それらはT細胞応答を惹起する能力について試験され得る。モチーフ保有ペプチドの調製および評価は、国際公開第94/20127号パンフレットおよび国際公開第94/03205号パンフレットに記載される。簡潔に、特定の抗原由来のエピトープを含むペプチドが合成され、そして適切なHLAタンパク質に結合するそれらの能力について試験される。これらのアッセイは、放射ヨウ素標識された参照ペプチドの結合に関連して、精製されたHLAクラスI分子への本発明のペプチドの結合を評価する工程を包含する。あるいは、エンプティークラスI分子(すなわち、その中のペプチドを欠く)を発現する細胞は、免疫蛍光染色およびフローマイクロ蛍光測定により、ペプチド結合について評価され得る。ペプチド結合を評価するために使用され得る他のアッセイとしては、ペプチド依存性クラスIアセンブリアッセイおよび/またはペプチド競合によるCTL認識の阻害が挙げられる。典型的に500nM以下の親和性でクラスI分子に結合するこれらのペプチドは、さらに、感染した個体または免疫した個体由来のCTLに対する標的として機能するそれらの能力、および疾患に関連した選択された標的細胞と反応し得るCTL集団を生じる1次インビトロまたはインビボCTL応答を誘導し得るそれらの能力について評価される。
【0156】
類似のアッセイは、HLAクラスII結合ペプチドの評価のために使用される。典型的には1000nM以下の親和性で結合することが示されるHLAクラスIIモチーフ保有ペプチドは、さらに、HTL応答を刺激する能力について評価される。
【0157】
T細胞応答を検出するために利用される従来のアッセイとしては、増殖アッセイ、リンホカイン分泌アッセイ、直接的細胞傷害性アッセイ、および限界希釈アッセイが挙げられる。例えば、ペプチドと共にインキュベートされる抗原提示細胞は、レスポンダー細胞集団においてCTL応答を誘導する能力についてアッセイされ得る。抗原提示細胞は、通常の細胞(例えば、末梢血単核細胞または樹状細胞)であり得る。あるいは、内部でプロセシングされたペプチドでクラスI分子を負荷(load)する能力を欠き、かつ、適切なヒトクラスI遺伝子でトランスフェクトされた変異体非ヒト哺乳動物細胞株が、インビトロ1次CTL応答を誘導するペプチドの能力を試験するために使用され得る。
【0158】
末梢血単核細胞(PBMC)は、CTL前駆体のレスポンダー細胞供給源として使用され得る。適切な抗原提示細胞をペプチドと共にインキュベートし、インキュベート後、次いでペプチド負荷された抗原提示細胞を最適化された培養条件下でレスポンダー細胞集団とともにインキュベートする。ポシティブCTL活性は、放射線標識された標的細胞(特異的ペプチドパルス標的およびペプチド配列が由来する抗原の内因的にプロセシングされた形態を発現する標的細胞の両方)を殺傷するCTLの存在について培養物をアッセイすることによって決定され得る。
【0159】
さらに、蛍光標識HLAテトラマー複合体を用いて染色することによって、抗原特異的T細胞の直接的な定量を可能にする方法が考え出されている(Altman,J.D.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10330、1993;Altman,J.D.ら、Science 274:94、1996)。他の比較的最近の技術的な発達は、細胞内リンホカインに対する染色、およびインターフェロン放出アッセイまたはELISPOTアッセイを含む。テトラマー染色、細胞内リンホカイン染色およびELISPOTアッセイは、全て、従来のアッセイより少なくとも10倍感度が高いようである(Lalvani,A.ら、J.Exp.Med.186:859、1997;Dunbar,P.R.ら、Curr.Biol.8:413、1998;Murali−Krishna,K.ら、Immunity 8:177、1998)。
【0160】
HLT活性化も、T細胞増殖およびリンホカイン(例えば、IL−2)分泌などの当業者に公知のこのような技術を使用して評価され得る(例えば、Alexanderら、Immunity 1:751−761、1994を参照のこと)。
【0161】
あるいは、HLAトランスジェニックマウスの免疫化が、ペプチドエピトープの免疫原性を決定するために使用され得る。ヒトA2.1対立遺伝子、ヒトA11対立遺伝子(これらは、HLA−A3エピトープを分析するためにさらに使用され得る)、およびヒトB7対立遺伝子を有するマウスを含むいくつかのトランスジェニックマウスモデルが特徴付けられ、そして他のもの(例えば、HLA−A1およびA24についてのトランスジェニックマウス)が開発されている。HLA−DR1およびHLA−DR3マウスモデルも開発されている。他のHLA対立遺伝子を有するさらなるトランスジェニックマウスモデルが、必要ならば作製され得る。マウスは、不完全フロイントアジュバント中に乳化されたペプチドで免疫化され得、そして生じたT細胞を、ペプチドパルスされた標的細胞および適切な遺伝子でトランスフェクトされた標的細胞を認識するそれらの能力について試験した。CTL応答が上記の細胞傷害性アッセイを使用して分析され得る。同様に、HTL応答が、T細胞増殖またはリンホカイン分泌などのアッセイを使用して分析され得る。
【0162】
免疫原性ペプチドエピトープが、表XXIIIに記載される。
【0163】
III.J.診断薬剤としての、および免疫応答を評価するためのペプチドエピトープの使用
本発明の1つの態様において、本明細書中に記載されるHLAクラスIおよびクラスII結合ペプチドは、免疫応答を評価するための試薬として使用される。評価される免疫応答は、免疫源として任意の薬剤を使用することによって誘導され、この任意の薬剤は、試薬として使用されるペプチドエピトープ(単数または複数)を認識し、それに結合する、抗原特異的CTLまたはHTLを産生を生じ得る。このペプチド試薬は、免疫原として使用される必要がない。このような分析について使用されるアッセイ系は、比較的最近の技術開発(例えば、テトラマー、細胞内リホカインの染色およびインターフェロン放出アッセイ、またはELISPOTアッセイ)を含む。
【0164】
例えば、本発明のペプチドは、病原または免疫原への暴露に続いて、抗原特異的CTLの存在について末梢血単核細胞を評価するためのテトラマー染色アッセイにおいて使用される。HLA−テトラマー複合体は、抗原特異的CTLを直接可視化するために使用され(例えば、Oggら、Science 279:2103−2106、1998;およびAltmanら、Science 174:94−96、1996)、そして末梢血単核細胞のサンプル中における抗原特異的CTL集団の頻度を決定する。
【0165】
本発明のペプチドを使用するテトラマー試薬は、以下のように生成される:HLA分子に結合するペプチドを対応するHLA重鎖およびβ2−ミクログロブリンの存在下でリフォールディリングして、3分子複合体を生成する。この複合体は、以前にタンパク質に操作された部位で重鎖のカルボキシル末端でビオチン化される。次いで、テトラマー形成がストレプトアビジンの添加によって誘導される。蛍光標識されたストレプトアビジンによって、このテトラマーは、抗原特異的細胞を染色するために使用され得る。次いで、これらの細胞は、例えば、フローサイトメトリーによって容易に同定され得る。このような手順は、診断目的または予後目的のために使用され得る。この手順によって同定された細胞はまた、治療目的のために使用され得る。
【0166】
本発明のペプチドはまた、免疫リコール応答を評価するための試薬として使用され得る。(例えば、Bertoniら、J.Clin.Invest.100:503−513、1997およびPennaら、J.Exp.Med.174:1565−1570、1991を参照のこと)。例えば、HPV感染した個体由来の患者PBMCサンプルは、特定のペプチドを使用して抗原特異的CTLまたはHTLの存在について分析され得る。PBMCを培養し、本発明のペプチドで細胞を刺激することによって、単核細胞を含む血液サンプルを評価し得る。適切な培養期間の後、拡大した細胞集団が、例えば、CTLまたはHTL活性について分析され得る。
【0167】
このペプチドはまた、ワクチンの効力を評価するための試薬として使用される。免疫原と共にワクチン接種された患者から得られたPBMCは、例えば、上記の方法のいずれかを使用して分析され得る。患者は、HLA型であり、そしてその患者に存在する対立遺伝子特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬が分析のために選択される。ワクチンの免疫原性は、PBMCサンプル中のHPVエピトープ特異的CTLおよび/またはHTLの存在によって示される。
【0168】
本発明のペプチドはまた、当該分野で周知の技術を使用して、抗体を作製するために使用され得る(例えば、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY、Wiley/Greene、NY;およびAntibodies A Laboratory Manual Harlow、Harlow and Lane、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989を参照のこと)。これらは、HPV感染を診断するための試薬として有用であり得る。このような抗体は、HLA分子のコンテクストにおいてペプチドを認識する抗体(すなわち、ペプチド−MHC複合体に結合する抗体)を含む。
【0169】
IV.K.ワクチン組成物
ワクチンおよび本明細書中に記載されるような免疫原性的に有効量の1つまたは複数のペプチドを含むワクチンを調製する方法は、本発明のさらなる実施形態である。一旦適切に免疫原性エピトープが規定されると、それらは、種々の手段によって分類され、そして送達され得、本明細書中で、「ワクチン」組成物といわれる。このようなワクチン組成物としては、例えば、リポペプチド(例えば、Vitiello,A.ら、J.Clin.Invest.95:341、1995)、ポリ(DL−ラクチド−co−グリコリド)(「PLG」)マイクロスフィアにカプセル化されたペプチド組成物(例えば、Eldridgeら、Molec.Immunol.28:287−294、1991:Alonsoら、Vaccine 12:299−306、1994;Jonesら、Vaccine 13:675−681、1995を参照のこと)、免疫刺激複合体(ISCOMS)に含まれるペプチド組成物(例えば、Takahashiら、Nature 344:873−875、1990;Huら、Clin Exp Immunol.113:235−243、1998を参照のこと)、多抗原ペプチド系(MAP)(例えば、Tam,J.P.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5409−5413、1988;Tam,J.P.、J Immunol.Methods 196:17−32、1996を参照のこと)、多価ペプチドとして処方されたペプチド;弾道的(ballistic)送達システムで使用するペプチド、典型的には結晶ペプチド、ウイルス送達ベクター(Perkus,M.E.ら、Concepts in vaccine development、Kaufmann,S.H.E.,編、379頁、1996;Chakrabarti,S.ら、Nature 320:535、1986;Hu,S.L.ら、Nature 320:537、1986;Kieny,M.−P.ら、AIDS Bio/Technology 4:790、1986;Top,F.H.ら、J.Infect.Dis.124:148、1971;Chanda,P.K.ら、Virology 175:535、1990)、ウイルスまたは合成起源の粒子(例えば、Kofler,N.ら、J.Immunol.Methods.192:25、1996;Eldridge,J.H.ら、Sem.Hematol.30:16、1993;Falo,L.D.,Jr.ら、Nature Med.7:649、1995)、アジュバンド(Warren,H.S.、Vogel,F.R.、およびChedid,L.A.Annu.Rev.Immunol.4:369、1986;Gupta,R.K.ら、Vaccine 11:293、1993)、リポソーム(Reddy,R.ら、J.Immunol.148:1585、1992;Rock,K.L.、Immunol.Today 17:131、1996)、あるいは、裸cDNAまたは粒子吸収cDNA(Ulmer,J.B.ら、Science 259:1745、1993;Robinson,H.L.、Hunt,L.A.、およびWebster,R.G.、Vaccine 11:957、1993;Shiver,J.W.ら、Concepts in vaccine development、Kaufmann,S.H.E.,編、423頁、1996;Cease,K.B.、およびBerzofsky,J.A.、Annu.Rev.Immunol.12:923、1994ならびにEldridge,J.H.ら、Sem.Hematol.30:16、1993)が挙げられる。毒素標的化送達技術(レセプター媒介標的化としても公知であり、例えば、Avant Immunotherapeutics,Inc.(Needham、Massachusetts)の技術)も使用され得る。
【0170】
本発明のワクチン組成物は、核酸媒介様式を含む。1つまたは複数の本発明のペプチドをコードするDNAまたはRNAも患者に投与され得る。このアプローチは、例えば、Wolffら、Science 247:1465(1990)ならびに米国特許第5,580,859号;同第5,589,466号;同第5,804,566号;同第5,739,118号;同第5,736,524号;同第5,679,647号;国際公開第98/04720号パンフレット;および以下により詳細に記載される。DNAベースの送達技術の例には、「裸DNA」、促進された(ブピバカイン、ポリマー、ペプチド−媒介)送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介送達(「遺伝子銃」)または圧力媒介送達(例えば、米国特許第5,922,687号を参照のこと)が挙げられる。
【0171】
治療または予防免疫目的のために、本発明のペプチドはまた、ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって発現され得る。発現ベクターの例としては、弱毒化ウイルス宿主(例えば、ワクシニアまたは鶏痘)が挙げられる。このアプローチは、例えば、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしてワクシニアウイルスの使用を含む。急性または慢性感染した宿主または非感染宿主への導入の際に、組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、それによって、宿主にCTLおよび/またはHTL応答を惹起させる。ワクシニアベクターおよび免疫化プロトコルにおいて有用な方法は、例えば、米国特許第4,722,848号に記載される。別のベクターは、BCG(カルメット−ゲラン杆菌)である。BCGベクターは、Stoverら、Nature 351:456−460(1991)に記載される。本発明のペプチドの治療的投与または免疫化のために有用な広範な種々の他のベクター(例えば、アデノウイルスおよびアデノ衛星ウイルスのベクター、レトロウイルスベクター、Salmonella typhiベクター、解毒化炭疽毒素ベクターなど)は、本明細書中の説明から当業者に明らかである。
【0172】
さらに、本発明のワクチンは、特許請求されたペプチドの1つ以上の組成物を包含する。ペプチドは、ワクチン中に個々に存在し得る。あるいは、このペプチドは、同じペプチドの複数のコピーを含むホモポリマーとして、または種々のペプチドのヘテロポリマーとして存在し得る。ポリマーは、免疫学的反応の増加という利点を有し、そして異なるペプチドエピトープが、ポリマーを作り上げるために使用される場合、免疫応答について標的化された病原性生物または腫瘍関連ペプチドの異なる抗原決定基と反応する抗体および/またはCTLを誘導するさらなる能力を有する。組成物は、抗原の天然に存在する領域であり得るか、または例えば、組換えによりまたは化学合成によって調製され得る。
【0173】
本発明のワクチンと共に使用されるキャリアは、当該分野で周知であり、例えば、サイログロブリン、ヒト血清アルブミンのようなアルブミン、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸(例えば、ポリL−リジン、ポリL−グルタミン酸)、インフルエンザ、B型肝炎ウイルスコアタンパク質などが挙げられる。このワクチンは、生理学的に許容可能な(すなわち、受容可能な)希釈剤(例えば、水、または生理食塩水、好ましくはリン酸緩衝化生理食塩水)を含み得る。このワクチンはまた、典型的に、アジュバントを含む。不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはミョウバンのようなアジュバントは、当該分野で周知の材料の例である。さらに、本明細書中に記載されるように、CTL応答は、本発明のペプチドを脂質(例えば、トリパルミトイル−S−グリセリルシステイニルセリル−セリン(P3CSS))に共役することによってプライムされ得る。
【0174】
注射、エアロゾル、経口、経皮、経粘膜、胸膜腔内、鞘内または他の適切な経路を介する、本発明のペプチド組成物を用いる免疫化の際に、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な、多量のCTLおよび/またはHTLを生成することによって、ワクチンに応答する。その結果、この宿主は、後の感染に対して少なくとも部分的に免疫となるか、または進行中の慢性感染の発症に対して少なくとも部分的に耐性となるか、あるいは抗原が腫瘍関連である場合、少なくともいくつかの治療的利点を得る。
【0175】
いくつかの実施形態において、クラスIペプチド成分を、目的の標的抗原への中和抗体応答および/またはヘルパーT細胞応答を誘導するか、または促進する成分と組み合わせることが所望され得る。このような組成物の好ましい実施形態は、本発明のクラスIおよびクラスIIエピトープを含む。このような組成物の代替的実施形態は、PanDR分子、例えば、PADRE(登録商標)(Epimmune、San Diego、CA;例えば、米国特許第5,736,142号に記載される)と共に、本発明のクラスIおよび/またはクラスIIエピトープを含む。
【0176】
本発明のワクチンはまた、本発明のペプチドを提示するためのビヒクルとして、抗原提示細胞(APC)、例えば、樹状細胞(DC)を含み得る。ワクチン組成物は、樹状細胞の動員および採取に続き、インビトロで作製され得、これによって、樹状細胞の負荷がインビトロで起こる。例えば、樹状細胞は、例えば、本発明のミニ遺伝子でトランスフェクトされるか、ペプチドでパルス処理される。次いで、この樹状細胞が、インビボで免疫応答を惹起するために、患者に投与され得る。
【0177】
ワクチン組成物は、DNAベースであれペプチドベースであれ、樹状細胞の動員と組み合わせてインビボで投与し、これにより樹状細胞のインビボでの負荷が引き起こされる。
【0178】
同様に、抗原性ペプチドが、エキソビボでCTLおよび/またはHTL応答を惹起するために使用される。得られるCTLまたはHTL細胞は、治療の他の従来の形態に応答しない、または本発明の治療的ワクチンペプチドまたは核酸に応答しない患者における慢性感染または腫瘍を処置するために使用され得る。特定の抗原(例えば、感染または腫瘍関連抗原)へのエキソビボCTLまたはHTL応答は、DCなどのAPCの供給源と共に、患者の、または遺伝子的に適合性のCTLもしくはHLT前駆細胞、および適切な免疫原性ペプチドを、組織培養でインキュベートすることによって誘導される。前駆細胞が活性化され、そしてエフェクター細胞に拡張される適切なインキュベート時間(典型的には約7〜28日間)の後、これらの細胞は、患者に注入して戻され、ここで、それらは、それらの特異的標的細胞(感染した細胞または腫瘍細胞)を破壊するか、またはこれらの破壊を促進する。トランスフェクトされた樹状細胞はまた、抗原提示細胞として使用され得る。
【0179】
本発明のワクチン組成物はまた、INFγなどのような免疫アジュバントとの組合せ使用を含め、慢性ウイルス感染に対して使用される他の処置と組み合わせて使用され得る。
【0180】
好ましくは、ワクチンにおける使用のためのポリエピトープ組成物への含有のため、またはワクチンに含まれそして/またはミニ遺伝子のような核酸によってコードされる個別のエピトープを選択するためにエピトープのアレイを選択する場合、以下の原理が利用される。以下の原理の各々は、選択をなすために釣り合いを取ることが好ましい。所定のワクチン組成物に組み込まれる複数のエピトープは、エピトープから誘導されるネイティブな抗原中の配列において連続であり得るが、その必要はない。
【0181】
1.)投与の際、HBV除去と相関されることが観測されている模倣免疫応答エピトープが選択される。HLAクラスIについて、これは、HBVの少なくとも1つの抗原由来の3〜4エピトープを含む。換言すれば、自然にHBVを解消した患者においては、彼らが少なくとも1つのHBV抗原に対して少なくとも3つのエピトープに対する免疫応答を生成したことが観察された。HLAクラスIIについて、類似の原理が使用される;再び、3〜4エピトープが、少なくとも1つのHBV抗原から選択される(例えば、Rosenbergら、Science 278:1447−1450を参照のこと)。
【0182】
2.)免疫原性を相関付けされるように確立された必要な結合親和性を有するエピトープが選択される:HLAクラスIについて、500nM以下のIC50、しばしば200nM以下のIC50;およびクラスIIについて、1000nM以下のIC50。
【0183】
3.)十分なスーパーモチーフ保有ペプチド、または対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイが、広い集団適用範囲を与えるために選択される。例えば、少なくとも80%の集団適用範囲を有することが好ましい。モンテカルロ分析(当該分野で公知の統計的評価)は、集団適用範囲の広がりまたは重複性を評価するために使用され得る。
【0184】
4.)癌関連抗原からエピトープを選択する場合、アナログを選択することがしばしば有用である。なぜなら、患者は、ネイティブのエピトープに対して発達した寛容性を有し得るからである。感染性疾患関連抗原についてのエピトープを選択する場合、ネイティブのエピトープまたはアナログエピトープのいずれかを選択することが好ましい。
【0185】
5.)「入れ子型(nested)エピトープ」といわれるエピトープが特に適切である。入れ子型エピトープは、少なくとも2つのエピトープが所定のペプチド配列において重複する場合に生じる。入れ子型ペプチド配列は、HLAクラスIおよびHLAクラスIIの両方のエピトープを含み得る。入れ子型エピトープが提供される場合、配列当たり最も大きな数のエピトープを有する配列を提供することが一般的目的である。したがって、1つの形態では、ペプチドにおけるアミノ末端エピトープのアミノ末端およびカルボキシ末端エピトープのカルボキシル末端よりも長いペプチドを提供することが回避される。複数エピトープ配列(例えば、入れ子型エピトープを含む配列)が提供される場合、一般に、病理学的または他の有害な生物学的特性を有さないことを確実にするために配列をスクリーニングすることが重要である。
【0186】
6.)ポリエピトープタンパク質が作製される場合、またはミニ遺伝子を作製する場合、目的のエピトープを包含する最も小さなペプチドを作製することが目的である。この原理は、入れ子型エピトープを含むペプチドを選択する場合に使用されるものと同じでない場合に、類似する。しかし、人工のポリエピトープペプチドの場合、サイズを最小化する目的は、ポリエピトープタンパク質中のエピトープの間の任意のスペーサー配列を組み込む必要性に対して釣り合いが取られる。スペーサーアミノ酸残基は、例えば、接合部エピトープ(免疫系によって認識されるが、標的抗原に存在せず、そしてエピトープの人工並位(man−made Juxtaposition)によって作製されるのみのエピトープ)を回避するために、またはエピトープ間の切断を容易にし、それによってエピトープ提示を増強するために、導入され得る。接合部エピトープは、一般に、回避される。なぜなら、レシピエントは、非ネイティブエピトープに対する免疫応答を生成し得るからである。「優性エピトープ」である接合部エピトープが、特に関係する。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が減少されるかまたは抑制される激しい(zealous)応答を導き得る。
【0187】
7.)同一の目標タンパク質の多数の変種の配列が利用可能な場合、その保存性に基づいて可能性のあるペプチドエピトープを選択することもできる。例えば、保存性の基準は、HLAクラスI結合ペプチドの配列全体またはHLAクラスIIの9マーのコア全体が、特定のタンパク質抗原について評価される配列の指定されたパーセンテージにおいて保存されていることを規定してもよい。
【0188】
IV.K.1.ミニ遺伝子ワクチン
複数のエピトープの同時送達を可能にする多くの異なるアプローチが利用可能である。本発明のペプチドをコードする核酸は、特に有用な、本発明の実施形態である。ミニ遺伝子の封入のためのエピトープは、好ましくは、前節に記載されるガイドラインに従って選択される。本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段は、本発明の1または複数のエピトープを含むペプチドをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。
【0189】
複数エピトープミニ遺伝子の使用は、以下および例えば、同時係属出願中の米国特許出願第09/311,784号;Ishiokaら、J.Iminunol.162:3915−3925、1999;An,L.およびWhitton,J.L.、J.Virol.71:2292、1997;Thomson,S.A.ら、J.Immunol.157:822、1996;Whitton,J.L.ら、J.Virol.67:348、1993;Hanke,R.ら、Vaccine 16:426、1998に記載される。例えば、1種または複数のHBV抗原の複数の領域由来のスーパーモチーフ保有エピトープおよび/またはモチーフ保有エピトープをコードする複数エピトープDNAプラスミド、万能(universal)ヘルパーT細胞エピトープ、例えばPADRE(登録商標)(またはHBV抗原由来の複数のHTLエピトープ)、および小胞体−転位シグナル配列が操作され得る。ワクチンは他のTAAに由来するエピトープを含んでもよい。
【0190】
多エピトープミニ遺伝子の免疫原性は、試験されるエピトープに対するCTL誘導応答の大きさを評価するために、トランスジェニックマウスにおいて試験され得る。さらに、インビボでのDNAコードエピトープの免疫原性は、DNAプラスミドでトランスフェクトされた標的細胞に対する特定のCTL系統のインビトロ応答と相関され得る。従って、これらの実験は、ミニ遺伝子が、1.)CTL応答を生成すること、そして2.)誘導されたCTLが、コードされたエピトープを発現する細胞を認識することの両方に役立つということを示し得る。
【0191】
例えば、ヒト細胞における発現のための選択されたエピトープ(ミニ遺伝子)をコードするDNA配列を作製するために、これらのエピトープのアミノ酸配列を逆転写し得る。ヒトコドン使用頻度表を使用して、各アミノ酸についてのコドン選択を導き得る。これらのエピトープコードDNA配列は、翻訳された場合に、連続的なポリペプチド配列が作製されるように、直接的に隣接され得る。発現および/または免疫原性を最適化するために、さらなるエレメントが、そのミニ遺伝子設計に組み込まれ得る。逆転写され得、そしてそのミニ遺伝子配列に含まれ得るアミノ酸配列の例としては、以下が挙げられる:HLAクラスIエピトープ、HLAクラスIIエピトープ、ユビキチン化シグナル配列および/または小胞体ターゲッティングシグナル。さらに、CTLエピトープおよびHTLエピトープのHLA提示は、そのCTLエピトープまたはHTLエピトープに隣接する、合成の(例えば、ポリアラニン)または天然に存在する隣接配列を含むことによって改変され得;そのエピトープを含むこれらのより大きいペプチドは、本発明の範囲内にある。
【0192】
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子の+鎖および−鎖をコードするオリゴヌクレオチドをアセンブルすることによってDNAに変換され得る。重複オリゴヌクレオチド(30〜100塩基長)が、周知技術を使用して適切な条件下で、合成、リン酸化、精製およびアニーリングされ得る。これらのオリゴヌクレオチドの末端は、例えば、T4 DNAリガーゼを使用して連結され得る。次いで、エピトープポリペプチドをコードする、この合成ミニ遺伝子は、所望の発現ベクターにクローニングされ得る。
【0193】
好ましくは、当業者に周知の標準的な調節配列が、標的細胞における発現を確実にするためにベクターに含まれる。以下のいくつかのベクターエレメントが所望される:ミニ遺伝子挿入物のための下流クローニング部位を含むプロモーター;効率的な転写終結のためのポリアデニル化シグナル;E.coli複製起点;およびE.coli選択マーカー(例えば、アンピシリン耐性またはカナマイシン耐性)。多くのプロモーター(例えば、ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)プロモーター)が、この目的に使用され得る。他の適切なプロモーター配列については、例えば、米国特許第5,580,859号および米国特許第5,598,466号を参照のこと。
【0194】
さらなるベクター改変が、ミニ遺伝子の発現および免疫原性を最適化するために所望され得る。いくつかの場合において、イントロンが、効率的な遺伝子発現に必要とされ、そして1以上の合成イントロンまたは天然に存在するイントロンが、ミニ遺伝子の転写される領域に組み込まれ得る。mRNA安定化配列および哺乳動物細胞における複製のための配列の包含もまた、ミニ遺伝子発現を増大するために考慮され得る。
【0195】
一旦、発現ベクターを選択すると、ミニ遺伝子を、プロモーターの下流のポリリンカー領域内にクローニングする。このプラスミドを、適切なE.coli株に形質転換し、そしてDNAを、標準的な技術を使用して調製する。ミニ遺伝子の方向およびDNA配列、ならびにベクターに含まれる他の全てのエレメントは、制限マッピングおよびDNA配列分析を使用して確認される。正しいプラスミドを保有する細菌細胞は、マスター(master)細胞バンクおよびワーキング(working)細胞バンクとして保存される。
【0196】
さらに、免疫刺激配列(ISSまたはCpG)は、DNAワクチンの免疫原性において役割を果たすようである。これらの配列は、免疫原性の増強が所望される場合に、そのベクター中のミニ遺伝子コード配列の外側に含まれ得る。
【0197】
いくつかの実施形態において、ミニ遺伝子コードエピトープおよび第2のタンパク質(免疫原性を増強または減少するために含まれる)の両方の産生を可能にする、二シストロン性(bi−cistronic)発現ベクターが使用され得る。同時発現される場合に免疫応答を有利に増強し得るタンパク質またはポリペプチドの例としては、サイトカイン(例えば、IL−2、IL−12、GM−CSF)、サイトカイン誘導分子(例えば、LeIF)、または同時刺激分子が挙げられる。ヘルパー(HTL)エピトープは、細胞内ターゲッティングシグナルに結合され得、そして発現されるCTLエピトープとは別々に発現され;これは、CTLエピトープとは異なる、HTLエピトープの細胞区画への指向を可能にする。必要ならば、これは、HLAクラスII経路へのHTLエピトープのより効率的な進入を促進し得、これによって、CTL誘導を改善する。HTL誘導またはCTL誘導とは対照的に、免疫抑制分子(例えば、TGF−β)の同時発現によって免疫応答を特異的に減少することが、特定の疾患において有利であり得る。
【0198】
治療量のプラスミドDNAは、例えば、E.coli中での発酵、その後の精製によって生成され得る。ワーキング細胞バンク由来のアリコートを使用して、培養培地に播種し、そして周知技術に従って、シェーカーフラスコまたはバイオリアクター中で飽和になるまで増殖させる。プラスミドDNAを、標準的なバイオ分離技術(例えば、QIAGEN,Inc.(Valencia、California)によって供給される固相陰イオン交換樹脂)を使用して精製し得る。必要ならば、スーパーコイルDNAを、ゲル電気泳動または他の方法を使用して、開環形態および線状形態から単離し得る。
【0199】
精製プラスミドDNAは、種々の処方物を使用して、注入用に調製され得る。これらの最も単純なものは、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中での凍結乾燥化DNAの再構成である。このアプローチ(「裸DNA」としても知られる)は、臨床試験において筋内(IM)投与のために現在使用されている。ミニ遺伝子DNAワクチンの免疫治療効果を最大化するために、精製プラスミドDNAを処方するための代替的方法が望ましくあり得る。種々の方法が記載されており、そして新しい技術が利用可能になるかもしれない。カチオン性脂質もまた、処方物中で使用され得る(例えば、国際公開第93/24640号パンフレット;ManninoおよびGould−Fogerite、BioTechniques 6(7):682(1988);米国特許第5,279,833号;国際公開第91/0630924640号パンフレット;およびFelgnerら、Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 84:7413(1987)に記載されるような)。さらに、糖脂質、融合誘導(fusogenic)リポソーム、ペプチドおよび化合物(まとめて、保護的、相互作用的、非凝縮化合物(PINC)と呼ばれる)もまた、精製プラスミドDNAに複合体化され得、安定性、筋内分散、または特定の器官または細胞型に対する輸送のような変数に影響する。
【0200】
標的細胞の感作が、ミニ遺伝子コードCTLエピトープの発現およびHLAクラスI提示についての機能的アッセイとして使用され得る。例えば、プラスミドDNAが、標準的なCTLクロム放出アッセイについての標的として適切である哺乳動物細胞系統に導入される。使用されるトランスフェクション方法は、最終処方物に依存する。エレクトロポレーションは、「裸」DNAのために使用され得、一方、カチオン性脂質が、直接的なインビトロトランスフェクションを可能にする。グリーン蛍光タンパク質(GFP)を発現するプラスミドを同時トランスフェクトして、細胞自動解析分離装置(FACS)を使用する、トランスフェクトした細胞の富化を可能にし得る。次いで、これらの細胞を、クロム51(51Cr)標識し、そしてエピトープ特異的CTL系統についての標的細胞として使用し;51Cr放出によって検出される細胞溶解が、ミニ遺伝子コードCTLエピトープの産生およびHLA提示の両方を示す。
【0201】
インビボ免疫原性は、ミニ遺伝子DNA処方物の機能的試験のための第2のアプローチである。適切なヒトHLAタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを、このDNA産物で免疫する。投与の用量および経路は、処方物依存性である(例えば、PBS中のDNAについてはIM、脂質複合体化DNAについては腹腔内(IP))。免疫後21日で、脾細胞を収集し、試験する各エピトープをコードするペプチドの存在下で1週間再刺激する。その後、CTLエフェクター細胞について、標準的な技術を使用して、ペプチドがロードされた51Cr標識標的細胞の細胞溶解についてのアッセイを行う。ミニ遺伝子コードエピトープに対応するペプチドのHLA担持によって感作された標的細胞の溶解は、CTLのインビボ誘導についてのDNAワクチン機能を実証する。HTLエピトープの免疫原性は、類似の様式でトランスジェニックマウスにおいて評価される。
【0202】
あるいは、核酸は、例えば、米国特許第5,204,253号に記載されるような、弾道的送達を使用して投与され得る。この技術を使用して、DNAのみから構成される粒子が投与される。さらなる代替的実施形態において、DNAは、粒子(例えば、金粒子)に接着され得る。
【0203】
ミニ遺伝子はまた、当技術分野で知られている他のバクテリアまたはウイルス送達システムを用いて送達することも可能であり、例えば、本発明のエピトープをコードする発現構築物をワクシニアなどのウイルス性ベクターに組み込むことができる。
【0204】
IV.K.2.CTLペプチドとヘルパーペプチドとの組合せ
本発明のCTLペプチドを含むワクチン組成物は、所望の特性、例えば、改善された血清半減期、拡大された集団適用範囲、または増強された免疫原性を提供するように改変され得る。
【0205】
例えば、CTL活性を誘導するペプチドの能力は、Tヘルパー細胞応答を誘導し得る少なくとも1つのエピトープを含む配列にペプチドを連結させることによって増強され得る。免疫原性を増強するためのCTLエピトープと組み合わせたTヘルパーエピトープの使用は、例えば、同時係属中の米国特許出願第08/820360号、米国特許出願第08/197,484号、および米国特許出願第08/464,234号に例示される。
【0206】
CTLペプチドエピトープは、Tヘルパーペプチドに直接連結され得るが、しばしば、CTLエピトープ/HTLエピトープ結合体は、スペーサー分子に連結される。スペーサーは、典型的に、比較的小さい、中性の分子(例えば、アミノ酸またはアミノ酸模倣物)からなり、これらは、生理学的条件下で実質的に非荷電性である。スペーサーは、典型的には、例えば、Ala、Glyあるいは非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意に存在するスペーサーは、必ずしも同じ残基からなる必要はなく、したがって、ヘテロオリゴマーであっても、ホモオリゴマーであってもよいことが理解される。スペーサーは、存在する場合、通常、少なくとも1残基または2残基であり、より通常は、3〜6残基であり、場合によっては10残基以上である。CTLペプチドエピトープは、CTLペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、直接的にまたはスペーサーを介してのいずれかで、Tヘルパーペプチドエピトープに連結され得る。免疫原性ペプチドまたはTヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端は、アシル化され得る。
【0207】
特定の実施形態において、Tヘルパーペプチドは、その集団の大部分で存在するTヘルパー細胞によって認識されるペプチドである。これは、多くの、ほとんどの、または全てのHLAクラスII分子に結合するペプチドを選択することによって達成され得る。これらは、「ゆるやかに(loosely)HLA拘束された」または「不規則な(promiscuous)」Tヘルパー配列として知られる。不規則なアミノ酸配列の例としては、以下のような抗原由来の配列が挙げられる:破傷風トキソイドの830〜843位(QYIKANSKFIGITE;配列番号51484)、Plasmodium falciparum スポロゾイト周囲(CS)タンパク質の378〜398位(DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS;配列番号51485)およびStreptococcus 18kDタンパク質の116位(GAVDSILGGVATYGAA;配列番号51486)。他の例としては、DR 1−4−7スーパーモチーフ、またはDR3モチーフのいずれかを保有するペプチドが挙げられる。
【0208】
あるいは、天然に見い出されないアミノ酸配列を使用して、ゆるやかなHLA拘束様式で、Tヘルパーリンパ球を刺激し得る合成ペプチドを調製し得る(例えば、国際公開第95/07707号パンフレットを参照のこと)。汎DR結合(pan−DR binding)エピトープと呼ばれるこれらの合成化合物(例えば、PADRE(登録商標)、Epimmune,Inc.、San Diego、CA)は、最も好ましくは、ほとんどのHLA−DR(ヒトHLAクラスII)分子を結合するように設計される。例えば、式:aKXVAAWTLKAAa(ここで、「X」は、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニンまたはチロシンのいずれかであり、そしてaは、D−アラニンまたはL−アラニンのいずれかである)を有する、汎DR結合エピトープペプチドは、ほとんどのHLA−DR対立遺伝子に結合し、そしてほとんどの個体由来(それらのHLA型に拘わらず)のTヘルパーリンパ球の応答を刺激することが見い出されている。汎DR結合エピトープの代替物は、全て「L」天然アミノ酸を含み、そしてこのエピトープをコードする核酸の形態で提供され得る。
【0209】
HTLペプチドエピトープはその生物学的特性を変えるためにも改変され得る。例えば、D−アミノ酸を含有してプロテアーゼ抵抗性を増大させてその血清半減期を延長させることが可能であり、脂質、タンパク質や炭水化物などの他の分子と結合させてその生物学的活性を増大させることもできる。例えば、Tヘルパーペプチドは、1個または複数のパルミチン酸鎖とアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれでも結合させ得る。
【0210】
III.K.3.CTLペプチドとT細胞プライム剤との組合せ
いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物中に、細胞傷害性Tリンパ球をプライムする(prime)少なくとも1つの成分を含むことが望ましくあり得る。脂質は、ウイルス抗原に対してCTLをインビボでプライムし得る因子として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、リジン残基のε−アミノ基およびα−アミノ基に結合され得、次いで、例えば、Gly、Gly−Gly−、Ser、Ser−Serなどのような1以上の連結残基を介して、免疫原性ペプチドに連結され得る。次いで、この脂質化ペプチドは、ミセルまたは粒子のいずれかで直接的に投与され得るか、リポソーム内に組み込まれ得るか、またはアジュバント(例えば、不完全フロイントアジュバント)中で乳化され得る。好ましい実施形態において、特に効果的な免疫原性組成物は、Lysのε−アミノ基およびα−アミノ基に結合されたパルミチン酸を含み、これは、その免疫原性ペプチドのアミノ末端に連結(例えば、Ser−Ser)を介して結合される。
【0211】
CTL応答をプライムする脂質の別の例として、E.coliリポタンパク質(例えば、トリパルミトイル−S−グリセリルステイニルセリル−セリン(P3CSS))が、適切なペプチドに共有結合された場合にウイルス特異的CTLをプライムするために使用され得る(例えば、Deresら、Nature 342:561、1989を参照のこと)。本発明のポリペプチドは、例えば、P3CSSに結合され得、そしてこのリポペプチドが、個体に投与され、標的抗原に対するCTL応答を特異的にプライムし得る。さらに、中和抗体の誘導もまた、P3CSS結合体化エピトープでプライムされ得るので、2つのこのような組成物を組み合わせて、体液性応答および細胞性応答の両方をより効果的に誘発し得る。
【0212】
CTLペプチドおよび/またはHTLペプチドはアミノ酸がペプチドの末端に付加され、ペプチドの互いの容易な連結、キャリア支持体またはより大きいペプチドへの結合、ペプチドまたはオリゴペプチドの物理的特性または化学的特性の改変などを提供し得る。チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸などのアミノ酸が、ペプチドまたはオリゴペプチド(特に、クラスIペプチド)のC末端またはN末端に導入され得る。しかし、いくつかの場合において、CTLエピトープのカルボキシル末端での改変は、ペプチドの結合特性を変更し得ることに留意すべきである。さらに、ペプチドまたはオリゴペプチド配列は、末端NH2アシル化(例えば、アルカノイル(C1〜C20)アセチル化またはチオグリコリルアセチル化)、末端カルボキシルアミド化(例えば、アンモニア、メチルアミンなど)によって改変されることによって、天然の配列とは異なり得る。いくつかの例において、これらの改変は、支持体または他の分子に連結するための部位を提供し得る。
【0213】
IV.K.4.CTLペプチドおよび/またはHTLペプチドをパルスしたDCを含むワクチン組成物
本発明のワクチン組成物の実施形態は、患者の血液由来のPBMC(またはそこから単離されたDC)へのエピトープ保有ペプチドのカクテルのエキソビボ投与を包含する。DCの収集を容易にするための医薬(例えば、Progenipoietin(登録商標)(Monsanto、St.Louis、MO)またはGM−CSF/IL−4)が使用され得る。ペプチドでのDCのパルス後および患者への再注入の前に、DCを洗浄し、結合されなかったペプチドを除去する。この実施形態において、ワクチンは、ペプチドをパルスしたDCを含み、このペプチドをパルスしたDCは、その表面上でHLA分子と複合体化された、そのパルスされたペプチドエピトープを提示する。
【0214】
DCはエキソビボでペプチドカクテル(そのうちのいくつかが、目的の1種または複数のHBV抗原に対するCTL応答を刺激する)によってパルスすることもできる。場合によっては、PADREファミリー分子などのヘルパーT細胞(HTL)ペプチドを、CTL応答を容易にするために包含することもできる。したがって、好ましくは複数HBV抗原からのエピトープを含む本発明によるワクチンは、HBV感染の治療に用いることができる。
【0215】
IV.L.治療目的または予防目的のためのワクチンの投与
本発明のペプチドならびに本発明の薬学的組成物およびワクチン組成物は、典型的には、HBV感染を処置および/または予防するために用いることができる。本発明のペプチドを含むワクチン組成物は、HBVに感染した患者、あるいはHBV感染に感受性の個体またはそうでなければHBV感染の危険性がある個体に投与され、HBV抗原に対する免疫応答を誘発し、したがって、患者自身の免疫応答能力を増強する。
【0216】
本明細書に記載するように、本発明のCTLエピトープおよび/またはHTLエピトープを含むペプチドは、HLA分子によって提示され、そしてそのペプチドに含まれるエピトープに特異的なCTLまたはHTLを接触された場合に、免疫応答を誘発する。このペプチド(またはそれらをコードするDNA)は個々に投与され得るし、1種または複数のペプチド配列の融合体として投与することもできる。ペプチドがCTLまたはHTLを接触される様式は、本発明に重要ではない。例えば、このペプチドは、インビボまたはインビトロのいずれかでCTLまたはHTLを接触され得る。その接触がインビボで生じる場合、ペプチド自体が患者に投与され得るか、他のビヒクル(例えば、1種または複数のペプチドをコードするDNAベクター、ペプチドをコードするウイルスベクター、リポソームなど)が、本明細書に記載のように、使用され得る。
【0217】
ペプチドがインビトロで接触される場合、ワクチン接種薬剤は、細胞の集団(例えば、ペプチドをパルスした樹状細胞、HPV−特異的CTL(これは、このペプチドをインビトロで抗原提示細胞にパルスすることにより、または抗原提示細胞を本発明のミニ遺伝子でトランスフェクトさせることにより誘導された)を含み得る。このような細胞集団は、その後、治療的有効用量で患者に投与される。
【0218】
治療適用において、ペプチド組成物および/または核酸組成物は、ウイルス抗原に対する効果的なCTLおよび/またはHTL応答を誘発するのに、ならびに症状および/または合併症を治癒または少なくとも部分的に阻止または遅延するのに十分な量で患者に投与される。このことを達成するための十分な量は、「治療的有効用量」として定義される。この用途のために効果的な量は、例えば、投与される特定の組成物、投与の形態、処置される疾患の段階および重篤度、患者の体重および一般的な健康状態、ならびに処方する医師の判断に依存する。
【0219】
薬学的組成物のために、本発明の免疫原性ポリペプチド、またはそれらをコードするDNAは、一般に、HBVに既に感染した患者に投与される。これらのペプチドまたはそれらをコードするDNAは、個々で投与され得るか、または1以上のペプチド配列の融合体として投与され得る。HBV感染した患者は、それらの免疫原性ペプチドで別々に処置されるか、または他の処置と適切に組み合わせて処置され得る。
【0220】
治療的用途のために、投与は、一般に、HBV感染の最初の診断で開始すべきである。この後に、少なくとも症状が実質的に寛解されるまで、およびその後の期間の間で、追加免疫用量を行う。患者に送達するためのワクチン組成物の実施形態(すなわち、ペプチドカクテル、ポリエピトープポリペプチド、ミニ遺伝子、またはHBV特異的CTLもしくはパルスした樹状細胞などの実施形態を含むがこれらに限定されない)は、病気の段階や患者の健康状態によって変わり得る。例えば、慢性HBV感染の患者においては、HBV特異的CTLを含むワクチンが、代替的実施形態よりもHBV感染細胞を殺すのにより有効であろう。
【0221】
感受性の個体が、感染前または感染中に同定される場合、その組成物を、それらの個体に標的化し得、これにより、より大きい集団への投与の必要性を最小化する。
【0222】
HBV感染の処置または予防のために使用されるペプチドもしくは他の組成物は、例えば、疾患の明らかな症状を有しない者において使用され得る。この文脈において、細胞傷害性T細胞応答を有効的に刺激するのに十分な投与の様式により送達される量のペプチドエピトープを提供することが一般的に重要であり、ヘルパーT細胞応答を刺激する組成物もまた、本発明のこの実施形態に従って与えられ得る。
【0223】
初期の治療的免疫化のための投薬量は、単位投薬量範囲において一般的に生じ、ここで、そのより低い値は約1、5、50、500または1000μgであり、そしてより高い値は、約10,000;20,000;30,000;または50,000μgである。ヒトに対する投薬量値は、典型的に、70kgの患者につき、約500μg〜約50,000μgの範囲に渡る。数週間〜数カ月に渡るブースト養生法に従う、約1.0μg〜約50,000μgの間のペプチドのブースター投薬量は、患者の血液から得られるCTLおよびHTLの比活性を測定することにより決定される患者の応答および状態に依存して投与され得る。投与は、少なくとも臨床的症状または実験室の試験が、そのウイルス感染が除去されるか、または低減されることを示すまでおよびその後の一定期間の間継続すべきである。投薬量、投与経路および用量スケジュールは、当該分野において公知の方法論に従って調整される。
【0224】
ある実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、重篤な疾患状態(すなわち、生命を脅かす状況または潜在的に生命を脅かす状況)において使用され得る。そのような場合において、本発明の好ましい組成物における最小量の外来基質および相対的非毒性のペプチドの結果として、これらの規定された投薬量に対して、実質的に過剰なこれらのペプチド組成物を投与することが可能であり、そして治療医師により所望されると感じられ得る。
【0225】
本発明のワクチン組成物はまた、予防薬剤として純粋に使用され得る。一般に、初回の予防免疫のための用量は、一般に、単位投薬範囲にあり、低い値で、約1、5、50、500または1000μg、そして高い値で、約10,000;20,000;30,000;または50,000μgである。ヒトについての投薬値は、典型的に、70キログラム患者当たり、約500μg〜約50,000μgの範囲である。これに続いて、ワクチンの初回投与後、約4週間〜6カ月の規定された間隔で投与される約1.0μg〜約50,000μgの間のペプチドのブースター投薬量で追加免疫する。このワクチンの免疫原性は、患者の血液のサンプルから得たCTLおよびHTLの比活性を測定することによって評価され得る。
【0226】
治療処置のための薬学的組成物は、非経口投与、局所的投与、経口投与、髄腔内投与または局所(例えば、クリームまたは局所用軟膏)投与のために意図される。好ましくは、この薬学的組成物は、非経口的(例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内)に投与される。従って、本発明は、非経口投与のための組成物を提供し、この組成物は、受容可能なキャリア(好ましくは、水性キャリア)に溶解されているか、または懸濁されている免疫原性ペプチドの溶液を含む。種々の水性キャリア(例えば、水、緩衝化水、0.8%生理食塩水、0.3%グリシン、ヒアルロン酸など)が使用され得る。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。得られた水溶液は、そのままかもしくは凍結乾燥された状態での使用のために包装され得、凍結乾燥された調製物は、投与の前に滅菌溶液と合わせられる。これらの組成物は、生理学的状態に近づけるために必要とされる場合、薬学的に受容可能な補助物質(例えば、pH調節剤および緩衝化剤、張度調節剤、湿潤剤、防腐剤など(例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレアートなど))を含み得る。
【0227】
薬学的処方物中の本発明のペプチドの濃度は、広範に変動し得(すなわち、約0.1質量%未満(通常は約2重量%もしくは少なくとも約2質量%)から20質量%〜50質量%以上と同程度まで)、そして選択された投与の特定様式に従って、主に流体容量、粘性などによって選択される。
【0228】
ヒト単位用量形態のペプチド組成物は、ヒト単位用量の受容可能なキャリア、好ましくは水性キャリアを含む薬学的組成物内に代表的に含まれて、そしてヒトに対してそのような組成物を投与するために使用されることが当業者に公知である一定容量の流体において投与される(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第17版、A.Gennaro、Editor、Mack Publishing Co.、Easton、Pennsylvania、1985を参照のこと)。
【0229】
本発明のペプチド、および/またはこのペプチドをコードする核酸はまた、リポソームを介して投与され得、このリポソームはまた、特定の組織(例えば、リンパ組織)に対してペプチドを標的とするためか、または感染細胞に対して選択的に標的とするため、およびペプチド組成物の半減期を増加するために役立ち得る。リポソームとしては、エマルジョン、泡沫、ミセル、不溶性単分子膜、液晶、リン脂質分散系、ラメラ層(lamellar layer)などが挙げられる。これらの調製物において、送達されるべきペプチドは、単独でか、もしくはリンパ系細胞の一般的なレセプターと結合する分子(例えば、CD45抗原に結合するモノクローナル抗体)と共にか、または他の治療組成物もしくは免疫原性組成物と共にリポソームの一部として取り込まれる。従って、本発明の所望のペプチドで満たされているか、または装飾されているかのいずれかのリポソームは、リンパ系細胞の部位に指向され得、次いで、ここで、そのリポソームは、そのペプチド組成物を送達する。本発明の使用のためのリポソームが、標準的なベシクル形成脂質から形成され、そのベシクル形成脂質としては、一般的に中性リン脂質および負電荷リン脂質ならびにステロール(例えば、コレステロール)が挙げられる。脂質の選択は、例えば、リポソームサイズ、血流におけるリポソームの酸不安定性および酸安定性を考慮して、一般的に導かれる。例えば、Szokaら、Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)および米国特許第4,235,871号、同第4,501,728号、同第4,837,028号、および同第5,019,369号に記載されるように、リポソームを調製するための種々の方法が利用可能である。
【0230】
免疫系の細胞を標的とするために、リポソーム内に組み込まれるべきリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に対して特異的な抗体またはそのフラグメントを含み得る。ペプチドを含むリポソーム懸濁物は、とりわけ、投与の様式、送達されるペプチド、および処置される疾患の段階に従って変動する用量において、静脈内に、局所に(locally)、局所的(topically)などにおいて投与され得る。
【0231】
固体組成物のために、従来の非毒性固体キャリアが使用され得、そのキャリアとしては、例えば、薬学的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。経口投与のために、薬学的に受容可能な非毒性組成物は、通常使用される任意の賦形剤(例えば、上記に列挙されたそれらのキャリア)、および一般的に10〜95%の活性成分(すなわち、本発明の1つ以上のペプチド、およびより好ましくは25%〜75%の濃度にて)を取り込むことによって形成される。
【0232】
エアロゾル投与のために、免疫原性ペプチドが、界面活性剤および噴霧剤と共に微細に分割された形態で好ましくは提供される。ペプチドの代表的な割合は、0.01質量%〜20質量%であり、好ましくは1質量%〜10質量%である。この界面活性剤は、当然ながら、非毒性でなければならず、そして好ましくは、噴霧剤に可溶性である。そのような薬剤の代表的なものは、6〜22個の炭素原子を含む、脂肪酸のエステルまたは部分エステル(例えば、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物とカプロン酸、オクタン酸、ラウリル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン(olesteric)酸およびオレイン酸との)である。混合エステル(例えば、混合グリセリドまたは天然グリセリド)が使用され得る。この界面活性剤は、組成物の0.1質量%〜20質量%、好ましくは0.25〜5質量%を構成し得る。組成物の残りは、通常、噴霧剤である。キャリアもまた、所望される場合、例えば、鼻腔内送達のためにレシチンと共に含まれ得る。
【0233】
IV.M.キット
本発明のペプチドおよび核酸組成物は、ワクチン投与のための指示と共にキット中で提供され得る。典型的には、そのキットは、容器中の、好ましくは、単位用量形態の所望のペプチド組成物および投与についての指示書を含む。別のキットは、投与についての指示書と共に、好ましくは、単位用量形態で容器中に本発明の所望の核酸を有するミニ遺伝子構築物を含む。IL−2またはIL−12などのリンホカインはまた、そのキットに含まれ得る。また所望され得る他のキット構成成分としては、例えば、滅菌シリンジ、ブースター投薬、および他の所望の賦形剤が挙げられる。
【0234】
本発明のエピトープを使用して成功裡に免疫応答を誘導した。これらのエピトープによる免疫応答はエピトープを様々な形態で投与することにより誘導された。エピトープはペプチドとして、核酸として、そして本発明のエピトープをコードする核酸を含むウイルス性ベクターとして投与された。ペプチドに基づいたエピトープ形式の投与に際しては、空のHLA分子上にエピトープの直接に負荷することにより免疫応答が誘導され、エピトープのインターナリゼーションおよびHLAクラスI経路を通じたプロセシングによって細胞上で発現された;いずれにしても、エピトープを発現するHLA分子は、次いで、CTL応答と相互作用し、CTL応答を誘導することができた。ペプチドは直接またはリポソームなどの薬剤を使用して送達することができる。それらはさらに、弾道的送達(典型的にはペプチドは結晶の形式である)を使用して送達することができる。DNAが免疫応答を誘導するために使用される場合、それは裸DNAとして一般におよそ1〜5mgの服用量範囲で、または弾道的「遺伝子銃」送達によって典型的にはおよそ10〜100μgの服用量範囲で投与される。DNAは様々な形態、例えば、線形、環状などで送達することができる。本発明に従ってエピトープをコードする核酸を含む、様々なウイルスのベクターが成功裡に使用された。
【0235】
したがって、本発明の組成物はいくつかの形式で存在する。本発明のこれらの組成物形式の各々の実施形態は、免疫応答を誘導するために成功裡に使用された。
【0236】
本発明の1つの組成物は多くのペプチドを含む。この複数すなわちペプチドカクテルは、一般に1種または複数の薬学的に許容可能な賦形剤と混合される。ペプチドカクテルは、同じペプチドの複数のコピーを含むことができるし、またはペプチドの混合物を含むことができる。ペプチドは天然に存在するエピトープのアナログであり得る。ペプチドは人工のアミノ酸および/または表面活性分子の付加(脂質化、アセチル化、糖鎖形成、ビオチン化、リン酸化など)のような化学的改変を含むことができる。ペプチドはCTLエピトープまたはHTLエピトープであり得る。好ましい実施形態では、ペプチドカクテルが多くの異なるCTLエピトープおよび少なくとも1つのHTLエピトープを含む。HTLエピトープは、天然のまたは非天然の(例えばPADRE(登録商標)(Epimmune Inc.、San Diego、CA))であり得る。本発明の実施例中の別個のエピトープの数は、一般に1〜150までの全体の単位整数である(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、96、97、98、99、100または150)。
【0237】
本発明の組成物のさらなる実施形態は、ポリペプチド複数エピトープ構築物、つまりポリエピトープペプチドを含む。本発明のポリエピトープペプチドは、当技術分野においてよく知られた技術の使用によって調製される。知られた技術の使用によって、本発明のエピトープは互いに連結される。ポリエピトープペプチドは線形でもよいし非線形(例えば、多価)でもよい。これらのポリエピトープな構築物は、人工のアミノ酸、離隔用すなわちスペーサーアミノ酸、隣接(flanking)アミノ酸、または隣接したエピトープユニット間の化学的改変を含むことができる。ポリエピトープな構築物は、へテロポリマーでもホモポリマーでもよい。ポリエピトープな構築物は、一般に2〜150(例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、または150)の間の任意の全体の単位整数の数量であり得る。ポリエピトープな構築物は、CTLおよび/またはHTLエピトープを含むことができる。構築物中の1つ以上エピトープは改変、例えば、表面活性材料(例えば脂質)の追加によって、または化学的改変(例えばアセチル化など)されることができる。さらに、複数エピトープ構築物中の結合は、ペプチド結合以外のもの(例えば共有結合、エステル結合、エーテル結合、ジスルフィド結合、水素結合、イオン結合など)であり得る。
【0238】
あるいは、本発明の組成物は、ネイティブな配列に相同性(つまり、それと一致するか接触する)を有するアミノ酸の連続、配列、伸張などを含む構築物を含む。アミノ酸のこの伸張は、アミノ酸の少なくとも1つのアミノ酸部分配列であって、アミノ酸のより長いシリーズから開裂または分離された場合に、本発明に従ってHLAクラスIまたはHLAクラスIIエピトープとして機能する配列を含む。この実施形態では、ペプチド配列は、当技術分野で知られているか提供される多くの使用によって、ここに定義されるような構築物となるように改変される。ポリエピトープな構築物、70〜100%(例えば70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100パーセント)からの任意の全体の単位整数インクリメントにネイティブな配列への相同性を含むことができる。
【0239】
本発明の組成物のさらなる実施形態は、本発明の1つ以上エピトープを含む抗原提示細胞である。抗原提示細胞は樹状細胞のような細胞を示す「プロフェッショナルな」抗原であり得る。抗原提示細胞は、当技術分野において知られているまたは決定された任意の手段によって本発明のエピトープを含むことができる。そのような手段は、1つ以上の個々のエピトープにより、または多数のエピトープを含む1つ以上のペプチドにより樹状細胞のパルスすることを含み、弾道的核酸送達などの核酸投与によって、または核酸を投与するための当技術分野の他の技術(ベクターに基づく(例えばウイルスのベクター)核酸の送達を含む)による。
【0240】
本発明の組成物のさらなる実施形態は、本発明の1つ以上のペプチドをコードする核酸、または本発明のポリエピトープペプチドをコードする核酸を含む。当業者には理解されるように、様々な核酸組成物は、遺伝暗号の冗長性により同一のペプチドをコードする。これらの核酸組成物の各々は本発明の範囲内となる。本発明のこの実施形態はDNAまたはRNAを含み、そしてある実施形態においては、DNAとRNAの組合せを含む。本発明のペプチドをコードする核酸を含む任意の組成物または本発明の他の任意のペプチドに基づく組成物も本発明の範囲以内にあることが理解されるべきである。
【0241】
本発明のペプチドに基づく形式は(それらをコードする核酸と同様に)、当技術分野において知られているか将来知られる原理を使用して生成された本発明のエピトープのアナログを含むことができる。アナログ化と関係する原理は、現在、当技術分野の中で知られており、ここに開示される;さらに、アナログ化する原理(ヘテロクリティック(heteroclitic)アナログ化)は、1999年1月6日に出願され共に係属しているU.S.S.N.09/226,775に開示される。一般に、本発明の組成物は分離されるか精製される。
【0242】
(V.実施例)
本発明は、特定の実施例によってより詳細に記載される。以下の実施例は、例示的な目的について提供され、そして、いずれの方法においても本発明を制限することを意図するものではない。当業者は、本発明に従って、種々の重要でないパラメーターが、別の実施形態を生じるように変化され得るかまたは改変され得ることを容易に理解する。
【0243】
実施例1:HLAクラスIおよびクラスII結合アッセイ
HLA分子に結合するペプチドの以下の実施例は、HLAクラスIおよびクラスIIペプチドの結合親和性の定量を示す。結合アッセイは、モチーフ保有であるかまたはモチーフ保有でないかのどちらかであるペプチドを使用して実施し得る。
【0244】
細胞溶解物は、開示されたプロトコル(Sidneyら、Current Protocols in Immunology 18.3.1(1998);Sidneyら、J.Immunol.154:247(1995);Setteら、Mol.Imunol.31:813(1994))に従って調製し、また、HLA分子が精製された。HLA分子の源として使用される細胞系、および、細胞溶解物からのHLA分子の抽出のために使用された抗体も、これらの刊行物に記載される。
【0245】
エプスタイン−バーウイルス(EBV)で形質転換したホモ接合性細胞系統、線維芽細胞、CIR、または721.221形質転換体を、HLAクラスI分子の供給源として使用する。これらの細胞は、2mMLグルタミン(GIBCO、Grand Island、NY)、50μM 2−ME、100μg/mlストレプトマイシン、100U/mlペニシリン(Irvine Scientific)および10%の加熱不活性化されたFCS(Irvine Scientific、Santa Ana、CA)を加えたRPMI−1640培地において培養によってインビトロで維持した。細胞は、225cm2の組織培養フラスコにおいて、または大規模培養のためにローラーボトル装置において成長させた。
【0246】
細胞溶解物は以下のように調製された。簡単に言えば、細胞は、50mMトリスHCI(pH8.5、1%Nonidet P−40(Fluka Biochemika、Buchs、スイス)を含む)、150mM NaCl、5mM EDTAおよび2mM PMSF中、108個の細胞/mlの濃度で溶解した。溶解物は遠心分離(15,000×g、30分間)によって砕片および核を取り除いた。
【0247】
HLA分子からアフィニティークロマトグラフィーによって溶解物を取り出した。溶解物は、不活性化されたSepharose CL4−Bおよびタンパク質A−Sepharoseの2つのプレカラムに2度通した。次に、溶解物を、適当な抗体を結合したSepharose CL−4Bビーズカラムに通した。次いで、抗HLAカラムは10カラム容積の10mMトリス−HCL(pH8.0、1%のNP−40、PBS溶液)で、2カラム容積のPBSで、および2カラム容積の0.4%n−オクチルグリコシドを含むPBSで洗浄した。最後に、MHC分子は50mMジエチルアミン(4%のn−オクチルグリコシドを含む0.15M NaCl溶液。pH11.5)で溶出した。1/25容積の2.0Mトリス(pH6.8)を加え、溶離液pHが約8.0まで低下するように溶出した。次いで、溶離液をCentriprepコンセントレータ(Amicon、Beverly、MA)中2000rpmでの遠心分離によって濃縮した。タンパク質成分は、BCAタンパク質アッセイ((Pierce Chemical Co.、Rockford、IL)によって評価し、SDS−PAGEによって確認した。
【0248】
ペプチドのクラスIおよびクラスII MHCへの結合を測定するために利用されたプロトコルの詳細な記載は公表されている(Setteら、Mol.Immunol.31:813、1994;Sidneyら、in Current Protocols in Immunology,Margulies,Ed.、John Wiley & Sons、New York、Section 18.3、1998))。簡単に言えば、MHC分子(5〜500nM)を精製し、プロテアーゼ阻害剤剤カクテルの存在下、0.05%のNonidet P−40(NP40)(またはH−2 IA分析用の20%w/vジギトニン)を含むPBS中で48時間、様々な無標識ペプチド阻害剤および1〜10nM125I−放射標識プローブペプチドと共にインキュベートした。プロテアーゼ阻害剤(各々CalBioChem、La Jolla、CA)の最終濃度は、1mM PMSF、1.3nM1.10 フェナンスロリン(phenanthroline)、73μMペプスタチンA、8mM EDTA、6mM N−エチルマレイミド(クラスII分析用の)および200μM Nアルファ−p−トシル−L−リジンクロロメチルケトン(TLCK)であった。分析はすべて、DRB1*0301(pH4.5で実行された)およびDRB1*1601(DR2w21β1)およびDRB4*0101(DRw53)(pH5.0で実行された)を例外としてpH7.0で実行された。pHは別記した(Sidneyら、Current Protocols in Immunology、Margulies,Ed.、John Wiley & Sons、New York、Section 18.3、1998を参照のこと)ように調節した。
【0249】
インキュベーションに続いて、MHCペプチド複合体を、PBS(pH6.5、0.5%NP40および0.1%NaN3を含む)1.2mls/分で溶出し、7.8mm×15cmのTSK200カラム(TosoHaas 16215、Montgomeryville、PA)上のゲルろ過によって遊離のペプチドから分離した。DRB1*1501(DR2w21β1)アッセイに使用された大きなサイズの放射性標識ペプチドは、このような条件下で未結合ピークから結合ピークを分離することがより難しいので、全てのDRB1*1501(DR2w21β1)アッセイを、0.6mls/分で溶出する7.8mm×30cm TSK2000カラムを用いて実施した。TSKカラムからの溶出液を、Beckman170放射性標識検出器に通過させ、そして、放射活性をプロットしそしてHewlett−Packard3396Aインテグレーターを用いて積算し、そして結合したペプチドの画分を決定した。
【0250】
放射性標識ペプチドを、クロラミンT法を用いてヨウ素化した。それぞれのアッセイおよびそのアッセイ特異的IC50nMにおいて利用される代表的な放射性標識プローブペプチドを、表IVおよびVに要約した。典型的には、予備実験において、MHC調製物の各々を、総放射活性の10〜20%と結合するための必要なHLA分子の濃度を決定するために、固定量の放射性標識ペプチドの存在下で滴定した。続く全ての阻害および直接的結合アッセイを、これらのHLA濃度で行った。
【0251】
これらの条件[標識]<[HLA]および[IC50]≧[HLA]下で、測定したIC50値は、真のKD値の合理的な近似値であった。ペプチドインヒビターは、典型的には、120μg/mlから1.2ng/mlまでの範囲の濃度で試験し、そして、2〜4の完全に独立した実験で試験した。異なった実験で獲得されたデータの比較を可能にするために、試験されたそれぞれのペプチドついてのIC50で、阻害についてのポジティブコントロール(典型的には、放射性標識プローブペプチドの未標識バージョン)のIC50を割ることによって、それぞれのペプチドについて相対的な結合数値を計算する。実験間比較のために、相対結合値を編集した。これらの値は、引き続き目的のペプチドの相対結合で、阻害についてのポジティブコントロールのIC50nMを割ることによって変換され、IC50nM値に戻ることができる。データ編集のこの方法は最も正確であり、そして異なった日数で試験されたペプチドまたは異なったロットの精製MHCとの比較について一貫していることを証明する。
【0252】
HLA−DR精製(LB3.1)について使用される抗体は、α鎖特異的であるため、β1分子は、β3(および/またはβ4およびβ5)分子から分離されない。結合アッセイのβ1特異性は、DRB1*0101(DR1)、DRB1*0802(DR8w2)、およびDRB1*0803(DR8w3)の場合で明らかであるが、β3は全く発現されない。DRB1*0301(DR3)およびDRB3*0101(DR52a)、DRB1*0401(DR4w4)、DRB1*0404(DR4w14)、DRB1*0405(DR4w15)、DRB1*1101(DR5)、DRB1*1201(DR5w12)、DRB1*1302(DR6w19)およびDRB1*0701(DR7)についてもまた示されてきた。DRB1*1501(DR2w2β1)、DRB5*0101(DR2w2β2)、DRB1*1601(DR2w21β1)、DRB5*0201(DR51Dw21)、およびDRB4*0101(DRw53)アッセイついてのβ鎖特異性の問題は、線維芽細胞の使用によって回避できる。DRβ分子特異性に関するアッセイの開発および確証は、以前に記載されている(例えば、Southwoodら、J.Immunol.160:3363−3373、1998を参照のこと)。
【0253】
上記に概略される結合アッセイを、例えば、実施例2に記載されるように、スーパーモチーフおよび/またはモチーフ保有エピトープを分析するために使用し得る。
【0254】
実施例2.保存されたHLAスーパーモチーフ保有CTL候補エピトープの同定
本発明のワクチン組成物は、広範な集団の適用範囲を達成するために、多数のHLAスーパーモチーフまたはモチーフを含む多数のエピトープを含み得る。この実施例は、そのようなワクチン組成物における含有についてのスーパーモチーフ保有エピトープの同定を例示する。集団適用範囲は、下記のストラテジーを使用して計算した。エピトープは、HLA−A2、−A3もしくは−B7スーパーモチーフまたはHLA−A1もしくは−A24モチーフを保有するように選択された。
【0255】
スーパーモチーフおよび/またはモチーフ保有エピトープの同定のためのコンピュータサーチおよびアルゴリズム
HLAクラスIのスーパーモチーフもしくはモチーフまたはHLAクラスIIのスーパーモチーフもしくはモチーフを保有するエピトープについてのコンピュータサーチを、以下のように行った。全ての翻訳されたHBV単離配列を、適切なHLA結合モチーフを含む潜在的ペプチド配列を同定するために、テキストストリング(text string)サーチソフトウェアプログラム(例えば、MotifSearch1.4(D.Brown、San Diego))を用いて分析した;代替のプログラムは、本明細書中に開示されるモチーフ/スーパーモチーフを参照して、当該分野の情報に従って、容易に作製される。さらに、そのような計算は、頭の中で行われ得る。同定されたA2スーパーモチーフ配列、A3スーパーモチーフ配列、およびDRスーパーモチーフ配列を、特定のHLAクラスI分子またはHLAクラスII分子に結合するそれらの能力を推定するための多項式アルゴリズムを用いて、スコアリングした。これらの多項式アルゴリズムは、伸長したモチーフおよび精製されたモチーフの両方を考慮し(すなわち、異なる位置での異なるアミノ酸の影響を考慮するために)、かつ以下の前提に基本的に基づく。この前提とは、ペプチドHLA分子相互作用の親和性全体(言い換えるとΔG)は、以下の型の直線的な多項式関数:
「ΔG」=a1i×a2i×a3i......×ani
として近似し得、ここで、ajiは、nアミノ酸のペプチドの配列に沿って、所定の位置(i)での所定のアミノ酸(j)の存在効果を示す係数である。この方法の重要な仮説は、それぞれの位置での効果が互いに実質的に独立している(すなわち、個々の側鎖の独立した結合)ということである。残基jがペプチド中の位置iで生じる場合、定常量jiが、ペプチドの残りの配列とは無関係なペプチドの結合の自由エネルギーに貢献することが想定される。この仮説は、ペプチドが実質的に伸長したコンフォメーションでMHCに結合しかつT細胞によって認識されることを示す本発明者らの研究室の研究(データは本明細書中に示されていない)によって正当化される。
【0256】
特定のアルゴリズム係数の誘導法は、Gulukotaら、J.Mol.Biol.267:1258−126、1997;(Sidneyら、Human Immunol.45:79−93、1996;およびSouthwoodら、J.Immunol.160:3363−3373、1998もまた参照のこと)に記載されている。手短には、全てのi位置について、アンカーおよび非アンカーも同様に、jを有する全てのペプチドの平均相対結合(ARB)の相乗平均を、集団の残りと比較して計算し、そして、jiの推定値として使用した。クラスIIペプチドについて、多数のアライメントが可能な場合、反復手順に従って、最高のスコアリングのアライメントのみを利用した。試験セットにおける所定のペプチドのアルゴリズムスコアを計算するために、そのペプチドの配列に対応するARB値を乗算した。この積が選択される閾値を超える場合、そのペプチドは、結合することが推定される。適切な閾値を、所望される推定のストリンジェンシーの度合いの関数として選択する。
【0257】
HLA−A2スーパータイプ交差反応性ペプチドの選択
20のHBV単離体由来の完全配列をアライメントし、次いで、HLA−A2スーパーモチーフの一次アンカー特異性を含む保存された9および10マーの配列を同定するために、カスタマイズしたコンピュータプログラムを利用して、走査した。
【0258】
全150の保存されたモチーフ陽性配列を同定した。次いで、これらのペプチドを、A*0201特異的多項式アルゴリズムを用いてA*0201の好ましい二次アンカー残基の存在について評価した。全85の保存されたモチーフ保有配列を選択し合成した。
【0259】
これらの85の保存されたモチーフ保有9および10マーのペプチドのうち85を、精製したHLA−A*0201分子にインビトロで結合するそれらの能力について試験した。34ペプチドが良好なA*0201結合体(IC50≦500nM)であり;15が高い結合体(IC50≦50nM)であり19が中程度の結合体(IC50が50〜500nM)であることが見出された(表XXVI)。
【0260】
独立した分析の過程で、25の保存された、HBV由来の、適当なA2−スーパータイプ一次アンカーを備えた8または11のマー配列も合成し、A*0201結合について試験した。1つのペプチド、HBV env 259 1 1マー(ペプチド1147.14)は、IC50が500nM以下でA*0201に結合し、また表XXVIに含まれていた。表XXVIには、HBV pol 538 9マーペプチド(これはA*0201に5.1nMのIC50で結合する)(以下を参照))の一置換体であるアナログペプチドも示す。
【0261】
36のA*0201結合体のうちの30は、続けて、追加のA2−スーパータイプ対立遺伝子(A*0202、A*0203、A*0206およびA*6802)への結合能力について試験した。表XXVIの中で示されるように、15/30の(50%)ペプチドがA2スーパータイプ交差反応結合体(少なくとも試験した5つのA2スーパータイプ対立遺伝子のうち3つと結合する結合体)であることが見出された。さらに詳しい分析のためにこれらの15のペプチドを選択した。
【0262】
HLA−A3スーパーモチーフ保有エピトープの選択
同じ20の単離体由来の配列について、HLA−A2スーパーモチーフの一次アンカーを有する保存されたペプチドの存在を同様に調べた。合計80の保存された9−または10マーモチーフを含む配列が同定された。A03およびA11アルゴリズムを使用する詳しい分析は、いずれか一方または両方のアルゴリズムにおいて高く得点した40の配列を同定した。対応するペプチドのうちの36を合成し、HLAA*03およびHLA−A*11(2つの最も一般的なA3−スーパータイプ対立遺伝子)への結合を試験した。A3および/またはA11とIC50値≦500nMの親和性で結合する23のペプチドが同定された(表XXVI1)。
【0263】
独立した一連の研究過程で、30のHBV由来の8マーおよび24の11マー配列(単離物の75%以上保存)を選択しA*03とA*11についての結合試験を行った。4つの8マーおよび9つの11マーは、対立遺伝子のいずれかまたは両方と結合することが見出された(表XXVII)。最終的に、4つの9マー、および1つの10マーが、(上に概説した探索基準を使用して選択されていない保存されたHBV由来ペプチド。但し、それはA*03および/またはA*11を結合することが示された)同定され、表XXVIIに含まれている。これらのペプチドのうち2つは標準的でないアンカー(ペプチド20.0131および20.0130)であり、また、他の3つはアルゴリズム陰性(ペプチド1142.05、1099.03および1090.15)である。
【0264】
続いて41個のA*03および/またはA*11結合ペプチドのうち38こをを、他の共通のA3−スーパータイプ対立遺伝子(A*3101、A*3301およびA*6801)への交差反応性の結合力に関して試験した。これらのペプチドのうちの17個がA3−スーパータイプ交差反応性だったことが判明し、試験した5つのA3−スーパータイプ対立遺伝子のうち少なくとも3つと結合した(表XXVII)。
【0265】
HLA−B7スーパーモチーフ保有エピトープの選択
同じ20の単離物をHLA−B7スーパーモチーフを有する保存された9マーおよび10マーペプチドの存在について分析し、46の配列が同定された。対応する34のペプチドを合成し、HLA−B*0702(最も一般的なB7−スーパータイプ対立遺伝子)との結合を試験した。9つのペプチドが、IC50値≦500nMでB*0702と結合した(表XXVIII)。次いで、これらの9つのペプチドを、他の共通B7−スーパータイプ対立遺伝子(B*3501、B*51、B*5301およびB*5401)との結合について試験した。9つのうち5個のB*0702結合体は、試験した5つのB7−スーパータイプ対立遺伝子の3個以上に結合することができた。
【0266】
B7−スーパータイプ対立遺伝子の第2のアンカー必要条件を調査する別の研究において、B7−スーパーモチーフを有するすべての入手可能なペプチドをすべてのB7−スーパータイプ対立遺伝子との結合について試験した。その結果、上に記載した34のペプチドもすべて、他のB7との結合について試験した。これらの実験は、少なくとも1つのB7−スーパータイプ対立遺伝子とIC50値≦500nMで結合するさらに10個のペプチドを同定し、その中には3つ以上の対立遺伝子と結合する2つのペプチドが含まれていた。これらの10個のペプチドも表XXVIII中に示す。
【0267】
保存されたB7−スーパータイプ縮重HBV由来9−マーおよび10マーペプチドの数は、A2−およびA3−スーパータイプと比較して少ないため、20個の単離物を、保存モチーフ保有8−マーおよび11マーを同定するために再び検査した。この再走査は51個のペプチドを同定した。これらのうちの31個を合成し、5つの最も共通のB7−スーパータイプ対立遺伝子の各々への結合を試験した。19個の8−および11マーペプチドが、少なくとも1つのB7−スーパータイプ対立遺伝子と高いまたは中程度の親和性(IC50値≦500nM)をもって結合した(表XXVIII)。2つのペプチドが、試験した5つの対立遺伝子のうちの3つと結合する縮重した結合体であった。
【0268】
要約すれば、分析した単離体において75%以上保存された縮重B7−スーパータイプ結合体である9つのHBV由来ペプチド全体が同定された(表XXVIII)。
【0269】
A1およびA24モチーフ保有エピトープの選択
さらに集団適用範囲を拡大するため、HLA−A1および−A24エピトープを本分析に組み入れた。5つの異なる主な人種(白人、北米黒人、中国人、日本人およびラテンアメリカ人)中で、A1は平均12%以上、A24は人口におよそ29%の存在している。これらの対立遺伝子は組み合わせられて、39%の平均頻度でこれらの同じ人口の中で表わされるであろう。A1とA24がA2−、A3−およびB7−スーパータイプ対立遺伝子と合わせた場合、合計の適用範囲は主要な人種中で>95.4%である;比較すると、A2−、A3−およびB7−スーパータイプを合わせた適用範囲が86.2%である。
【0270】
A1とA24バインダーに対するHBVの系統的な分析はまだ終わっていない。しかしながら、独立した研究の過程で、A*0101に500nM未満のIC50で結合する15個の保存されたHBV由来ペプチドが同定され(表XXIX);これらのうちの7個は100nM未満のIC50で結合する。同様の文脈の中で、14個の保存されたA*2402結合HBV由来ペプチドがさらに同定され、それらのうちの6個は、A*2402に100nM未満のIC50で結合する(表XXIX)。
【0271】
実施例3:免疫原性の確認
A*0201免疫原性の評価
上に識別された15個のHBV由来HLA−A2スーパータイプ交差反応性ペプチドの免疫性分析を表XXXに要約する。ペプチドは、3つの系の少なくとも1つでの免疫原性についてスクリーニングした。ペプチドはインビトロでの主要抗原特異的CTLの誘導のためにヒトPBMC(Wentworthら、Molec.Immunol.32:603、1995)を使用してスクリーニングし;このデータは、表XXXの中「主要なCTL」として示す。
【0272】
ヒトPBMCからの主要抗原特異的CTLのインビトロ誘導用のプロトコルは、ウェントワースら(Wentworthら、Molec.Immunol.32:603、1995)に記載されている。CD8+T細胞のために正常な寄贈者からのPBMCを富裕化し、IL−7の存在下にペプチド負荷抗原提示細胞(SAC−I活性化されたPBMC)と共にインキュベートした。7日の培養後、ペプチドでパルスされた照射された自系付着細胞(autologous adherent cells)を使用して新たに培養物を刺激し、次いで、7日後に細胞傷害活性について試験した。
【0273】
さらに、HLAトランスジェニックマウスがペプチド免疫原性を評価するために使用され;このデータは表XXXの「トランスジェニックCTL」に示す。従来の研究は、A*0201/Kbトランスジェニックマウスで誘導されたCTLがヒト中で誘導されたCTLに似た特異性を示すことを示している(Vitielloら、J.Exp.Med.173:1007、1991;Wentworthら、Eur.J.Immunol.26:97、1996)。
【0274】
ペプチド免疫に続くトランスジェニックマウス中のCTL誘導はVitielloら(Vitielloら、J.Exp.Med.173:1007、1991)およびAlexanderら(Alexanderら、J.Immunol.159:4753、1997)に記載されている。簡単に言えば、合成ペプチド(50μg/マウス)およびヘルパーエピトープHBVコア128(140μg/マウス)を不完全なフロイントアジュバント(IFA)中に乳化し、尾の基部において皮下注入した。注入の11日後に、脾細胞を、ペプチド負荷した同質遺伝子的なLPS芽細胞の存在下でインキュベートした。6日後に、ペプチドパルス標的を使用して、培養物を細胞障害活性について分析した。
【0275】
また、ペプチドを、急性感染HBV患者の中のリコールCTL応答のリコールを刺激する能力に関して試験し(Bertoniら、J.Clin.Invest.100:503、1997年;Rehermannら、J.Clin.Invest.97:1655−1665、1996年;Nayersinaら、J.Immunol.150:4659、1993);これらのデータは「表XXX」中に「患者CTL」として示す。天然感染過程でペプチドが認識されることが示されるため、患者の免疫原性データは特に有益である。これらのデータは、ペプチドが、CTLの目標を表わす人間の細胞中で処理され提示されることを実証する。さらに、患者中のCTL応答の誘導が感染の解消に関連付けられたように、このデータはワクチン設計に特に関連する。
【0276】
リコールCTL応答の評価については、Bertoniら(Bertoniら、J.Clin.Invest.100:503、1997)によって記載されるようにしてスクリーニングが行われた。簡単に言えば、HBVに急性感染した患者からのPBMCを、10μg/mlの合成ペプチド存在下で培養した。7日後に、培養物をペプチドで再刺激した。ペプチドでパルスされた標的細胞を使用し、培養物を14日目に細胞障害活性についてアッセイした。
【0277】
15個のA2スーパータイプを結合するペプチドのうち11個は利用したシステムの少なくとも1つにおいて免疫原性であることが見出された。11個のペプチドのうちの5個は、以前にHBV急性感染患者中のものと同一視されている(Bertoniら、J.Clin.Invest.100:503、1997)。追加の縮重した5つのペプチド(1069.06、1090.77、1147.14、927.42および927.46)が、HLA−A*0201のトランスジェニックマウス中でCTL応答を誘導した。11個の免疫原性スーパータイプ交差反応性ペプチドは3つのHBV抗原によってコードされる;コア、エンベロープおよびポリメラーゼである。
【0278】
このセット(11個の免疫原性A2−スーパーモチーフ保有エピトープ)は、1つのアナログペプチド1090.77を含んでいる。野生体ペプチド1090.14(これからこのアナログは誘導される)はA2−スーパータイプ非交差反応性であるが、しかし急性HBV患者からのリコールCTL応答において認識され、HLA−A*0201のトランスジェニックマウスにおいてもヒトの初代培養物においても免疫原性であることが示された(表XXX)。野生体ペプチド1090.14と1090.77アナログの交差認識に取り組むさらなる研究は、以下に詳細に記載される。
【0279】
独立した分析の過程で、表XXXbに示す非交差反応性ペプチドのうち14個(1090.14を含む)は少なくとも1つの系において免疫原性であることが見出された。これらのペプチドのうち5個のペプチドが患者において認識され;4つのペプチドが、トランスジェニックマウス中のCTLを誘導した。
【0280】
結論として、11個のA2−スーパータイプ交差反応性ペプチドが、調べた3つのシステムの少なくとも1つにおいて免疫原性を示すことができることが識別された。
【0281】
A*03/11免疫原性の評価
17個のA3−スーパータイプ交差反応性ペプチドの免疫原性のうち7個を評価した(表XXXI)。前節に記載したように、A3−スーパーモチーフ保有ペプチドは初代培養物、患者の応答、またはHLA−A11トランスジェニックマウスを使用してスクリーニングした(Alexanderら、J.lmmunol.159:4753、1997)。ペプチド1.0219を例外として、表XXXI挿入表にリストされた保存された交差反応性ペプチドはすべて、免疫原性であることが見出された。
【0282】
さらに、交差反応性スーパータイプ結合を示す、保存性の弱いペプチド(1150.51;40%が保存された)は、トランスジェニックマウスにおいて免疫原性であることが見出され、表XXXIに含まれていた。同様に他の2つの保存されているが交差反応性でないペプチドも、急性感染HBV患者(Bertoniら、J.Clin.Invest.100:503、1997)において認識されることが示された。これらのエピトープは表XXXI中に示される。
【0283】
8個の保存された免疫原性HBV誘導A3スーパーモチーフ保有エピトープのうちの7個(交差反応性ペプチド6個をすべて含む)について、患者において陽性データが得られた点は注目に値する。これらのエピトープは、1つのエピトープがコアタンパク質配列に由来している他は主にポリメラーゼタンパク質配列に由来する。X抗原では多くの交差反応性ペプチドが識別されていたが(表XXXI)、現在まで、これらのペプチドは免疫原性についてスクリーニングされていない。
【0284】
要約すれば、急性感染患者においてCTLによって認識されるか、HLAトランスジェニックマウスにおいてCTLを誘導する、7個のA3−スーパーモチーフ保有交差反応性ペプチドが識別された。
【0285】
B7免疫原性の評価
HBV由来HLA−B7−スーパーモチーフ保有、交差反応性ペプチドが関係する免疫原性の研究を表XXXIIに要約する。HLA−B7ペプチドは、もっぱら、初代培養物または急性感染HBV患者のいずれかにおいて応答を測定するヒトシステムでスクリーニングした。スクリーニングされた7つの縮重したペプチドのうち4個は免疫原性を示した。交差反応性でない1つのペプチド(XRN<3)、1147.04も、急性感染HBV患者(Bertoniら、J.Clin.Invest.100:503、1997年;Table XXXIIを見る)において認識されることが示された。
【0286】
要約すれば、急性感染HBV患者において認識される、5つの保存されたHBV由来B7−スーパーモチーフ保有エピトープが識別された。これらのエピトープは、4つの異なるHBV抗原(コア、エンベロープ、ポリメラーゼおよびX)をカバーすることができる。
【0287】
実施例4:アナログを作製することによって天然のペプチドの結合能力を改善するための伸長したスーパーモチーフの実施
本明細書中に示されるように、HLAモチーフおよびスーパーモチーフ(一次および/または二次の残基を含む)は、高度に交差反応性の天然のペプチドの調製において有用である。さらに、HLAモチーフおよびスーパーモチーフの規定はまた、アナログ化、または「修正(fixed)されて」、ペプチドに特定の特徴(例えば、スーパータイプを構成するHLA分子の群内のより優れた交差反応性、および/またはそれらHLA分子のいくつかまたは全てについてのより優れた結合親和性)を与える天然のペプチド配列内の残基を同定することによって、当業者が高度に交差反応性のエピトープを操作するのを可能とする。調整された結合親和性を示すアナログペプチドの例を、この実施例に示す。
【0288】
一次アンカー残基を用いるアナログ化
クラスIペプチド配位子は、その結合親和性および/または縮重を増加させるために改変するか「固定」できることが示された(シドニーら、J.Immunol.157:3480、1996)。同様にこれらの固定されたペプチドは、野生体エピトープに特異的なT細胞により免疫原性および交差反応性認識を増加させることも示すであろう(Parkhurstら、J.Immunol.157:2539、1996年;Pogueら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8166、1995)。特に、A2スーパータイプペプチドの主要なアンカーは「固定」してもよく、2位でLまたはVに(または天然の場合はMに)およびC末端をVにアナログ化してもよい。表XXVIに示すように、14個のうちの9個のA2−スーパータイプ交差反応性結合ペプチドは、これらの基準によって「固定可能」であり、21個の非交差反応性結合体のうち16個も同様である。固定に対する理想的候補は、少なくとも3個のA2−スーパータイプ対立遺伝子特異的分子とIC50≦5000nMで結合するペプチドである。
【0289】
より広く交差反応性なエピトープを生成するこの戦略の効能の1つの例は、ペプチド1090.14(表XXVI)のケースによって提供される。以前に、このペプチドは、検討されたそれぞれの系において高度に免疫原性であることが示された。しかし、単一のA2−スーパータイプ対立遺伝子特異的分子、A*0201に対する結合性のみを示す。このエピトープの非交差反応的結合能力は集団適用範囲を制限し、したがって候補ワクチンにこのペプチドを含む価値を制限する。結合親和性および交差反応性を増加させるための努力において、ペプチド1090.14のC−末端を「アラニン」からA2−スーパーモチーフの好適残基「バリン」に変更した。この変更はA*0201の結合能力(200nMから5.1nMまで)に劇的な増加(40倍)をもたらしたが、他の3個のA2−スーパータイプ対立遺伝子特異的分子に結合することができるペプチドをも生じた(ペプチド1090.77、表XXVI参照)。
【0290】
HLA−A*0201トランスジェニックマウスを用いた研究は、1090.77ペプチドで免疫にされたマウスからのCTL応答が天然に存在するペプチド1090.14またはバリン置換アナログ(つまり1090.77)のいずれかが負荷された標的細胞を認識することを示した。実際、1090.77誘導されたCTLによる溶解は、標的細胞を負荷するために使用されたのがアナログであるか野生型の配列であるか判別不能であった(B.Livingston、出版されていないデータ)。
【0291】
ワクチン構築物設計のためのこれらの観察の重要性は、効力のあるウイルスの応答阻害剤、ラミブジンで慢性のHBV患者が治療された研究によって示される。ラミブジンを用いた拡張治療は、1090.14エピトープにおいて2位をメチオニンからバリンに代えたHBVの薬剤耐性菌の選択をもたらし、エピトープに基づくワクチンをラミブジンと併用することが、野生体および突然変異体配列の両方を認識するCTL反応を誘導する能力を持つ必要があってもよいことを示唆する。
【0292】
交差認識がネイティブなペプチド(1090.14)とアナログペプチドおよびラミブジン誘導変異体M2ペプチドの間で可能であることを実証するために、1090.77アナログペプチドを使用してCTLを生成した。次いで、野生体ペプチド(1090.14)またはラミブジン誘導変異体M2ペプチドのいずれかによってこれらのCTL培養物を刺激した。次いで、野生体またはラミブジン誘導変異体ペプチドのいずれかが負荷された標的細胞を溶解するこれらCTLの能力を分析した。いずれかのペプチドを示す標的細胞は、同様にいずれかのCTL培養によって溶解された(表XXVI)。
【0293】
これらの研究はペプチドのアナログ化することは、どのように野生体と突然変異体のエピトープ間の交差認識を可能にすると共にHLA−A2スーパータイプ縮重の劇的な増加をもたらすことができるかを実証する。より具体的に言えば、これらの結果は、アナログペプチド1090.77を利用するワクチンが、野生株HBVおよび抗ラミブジンHBV株の両方を認識する反応を刺激していることを示す。
【0294】
同様に、HLA−A3スーパーモチーフ保有エピトープのアナログを生成してもよい。例えば、2位で好ましいV、およびC−末端でRまたはKを有するようにペプチドをアナログ化することもできる。A3−スーパータイプ縮重ペプチドのうち表XXVIIで識別された12個が主要なアンカー固定に対する候補であり、24個の非交差反応性結合体のうちの19個も同様である。
【0295】
アナログペプチドは、A*03とA*11に結合することが最初に試験され、次いで、親ペプチドと比較して等価、または改善された結合能力を示すものがA3−スーパータイプ交差応答性に関して試験されるであろう。必要な場合には、次いで、改善された交差反応性を実証するアナログを免疫原性について評価さらに評価する。
【0296】
代表的には、B7のスーパーモチーフ保有エピトープを識別することはより困難である。A2−およびA3−スーパータイプエピトープの場合と同様に、ペプチドアナログ化戦略を用いて、増加した交差反応性結合を備えた付加的なB7スーパーモチーフ保有ペプチドを生成することができる。一般に、B7のスーパーモチーフ保有ペプチドは2位でPをそれらのC−末端でIを有するように固定されるべきである。
【0297】
2つの異なるB7様ペプチド(HBV env 313およびHBV pol 541)のC−末端がI残基で置換された一次アンカー単一アミノ酸残基を表わすアナログを合成し、それらのB7−スーパータイプ結合能力に関して試験した。両方の場合において、I置換が結合親和性および/または交差反応性に全面的な肯定的な効果があったことが見出された。HBV env 313の場合には、I9の(C−末端位置9でのI)置換が、B*5401の結合親和性をほぼ400倍に増加することによって結合された4から5個の対立遺伝子からの交差反応性を増加させるのに有効であった。HBV pol 541の場合には、増加した交差反応性は、B*5401結合の実質的な増加によって同様に達成された。さらに、B*0702、B*51およびB*5301への結合親和性における著しい増加が、HBV pol 541 I9アナログで観察された。
【0298】
二次アンカー残基でのアナログ化
さらに、HLAスーパーモチーフは、交差反応性特性に関係している二次アンカー位置の特定の残基を識別することにより、高度に交差反応的なペプチドを操作することにおいて価値がある。これを実証するため、5つの異なるB7−スーパータイプ結合性ペプチドのうちの位置1および3で単一のアミノ酸置換を表わすペプチドの第2のセットを合成し、B−7スーパータイプ結合能力について試験した。4/4のケースでは、位置1でネイティブな残基を芳香性の残基F(「Fl」置換)に替える効果が、親ペプチドと比較して、交差反応性の増加をもたらし、また、ほとんどの例で、結合親和性が3倍以上に増加した(表XXVIII)。より具体的には、HBV env 313、MAGE2 170およびHBV core 168については、完全なスーパータイプ交差反応性がF1置換アナログで達成された。これらの増加はB*5401結合親和性を劇的に増加させることにより達成された。さらに、親和性における増加は、HBV core 168(B*3501とB*5301)およびMAGE2 170 (B*3501、B51およびB*5301)の場合に他の対立遺伝子について見られた。最後に、MAGE3 196の場合には、F1置換はB*0702結合における増加のために交差反応性を増加させるのに有効であった。B51の結合能力をほぼ70倍に増加させる点も注目された。
【0299】
2つのアナログが、位置3でのスーパーモチーフの肯定的なF置換(「F3」置換)を使用して作られた。両方の例で、結合親和性および交差反応性の増加が達成された。特に、HBV pol 541の場合には、F3置換は、B*5401結合に対するその影響の効力により交差反応性を増加させるのに有効であった。MAGE3 196の場合、完全なスーパータイプ交差反応性が、B*0702およびB*3501の結合能力を増加させることにより達成された。また、MAGE3 196の場合には、B*3501、B*51、B*5301およびB*5401について40倍と5000倍の間に結合能力が増加することは注目に値する。
【0300】
結論として、これらのデータは、単一のアミノ酸置換であってもその使用によって、HLAスーパータイプ分子用のペプチド配位子の結合親和性および/または交差反応性を増加させることが可能であることを実証する。
【0301】
実施例5:HLA−DR結合モチーフによる保存されたHBV誘導配列の識別 以下に概説するように、実施例1〜3に記載されたのと同様な方法論を用いることにより、HLAクラスIIスーパーモチーフまたはモチーフ保有ペプチドエピトープも識別できる。
【0302】
HLA−DR−スーパーモチーフ保有エピトープの選択
HLAクラスIl分子は、典型的には、長さで12から20残基の間でペプチドを結合する。しかし、HLAクラスIと同様に、特異性および相互作用のエネルギーは通常、約9残基の短いコア領域に含まれている。ほとんどのDR分子は、位置1(Pl)の疎水性残基が主要なアンカー(main anchor)であるこの9−マーコア内の重複する特異性を共有している(O’Sullivanら、J.Immunol.147:2663、1991;Southwoodら、J.Immunol.160:3363、1998)。さらに、位置6(P6)の中の小さいか疎水性残基の存在も、ほとんどのDRペプチド相互作用にとって重要である。この重複するP1―P6特異性は9マーコア領域内に、DRスーパーモチーフとして定義された。クラスI分子とは異なり、DR分子は結合力のある溝の両端で開いていて、したがって長さの変わるより長いペプチドを提供することができる。実際、ペプチド−DR相互作用のほとんどのエネルギーがコア領域によって寄与されるように見えている一方、側面に位置する残基は高い親和性相互作用にとって重要であると思われる。また、MHC結合には厳密に必要でないが、側方に位置する残基はT細胞認識のためのほとんどの実例において明らかに必要である。
【0303】
HBV由来DR交差反応性HTLエピトープを識別するために、HLAクラスIモチーフ配列の識別用に走査したのと同じ20個のHBVポリタンパク質モチーフ配列を、結合性HLA−DRのためのモチーフを備えた配列の存在に関して走査した。特に、9−マーコアを含むDR−スーパーモチーフで構成された15マー配列、および領域の側面を守る3残基N−末端およびC−末端が選択された。走査したHBV株の少なくとも85%(17/20)で15マー配列の100%が保存されることがさらに必要とされた。これらの基準を使用して、36個の非冗長(non−retundant)配列が識別された。これらのペプチドのうちの35個を続いて合成した。
【0304】
DR分子に結合するペプチドを予測するためのアルゴリズムも開発されている(Southwoodら、J.lmmunol.160:3363、1998)。個々のDR分子に特異的なこれらのアルゴリズムは9マーコア領域のスコアリングおよびランキングを可能にする。選択表を使用して、これらのアルゴリズムが、適当なDR分子と結合する可能性の高いペプチド配列を効率的に選択することが見出された。さらに、アルゴリズム(特にDR1、DR4w4およびDR7のためのもの)を実行すると、連続して効率的にDR交差反応性ペプチドを選択することができることが見出された。
【0305】
これらのアルゴリズムが追加のペプチドを識別するかどうか確かめるために、上述で使用したのと同じHBVポリタンパク質を、9マーコア領域の100%が85%(17/20の株)保存されている15−マーペプチドの存在を調べるために再走査した。次に、これらのペプチドの各々の9マーコア領域にDR1、DR4w4およびDR7アルゴリズムを使用して得点を付けた。その結果、8個のさらなる配列が識別され合成された。
【0306】
要約すると、9マーコア領域がDRスーパーモチーフを含んでいたか、DRの結合性配列を予測するアルゴリズムを使用して選択された、44個の15マーペプチドが識別された。これらのペプチドのうちの43個が合成された(表XXXIII)。
【0307】
上記のHBV由来ペプチドの分析を実行する一方、9つのペプチド(これらはそのDR1、DR4w4およびDR7アルゴリズムプロフィールに基づいてDR交差反応性結合力のあるペプチドであると予測されたが、9マーコア領域が80%しか保存されていない)も識別された。95%が保存されているDRスーパーモチーフコア領域を含むが、N終点から取り除かれた1つの残基だけが位置決定された追加ペプチドがあらかじめ合成された。これらの10個のペプチドもさらに分析するために選択され、表XXXIIIの中で示される。
【0308】
最後に、2つのペプチドCF−08および1186.25(上述で選択されたペプチド(27.0280)と冗長である)を追加的な分析のために考慮した。ペプチド1186.25は多数のDR−スーパーモチーフ配列を含んでいる。ペプチドCF−08は両方の27.0280および1186.25を入れ子にする20マーである。これらのペプチドは表XXXIIIの中で示される。
【0309】
上述で識別された55個のHBV由来ペプチドを、共通のHLA−DR対立遺伝子を結合するそれらの能力に関して試験した。集団適用範囲およびほとんどのDR対立遺伝子(例えばSouthwoodら、J.Immunol.160:3363、1998参照)の結合性レパートリー間の関係の両方を最大限にするために、DRアッセイの連続パネルに対する結合に関してペプチドをスクリーニングした。これらのスクリーニングパネルの構成、および関連する抗原の発現型頻度は、表XXXIVに示される。ペプチドはすべて、一次パネル中の対立遺伝子(DR1、DR4w4およびDR7)に結合するかを最初に試験した。次いで、これらの3つの対立遺伝子のうちの少なくとも2つと結合するペプチドだけが、二次分析(DR2w2β1、DR2w2β2、DR6wl9およびDR9)において結合するか試験した。最後に、4つの二次パネル対立遺伝子の少なくとも2つと結合するペプチド、したがって全部で7つの対立遺伝子の4つと結合するペプチドのみを三次分析で結合するかをスクリーニングした(DR4w15、DR5w11およびDR8w2)。
【0310】
試験に際して、もともとの55個のペプチドのうちの25個(45%)が一次パネル対立遺伝子の2つ以上と結合することが見出された。これらの25個のペプチドを続いて二次分析において試験した時、20個は一次および二次の分析パネル中の7つのDR対立遺伝子の少なくとも4つと結合することが分かった。最後に、二次スクリーニング過程を通る20個のペプチドのうちの18個を三次分析において結合するか試験した。その結果、12個のペプチドが、10個の共通HLA−DR対立遺伝子のうち少なくとも7つと結合することが示された。これらの12個のペプチド配列および一次から三次パネルに至る各分析に対するそれらの結合能力を表XXXVの中に示す。また、ペプチドCF−08および857.02(今までに試験した対立遺伝子の5/5および5/6それぞれと結合する)も示す。
【0311】
要約すると、多数のHLA−DR対立遺伝子と結合できる、HBVゲノムの12個の独立領域に由来する14個のペプチドが識別された。このペプチドセットは、Core(Nuc)、PolおよびEnv抗原から少なくとも2つのエピトープを各々含んでいる。
【0312】
保存されたDR3モチーフペプチドの選択
HLA−DR3は白人、黒人およびヒスパニック系の人口において広く分布している対立遺伝子であるので、DR3結合能力はHTLエピトープの選択において重要な基準である。しかし、以前に生成されたデータは、DR3が他のDR対立遺伝子と稀にしか交差反応しないことが示されている(Sydneyら、J.Immunol.149:2634−2640、1992;Gelukら、J.Immunol.152:5742−5748、1994;Southwoodら、J.Immunol.160:3363−3373、1998)。これは、DR3ペプチド結合性モチーフは、ほとんどの他のDR対立遺伝子の特異性とは異なるように見えるという点で完全に驚くべきではない。
【0313】
DR3と結合するペプチドを効率的に識別するために、目標タンパク質を、Gelukら(J.Immunol.152:5742−5748、1994)によって報告された2つのDR3特異的結合性モチーフのうちの1つを保持する保存された配列について分析した。18個の配列が識別された。これらの配列のうちの8つは、表XXXVIに示すペプチドと大部分は冗長であり、3個は以前に他の研究用に合成されたペプチドであった。7個のユニークな配列が合成された。
【0314】
DR3モチーフを含む18個のペプチドのうちの17個をそれらのDR3結合能力に関して試験した。4つのペプチドが、DR3に1000nMあるいはそれより良好な親和性で結合することが見出された(表XXXVI)。
【0315】
実施例6.HPV由来HTLエピトープの免疫原性
この例は、免疫原性DRスーパーモチーフおよびDR3のモチーフ保有エピトープを実施例5の中で方法論を用いて識別されたものの中から決定する。
【0316】
HTLエピトープの免疫原性は、HTL応答を刺激する能力の評価および/または適当なトランスジェニックマウスモデルの使用により、CTLエピトープの免疫原性の決定と類似したやり方で評価される。免疫原性は、1)正常なPBMCを使用するインビトロでの一次誘導、または2)癌患者PBMCからのリコール応答:に関してスクリーニングすることにより決定される。
【0317】
実施例7.集団適用範囲の広さを決定するための種々の人種背景におけるHLAスーパータイプの表現型の頻度の算出
この実施例は、複数のスーパーモチーフおよび/またはモチーフを含む複数のエピトープを構成するワクチン組成物の集団の適用範囲の広さの評価を例証する。
【0318】
集団適用範囲を分析するために、HLA対立遺伝子の遺伝子頻度を、決定した。各HLA対立遺伝子についての遺伝子頻度を、二項分布式gf=1−(SQRT(1−af))を利用して、抗原または対立遺伝子頻度から算出した(例えば、Sidneyら、Human Immunol.45:79−93、1996を参照のこと)。全体的な表現型頻度を得るために、蓄積(cumlative)遺伝子頻度を算出し、そして蓄積抗原頻度は、逆の式[af=1−(1−Cgf)2]の使用により、導かれる。
【0319】
頻度データが、DNAタイピングのレベルにおいて利用可能でない場合、血清学的に規定される抗原頻度への対応が、仮定された。合計の潜在的なスーパータイプ集団適用範囲を得るために、結合の不安定性を仮定せず、そしてスーパータイプの各々に属することが確認された対立遺伝子のみを含んだ(最小の評価)。遺伝子座中の組合せにより達成される合計の潜在的適用範囲の評価を、考えられるB対立遺伝子により含まれることが期待され得るAに含まれない集団の比率をAの適用範囲に足すことにより行った(例えば、合計=A+B*(1−A))。A3様スーパータイプの確認されたメンバーは、A3、A11、A31、A*3301、およびA*6801である。A3様スーパータイプは、A34、A66、およびA*7401を潜在的に含み得るが、これらの対立遺伝子を、全体の頻度の算出には含まなかった。同様に、A2様スーパータイプファミリーの確認されたメンバーは、A*0201、A*0202、A*0203、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207、A*6802、およびA*6901である。最終的に、B7様スーパータイプの確認された対立遺伝子は、B7、B*3501−03、B*51、B*5301、B*5401、B*5501−2、B*5601、B*6701、およびB*7801である(潜在的にはまた、B*1401、B*3504−06、B*4201、およびB*5602)。A2スーパータイプ、A3スーパータイプおよびB7スーパータイプを組み合わせることにより達成される集団適用範囲は、5つの主要な人種集団において約86%である(表XXIを参照のこと)。適用範囲を、A1モチーフおよびA24モチーフを保有するペプチドを含むことにより拡大し得る。5つの異なる主要な人種集団(白色人種、北米黒色人種、中国人、日本人、およびスペイン系人種)にまたがり、平均して、A1は、集団の12%そしてA24は、集団の29%で存在する。合わせて、これらの対立遺伝子は、これらの同じ人種集団において平均39%の頻度で示された。主要な人種にまたがる合計の適用範囲は、A1およびA24が、A2スーパータイプ対立遺伝子、A3スーパータイプ対立遺伝子およびB7スーパータイプ対立遺伝子の適用と組み合わさる場合、95%より大きい。
【0320】
HLAクラスII分子のための集団適用範囲は本開示に基づいて同様に開発することができる。
【0321】
候補HLAクラスIおよびクラスIIの要約
要約すると、先に示したデータに基づいて、34個の保存されたCTLエピトープがワクチン候補として選択された(表XXXVII)。これら34個のエピトープのうち、7個はコアから、18個はポリメラーゼから、そして9個はエンベロープから由来するものである。X抗原からのエピトープは、パッケージに含まれていない。このタンパク質は低量で発現し、したがって、免疫学的な重要性は小さいからである。
【0322】
CTLエピトープのこのパネルによって与えられた集団適用範囲は5つの主要人種の各集団において95%を超えると推測される。モンテカルロ分析(図1)を使用して、白人、北アメリカの黒人、日本人、中国人およびヒスパニック系で構成された集団中の個体のおよそ90%が、ワクチン候補エピトープの5つ以上を認識するだろうことは予測される。
【0323】
好ましいCTLエピトープは34個の個別のペプチドを含んでいるが、2つのペプチドは、より長いペプチド内に完全に入れ子にされているため、ワクチン候補に含まれなければならないペプチドの数は有効的に減っている。具体的にはA2−拘束ペプチド927.15は、B7−拘束ペプチド26.0570内に入れ子にされ、B7−拘束ペプチド988.05はA2−拘束ペプチド924.07内に入れ子にされる。同様に、A−24拘束ペプチド20.0136とA2−拘束ペプチド1013.01は、同じコア領域を含み第1のアミノ酸でのみ異なっている。関連して言えば、A2−拘束ペプチド1090.14およびB7−拘束ペプチド1147.05は、2つのアミノ酸によって重なっており、1つの連続するペプチド配列としてこれら2つのエピトープを運搬する可能性を高めている。
【0324】
ペプチドのセットは9個のA2−拘束CTLエピトープ;4つのポリメラーゼ誘導エピトープ、4つのエンベロープ誘導エピトープおよびコアエピトープを含む。これらの9個のペプチドのうちの7個は急性患者からのリコールCTL分析で認識される。患者において認識された7個のペプチドのうち、2個は非交差反応性結合ペプチドである。潜在的なワクチン候補としてのこれらのペプチドの包含は、HLA−A*0201が、検査されたすべての人種において主に発現されるA2−スーパータイプ対立遺伝子であるという観察から生じる。そのため、ペプチドを結合する交差反応性でないA*0201の包含は、抗原適用範囲および集団適用範囲の冗長性を増加させる。患者の免疫原性データを欠くわずか2つのA2−拘束ペプチドは、ペプチド1090.77および1069.06である。1090.77ペプチドは急性HBV患者の中で認識された高度に免疫原性なペプチドのアナログである。アナログペプチドを認識する能力に関して、患者におけるリコール応答が試験されていないことが、HLAトランスジェニックマウスの中で行われた免疫原性研究は、1090.77で誘導されるCTLは、天然に存在する配列を伴う標的細胞を認識することができることを示した。これらのデータは、1090.77のペプチドに対して増加されるCTLは、交差反応性であり、HBV感染細胞を認識するべきであるということを示している。A6802へのその高い結合親和性性がより大きな人口適用範囲をもたらすので、ペプチド1069.06は潜在的なワクチンエピトープとして含まれていた。該ペプチドは、HLA−A2トランスジェニックマウスおよび主なヒト培養において免疫原である。
【0325】
好ましいCTLエピトープは7個のA3−スーパータイプ拘束ペプチドを含んでおり;6個はポリメラーゼ抗原に由来し、1個はコア領域に由来する。A3−スーパータイプワクチン候補ペプチドはすべて患者において免疫原である。ペプチド1142.05は非交差反応性のA3−拘束ペプチドであるが、それは、患者の中で認識されることを示されており、結合性HLA−A1と結合することができる。
【0326】
9個のB7−拘束ペプチドが実施例において識別された好ましいCTLエピトープである。このグループのうち、3つのエピトープが、患者の中で認識されることが示された。一方、これらのペプチドのうちの1つ、1147.04は非交差反応性の結合体であり、これは主要B7スーパータイプ対立遺伝子のうちの2つにIC50または結合親和性価値100nM未満で結合する。6個のB7スーパータイプエピトープは、スーパータイプ結合に基づく好ましいエピトープとして含まれていた。ヒトにおける免疫原性研究(Bertoniら、1997;Doolanら、1997;Threlkeldら、1997)は、高度に交差反応的なペプチドは、エピトープとしてほとんど常に認識されることを実証した。これらの結果を踏まえれば、また、利用可能な免疫原性データが限定的であるという点に照らして、選択基準としてB7−スーパータイプ結合親和性の使用が適当であると考えられた。
【0327】
同様に、A1−およびA24−拘束ペプチドに関する免疫原性データは少ない。1つの好ましいCTLエピトープ1069.04は、急性HBV患者からのリコール応答において認識されることが報告された。これまでの節で議論したように結合親和性<100nMのペプチドの高い割合は免疫原性であることがわかる。この理由で、結合親和性<100nMであるすべてのA1およびA24ペプチドは好ましいCTLエピトープと見なされた。この選択基準を用いて、3個のA1−拘束ペプチドおよび6個のA24−拘束ペプチドは、候補エピトープとして確認される。詳しい分析で、3個のコア由来ペプチドが中間の親和性を有するA24と結合することが見出された。この研究の過程で、比較的少ないコアエピトープしか識別されなかったので、抗原適用範囲により大きな冗長性をもたらすために、中間のA24結合性コアペプチドも好ましいエピトープのセットに包含された。
【0328】
好ましいHBV由来HTLエピトープのリストは、表XXXVIIに要約される。HTLエピトープのセットは、12個のDRスーパーモチーフ結合性ペプチドおよび4個のDR3結合性ペプチドを含む。HTLエピトープの大部分はポリメラーゼに由来する;2個のエンベロープおよび2個のコアに由来するエピトープも好ましいHTLエピトープのセットに含まれる。HTLエピトープのパネルによって表わされる、評価された集団適用範囲の合計は、5つの主要人種集団の各々において91%を超えている(表XXXVIII)。
【0329】
実施例9:プライミング後に内因的にプロセシングされる抗原の生成の認識
この実施例は、実施例1〜5に記載されるように同定されかつ選択されたネイティブなペプチドエピトープまたは類似のペプチドエピトープにより誘導されるCTLが、内因的に合成される、すなわちネイティブな抗原を認識することを決定する。
【0330】
実施例3におけるようなペプチドエピトープ(例えば、HLA−A2スーパーモチーフ保有エピトープ)を用いて免疫されたトランスジェニックマウスから単離されたエフェクター細胞を、ペプチドでコートされた刺激細胞を使用してインビトロで再刺激する。6日後、エフェクター細胞を、細胞傷害性についてアッセイし、そしてペプチド特異的細胞傷害性活性を含む細胞株をさらに再刺激する。さらに6日後、これらの細胞株を、ペプチドの非存在下または存在下で、51Cr標識Jurkat−A2.1/Kb標的細胞に関する細胞傷害性活性について試験し、そしてまた、内因的に合成された抗原を保有する51Cr標識標的細胞(例えば、HBV発現ベクターを用いて安定にトランスフェクトされる細胞)に関して試験する。
【0331】
この結果は、ペプチドエピトープを用いてプライムされた動物から得られたCTL系統が、内因的に合成されたHBV抗原を認識することを示す。このような分析に使用されるべきトランスジェニックマウスモデルの選択は、評価されているエピトープに依存する。HLA−A*0201/Kbトランスジェニックマウスに加え、いくつかの他のトランスジェニックマウスモデル(ヒトA11を有するマウスを含む)(これはまた、A3エピトープ、およびB7対立遺伝子を評価するために使用され得る)が特徴付けられており、そして他(例えば、HLA−A1およびA24に対するトランスジェニックマウス)が開発されている。HLA−DR1マウスモデルおよびHLA−DR3マウスモデルもまた開発されており、これを、HTLエピトープを評価するために使用し得る。
【0332】
実施例9:トランスジェニックマウスにおけるCTL−HTL結合体化エピトープの活性
本実施例は、HBV CTL/HTLペプチド結合体の使用によるトランスジェニックマウスにおけるCTLおよびHTLの誘導を例示する。同様な研究はOseroffら、Vaccine 16:823−833(1998)に見出される。
【0333】
ペプチド組成物は、複数のCTLおよび/またはHTLエピトープを含むことができ、さらに、複数HPV標的抗原から選択されるエピトープを含み得る。エピトープは実施例1〜6に記載されるような方法論を用いて識別される。例えば、そのようなペプチド組成物は、例えば、多数のHLAファミリーのメンバーと500nM以下の親和性で結合する少なくとも1つのCTLエピトープ、またはそのエピトープのアナログを含む好ましいエピトープと結合するHTLエピトープを含み得る。所望であれば、ペプチドは脂質化(lipidated)されてもよい。
【0334】
免疫手順:トランスジェニックマウスの免疫は文献記載(Alexanderら、J.Immunol.159:4753−4761、1997)のように実行される。例えば、A2/Kbマウス(それらはヒトHLA A2.1対立遺伝子に関する遺伝子組換体で、HLA−A*0201モチーフまたはHLA−A2スーパーモチーフ保有エピトープの免疫原性の評価に役立つ)は、不完全フロイントアジュバント中で、またはペプチド組成物が脂質化されたCTL/HTL結合体である場合は、DMSO/食塩水の中で、もしくはペプチド組成物がポリペプチドである場合は、PBSあるいは不完全フロイントアジュバント中で、皮下に(尾の基部)に0.1mlのペプチドをプライミングされる。プライミングの7日後に、これらの動物から得られた脾細胞は、ペプチドで覆われた、照射された同質遺伝子LPS−活性化リンパ芽球で新たに刺激される。
【0335】
細胞株:ペプチド特異的細胞傷害性アッセイのための標的細胞は、HLA−A2.1/Kbキメラ遺伝子を用いてトランスフェクトされたJurkat細胞である(例えば、Vitielloら、J.Exp.Med.173:1007、1991)。
【0336】
インビトロのCTL活性:プライムの1週間後、脾臓細胞(30×106細胞/フラスコ)を、37℃において、10mlの培養培地/T25フラスコ中で、同族の、照射された(3000ラド)、ペプチドコートされたリンパ芽球(10×106細胞/フラスコ)と、共培養する。6日後、エフェクター細胞を回収し、細胞毒性活性についてアッセイする。
【0337】
細胞傷害性活性についてのアッセイ:標的細胞(1.0〜1.5×106)を、37℃において、200μlの51Crの存在下でインキュベートする。60分後、細胞を3回洗浄し、そしてR10培地で再懸濁する。1μg/mlの濃度において必要とされるペプチドを添加する。アッセイについて、104 51Cr標識標的細胞を、Uボトムの96穴プレートにおいて、異なる濃度のエフェクター細胞(200μlの最終用量)に添加する。37℃におけるインキュベーション6時間後、上清の0.1mlのアリコートを、各穴から除去し、そして放射活性を、マイクロメディック(micromedic)自動γ計測器において計測する。百分率特異的溶解を、式により測定する:百分率特異的放出=100×(実験的放出−自発的放出)/(最大放出−自発的放出)。同じ条件下の別個のCTLアッセイの実行の間で、比較を容易にするために、%51Cr放出データを、溶解単位/106個の細胞として表す。1つの溶解単位を、6時間51Cr放出アッセイにおいて10,000個の標的細胞である30%の溶解を達成するために必要とされるエフェクター細胞の数として任意に規定する。特異的な溶解単位/106を得るために、ペプチドの非存在下で得られる溶解単位/106を、ペプチドの存在下で得られる溶解単位/106から引く。例えば、30%の51Cr放出が、ペプチドの非存在下、50:1のエフェクター(E):標的(T)比(すなわち、10,000個の表TKEII標的に対して、5×105個のエフェクター細胞)において、およびペプチドの存在下、5:1のエフェクター(E):標的(T)比(すなわち、10,000個の標的に対して、5×104個のエフェクター細胞)において得られるならば、特異的溶解単位は、[(1/50,000)−(1/500,000)]×106=18LUである。
【0338】
この結果を、免疫原性CTL/HTL結合体ワクチン沈殿物を注入された動物のCTL応答の大きさを評価するために、分析し、そして実施例3で概略されるようなCTLエピトープを使用して達成されるCTL応答の大きさと比較する。これと類似する分析を、複数のCTLエピトープおよび/または複数のHTLエピトープを含むペプチド結合体の免疫原性を評価するために実施し得る。これらの手順に従って、CTL応答を誘導し、そして付随して、HTL応答を、このような組成物の投与に際して誘導することを見出す。
【0339】
実施例10.HBV特異的ワクチン中の含有のためのCTLエピトープおよびHTLエピトープの選択
本実施例は、本発明のワクチン組成物のためのペプチドエピトープの選択についての手順を例示する。この組成物中のペプチドは、核酸配列の形態で、ペプチドをコードする単一または1つまたは複数の配列(すなわち、ミニ遺伝子)であり得るか、または単一のエピトープおよび/またはポリエピトープなペプチドであり得る。
【0340】
以下の原理は、ワクチン組成物中の含有のためのエピトープアレイを選択する際に用いられる。選択を行うためには以下の原理のそれぞれのバランスを取る。
【0341】
投与の際に、HBV除去と相互に関係があることが観察されている免疫応答を模倣するエピトープを選択する。使用するエピトープの数は自然にHBVを解消する患者の観察に依存する。例えば、自然にHBVを解消する患者が少なくとも1つのHPB抗原上で少なくとも3個のエピトープに対する免疫応答を生ずることが観察された場合、次いで、3〜4個のエピトープがHLAクラスIに包含されるべきである。同様の理由がHLAクラスIIエピトープを決定するのにも使用される。
【0342】
エピトープはしばしば、HCLクラスI分子に対する500nM以下のIC50の結合親和性を有するか、またはクラスIIに対する1000nM以下のIC50の結合親和性を有するエピトープを選択する。
【0343】
十分なスーパーモチーフ保有ペプチド、または対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイを、広範な集団適用範囲を与えるために選択する。例えば、エピトープを、少なくとも80%の集団適用範囲を提供するために選択する。モンテカルロ分析(当該分野で公知の統計的評価)を使用して、集団適用範囲の広さ、または重複を評価し得る。
【0344】
ポリエピトープ組成物(例えば、ミニ遺伝子)を作製する場合、典型的には、目的のエピトープを含む可能な最も小さいペプチドを生成することが所望される。この使用される原理は、ネストされるエピトープを含むペプチドを選択する場合に使用される原理と同じでない場合、類似する。
【0345】
同一の標的タンパク質の多数の変種の配列が利用可能である場合、タンパク質ペプチドエピトープはその保存性に基づいて選択することもできる。例えば、保存性の基準は、HLAクラスI結合ペプチドの全配列またはクラスII結合ペプチドの全9マーのコアが、特定のタンパク質抗原について評価される配列の指定されたパーセンテージで保存されることを規定してもよい。
【0346】
ワクチン組成物中の含有のためのペプチドエピトープを、例えば、表XXXVIIaおよびbに列挙されるエピトープから選択する。選択されるペプチドから構成されるワクチン組成物は、投与される場合、安全で、効果的であり、そして急性HBV感染を排除する免疫応答の大きさに類似の免疫応答を誘発する。
【0347】
実施例11:ミニ遺伝子の複数のエピトープDNAプラスミドの構築
この実施例は、ミニ遺伝子発現プラスミドの構築のための誘導を提供する。ミニ遺伝子プラスミドは、もちろん、本明細書中に記載されるようなCTLおよび/またはHTLエピトープもしくはエピトープのアナログの種々の構造を含み得る。発現プラスミドの構築および評価の例を、例えば、同時に係属しているU.S.S.N.09/311,784(5/13/99に出願された)において記載する。このようなプラスミドの例を図2に示し、ミニ遺伝子構築物におけるHBVエピトープの位置を例示する。こうしたプラスミドは、例えば、複数のCTLおよびHTLペプチドエピトープも含み得る。
【0348】
ミニ遺伝子発現プラスミドは、典型的には、複数のCTLペプチドエピトープおよびHTLペプチドエピトープを含み得る。本実施例において、HLA−A2スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープ、HLA−A3スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープ、HLA−B7スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープならびにHLA−A1モチーフ保有ペプチドエピトープおよびHLA−A24モチーフ保有ペプチドエピトープを、DRスーパーモチーフ保有エピトープおよび/またはDR3エピトープと共に使用する(図2)。好ましいエピトープを、例えば、表XXVI〜XXXIIIにおいて同定する。複数のスーパーモチーフ/モチーフが広範な集団適用範囲を保証するために示されるように、複数のHBV抗原(例えば、コア、ポリメラーゼおよびXタンパク質)由来のHLAクラスIスーパーモチーフまたはモチーフ保有ペプチドエピトープを選択する。同様に、HLAクラスIIエピトープを、複数のHBV抗原から選択し、広範な集団適用範囲を提供し、すなわち、HLA DR−1−4−7スーパーモチーフ保有エピトープおよびHLA DR−3モチーフ保有エピトープを、ミニ遺伝子構築物中の含有のために選択する。次いで、選択されたCTLエピトープおよびHTLエピトープを、発現ベクターにおける発現のためにミニ遺伝子中に組み込む。
【0349】
本実施例は、このようなミニ遺伝子保有発現プラスミドの構築に使用される方法を示す。ミニ遺伝子組成物のために使用され得る他の発現ベクターは利用可能であり、そして当業者に公知である。
【0350】
ミニ遺伝子DNAプラスミドは、コンセンサスKozak配列ならびにコンセンサスマウスκIg軽鎖シグナル配列、続いて本明細書中に開示された原理に従って選択されたCTLエピトープおよび/またはHTLエピトープのストリングを含む。
【0351】
15個のヌクレオチド重複を含む平均約70ヌクレオチド長である重複オリゴヌクレオチド(例えば、8個のオリゴヌクレオチド)を合成し、そしてHPLC精製する。このオリゴヌクレオチドは、選択されたペプチドエピトープならびに適切なリンカーヌクレオチドをコードする。最終的なマルチエピトープミニ遺伝子を、PCRを用いる3セットの反応で重複オリゴヌクレオチドを伸長することによって結合する。Perkin/Elmer9600PCR機器を使用し、そして以下の条件を使用して全部で30サイクルを実施する:95℃で15分間、アニーリング温度(各プライマー対の最も低く計算されたTmより5°下)で30秒間、および72℃で1分間。
【0352】
第1回目のPCR反応について、2つのオリゴヌクレオチドの各々の5μgを、アニーリングし、そして伸長する:オリゴヌクレオチド1+2、3+4、5+6、および7+8を、Pfuポリメラーゼ緩衝液(lx=10mM KCL、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris−クロライド、pH8.75、2mM MgSO4、0.1% Triton X−100、100μg/ml BSA)、0.25mM 各dNTP、および2.5UのPfuポリメラーゼを含む100μlの反応物と合わせる。全長ダイマー生成物を、ゲル精製し、そして、2つの反応物(1+2と3+4の生成物、ならびに5+6と7+8の生成物を含む)を10サイクルにわたり混合し、アニーリングし、そして伸長させる。次いで、この2つの反応物の半分を混合し、そして、5サイクルのアニーリングおよび伸長を実施し、その後に、隣接プライマーを添加して、全長生成物をさらに25回サイクルで増幅する。全長生成物を、ゲル精製し、そしてpCR−blunt(Invitrogen)にクローン化し、そして、個々のクローンを、配列決定によってスクリーニングする。
【0353】
実施例12.プラスミド構築およびこの構築物が免疫原性を誘導する程度
プラスミド構築物(例えば、実施例11に従って構築されたプラスミド)が免疫原性を誘導し得る程度を、エピトープを発現する核酸構築物を備えたAPCの形質導入またはトランスフェクションに続くAPCによるエピトープ提示について試験することによりインビトロで評価することができる。このような研究は、「抗原性」を決定し、そして、ヒトAPCの使用を可能にする。このアッセイは、ある状況においてAPCによって提示されるこのエピトープの能力を示し、この状況は、細胞表面上のエピトープ−HLAクラスI複合体の密度を定量することによって、T細胞により認識される。定量を、APCから溶出されたペプチドの量を直接測定することによって実施し得る(例えばSijtsら、J.Immunol.156:683−692、1996;Demotzら、Nature 342:682−684、1989参照);または、ペプチド−HLAクラスI複合体の数を、感染もしくはトランスフェクトされた標的細胞によって誘導された溶解物またはリンホカイン放出の量を測定し、次いで、等価なレベルの溶解物またはリンホカイン放出を得るのに必要であるペプチドの濃度を決定することによって評価することができる(例えばKageyamaら、J.Immunol.154:567−576、1995参照)。
【0354】
あるいは、免疫原性は、マウスへのインビボ注入およびこれに続くCTLおよびHTL活性のインビトロ評価を通じて評価することができ、CTLおよびHTL活性はそれぞれ、例えば、同時係属する1999年5月13日に出願されたU.S.S.N.09/311,784およびAlexanderら、Immunity 1:751−761、1994に詳述されるように、細胞傷害性および増殖アッセイを用いて分析される。
【0355】
例えば、少なくとも1つのHLA−A2スーパーモチーフペプチドを含むDNAミニ遺伝子構築物(例えば、U.S.S.N.09/311、784に記載されているようにして生成されるpMinミニ遺伝子構築物)がCTLをインビボで誘導する能力を評価するために、HLA−A2.1/Kbトランスジェニックマウスを、例えば100μgの裸のcDNAを用いて筋内で免疫する。cDNA免疫によって誘導されたCTLのレベルを比較するための手段として、対照の動物群もまた、実際のペプチド組成物(これは、ミニ遺伝子によってコードされるのと同様に単一のポリペプチドとして合成される複数エピトープを含む)で免疫する。
【0356】
免疫動物からの脾細胞を、各それぞれの組成物(ミニ遺伝子またはポリエピトープペプチドにコードされるペプチドエピトープ)で2回刺激し、次いで、51Cr放出アッセイにおいてペプチド特異的細胞傷害活性についてアッセイする。この結果は、A2拘束エピトープに対して指向されるCTL応答の大きさを示し、したがって、ミニ遺伝子ワクチンおよびポリエピトープワクチンのインビボ免疫原性を示す。したがって、このミニ遺伝子が、ポリエピトープペプチドワクチンと同様に、HLA−A2スーパーモチーフペプチドエピトープに対して指向される免疫応答を誘発することを見出した。同様の分析がまた、他のHLA−A3トランスジェニックマウスモデルおよびHLA−B7トランスジェニックマウスモデルを用いて実施され、HLA−A3モチーフおよびHLA−B7モチーフまたはHLA−A3スーパーモチーフおよびHLA−B7スーパーモチーフによるCTL誘導を評価する。
【0357】
ミニ遺伝子をコードするクラスIIエピトープのインビボでのHTL誘導能力を評価するために、DRトランスジェニックマウスを、あるいは適当なマウスMHC分子と交差反応するそうしたエピトープについて評価するために、例えば、I−Ab拘束マウスを、プラスミドDNA100μgを用いて筋内に免疫する。DNA免疫付与により誘導されるHTLレベルと比較する手段として、対照動物の一群も完全フロイントアジュバントに乳化させた実際のペプチド組成物で免疫する。CD4+T細胞、すなわちHTLを、被免疫動物の脾細胞から精製し、各組成物(ミニ遺伝子中にコードされたペプチド)それぞれで刺激する。3H−チミジン組み込み増殖アッセイ(例えば、Alexanderら、Immunity 1:751−761、1994参照)を用いてHTL応答を測定する。結果はHTL応答の大きさを示し、従って、ミニ遺伝子のインビボでの免疫原性を実証する。
【0358】
実施例11に記載するように構築されるDNAミニ遺伝子は、プライムブーストプロトコルを用いてブースト剤と組み合わせたワクチンとして評価してもよい。ブースト剤は、組換えタンパク質(例えば、Barnettら、Aids Res.and Human Retroviruses 14、Supplement 3:S299−S309、1998)または組換えワクチン、例えば、目的の完全タンパク質をコードするミニ遺伝子またはDNAを発現するもの(例えば、Hankeら、Vaccine 16:439−445、1998;Sedegahら、Proc.Natl.Acad.Sci USA 95:7648−53、1998;HankeおよびMcMichael、Immunol.Letters 66:177−181、1999;およびRobinsonら、Nature Med.5:526−34、1999)から構成することができる
【0359】
例えば、プライムブーストプロトコルで使用されるDNAミニ遺伝子の効能は、最初はトランスジェニックマウスで評価する。この例では、A2.1/Kbトランスジェニックマウスを100μgのDNAミニ遺伝子(少なくとも1つのHLA−A2スーパーモチーフ保有ペプチドを含む免疫原性ペプチドをコードする)でIMにより免疫する。インキュベーション期間(3〜9週間の範囲)の後、DNAミニ遺伝子によってコードされるのと同一の配列を発現する組換えワクチンウイルス107pfu/マウスを用いて、マウスをIPでブーストする。対照マウスは、ミニ遺伝子配列を含まない100μgのDNAまたは組換えワクチンで免疫するか、ミニ遺伝子をコードするDNAを用いるがワクチンブーストは行わずに免疫する。さらに2週間のインキュベーション期間の後、ELISPOTアッセイにおいてペプチド特異的活性についてマウスからの脾細胞を直ちに分析する。さらに、ミニ遺伝子内にコードされるA2拘束ペプチドエピトープおよび組換えワクチンを用いて脾細胞をインビトロで刺激し、次いで、INF−γ ELISAにおいてペプチド特異的活性について分析する。
【0360】
プライムブーストプロトコルにおいて利用されるミニ遺伝子は、DNA単独よりもHLA2−A2スーパーモチーフペプチドに向けてより大きな免疫応答を誘発することが見出される。こうした分析は、HLA−A11またはHLA−B7トランスジェニックマウスモデルを用いてHLA−A3またはHLA−B7モチーフまたはスーパーモチーフエピトープにより誘導されるCTLを評価して行うこともできる。
【0361】
人間におけるプライムブーストプロトコルの使用は実施例20に記載する。
【0362】
実施例13:予防的使用のためのペプチド組成物
本発明のワクチン組成物は、感染の危険性がある人のHJBV感染を予防するのに用いることもできる。例えば、実施例9および/または実施例10に選択されるような複数のCTLエピトープおよびHTLエピトープを含むポリエピトープペプチドエピトープ組成物(またはこれを含む核酸)であって、集団の80%より多くを標的とするように選択される組成物を、HBV感染の危険性がある個体に投与する。
【0363】
例えば、複数のエピトープを包む単一のポリペプチドとしてペプチドベースの組成物を提供することができる。このワクチンは、典型的には、フロイント不完全アジュバントなどのアジュバントを含む生理学的溶液中に投与される。最初の免疫のためのペプチドの用量は、70kgの患者に対して、約1〜約50,000μg、一般的に100〜5,000μgである。ワクチンの最初の投与の後に、続いて4週でブースター投与量、PBMCサンプル中のエピトープ−特異的CTL集団の存在を決定する技術によるこの患者における免疫応答の大きさの評価が続く。必要とされるならば、さらなるブースター投与量を投与する。この組成物は、HPV感染に対する予防法として、安全かつ効果的の両方であることが見出される。
【0364】
あるいは、トランスフェクト剤を典型的に含む組成物を、当該分野で公知の方法論および本明細書中に開示される方法論に従って、核酸ベースのワクチンを投与するために使用することができる。
【0365】
実施例14:ネイティブなHBV配列由来のポリエピトープワクチン組成物
ネイティブなHBVポリタンパク質配列を、好ましくは各クラスIおよび/またはクラスIIのスーパーモチーフまたはモチーフについて規定されたコンピュータアルゴリズムを用いてスクリーニングし、複数のエピトープを含むポリタンパク質の「比較的に短い(relatively short)」領域を同定する。そして、この配列は、好ましくは、ネイティブ抗原全体よりも短い長さである。複数の異なる、重複さえしているエピトープを含むこの比較的に短い配列を選択し、そして使用してミニ遺伝子構築物を作製する。この構築物を操作して、ネイティブなタンパク質配列に対応するペプチドを発現させる。「比較的に短い」ペプチドは、一般的に、250アミノ酸長より短く、しばしば100アミノ酸長より短く、好ましくは75アミノ酸長より短く、そしてより好ましくは50アミノ酸長より短い。上述のワクチン組成物のタンパク質配列は、配列内に含まれる最大数のエピトープを有する、すなわち高いエピトープ濃度を有するので、選択される。本明細書中で述べられるように、エピトープモチーフがネスト(be nested)されてもよいし、重複(すなわち、互いに関してフレームシフトする)であってもよい。例えば、f重複エピトープを有する、2つの9マーのエピトープおよび1つの10マーのエピトープが10アミノ酸ペプチド中に存在し得る。このようなワクチン組成物を、治療目的または予防目的のために投与する。
【0366】
ワクチン組成物は、例えば、少なくとも1つのHBV標的抗原由来の3つのCTLエピトープおよび少なくとも1つのHTLエピトープを含む。このポリエピトープのネイティブな配列は、ペプチドとしてかまたはこのペプチドをコードする核酸配列としてかのいずれかで投与される。あるいは、アナログが、このネイティブな配列から作製され得、これによって、1つまたは複数のエピトープは、ポリエピトープペプチドの交差反応性および/または結合親和性特性を変化させる置換を含む。
【0367】
本実施例の実施形態は、免疫系プロセシングの今まで発見されていない態様が、ネイティブなネスト配列(nested sequence)に適用され、これによって、治療的または予防的な免疫応答を誘導するワクチン組成物の生成を容易にする可能性を提供する。さらなるこのような実施形態は、現在未知であるHLA構造に関するモチーフ保有エピトープの可能性を提供する。さらに、本実施形態(アナログを欠く)は、ネイティブなHBV抗原に実際に存在する複数のペプチド配列に対する免疫応答を指向し、したがって、任意の連結エピトープを評価する必要を回避する。最後に、本実施形態は、核酸ワクチン組成物を生成する場合に規模の経済を提供する。
【0368】
本実施例に関連して、コンピュータプログラムは、当該分野における原理に従って導かれ得、これは、標的配列において、配列長当たりの最も大きい数のエピトープを同定する。
【0369】
実施例15.複数の疾患に指向されるポリエピトープワクチン組成物
本発明のHBVペプチドエピトープを、1つまたは複数の他の疾患に関連する標的抗原由来のペプチドエピトープと共に使用し、HBVならびに他の疾患の予防または治療に有用であるワクチン組成物を作製する。他の疾患の例としては、HIVおよびHCVおよびHPVが挙げられるが、これらに限定されない。
【0370】
例えば、集団の98%より多くを標的とする複数のCTLエピトープおよびHTLエピトープを含むポリエピトープなペプチド組成物は、HBV感染およびHIV感染の両方について危険性がある個体に投与するために作製され得る。この組成物は、種々の疾患に関連される供給源由来の複数のエピトープを組み込む単一ポリペプチドとして提供され得るか、または1つまたは複数の異なるエピトープを含む組成物として投与され得る。
【0371】
実施例16.免疫応答を評価するためのペプチドの使用
本発明のペプチドを使用して、HBVを指向する特異的CTL集団またはHTL集団の存在について、免疫応答を分析し得る。このような分析は、Oggら、Science 279:2103−2106、1998に記載されるような方法で実施され得る。以下の実施例において、本発明に従うペプチドを、免疫原としてではなく、診断目的または予防目的のための試薬として使用する。
【0372】
本実施例において、高度に感受性のヒト白血球抗原テトラマー複合体(「テトラマー」)を、例えば、感染の異なる段階におけるHLA A*0201陽性個体由来のHBV HLA−A*0201特異的CTL頻度、または引き続くA*0201モチーフを含むHBVペプチドを用いた免疫の断面(cross−sectional)分析に使用する。テトラマー複合体を、記載されるように合成する(Museyら、N.Engl.J.Med.337:1267、1997)。簡潔に言うと、精製HLA重鎖(本実施例におけるA*0201)およびβ2ミクログロブリンを、原核生物発現系の手段によって合成する。この重鎖を、膜貫通細胞質テイルの欠失およびBirA酵素ビオチン化部位を含む配列のCOOH末端添加によって改変する。重鎖、β2ミクログロブリン、およびペプチドを、希釈によって再度折り畳む。45kDの再度折り畳まれた生成物を、高速タンパク質液体クロマトグラフィーによって単離し、次いで、ビオチン(Sigma、St.Louis、Missouri)、アデノシン5’三リン酸、およびマグネシウムの存在下で、BirAによってビオチン化する。ストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体を、1:4のモル比で添加し、そして、テトラマー生成物を、1mg/mlに濃縮する。得られた生成物を、テトラマー−フィコエリトリンと呼ぶ。
【0373】
患者の血液サンプルの分析に関して、約100万個のPBMCを、300gで5分間遠心分離し、そして、50μlの冷リン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁する。三色分析を、抗CD8−Tricolor、および抗CD38と共に、テトラマー−フィコエリトリンで実施する。PBMCを、テトラマーおよび抗体を用いて氷上で30〜60分間インキュベートし、次いで、ホルムアルデヒド固定の前に2回洗浄する。99.98%を越える対照サンプルを含むようにゲートを適用する。テトラマーについての対照としては、A*0201陰性個体およびA*0201陽性未感染ドナーの両方が挙げられる。次いで、テトラマーで染色された細胞の割合を、フローサイトメトリーによって決定する。この結果は、エピトープ拘束CTLを含むPBMCサンプル中の細胞数を示し、これによって、HBVエピトープに対する免疫応答の程度を直ちに示し、このようにして、HBV感染の段階、HBVへの曝露の状態または保護的応答もしくは治療的応答を誘発するワクチンへの曝露を示す。
【0374】
実施例17:リコール応答(recall response)を評価するためのペプチドエピトープの使用
本発明のペプチドエピトープを、患者における急性応答またはリコール応答などのT細胞応答を評価するための試薬として使用する。このような分析は、感染から回復した患者、HBVに慢性的に感染する患者、またはHBVワクチンをワクチン接種された患者に対して実施され得る。
【0375】
例えば、ワクチン接種された個体のクラスI拘束CTL応答を、分析し得る。ワクチンは、任意のHBVワクチンでよい。PBMCを、ワクチン接種された個体およびHLA型の個体から回収する。次いで、複数のHLAスーパータイプファミリーのメンバーとの交差反応性を提供するスーパーモチーフを最適には保有する本発明の適切なペプチドエピトープを、そのHLA型を保有する個体由来のサンプルの分析のために使用する。
【0376】
ワクチン接種された個体由来のPBMCを、Ficoll−Histopaque密度勾配(Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)上で分離し、HBSS(GIBCO Laboratories)中で3回洗浄し、RPMI−1640(GIBCO Laboratories)(これは、L−グルタミン(2mM)、ペニシリン(50U/ml)、ストレプトマイシン(50μg/ml)、およびHepes(l0mM)が補充され、10% 熱不活性化ヒトAB血清を(完全RPMI)を含む)中に再懸濁し、そして、マイクロ培養(microculture)形式を用いて平面培養する。本発明のエピトープを含む合成ペプチドを、10μg/mlで各ウェルに添加し、そしてHBVコア128〜140エピトープを、刺激の最初の週の間に、T細胞補助の供給源として1μg/mlで各ウェルに添加する。
【0377】
マイクロ培養形式において、4×105個のPBMCを、96ウェルの丸底プレートにおいて100μl/ウェルの完全RPMI中、8個の複製培養物において、ペプチドで刺激する。3日目および10日目に、100mlの完全RPMIおよび20U/ml最終濃度のrIL−2を各ウェルに添加する。7日目に、培養物を、96ウェルの平底プレートに移し、そして、ペプチド、rIL−2および105個の照射された(3,000rad)自系供給細胞で再刺激する。培養物を、14日目に、細胞傷害活性に関して試験する。陽性のCTL応答は、以前に記載されたように(Rehermannら、Nature Med.2:1104、1108、1996;Rehermannら、J.Clin.Invest.97:1655−1665、1996;およびRehermannら、J.Clin.Invest.98:1432−1440、1996)未感染の対照被験体との比較に基づいて、10%より大きい特異的51Cr放出を示すために、8個の複製培養物のうちの2つ以上を必要とする。
【0378】
標的細胞株は、自系および同種異系のEBV形質転換B−LCLであり、これらは、American Society for Histocompatibility and Immunogenetics(ASHI、Boston、MA)から購入されるか、または記載されたように(Guilhotら、J Virol.66:2670−2678、1992)患者のプールから確立されるかのいずれかである。
【0379】
細胞傷害性アッセイを、以下の方法で実施する。標的細胞は、同種異系のHLAが一致したBリンパ芽球細胞株または自系EBV形質転換Bリンパ芽球細胞株のいずれかからなり、これらの細胞株を、10μMの本発明の合成ペプチドエピトープと共に一晩インキュベートし、そして100μCiの51Cr(Amersham Corp.、Arlington Heights、IL)を用いて1時間標識し、この後、これらをHBSSを用いて4回洗浄する。
【0380】
細胞傷害活性を、3,000個の標的/ウェルを含むU底の96ウェルプレートを用いて、標準的な4−h、分裂ウェル(split well)51Cr放出アッセイにおいて決定する。刺激されたPBMCを、14日目に、20〜50:1のエフェクター/標的(E/T)比において試験する。百分率細胞傷害性を、式:100×[(実験的な放出−自発的な放出)/最大の放出−自発的な放出)]から決定する。最大の放出は、洗浄剤(2% Triton X−100;Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)による標的の溶解により決定する。自発的な放出は、全ての実験に対して、最大放出の25%未満である。
【0381】
このような分析の結果は、HLA拘束CTL集団がHBVまたはHBVワクチンへの事前の曝露によって刺激された程度を示す。
【0382】
同様にクラスII拘束HTL応答も分析され得る。精製されたPBMCを、96ウェル平底プレート中、1.5×105細胞/ウェルの密度で培養し、そして10μg/mlの合成ペプチド、全抗原、またはPHAを用いて刺激する。細胞を、慣用的に、各条件について4〜6ウェルの反復実験において平面培養する。培養の7日後、この培地を取り除き、そして、10U/mlのIL−2を含む新鮮な培地で置きかえる。2日後、1μCi 3H−チミジンを、各ウェルに添加し、そしてさらなる18時間インキュベーションを続ける。次いで、細胞性のDNAを、ガラスファイバーマット上に収集し、そして、3H−チミジン取りこみについて分析する。抗原特異的T細胞増殖を、抗原の存在下での3H−チミジン取りこみを抗原の非存在下での3H−チミジン取り込みで割った比として、算出する。
【0383】
実施例18:ヒトにおける特異的CTL応答の誘導
本発明のHBV CTLエピトープおよびHTLエピトープを含む免疫原性組成物に関するヒト臨床試験を、INDフェーズI、用量増大研究(5、50、および500μg)として設定し、そして、無作為化、二重ブラインドのプラシーボ制御された試験として実行する。このような試験は、例えば以下のように設計される:
全部で約27人の被験体を、登録し、そして3群に分ける:
群I:3人の被験体に、プラシーボを注射し、そして6人の被験体に、5μgのペプチド組成物を注射する;
群II:3人の被験体に、プラシーボを注射し、そして6人の被験体に、50μgのペプチド組成物を注射する;
群III:3人の被験体に、プラシーボを注射し、そして6人の被験体に、500μgのペプチド組成物を注射する。
【0384】
最初の注射の4週間後、全ての被験体に同じ投与量でブースター接種を受けさせる。
【0385】
本研究において測定された終点は、ペプチド組成物の安全性および寛容性ならびにこの組成物の免疫原性に関連する。ペプチド組成物に対する細胞性免疫応答は、このペプチド組成物の固有の活性の指標であり、従って、生物学的効果の測定としてみなされ得る。以下に、安全性および効果の終点に関する臨床データおよび実験室データを要約する。
【0386】
安全性:有害事象の発生率を、プラシーボ処置群および薬物処置群においてモニターし、そして、程度および可逆性に関して評価する。
【0387】
ワクチン効果の評価:ワクチン効果の評価に関して、被験体を、注射の前および注射の後に採血する。末梢血単核細胞を、新鮮なヘパリン処理された血液からFicoll−Hypaque密度勾配遠心分離によって単離し、凍結培地に等分し、そして凍結保存する。サンプルを、CTL活性およびHTL活性についてアッセイする。
【0388】
このようにして、ワクチンが、安全かつ有効であることの両方を見出される。
【0389】
実施例19:HBVに感染した患者におけるフェーズII試験
フェーズII試験を、慢性HBV感染を有する患者(男性および女性)へのCTL−HTLペプチド組成物の投与の効果を研究するために実施する。この試験の主要な目的は、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)における一過性発赤(transient flare)、ALTの正常化、およびHBV DNAの減少によって明らかにされるように、慢性的に感染されるHBV患者においてCTLを誘導するための有効な用量および投与計画を決定すること、これらの患者におけるCTL応答を誘導することの安全性を確立すること、および、どの程度までCTL活性化が慢性的に感染されるCTL患者の臨床状況を改善するかを調べることである。このような研究は、例えば以下のように設計される:
本研究は、米国およびカナダの複数のセンターで実施される。試験の設計は、オープン標識の非制御された用量増大プロトコルであって、ここで、ペプチド組成物は、単一用量として投与され、6週間後に引き続き同じ用量の単一ブースターショットによって投与される。用量は、1回の注射当たり50、500、および5,000μgである。薬物関連有害効果が記録される。
【0390】
3つの患者群が存在する。第1の群を、50μgのペプチド組成物を有して注射し、そして第2群および第3群を、それぞれ、500および5,000μgのペプチド組成を有してで注射する。各群の中の患者は、年齢が21〜65歳の範囲であり、男性および女性の両方を含む。患者は多様な人種背景を表す。この患者らは全員が、HBVに5年間以上感染しており、そして、彼ら全員は、HIV陰性、HCV陰性およびHDV陰性であるが、陽性レベルのHBe抗原およびHBs抗原を有する。
【0391】
ALT発赤の大きさおよび発生率および血液中のHBV DNAのレベルを、ペプチド組成物の投与の効果を評価するためにモニターする。血液中のHBV DNAのレベルは、治療の進行の間接的な指標である。ワクチン組成物は、慢性HBV感染の治療において、安全かつ有効であることの両方を見出される。
【0392】
実施例20.プライムブースト(prime boost)プロトコルを用いたCTL応答の誘導
同様に、プライムブーストプロトコルを、ワクチンのヒトへの投与のために使用することもできる。このようなワクチン投与計画としては、例えば裸のDNAの初回投与、続くこのワクチンをコードする組換えウイルスを用いるブースト、または組換えタンパク質/ポリペプチドもしくはアジュバント中に投与されるペプチド混合物の初回投与が挙げられる。
【0393】
例えば、初回免疫は、実施例11に構築されたような発現ベクターを用いて、複数の部位に0.5〜5mgの量で、IM(またはSCまたはID)で投与される裸の核酸の形態で、実施してよい。同様に、核酸(0.1〜1000μg)を、遺伝子銃を用いて投与することもできる。次いで、3〜4週間のインキュベーション期間の後、ブースター用量を投与する。このブースターは、5×107〜5×109pfuの用量で投与される組換え鶏痘ウイルスであり得る。MVA、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスなどの代替の組換えウイルスも同様に、このブースターに使用することができ、あるいは、ポリエピトープなタンパク質もしくはこのペプチドの混合物を投与することができる。ワクチン効果の評価のために、患者の血液サンプルを、免疫前、ならびに初期ワクチンおよびブースター用量のワクチンの投与後の間に得る。末梢血単核細胞を、新鮮なヘパリン処理された血液からFicoll−Hypaque密度勾配遠心分離によって単離し、凍結培地に等分し、そして凍結保存する。サンプルを、CTL活性およびHTL活性についてアッセイする。
【0394】
この結果は、HBVに対する保護的免疫を達成するか、またはHBV感染を治療するのに十分である大きさの応答が生成されることを示す。
【0395】
実施例21.樹状細胞(DC)を用いるワクチン組成物の投与
本発明のペプチドエピトープを含むワクチンは、DCなどのAPCを用いて投与することができる。本実施例において、ペプチドパルスされたDCを、CTL応答をインビボにおいて刺激するために患者に投与する。本方法において、樹状細胞を単離し、増殖し、そして、本発明のペプチドCTLエピトープおよびペプチドHTLエピトープを含むワクチンを用いてパルスする。樹状細胞を、患者に注入して戻し、インビボにおいてCTL応答およびHTL応答を誘発する。次いで、誘導されたCTLおよびHTLは、特定の標的細胞(この細胞は、ワクチン中のエピトープが誘導されるタンパク質を保有する)を破壊するかまたはこの細胞の破壊を容易にする。
【0396】
例えば、エピトープ保有ペプチドのカクテルをエキソビボでPBMCに投与するか、それからDCを単離する。Progenipoietin(商標)(Monsanto、St.Louis、MO)やGM−CSF/IL−4などのDCの採取を用意する薬剤を用いることもできる。DCをペプチドでパルスした後であって、患者に再注入する前に、DCを洗浄して未結合ペプチドを除去する。
【0397】
臨床的に理解されるように、また、当業者によって臨床的結果に基づいて容易に決定されるように、患者に再注入されるDCの数は変化することができる(例えば、Nature Med.4:328、1998;Nature Med.2:52、1996およびProstate 32:272、1997参照)。典型的には患者当たり2〜50×106DCが投与されるが、107または108といったより多数のDCも提供し得る。このような細胞集団は典型的には50〜90%の間のDCを含む。
【0398】
いくつかの実施形態においては、ペプチド負荷されたPBMCをDCの精製を行わずに患者に注入する。例えば、Progenipoietin(商標)などの薬剤処理後で生成されるDCを含むPBMCをDCの精製を行わずに患者に注入する。投与されるPBMCの合計数はしばしば108〜1010の範囲である。一般に患者に注入される細胞の用量は、それぞれの患者の血液中のDCのパーセンテージに基づき、例えば、特異的抗DC抗体を用いる免疫蛍光分析によって決定される。したがって、例えば、与えられた患者の末梢血においてProgenipoietin(商標)が2%のDCを可動化し、その患者が5×106のDCを受け取るべきならば、次いで、患者は、全量2.5×108のペプチド負荷されたPBMCを注入されるであろう。Progenipoietin(商標)などの薬剤により可動化されるDCのパーセントは典型的には2〜10%との間である評価されるが、当業者が理解するように、これは変化し得る。
【0399】
エキソビボでのCTL/HTL応答の活性化
あるいは、HPV抗原に対するエキソビボのCTL応答またはHTL応答は、組織培養物中、患者のまたは一般的に適合性の、CTLまたはHTL前駆体細胞をDCなどのAPCの供給源および適切な免疫原性ペプチドと共にインキュベートすることによって誘導され得る。前駆体細胞が活性化され、エフェクター細胞に拡大される適切なインキュベーション時間(典型的には約7〜28日間)の後、細胞を、患者に注射して戻し、ここで、これらの細胞は、それらの特定の標的細胞を破壊するか(CTL)またはそれらの破壊を容易にする(HTL)。
【0400】
実施例22:モチーフ保有ペプチドを同定する代替方法
モチーフ保有ペプチドを同定するための別の方法は、規定されたMHC分子を保有する細胞からこれらを溶出することである。例えば、組織型(tissue typing)に使用されるEBV形質転換されたB細胞株は、HLA分子をこの細胞が発現するかを決定するために徹底的に特徴付けられてきた。特定の場合において、これらの細胞は、単一の型のHLA分子のみ発現する。これらの細胞を、病原性生物で感染し得るか、または目的の抗原(例えば、HBVタンパク質)を発現する核酸でトランスフェクトし得る。次いで、感染の結果(またはトランスフェクトの結果として)産生されたペプチドの内因性抗原プロセシングによって産生されたペプチドは、細胞内のHLA分子に結合し、輸送され細胞表面上に提示される。次いで、ペプチドを、緩酸条件に曝露することによってHLA分子から溶出し、そしてこれらのアミノ酸配列を、例えば、質量スペクトル分析によって決定する(例えば、Kuboら、J.Immunol.152:3913、1994)。なぜなら、特定のHLA分子に結合する大部分のペプチドは、モチーフ保有であることから、これは、細胞上に発現された特定のHLA分子と関連するモチーフ保有ペプチドを得るための代替様式である。
【0401】
あるいは、内因性HLA分子を発現しない細胞株を、単一のHLA対立遺伝子をコードする発現構築物でトランススフェクトし得る。次いで、これらの細胞を、記載されるように使用し得、すなわち、これらの細胞を、病原体もしくは細胞表面上に提示された目的の抗原に対応するペプチドを単離するために、病原体で感染し得るか、または目的の抗原をコードする核酸でトランスフェクトし得る。このような分析から得られたペプチドは、この細胞中で発現される単一のHLA対立遺伝子への結合に対応するモチーフを保有する。
【0402】
当業者に明らかなように、当業者は、1より多くのHLA対立遺伝子を保有する細胞について同様の分析を実施することができ、そして引続いて発現される各HLA対立遺伝子に特異的なペプチドを決定することができる。さらに、当業者はまた、タンパク質抗原を用いる負荷(loading)のような感染またはトランスフェクト以外の手段が、細胞に抗原の供給源を提供するために使用され得ることも認識するであろう。
【0403】
本願明細書中の実施例は、本発明の範囲を制限するためではなく、本発明を例示するために提供される。本発明の他の変形は、当業者に容易に明らかであり、そして添付される特許請求の範囲に含まれる。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的に関して参照よって本明細書中に組み込まれる。
【0404】
【表2】
【0405】
【表3】
【0406】
【表4】
【0407】
【表5】
【0408】
【表6】
【0409】
【表7】
【0410】
【表8】
【0411】
【表9】
【0412】
【表10】
【0413】
【表11】
【0414】
【表12】
【0415】
【表13】
【0416】
【表14】
【0417】
【表15】
【0418】
【表16】
【0419】
【表17】
【0420】
【表18】
【0421】
【表19】
【0422】
【表20】
【0423】
【表21】
【0424】
【表22】
【0425】
【表23】
【0426】
【表24】
【0427】
【表25】
【0428】
【表26】
【0429】
【表27】
【0430】
【表28】
【0431】
【表29】
【0432】
【表30】
【0433】
【表31】
【0434】
【表32】
【0435】
【表33】
【0436】
【表34】
【0437】
【表35】
【0438】
【表36】
【0439】
【表37】
【0440】
【表38】
【0441】
【表39】
【0442】
【表40】
【0443】
【表41】
【0444】
【表42】
【0445】
【表43】
【0446】
【表44】
【0447】
【表45】
【0448】
【表46】
【0449】
【表47】
【0450】
【表48】
【0451】
【表49】
【0452】
【表50】
【0453】
【表51】
【0454】
【表52】
【0455】
【表53】
【0456】
【表54】
【0457】
【表55】
【0458】
【表56】
【0459】
【表57】
【0460】
【表58】
【0461】
【表59】
【0462】
【表60】
【0463】
【表61】
【0464】
【表62】
【0465】
【表63】
【0466】
【表64】
【0467】
【表65】
【0468】
【表66】
【0469】
【表67】
【0470】
【表68】
【0471】
【表69】
【0472】
【表70】
【0473】
【表71】
【0474】
【表72】
【0475】
【表73】
【0476】
【表74】
【0477】
【表75】
【0478】
【表76】
【0479】
【表77】
【0480】
【表78】
【0481】
【表79】
【0482】
【表80】
【0483】
【表81】
【0484】
【表82】
【0485】
【表83】
【0486】
【表84】
【0487】
【表85】
【0488】
【表86】
【0489】
【表87】
【0490】
【表88】
【0491】
【表89】
【0492】
【表90】
【0493】
【表91】
【0494】
【表92】
【0495】
【表93】
【0496】
【表94】
【0497】
【表95】
【0498】
【表96】
【0499】
【表97】
【0500】
【表98】
【0501】
【表99】
【0502】
【表100】
【0503】
【表101】
【0504】
【表102】
【0505】
【表103】
【0506】
【表104】
【0507】
【表105】
【0508】
【表106】
【0509】
【表107】
【0510】
【表108】
【0511】
【表109】
【0512】
【表110】
【0513】
【表111】
【0514】
【表112】
【0515】
【表113】
【0516】
【表114】
【0517】
【表115】
【0518】
【表116】
【0519】
【表117】
【0520】
【表118】
【0521】
【表119】
【0522】
【表120】
【0523】
【表121】
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、平均集団における、HLA−AおよびB分子により結合したHCV候補エピトープの数の関数としての遺伝子型の総頻度のグラフを提供する。
【図2】
図2は、実験モデルのミニ遺伝子構築物中のペプチドエピトープの位置を示す。
(連邦政府によって援助された研究および開発)
本発明は、一部、国立衛生研究所の助成の下で米国政府によって資金援助された。米国政府は、本発明の特定の権利を有する。
【0002】
(索引)
I. 発明の背景
II. 発明の概要
III.図面の簡単な説明
IV. 発明の詳細な説明
A.定義
B.HBVに対するCTL応答およびHTL応答の刺激
C.HLA分子に対するペプチドエピトープの結合親和性
D.ペプチドエピトープ結合モチーフおよびスーパーモチーフ
1.HLA−A1スーパーモチーフ
2.HLA−A2スーパーモチーフ
3.HLA−A3スーパーモチーフ
4.HLA−A24スーパーモチーフ
5.HLA−B7スーパーモチーフ
6.HLA−B27スーパーモチーフ
7.HLA−B44スーパーモチーフ
8.HLA−B58スーパーモチーフ
9.HLA−B62スーパーモチーフ
10.HLA−A1モチーフ
11.HLA−A2.1モチーフ
12.HLA−A3モチーフ
13.HLA−A11モチーフ
14.HLA−A24モチーフ
15.HLA−DR−1−4−7スーパーモチーフ
16.HLA−DR3モチーフ
E.ワクチンの増大する集団適用範囲
F.免疫応答刺激ペプチドアナログ
G.スーパーモチーフまたはモチーフを含有するエピトープについての、疾患関連抗原由来のタンパク質配列のコンピュータスクリーニング
H.ペプチドエピトープの調製
I.T細胞応答を検出するためのアッセイ
J.免疫応答を評価するためのペプチドエピトープの使用
K.ワクチン組成物
1.ミニ遺伝子ワクチン
2.CTLペプチドとヘルパーペプチドとの組合わせ
L.治療目的または予防目的のためのワクチンの投与
M.キット
V. 実施例
VI. 特許請求の範囲
VII.要約
【0003】
(I.発明の背景)
B型肝炎ウイルス(HBV)による慢性的感染は、世界人口の少なくとも5%が罹患し、肝炎および肝細胞癌の主要な原因である(Hoofnagle,J.、N.Engl.J.Med.323:337、1990;Fields,B.およびKnipe,D.、In:Fields Virology 2:2137、1990)。世界保健機構は、B型肝炎を、慢性肺疾患に迫る、AIDSより広まっている世界的な主たる死因に挙げている。慢性HBV感染は無症状のキャリアー段階から継続的な肝細胞壊死および炎症に及び、肝細胞癌につながり得る。
【0004】
HBVに対する免疫応答は、B型肝炎感染を抑制する上で重要な役割を果たしていると信じられている。ヌクレオカプシドコア、ポリメラーゼおよび表面抗原を含むHBVの様々な領域に対する体液性および細胞性応答が同定されてきた。T細胞仲介免疫、特にクラスIヒト白血球抗原(HLA)拘束(restricted)細胞傷害性Tリンパ球(CTL)は、確立したHBV感染と戦うのに不可欠だと信じられている。
【0005】
クラスIヒト白血球抗原(HLA)分子は、ほとんど全ての有核細胞の表面上で発現する。CTLは、クラスIHLA分子との複合体の形態で、様々な抗体の細胞内プロセシングに由来するペプチド断片を認識する。次いでこの認識は、直接的にHLA−ペプチド複合体を有する細胞の破壊またはウイルス複製を阻害する非破壊的機構(例えば、インターフェロンの産生)の活性化をもたらす。
【0006】
いくつかの研究は、自己制限的急性肝炎と多特異的なCTL応答との関連を強調している(Penna,A.ら、J.Exp.Med.174:1565、1991;Nayersina,R.ら、J.Immunol.150:4659、1993)。慢性HBV感染の自発的およびインターフェロン関与除去U(clearance)も活発なCTL応答の復帰と関連している(Guidotti,L.G.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3764、1994)。こうしたケースのすべてでCTL応答はポリクローナルであり、HBVエンベロープ、コアおよびポリメラーゼ抗原を含む多数のウイルスタンパク質に特異的である。対照的に、慢性肝炎患者では、通常、CTL活性は存在しないか弱く抗原的に制限されている。
【0007】
HBV感染の軽減におけるCTLの決定的役割は、HBVトランスジェニックマウスを用いた研究によってさらに明確にされてきた。HBVゲノムについてトランジェニックなマウスへのHBV−特異的CTLの養子免疫伝達はウイルス複製の抑制をもたらした。この効果は主として、非溶解性でリンホカインベースのメカニズムによって仲介された(Guidotti,L.G.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3764、1994;Guidotti,L.G.、Guilhot,S.およびChisari,F.V.、J.Virol.68:1265、1994;Guidotti,L.G.ら、J.Virol.69:6158、1995;Gilles,P.N.、Fey,G.およびChisari,F.V.、J.Virol.66:3955、1992)。
【0008】
HLAクラスI拘束応答の場合と同様に、HLAクラスII拘束T細胞応答は、通常、急性肝炎患者で検出され、慢性肝炎患者では存在しないか弱い(Chisari,F.V.およびFerrari,C.、Annu.Rev.Immunol.13:29、1995)。HLAクラスII応答は、ヘルパーT細胞(HTL)の活性化と結びついている。ヘルパーTリンパ球は、クラスIIHLA分子を認識し、ウイルス増殖を抑えるサイトカイン分泌を通じて直接にHBV感染の除去に寄与する(Franco,A.ら、J.Immunol.159:2001、1997)。しかし。疾病解決におけるその主要な役割は、ウイルス特異的CTLおよびB細胞の活性化および拡大の誘導によって仲介されていると信じられている。
【0009】
HBV感染で観察される異種免疫応答を考慮すると、複数のエピトープに対して同時に指向される多特異的な細胞性免疫応答の誘導が、HBVに対する有効なワクチンの開発のために重要であると思われる。しかし、HBV感染を除去する患者に見られる応答に対応する免疫応答を誘発する、ワクチンの実施形態を確立する必要性が存在する。エピトープベースなワクチンが有用と思われる。
【0010】
適切な技術の開発の際に、エピトープベースワクチンの使用は、現在のワクチンを超えたいくつかの利点を有する。このようなエピトープベースワクチンに含まれるためのエピトープは、ウイルスまたは腫瘍関連抗原の保存領域から選択されるべきで、これによって逸脱変異体(escape mutant)の可能性が減少する。抗原全体の使用に対するエピトープベースアプローチの利点は、抗原全体に対する免疫応答が抗原の可変領域に対して大きく向けられ、変異に起因する免疫の逸脱を可能にするという証拠が存在することである。さらに、抗原全体に存在し得る免疫抑制性エピトープは、エピトープベースワクチンの使用で回避され得る。
【0011】
さらに、エピトープベースワクチンのアプローチでは、選択されるエピトープ(CTLおよびHTL)を組み合わせる能力、さらに、エピトープの組成を改変する能力があり、例えば免疫原性を増大させる。従って、免疫応答は、必要に応じて、標的疾患のために調節され得る。従来のアプローチでは、同様の応答操作は可能ではない。
【0012】
エピトープベースの免疫刺激ワクチンの別の主要な利点は、その安全性にある。感染因子またはタンパク質抗原全体(これは、それ自身の固有の生物学的活性を有し得る)によって生じる起こり得る病理学的な副作用が排除される。
【0013】
エピトープベースワクチンはまた、同じ病原由来の複数の選択された抗原に対する免疫応答を指向し、そしてこれに焦点を合わせる能力を提供する。従って、特定の病原に対する免疫応答における患者間の可変性は、ワクチン組成物中の病原から、複数の抗原由来のエピトープを包含することによって軽減され得る。「病原」は、感染因子または腫瘍関連分子であり得る。
【0014】
しかし、広範に有効なエピトープベースの免疫療法の開発の最も手強い障壁の1つは、HLA分子の極度の多型性である。現在まで、有効で遺伝的に偏りのない集団をカバーすることは、非常に複雑な課題であった;そのような適用範囲には、各個々のHLA対立遺伝子と対応するHLA分子に特異的であるエピトープが使用されることが必要であり、その結果、人種的に多様な集団をカバーするために実施不可能なほど多数のエピトープが使用されなければならない。従って、エピトープベースワクチンの使用のために複数のHLA抗原分子によって結合されるペプチドエピトープの開発の必要性が存在する。多数のHLA抗原分子が結合すればするほど、ワクチンによる集団のカバー範囲の幅が大きくなる。
【0015】
さらに、本明細書中でより詳細に記載するように、例えば複数のHLA抗原に結合し得るペプチドが免疫応答を刺激する親和性でそのような結合をするように、ペプチド結合特性を調節する必要性が存在する。免疫原性と相関する親和性で2つ以上のHLA対立遺伝子によって拘束されたエピトープの同定は、十分な集団のカバー範囲を提供するために、かつ、多様な集団セグメントにおいて自己制限的急性肝炎において見られる自然免疫応答または慢性HBV感染の自発的除去の自然免疫応答を誘発する十分な効力の応答の誘発刺激を可能にするために重要である。このような応答はまた、エピトープの広範な配列を標的にすることができる。本明細書中に開示される技術は、このような好ましい免疫応答について提供される。
【0016】
この節において提供される情報は、本出願の出願日における当該技術分野の現在理解されている水準を開示することが意図される。本出願の優先日の後に生じた情報がこの節に含まれる。従って、この節の背景は、いずれにしても本発明の優先日を画することを意図していない。
【0017】
(II.発明の概要)
本発明は、例えば、HBVに対して指向されるエピトープベースワクチンを開発するために、抗原がT細胞に認識される機構についての本発明者らの知識を適用する。より詳細には、本出願は、特定のエピトープ薬学的組成物ならびにHBV感染の防止および処置における使用方法についての本発明者らの発見を伝達する。
【0018】
適切な技術の開発の際に、エピトープベースワクチンの使用は、特にワクチン組成物中の抗原全体の使用と比較した場合に、現在のワクチンよりいくつかの利点を有する。抗原全体に対する免疫応答は、抗原の可変領域に対して大きく向けられ、変異に起因する免疫の逸脱を可能にする、という証拠が存在する。エピトープベースワクチンに含ませるためのエピトープは、ウイルスまたは腫瘍関連抗原の保存領域から選択され、これによって逸脱変異体の可能性が減少する。さらに、抗原全体に存在し得る免疫抑制性エピトープは、エピトープベースワクチンの使用で回避され得る。
【0019】
エピトープベースワクチンアプローチのさらなる利点は、選択されるエピトープ(CTLおよびHTL)を組合わせる能力、さらに、エピトープの組成を変える能力であり、例えば増大した免疫原性を増大させる。従って、免疫応答は、必要に応じて、標的疾患のために調節され得る。従来のアプローチでは、同様の応答操作は可能ではない。
【0020】
エピトープベースの免疫刺激ワクチンの別の主要な利点は、その安全性にある。それ自身の固有の生物学的活性を有し得る感染因子またはタンパク質抗原全体によって生じる、起こり得る病理学的な副作用が排除される。
【0021】
エピトープベースワクチンはまた、同じ病原由来の複数の選択された抗原に対する免疫応答に向けられ、そしてこれに焦点を合わせる能力を提供する。従って、特定の病原に対する免疫応答における患者間の可変性は、ワクチン組成物中の病原由来の複数の抗原由来のエピトープを包含することによって軽減され得る。「病原」は、感染因子または腫瘍関連分子であり得る。
【0022】
しかし、広範に有効なエピトープベースの免疫療法の開発の最も手強い障壁の1つは、HLA分子の極度の多型性である。現在まで、有効で遺伝的に偏りのない集団をカバーすることは、非常に複雑な課題であった;そのようなカバーには、各個々のHLA対立遺伝子と対応するHLA分子に特異的であるエピトープが使用されることを必要となり、その結果、人種的に多様な集団をカバーするために実施不可能なほど多数のエピトープが使用されなければならない。従って、エピトープベースワクチンの使用のために複数のHLA抗原分子によって結合されるペプチドエピトープの必要性が存在する。多数のHLA抗原分子が結合すればするほど、ワクチンによる集団のカバー範囲の幅が大きくなる。
【0023】
さらに、本明細書中でより詳細に記載するように、例えば複数のHLA抗原に結合し得るペプチドが免疫応答を刺激する親和性でそのような結合をするように、ペプチド結合特性を調節する必要性が存在する。免疫原性と相関する親和性で1つ以上のHLA対立遺伝子によって拘束されるエピトープの同定は、十分な集団のカバー範囲を提供するために、かつ、多様な集団セグメントにおける感染を防止または清澄するために十分な効力の応答の誘発を可能にするために重要である。このような応答はまた、エピトープの広範な配列を標的にすることができる。本明細書中に開示される技術は、このような好ましい免疫応答について提供される。
【0024】
好ましい実施形態において、本発明のワクチン組成物に包含するためのエピトープは、モチーフまたはスーパーモチーフを有するエピトープの存在について既知の抗原のタンパク質配列を評価するプロセスによって選択される。次いで、モチーフまたはスーパーモチーフを有するエピトープに対応するペプチドは合成され、選択されるモチーフを認識するHLA分子に結合する能力について試験する。中程度または高い親和性、すなわち、HLAクラスI分子について500nM以下、あるいはHLAクラスII分子について1000nM以下のIC50(またはKD値)、で結合するこれらのペプチドは、CTLまたはHTL応答を誘導する能力についてさらに評価される。免疫原性ペプチドは、ワクチン組成物に包含するために選択される。
【0025】
スーパーモチーフを有するペプチドは、HLAスーパータイプファミリー内の複数の対立遺伝子に結合する能力についてさらに試験され得る。さらに、ペプチドエピトープは、結合親和性および/またはHLAスーパータイプ内の複数の対立遺伝子に結合する能力を改変するためにアナログ化(analogued)され得る。
【0026】
本発明はまた、既知のHLA型を有する患者におけるHBVワクチンの免疫原活性をモニタリングするための方法を含む実施形態を含み、この方法は、患者由来のTリンパ球サンプルを、この患者に存在する少なくとも1つのHLA対立遺伝子の産物に結合する表VI〜表XXまたは表XXIIに記載されるアミノ酸配列からなるHBVエピトープを本質的に含むペプチド組成物と共にインキュベートする工程と、このペプチドに結合するTリンパ球の存在を検出する工程とを包含する。好適な実施形態では、ペプチドは、テトラマー複合体を含み得る。
【0027】
本発明のペプチドを定義するための代替的様式は、特定の対立遺伝子特異的HLA分子または対立遺伝子特異的HLA分子群への結合と相関する、長さ、一次構造、取り得る二次構造および/または三次構造、または荷電などの物理的性質を列挙することである。ペプチドを定義するためのさらなる様式は、HLA結合ポケットの物理的特性、またはいくつかの対立遺伝子特異的HLA結合ポケットによって共有される特性(例えば、ポケットの配置および電荷分布)を列挙すること、ならびにペプチドがこれらのポケットに一致および結合することを説明することである。
【0028】
以下の議論から明らかなように、他の方法および実施形態も意図される。さらに、本明細書中に記載されるいずれかの方法によって生成される新規な合成ペプチドも本発明の一部である。
【0029】
(IV.発明の詳細な説明)
本発明のペプチドおよび対応する核酸組成物は、CTLまたはHTLいずれかの応答の生成を刺激することによって、HBVに対する免疫応答を刺激するために有用である。ネイティブなHBVアミノ酸配列から直接的または間接的に誘導されるペプチドは、HLA分子に結合し得、HBVに対する免疫応答を刺激し得る。HBVおよびその改変体由来の完全なポリタンパク質配列は、Genbankから得られ得る。ペプチドはまた、以下に提供される開示から明らかであるように、これまで未知のHBVの改変体についてその後に発見され得る配列情報から容易に決定され得る。
【0030】
本発明のペプチドは、以下に議論されるように多くの方法において同定されてきた。さらに、改変された免疫原性を示すペプチドアナログを作製するために特定のアミノ酸残基を改変することによって、アナログペプチドが誘導され、HLA分子についての結合活性が調節されてきた。さらに、本発明は、多数のHLA抗原と相互作用することができるエピトープベースワクチンがこれまでのワクチンより集団の広いカバーを提供することを可能にする、組成物および組成物の組合せを提供する。
【0031】
IV.A.定義
本発明は、アルファベット順に列挙された以下の定義を参照することにより効果的に理解されすることができる。
【0032】
「コンピュータ」または「コンピュータシステム」は、一般に以下を含む:プロセッサ;少なくとも1つの情報格納/検索装置(例えば、ハードドライブ、ディスクドライブまたはテープドライブなど);少なくとも1つの入力装置(例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーンまたはマイクロフォンなど);およびディスプレイ構造。さらに、コンピュータは、ネットワークとつながった通信路を含んでもよい。このようなコンピュータは、上記のものより多いものまたは少ないものを含み得る。
【0033】
本明細書において「構築物(construct)」は、一般に天然に存在しない組成物を指す。構築物は合成技術、例えば、組換えDNA調製および発現、または核酸もしくはアミノ酸の化学合成技術によって合成することができる。構築物はまた、一方の材料を別の材料に添加または関係させてその形態では天然に存在しない結果とすることによっても合成できる。
【0034】
「交差反応性結合」は、ペプチドが2つ以上のHLA分子により結合されることを示す;類義語は、変性結合(degenerate binding)である。
【0035】
「潜在エピトープ(cryptic epitope)」は、単離されたペプチドで免疫されることにより応答を誘発するが、該応答は、エピトープを含む無傷のタンパク質全体が抗原として使用される場合にはインビトロで交差反応性でない。
【0036】
「優性エピトープ」は、ネイティブな抗原全体で免疫する際に免疫応答を誘導するエピトープである(例えば、Sercarzら、Annu.Rev.Immunol.11:729−766、1993を参照のこと)。このような応答は、単離されたペプチドエピトープとインビトロで交差反応性である。
【0037】
特定のアミノ酸配列に関して、「エピトープ」は、特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、またはT細胞のコンテクストにおいて、T細胞レセプター(TCR)タンパク質および/または主要組織適合遺伝子複合体(MHC)レセプターによる認識に必要なアミノ酸残基のセットである。インビボまたはインビトロでの免疫系環境において、エピトープは、免疫グロブリン、TCRまたはHLA分子により認識される部位をともに形成する分子の集合的な特徴(一次ペプチド構造、二次ペプチド構造および三次ペプチド構造、ならびに電荷など)である。この開示を通して、エピトープおよびペプチドは、しばしば交換可能に用いられる。
【0038】
本発明のエピトープおよび追加のアミノ酸を含むタンパク質またはペプチド分子は、なお本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。ある実施形態において、本発明のペプチドの長さに対しては制限がある(さもなければ、構築物ではない)。長さが制限された実施形態は、本発明のエピトープを含むタンパク質/ペプチドがネイティブな配列と100%同一性を有する領域(すなわち、連続した一続きのアミノ酸)を含む場合に起こる。例えば天然分子全体に対し、解釈(reading)からエピトープの定義を避けるために、ネイティブなペプチド配列と100%同一性を有する任意の領域の長さに対して制限がある。従って、本発明のエピトープを含むペプチドおよびネイティブなペプチド配列と100%同一性を有する領域(さもなければ、構築物ではない)について、ネイティブな配列に対して100%同一性を有する領域は、一般に以下の長さを有する:600アミノ酸以下、しばしば500アミノ酸以下、しばしば400アミノ酸以下、しばしば250アミノ酸以下、しばしば100アミノ酸以下、しばしば85アミノ酸以下、しばしば75アミノ酸以下、しばしば65アミノ酸以下、およびしばしば50アミノ酸以下。ある実施形態において、本発明の「エピトープ」は、5アミノ酸に至るまでの任意の増分(49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5)において、ネイティブなペプチド配列に対して100%同一性を有する51アミノ酸未満の領域を有するペプチドにより含まれる。
【0039】
従って、600アミノ酸より長いペプチドまたはタンパク質配列は、それらがネイティブなペプチド配列と100%同一性を有する600個のアミノ酸を超える任意の連続する配列を含まない(さもなければ、構築物ではない)限り、本発明の範囲内にある。ネイティブな配列に対応する5つ以下の連続する残基を有する任意のペプチドについては、本発明の範囲内に入れるために、そのペプチドの最大長さに対する制限はない。CTLエピトープが、8アミノ酸残基に至るまでの任意の増分において600残基長未満であることは現在好ましい。
【0040】
「ヒト白血球抗原」または「HLA」は、ヒトクラスIまたはクラスII主要組織適合遺伝子複合体(MHC)タンパク質である(Stitesら、IMMUNOLOGY、第8版、Lange Publishing、Los Altos、CA(1994)を参照のこと)。
【0041】
「HLAスーパータイプまたはファミリー」は、本明細書中で使用される場合、共有のペプチド結合特異性に基づいて分類されるHLA分子のセットを記載する。特定のアミノ酸モチーフを有するペプチドに対して幾分類似した結合親和性を共有するHLAクラスI分子は、HLAスーパータイプに分類される。HLAスーパーファミリー、HLAスーパータイプファミリー、およびHLAxx様スーパータイプ分子(ここで、xxは、特定のHLA型を示す)という用語は、類義語である。
【0042】
本開示全体を通して、結果は「IC50」によって表される。IC50は、参照ペプチドの結合の50%阻害が観察される、結合アッセイにおけるペプチド濃度である。このアッセイが行われる条件(すなわち、制限されたHLAタンパク質および標識ペプチド濃度)が与えられると、これらの値は、KD値に近似する。結合を決定するためのアッセイは、以下に詳細に記載される(例えば、PCT公開WO94/20127およびWO94/03205)。IC50値は、アッセイ条件が変化する場合、しばしば劇的に変化し得、使用される特定の試薬(例えば、HLAの調製物など)に依存することは注意すべきである。例えば、過剰な濃度のHLA分子は、所与のリガンドの見かけの測定されたIC50を増大させる。
【0043】
あるいは、結合は、参照ペプチドに対して表される。特定のアッセイがより感度が高くなるか、またはより感度が低くなる場合、試験されたペプチドのIC50はいくらか変化し得るが、参照ペプチドに対する結合は、有意には変化しない。例えば、参照ペプチドのIC50が10倍増大する条件下でのアッセイ実施では、試験ペプチドのIC50値も約10倍シフトする。従って、曖昧さを回避するために、ペプチドが良好な、中程度の、弱い、またはネガティブなバインダーである否かの評価は、一般に、標準的なペプチドのIC50に対するそのIC50に基づく。
【0044】
結合はまた、他のアッセイ系を用いて決定され得る。これらのアッセイ系としては、以下を用いるものが挙げられる:生細胞(例えば、Ceppelliniら、Nature 339:392、1989;Christnickら、Nature 352:67、1991;Buschら、Immunol.2:443、19990;Hillら、J.Immunol.147:189、1991;del Guercioら、J.Immunol.154:685、1995)、界面活性剤溶解物を用いる無細胞系(例えば、Cerundoloら、J.Immunol.21:2069、1991)、固定化された精製MHC(例えば、Hillら、J.Immunol.152、2890、1994;Marshallら、J.Immunol.152:4946、1994)、ELISA系(例えば、Reayら、EMBO J.11:2829、1992)、表面プラズモン共鳴(例えば、Khilkoら、J.Biol.Chem.268:15425、1993);高フラックス可溶性相アッセイ(Hammerら、J.Exp.Med.180:2353、1994)、およびクラスI MHC安定化またはアセンブリの測定(例えば、Ljunggrenら、Nature 346:476、1990;Schumacherら、Cell 62:563、1990;Townsendら、Cell 62:285、1990;Parkerら、J.Immunol.149:1896、1992)。
【0045】
本明細書中で使用される、HLAクラスI分子に関する「高親和性」は、50nM以下のIC50またはKD値を有する結合として規定される;「中程度の親和性」は、約50nMと約500nMとの間のIC50またはKD値を有する結合である。HLAクラスII分子に対する結合に関する「高親和性」は、100nM以下のIC50またはKD値を有する結合として規定される;「中程度の親和性」は、約100nMと約1000nMとの間のIC50またはKD値を有する結合である。
【0046】
2つ以上のペプチド配列のコンテクストにおける「同一性の」またはパーセント「同一性」という用語は、配列比較アルゴリズムを用いてまたは手動アラインメントおよび目視により測定される比較ウィンドウでの最大の対応について比較及びアラインしたとき、同じ2つ以上の配列または部分配列あるいは同じアミノ酸残基を特定の割合有する2つ以上の配列または部分配列をいう。
【0047】
「免疫原性ペプチド」または「ペプチドエピトープ」は、ペプチドがHLA分子に結合し、CTLおよび/またはHTL応答を誘導するような、対立遺伝子特異的モチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドである。従って、本発明の免疫原性ペプチドは適切なHLA分子に結合することができ、その後に免疫原性ペプチドが由来する抗原に対する細胞傷害性T細胞の応答またはヘルパーT細胞の応答を誘導することができる。
【0048】
「単離された」または「生物学的に純粋な」という句は、通常は、物質がそのネイティブな形態で見出される場合に、この物質に付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質をいう。従って、本発明に従って単離されたペプチドは、好ましくは、それらのインサイチュ環境において、ペプチドと通常関連する物質を含まない。
【0049】
「連結する」または「結合する」とは、当業界で知られているペプチドを機能的に連結する任意の方法をいい、組換え融合、共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合および静電的結合を含むが、これらに限定されない。
【0050】
「主要組織適合遺伝子複合体」または「MHC」は、生理学的免疫応答を担う細胞相互作用の制御において役割を果たす一群の遺伝子である。ヒトにおいて、MHC複合体はHLA複合体としても公知である。MHC複合体およびHLA複合体の詳細な記載については、Paul、FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY、第3版、Raven Press、New York、1993を参照のこと。
【0051】
用語「モチーフ」とは、特定のHLA分子により認識される規定の長さのペプチド、通常は、クラスI HLAモチーフについては約8〜約13アミノ酸のペプチドおよびクラスII HLAモチーフについては約6〜約25アミノ酸のペプチドにおける残基のパターンをいう。ペプチドモチーフは、通常、各ヒトHLA対立遺伝子によりコードされる各タンパク質に対して異なり、一次および二次アンカー残基のパターンが異なる。
【0052】
「ネガティブ結合残基」または「有害残基(deleterious residue)」は、ペプチドエピトープのある位置(通常、一次アンカー位置ではない)に存在する場合にペプチドの該ペプチドの対応するHLA分子に対する結合親和性の減少を生じさせるアミノ酸である。「有害残基」でない残基はすべて「非有害残基」である。
【0053】
「非ネイティブ」配列または「構築物」とは、天然において見出されない、すなわち、「天然に存在しない」配列をいう。このような配列としては、例えば、脂質化ペプチドそうでなければ改変されたペプチド、およびネイティブなタンパク質配列において連続していないエピトープを含むポリエピトープ組成物が挙げられる。
【0054】
用語「ペプチド」は、本明細書中で「オリゴペプチド」と互換的に使用され、通常、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって互いに連結された一連の残基(通常、L−アミノ酸)を意味する。実施形態によっては、本発明の好ましいCTL誘導オリゴペプチドは、長さが13残基以下であり、通常、約8残基と約11残基との間で構成され、好ましくは9または10残基である。実施形態によっては、好ましいHTL誘導オリゴペプチドは、長さが約50残基未満であり、通常、約6残基と約30残基との間で構成され、より通常は、約12残基と約25残基との間で構成され、しばしば、約15残基と約20残基との間で構成される。
【0055】
「薬学的に許容可能な」とは、一般に、非毒性の、不活性かつ/または生理学的適合性の組成物をいう。
【0056】
「一次アンカー残基」は、免疫原性ペプチドとHLA分子との間の接触点を提供すると理解されているペプチド配列に沿った特定の位置でのアミノ酸である。規定された長さのペプチド内の1〜3つ(通常、2つ)の一次アンカー残基は、一般に、免疫原性ペプチドについて「モチーフ」を規定する。これらの残基は、HLA分子のペプチド結合溝と最近接で適合し、その側鎖は、結合溝自体の特定のポケットに埋め込まれていることが理解される。1つの実施形態において、一次アンカー残基は、本発明の9残基のペプチドの二位(アミノ末端位置から)およびカルボキシ末端位置に位置する。各モチーフおよびスーパーモチーフの一次アンカー位置は、表1に示される。例えば、アナログペプチドは、これらの一次アンカー位置における特定の残基の存在または非存在を変更することによって作製され得る。そのようなアナログは、特定のモチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を細かく調節するために使用される。
【0057】
「不規則な認識(promiscuous recognition)」は、異なるペプチドが多数のHLA分子のコンテクストにおいて同じT細胞クローンにより認識されることである。不規則な結合は、交差反応性結合と類語である。
【0058】
「防御免疫応答」または「治療免疫応答」とは、感染因子または腫瘍抗原由来の抗原に対するCTLおよび/またはHTL応答をいう。この応答は、疾患症状または進行を予防するか、または少なくとも部分的に停止する。この免疫応答はまた、ヘルパーT細胞の刺激により促進される抗体応答を含み得る。
【0059】
用語「残基」とは、アミド結合またはアミド結合ミメティックによってオリゴペプチド中に取りこまれているアミノ酸またはアミノ酸ミメティックをいう。
【0060】
「二次アンカー残基」は、ペプチド結合に影響し得る、ペプチド中の一次アンカーの位置以外の位置のアミノ酸である。二次アンカー残基は、1つの位置におけるアミノ酸のランダムな分布によって予測されるよりも、結合ペプチドの中で有意に高い頻度で生じる。この二次アンカー残基は、「二次アンカー位置」で生じるといわれる。二次アンカー残基は、高い親和性結合ペプチドの中で高い頻度で存在する残基と同定され得るか、あるいは高い親和性結合で会合する他の残基と同定され得る。例えば、アナログペプチドは、これらの二次アンカー位置における特定の残基の存在または非存在を変更することによって作製され得る。そのようなアナログは、特定のモチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を精密に調節するために使用される。
【0061】
「亜優性エピトープ(subdominant epitope)」は、エピトープを含む抗原全体で免疫した際にほとんどまたは全く応答を引き起こさないエピトープであるが、単離ペプチドで免疫することによって応答が得られ、この応答(潜在エピトープの場合とは異なる)はタンパク質全体を用いてインビトロまたはインビボでの応答をリコールする場合に検出される。
【0062】
「スーパーモチーフ」は、2つ以上のHLA対立遺伝子によりコードされるHLA分子により共有されるペプチド結合特異性である。好ましくは、スーパーモチーフを有するペプチドは、2つ以上のHLA抗原により、(本明細書中で規定される)高親和性または中程度の親和性で認識される。
【0063】
「合成ペプチド」とは、化学合成または組換えDNA技術のような方法を用いた人工ペプチドをいう。
【0064】
本明細書中で用いられる「ワクチン」は、1つ以上の本発明のペプチドを含む組成物である。本発明のワクチンの多くの実施形態が存在する(例えば、1つ以上のペプチドのカクテル;ポリエピトープペプチドにより構成された本発明の1つ以上のエピトープ;あるいはこのようなペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸(例えば、ポリエピトープペプチドをコードするミニ遺伝子)によるもの)。「1つ以上のペプチド」は、1〜150の任意の全単位整数、例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、または150以上の本発明のペプチドを含み得る。このペプチドまたはポリペプチドは、例えば、脂質化(lipidation)、標的化配列または他の配列の付加によって、任意選択により改変することができる。本発明のHLAクラスI結合ペプチドは、HLAクラスII結合ペプチドと混合されるか連結されて、細胞傷害性Tリンパ球およびヘルパーTリンパ球の両方の活性化を促進し得る。ワクチンはまた、ペプチドパルス化抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)を含み得る。
【0065】
ペプチド化合物を記載するために用いた名称は、各アミノ酸残基のアミノ基が左(N末端)に示され、カルボキシル基が右(C末端)に示される、従来の慣行に従う。アミノ酸残基位置がペプチドエピトープにおいて言及される場合、それらは、アミノからカルボキシルの方向に番号付けされ、1位はアミノ末端に最も近い位置である。本発明の選択された特定の実施形態を示す式において、アミノ末端基およびカルボキシル末端基は、他に特定されなければ、それらが生理学的pH値において呈する形態にある。アミノ酸構造式において、各残基は、一般に標準的な3文字または1文字表記により示される。アミノ酸残基のL形態は、大文字の1文字記号または最初が大文字の3文字記号により示される。そしてD形態を有するこれらのアミノ酸のD形態は、小文字の1文字記号または小文字の3文字記号により示される。グリシンは、不斉炭素原子を有さず、単に「Gly」または「G」と示される。アミノ酸の記号を以下に示す。
【0066】
【表1】
【0067】
IV.B.HBVに対するCTL応答およびHTL応答の刺激
T細胞が抗原を認識する機構は、過去十年の間に詳細に示されてきた。本発明者らの免疫系の新たな理解に基づいて、本発明者らは、広範な集団においてHBV感染に対する治療的または予防的免疫応答を誘導し得る有効なペプチドエピトープワクチン組成物を創造した。本願組成物の価値および有効性の理解のために、免疫学関連技術の簡単な総説を提供する。
【0068】
HLA分子とペプチド抗原の複合体は、HLA拘束T細胞により認識されるリガンドとして働く(Buus,S.ら、Cell 47:1071、1986;Babbitt,B.P.ら、Nature 317:359、1985;Townsend,A.およびBodmer,H.、Annu.Rev.Immunol.7:601、1989;Germain,R.N.、Annu.Rev.Immunol.11:403、1993)。単一のアミノ酸置換抗原アナログの研究および内因的に結合し天然でプロセシングされたペプチドの配列決定を通して、HLA抗原分子に対する特異的結合に必要なモチーフに対応する重要な残基が同定され、本明細書中に記載され、そして表I、IIおよびIIIに示される(例えば、Southwoodら、J.Immunol.160:3363、1998;Rammenseeら、Immunogenetics 41:178、1995;Rammenseeら、SYFPEITHI(ウェブを介して以下にアクセスすること:http://134.2.96.221/scripts.hlaserver.dll/home.htm);Sette,A.およびSidney,J.Curr.Opin.Immunol.10:478、1998;Engelhard,V.H.、Curr.Opin.Immunol.6:13、1994;Sette,A.およびGrey,H.M.、Curr.Opin.Immunol.4:79、1992;Sinigaglia,F.およびHammer,J.Curr.Biol.6:52、1994;Ruppertら、Cell 74:929−937、1993;Kondoら、J.Immunol.155:4307−4312、1995;Sidneyら、J.Immunol.157:3480−3490、1996;Sidneyら、Human Immunol.45:79−93、1996;Sette,A.およびSidney,J.Immunogenetics(印刷中)、1999もまた参照のこと)。
【0069】
さらに、HLA−ペプチド複合体のX線結晶解析により、対立遺伝子特異的様式でペプチドリガンドが保有する残基と適応するHLA分子のペプチド結合窪み(peptide binding cleft)内のポケットが明らかになった;次に、これらの残基によってこれらの残基が存在するペプチドのHLA結合能力が決定される(例えば、Madden,D.R.Annu.Rev.Immunol.13:587、1995;Smithら、Immunity 4:203、1996;Fremontら、Immunity 8:305、1998;Sternら、Structure 2:245、1994;Jones,E.Y.Curr.Opin.Immunol.9:75、1997;Brown,J.H.ら、Nature 364:33、1993;Guo,H.C.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8053、1993;Guo,H.C.ら、Nature 360:364、1992;Silver,M.L.ら、Nature 360:367、1992;Matsumura,M.ら、Science 257:927、1992;Maddenら、Cell 70:1035、1992;Fremont,D.H.ら、Science 257:919、1992;Saper,M.A.、Bjorkman,P.J.およびWiley,D.C.、J.Mol.Biol.219:277、1991を参照のこと)。
【0070】
従って、クラスIおよびクラスIIの対立遺伝子特異的HLA結合モチーフ、またはクラスIスーパーモチーフの規定は、特定のHLA抗原を結合する能力を有するタンパク質内の領域の同定を可能にする(例えば、Sette,A.およびGrey,H.M.、Curr.Opin.Immunol.4:79、1992;Sinigaglia,F.およびHammer,J.、Curr.Biol.6:52、1994;Engelhard、V.H.,Curr.Opin.Immunol.6:13、1994;Kast,W.M.ら、J.Immunol.、152:3904、1994も参照)。
【0071】
さらに、ペプチドとHLAとの間の相互作用の親和性を定量する様々なアッセイが確立された。こうしたアッセイは、例えば、IC50値、抗原提示阻害の測定(Sette.ら、J.Immunol.141:3893、1991)、インビトロアセンブリアッセイ(Townsendら、Cell 62:285、1990)解離率測定(Parkerら、J.Immunol.149:1896−1904、1992)およびRMA.Sなどの変異細胞を用いたFACS−ベースアッセイ(Meliefら、Eur.J.Immunol.21:2963、1991)。
【0072】
本発明者らは、結合親和性と免疫原性との相関が、候補ペプチドを評価する場合に考慮されるべき重要な因子であることを見出した。従って、モチーフ検索とHLA−ペプチド結合アッセイとの組合せにより、エピトープベースワクチンの候補が同定された。それらの結合親和性を決定した後、さらなる確認作業を行って、これらのワクチン候補の中で、抗原性および免疫原性の点で好ましい特徴を有するエピトープを選択し得る。種々のストラテジーを利用して、免疫原性を評価し得る。これらのストラテジーとしては、以下が挙げられる:
1)正常個体由来の初代T細胞培養物の評価(例えば、Wentworth,P.A.ら、Mol.Immunol.32:603、1995;Celis,E.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2105、1994;Tsai,V.ら,J.Immunol.158:1796、1997;Kawashima,I.ら、Human Immunol.59:1、1998);この手順は、正常被験体由来のPBLを、インビトロで抗原提示細胞の存在下で数週間にわたり試験ペプチドで刺激することを包含する。このペプチドに特異的なT細胞は、この期間に活性化され、そして例えば、ペプチド感作標的細胞に伴う51Cr放出アッセイを用いて検出される。
2)HLAトランスジェニックマウスの免疫(Wentworth,P.A.ら、J.Immunol.26:97、1996;Wentworth,P.A.ら、Int.Immunol.8:651、1996;Alexander,J.ら、J.Immunol.159:4753、1997);この方法において、不完全フロイントアジュバント中のペプチドをHLAトランスジェニックマウスの皮下に投与する。免疫して数週間後に、脾細胞を取り出し、そしてインビトロで約1週間にわたり試験ペプチドの存在下で培養する。ペプチド特異的T細胞は、例えば、ペプチド感作標的細胞および内因的に生成した抗原を発現する標的細胞に伴う51Cr放出アッセイを用いて検出される。
3)感染から回復した免疫個体、および/または慢性的に感染した患者からのリコールT細胞応答の実証(Rehermann,B.ら、J.Exp.Med.181:1047、1995;Doolan,D.L.ら、Immunity 7:97、1997;Bertoni,R.ら、J.Clin.Invest.100:503、1997;Threlkeld,S.C.ら、J.Immunol.159:1648、1997;Diepolder,H.M.ら、J.Virol.71:6011、1997)。このストラテジーを適用する際に、リコール応答は、例えば、感染を通じて天然に抗原に曝され、従って、「天然に」免疫応答を生成した被験体由来のPBLを培養することによって検出される。被験体由来のPBLを、インビトロで試験ペプチドおよび抗原提示細胞(APC)の存在下で1〜2週間の間培養して、「ナイーブな」T細胞と比較して、「記憶」T細胞の活性化を可能にする。培養期間の終わりに、T細胞活性を、ペプチド感作された標的、T細胞増殖、またはリンホカイン放出を伴う51Cr放出を含むT細胞活性についてのアッセイを用いて検出する。
【0073】
以下は、本発明のペプチドエピトープおよび対応する核酸を記載する。
【0074】
IV.C.HLA分子に対するペプチドエピトープの結合親和性
ここに示すように、高度なHLA多型は、ワクチン開発へのエピトープベースのアプローチと共に考慮すべき重要な因子である。この因子に取り組むために、高いかまたは中程度の親和性で複数のHLA分子に結合し得るペプチドを同定する工程を包含するエピトープの選択が好ましくは使用され、最も好ましくは、これらのエピトープは、高いかまたは中程度の親和性で2つ以上の対立遺伝子特異的HLA分子に結合する。
【0075】
ワクチン組成物のための目的のCTL誘導ペプチドとしては、好ましくは、IC50またはクラスI HLA分子に対する結合親和性の値が500nM以下であるペプチドが挙げられる。HTL誘導ペプチドとしては、好ましくは、IC50またはクラスII HLA分子に対する結合親和性の値が1000nM以下であるペプチドが挙げられる。例えば、ペプチド結合は、インビトロにおいて候補ペプチドが精製HLA分子に結合する能力を試験することによって評価される。次いで、高いかまたは中程度の親和性を示すペプチドは、さらなる分析のために考察される。選択されたペプチドは、スーパータイプファミリーの他のメンバーについて試験される。好ましい実施形態において、交差反応結合を阻害するペプチドは、次いで、ワクチンまたは細胞スクリーニング分析において使用される。
【0076】
本明細書に開示するように、高いHLA結合親和性は、より大きな免疫原性と相関している。より大きな免疫原性は、いくつかの異なる様式において明確であり得る。免疫原性は、免疫応答が少しでも誘発されるか否か、および任意の特定の応答の効力に対応する。例えば、ペプチドは、強力な応答を生成する場合を除いて、集団の多様なアレイにおける免疫応答を引き起こし得る。これらの原理に従って、90%近い高結合ペプチドは、中程度の親和性で結合するペプチドの約50%と対照してみると、免疫原性であることが見出されている。さらに、高結合親和性ペプチドは、より強力な免疫原性応答を引き起こす。結果として、高親和性結合ペプチドが使用される場合、ペプチドは同様の生物学的効果を引き起こす必要はあまりない。従って、本発明の好ましい実施形態において、高結合エピトープが特に望ましい。
【0077】
HLAクラスI分子に対する結合親和性と結合抗原上の別個のペプチドエピトープの免疫原性との間の関係は、本発明者によって当該分野で初めて決定された。結合親和性と免疫原性との間の相関は、2つの異なる実験的なアプローチで分析された(Setteら、J.Immunol.153:5586−5592、1994)。第1のアプローチにおいて、10,000倍の範囲を超えるHLA結合親和性の範囲の潜在性あるエピトープの免疫原性が、HLA−A*0201トランスジェニックマウスにおいて分析された。第2のアプローチにおいて、約100個の異なるB型肝炎ウイルス(HBV)由来潜在的エピトープ(全てが、A*0201結合モチーフを保有する)の抗原性は、急性肝炎の患者由来のPBL(末梢血リンパ球)を使用することによって評価された。これらのアプローチに従って、約500nM(好ましくは、IC50値が500nM以下)の親和性閾値はペプチドエピトープがCTL応答を引き起こす能力を決定することが決定された。これらのデータは、天然でプロセシングされたペプチドおよび合成T細胞エピトープに対するクラスI結合親和性の測定について当てはまる。これらのデータはまた、T細胞応答の具現における決定因子の選択の重要な役割を示す。
【0078】
HLAクラスII DR分子の状況における免疫原性に関連する親和性閾値も示されている(Southwoodら、J.Immunology 160:3363−3373、1998、および1998年5月29日出願の米国特許出願番号60/087192)。DR結合親和性の生物学的に有意な閾値を規定するために、32個のDR拘束エピトープのそれらの拘束エレメントに対する結合親和性のデータベースが集計された。これらの場合の約半分(32個のエピトープのうち15個)において、DR拘束は高結合親和性(すなわち、IC50値が100nM以下の結合親和性値)に関連していた。これらの場合の残りの半分(32個のうちの16個)において、DR拘束は中程度の親和性(100〜1000nM範囲の結合親和性値)に関連していた。32個の場合のうちただ1つにおいて、DR制限は1000nM以上のIC50に関連していた。従って、1000nMは、DR分子の状況における免疫原性に関連する親和性閾値として定義され得る。
【0079】
HLA分子に対するペプチドの結合親和性は、以下の実施例1のように決定され得る。
【0080】
IV.D.ペプチドエピトープ結合モチーフおよびスーパーモチーフ(Supermotif)
この数年間で、大部分のHLAクラスIおよびおそらくクラスII分子が、ペプチド結合レパートリーが大きく重複すること及び主要なペプチド結合ポケットのコンセンサス構造によって特徴付けられる比較的わずかなスーパータイプに分類することができることを示す証拠が蓄積されている。
【0081】
HLA分子ポケット分析について、結晶学的研究(Guo,H.C.ら、Nature 360:364、1992;Saper,M.A.、Bjorkman,P.J.およびWiley,D.C.、J.Mol.Biol.219:277、1991;Madden,D.R.、Garboczi,D.N.およびWiley,D.C.、Cell 75:693、1993)において記載されるようなHLAクラスI分子のBおよびFポケットを含む残基が、Parhamらのデータベースから集計された(Parham,P.、Adams,E.J.、およびArnett,K.L.、Immunol.Rev.143:141、1995)。これらの分析において、残基9、45、63、66、67、70および99は、Bポケットを構成すると考えられ、ペプチドリガンドの2位における残基に対する特異性を決定すると考えられた。同様に、残基77、80、81および116は、Fポケットの特異性を決定すると考えられ、HLA分子により結合されたペプチドリガンドのC末端残基に対する特異性を決定すると考えられた。
【0082】
単一のアミノ酸置換抗原アナログの研究、および内因的に結合し天然でプロセシングされたペプチドの配列決定を通して、HLA分子に対する対立遺伝子特異的結合に必要な重要な残基が同定された。これらの残基の存在は、HLA分子に対する結合親和性と相関する。高いかまたは中程度の親和性結合に相関するモチーフおよび/またはスーパーモチーフの同定は、ワクチンに含有させるための免疫原性ペプチドエピトープの同定に関する重要な問題である。Kastら(J.Immunol.152:3904−3912、1994)は、モチーフ保有ペプチドは、対立遺伝子特異的HLAクラスI分子に結合するエピトープの90%を構成することを示した。この研究において、9個のアミノ酸長かつ8個のアミノ酸が重なる全ての可能なペプチド(240個のペプチド)(これはヒト乳頭腫ウイルス属16型のE6およびE7タンパク質の配列全体をカバーする)は、異なる人種間で高頻度で発現される5個の対立遺伝子特異的HLA分子への結合について評価された。この偏りのないペプチドのセットは、HLAクラスIモチーフの予測値の評価を可能にした。240個のペプチドのセットから、高いかまたは中程度の親和性を有する対立遺伝子特異的HLA分子に結合する22個のペプチドが同定された。これらの22個のペプチドのうち、20個(すなわち、91%)はモチーフを保有していた。従って、この研究は、ワクチンに含有させるためのペプチドエピトープの同定のためのモチーフの値を説明し、モチーフベースの同定技術の適用は潜在性あるエピトープの90%のスクリーニングを排除する。
【0083】
このようなペプチドエピトープは、以下に記載される表で同定される。HLAクラスIエピトープのための表1は対立遺伝子特異的HLAクラスI分子と中程度のまたは高い親和性で結合するペプチドの90%以上を含む。
【0084】
本発明のペプチドはまた、MHCクラスII DR分子に結合するエピトープを含み得る。クラスIとクラスIIのHLA分子間の顕著な相違は、クラスI分子に結合するペプチドについては厳格なサイズ制限が存在するものの、ペプチドのN末端およびC末端に対する、モチーフのサイズおよび結合フレームの位置の両方におけるより大きな程度の異質性がクラスIIペプチドリガンドについては示され得ることである。この異質性の増加は、クラスIの対応物と異なり両端で開いているクラスII分子の結合溝の構造に由来する。DRB*0101ペプチド複合体の結晶学的分析(例えば、Madden,D.R.Ann.Rev.Immunol.13:587、1995を参照のこと)は、DRB*0101と複合化したペプチドの1位および位置6を占める残基がDRBa*0101分子上の2つの相補的なポケットに結合し、P1位置が最も重要なアンカー残基および最も深い疎水性ポケットに対応することを示した。他の研究はまた、P6位置を様々な他のDR分子に結合する重要なアンカー残基として指摘した。
【0085】
従って、本発明のペプチドは、いくつかのHLA特異的アミノ酸モチーフの任意の1つによって同定される(例えば、表I−IIIを参照のこと)。モチーフの存在がいくつかの対立遺伝子特異的HLA抗原に結合する能力と対応する場合、これはスーパーモチーフと称される。特定のアミノ酸モチーフを有するペプチドに結合する対立遺伝子特異的HLA分子は、包括的にHLA「スーパーモチーフ」と称される。
【0086】
以下に記載されるペプチドモチーフおよびスーパーモチーフは、本発明のペプチドの同定および使用のためのガイダンスを提供する。
【0087】
それぞれのスーパーモチーフまたはモチーフを保有するペプチドエピトープの例は、各モチーフまたはスーパーモチーフの説明において示されるような表に挙げられる。これらの表は、ペプチドエピトープのいくつかについての結合親和性比のリストを含む。この比は以下の式を使用することによって、IC50に変換され得る:標準ペプチドのIC50/比=試験ペプチド(すなわち、ペプチドエピトープ)のIC50。クラスIペプチドに対する結合親和性を決定するために使用される標準ペプチドのIC50値は、表IVに示される。クラスIIペプチドに対する結合親和性を決定するために使用される標準ペプチドのIC50値は、表Vに示される。結合アッセイのための標準として使用されるペプチドは、標準の例であり;代替の標準ペプチドはまた、このような分析を実施する場合に使用され得る。
【0088】
各表に列挙されるペプチドエピトープ配列を得るために、20個のHBV株(HPBADR、HPBADRlCG、HPBADRA、HPBADRC、HPBADRCG、HPBCGADR、HPBVADRM、HPBADW、HPBADW1、HPBADW2、HPBADW3、HPBADWZ、HPBHEPB、HPBVADW2、HPBAYR、HPBV、HPBVAYWC、HPBVAYWCI、NAD HPBVAYWE)から得たタンパク質配列データが、指定されたスーパーモチーフまたはモチーフの存在について評価された。ペプチドエピトープも保存性に基づいて評価された。保存性の基準は、ペプチドの配列全体が、特定のタンパク質について利用可能な配列の75%において全体的に保存されていることを必要とする。選択されたペプチドエピトープの保存百分率は表に示される。頻度、すなわち、この20個の株のうち全体的に保存されるペプチド配列が同定された株の数も示される。表中の「第1位置」のカラムは、エピトープの最初のアミノ酸残基に対応するHBVタンパク質のアミノ酸位置を示す。「アミノ酸の数」は、エピトープ配列中の残基の数を示す。
【0089】
CTL誘導ペプチドエピトープを示すHLAクラスIモチーフ
以下に示されるHLAクラスIペプチドエピトープスーパーモチーフおよびモチーフの一次アンカー残基を表Iに要約する。表I(a)に記載されるHLAクラスIモチーフは本願特許請求の範囲に記載された本発明に最も関連するものである。一次および二次アンカー位置は表IIに要約される。HLAクラスIスーパータイプファミリーを含む対立遺伝子特異的HLA分子は表VIに列挙される。
【0090】
IV.D.1.HLA−A1スーパーモチーフ
HLA−A1スーパーモチーフは、エピトープの2位における小さな(TまたはS)または疎水性の(L、I、VまたはM)一次アンカー残基及びエピトープのC末端位における芳香族の(Y、FまたはW)一次アンカー残基のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。A1スーパーモチーフ(すなわち、HLA−A1スーパータイプ)に結合するHLA分子の対応するファミリーは、少なくともA*0101、A*2601、A*2602、A*2501、およびA*3201からなる(例えば、DiBrino,M.ら、J.Immunol.151:5930、1993;DiBrino,M.ら、J.Immunol.152:620、1994;Kondo,A.ら、Immunogenetics 45:249、1997を参照のこと)。A1スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的HLA分子は、表VIに示される。個々のHLAタンパク質の各々に結合するペプチドは、一次および/または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフに対して指定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0091】
A1スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表VIIに記載される。
【0092】
IV.D.2.HLA−A2スーパーモチーフ
対立遺伝子特異的HLA−A2.1分子に対する一次アンカーの特異性(Falkら、Nature 351:290−296、1991;Huntら、Science 255:1261−1263、1992)、およびHLA A2ファミリー内の交差反応結合(Fruciら、Human Immunol.38:187−192、1993;Tanigakiら、Human Immunol.39:155−162、1994)が記載されている。本発明者らは、複数の対立遺伝子特異的HLA A2分子への交差反応結合を決定するさらなる一次アンカー残基を規定した(Del Guercioら、J.Immunol.154:685−693、1995)。HLA−A2スーパーモチーフは、エピトープの2位に一次アンカー残基としてのL、I、V、M、A、TまたはQ及びエピトープのC末端位に一次アンカー残基としてのL、I、V、M、AまたはTを有するペプチドリガンドを含む。
【0093】
HLA分子の対応するファミリー(すなわち、これらのペプチドに結合するHLA−A2スーパータイプ)は、少なくともA*0201、A*0202、A*0203、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207、A*0209、A*0214、A*6802、およびA*6901からなる。A2スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的HLA分子は、表VIに示される。以下に詳細に説明されるように、個々の対立遺伝子特異的HLA分子の各々への結合は、一次アンカーおよび/または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはこのスーパーモチーフに対して指定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0094】
A2スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表VIIIに記載される。2位において一次アンカー残基V、A、TまたはQを含み、C末端位においてL、I、V、AまたはTを含むモチーフは、本願の特許請求の範囲に記載された発明に特に最も関連するものである。
【0095】
IV.D.3.HLA−A3スーパーモチーフ
HLA−A3スーパーモチーフは、エピトープの2位における一次アンカーとしてのA、L、I、V、M、SまたはT及びエピトープのC末端(すなわち、9マーの9位)における一次アンカーとしての正電荷の残基RまたはKのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。A3スーパーモチーフに結合するHLA分子(HLA−A3スーパータイプ)の対応するファミリーの例示的なメンバーは、少なくともA*0301、A*1101、A*3101、A*3301およびA*6801を含む。A3スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的HLA分子は、表VIに示される。以下で詳細に説明されるように、個々の対立遺伝子特異的HLAタンパク質の各々に結合するペプチドは、ペプチドの一次および/または二次アンカー位置におけるアミノ酸の置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0096】
A3スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表IXに記載される。
【0097】
IV.D.4.HLA−A24スーパーモチーフ
HLA−A24スーパーモチーフは、エピトープの2位における一次アンカーとしての芳香族残基(F、WまたはY)及びエピトープのC末端位における一次アンカーとしての疎水性残基(Y、F、L、I、VまたはM)のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。A24スーパーモチーフ(すなわち、A24スーパータイプ)に結合するHLA分子の対応するファミリーは、少なくともA*2402、A*3001およびA*2301を含む。A24スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的HLA分子は、表VIに示される。対立遺伝子特異的HLA分子の各々に結合するペプチドは、一次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0098】
A24スーパーモチーフを含む代表的ペプチドエピトープは、表Xに記載される。
【0099】
IV.D.5.HLA−B7スーパーモチーフ
HLA−B7スーパーモチーフは、エピトープの2位における一次アンカーとしてのプロリン及びエピトープのC末端位における一次アンカーとしての疎水性または脂肪族のアミノ酸(L、I、V、M、A、F、WまたはY)を保有するペプチドによって特徴付けられる。B7スーパーモチーフに結合するHLA分子(すなわち、HLA−B7スーパータイプ)の対応するファミリーは、B*0702、B*0703、B*0704、B*0705、B*1508、B*3501、B*3502、B*3503、B*3504、B*3505、B*3506、B*3507、B*3508、B*5101、B*5102、B*5103、B*5104、B*5105、B*5301、B*5401、B*5501、B*5502、B*5601、B*5602、B*6701、およびB*7801を含む少なくとも26個のHLA−Bタンパク質からなる(例えば、Sidneyら、J.Immunol.154:247、1995;Barberら、Curr.Biol.5:179、1995;Hillら、Nature 360:434、1992;Rammenseeら、Immunogenetics 41:178、1995を参照のこと)。B7スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的HLA分子は、表VIに示される。以下に詳細に説明されるように、個々の対立遺伝子特異的HLAタンパク質の各々に結合するペプチドは、ペプチドの一次および/または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0100】
B7スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表XIに記載される。
【0101】
IV.D.6.HLA−B27スーパーモチーフ
HLA−B27スーパーモチーフは、エピトープの2位における一次アンカーとしての正電荷の残基(R、HまたはK)及びエピトープのC末端位における一次アンカーとしての疎水性の残基(F、Y、L、W、M、I、AまたはV)のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。B27スーパーモチーフ(すなわち、B27スーパータイプ)に結合するHLA分子の対応するファミリーの例示的なメンバーは、少なくともB*1401、B*1402、B*1509、B*2702、B*2703、B*2704、B*2705、B*2706、B*3801、B*3901、B*3902、およびB*7301を含む。B27スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的HLA分子は、表VIに示される。対立遺伝子特異的HLA分子の各々に結合するペプチドは、一次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0102】
B27スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表XIIに記載される。
【0103】
IV.D.7.HLA−B44スーパーモチーフ
HLA−B44スーパーモチーフは、エピトープの2位における一次アンカーとしての負電荷の残基(DまたはE)及びエピトープのC末端位における一次アンカーとしての疎水性残基(F、W、Y、L、I、M、VまたはA)のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。B44スーパーモチーフ(すなわち、B44スーパータイプ)に結合するHLA分子の対応するファミリーの例示的なメンバーは、少なくともB*1801、B*1802、B*3701、B*4001、B*4002、B*4006、B*4402、B*4403、およびB*4006を含む。対立遺伝子特異的HLA分子の各々に結合するペプチドは、一次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0104】
IV.D.8.HLA−B58スーパーモチーフ
HLA−B58スーパーモチーフは、エピトープの2位における一次アンカー残基としての小さな脂肪族残基(A、SまたはT)及びエピトープのC末端位における一次アンカー残基としての芳香族または疎水性残基(F、W、Y、L、I、V、MまたはA)のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。B58スーパーモチーフ(すなわち、B58スーパータイプ)に結合するHLA分子の対応するファミリーの例示的なメンバーは、少なくともB*1516、B*1517、B*5701、B*5702、およびB*5801を含む。B58スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的HLA分子は、表VIに示される。対立遺伝子特異的分子の各々に結合するペプチドは、一次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0105】
B58スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表XIIIに記載される。
【0106】
IV.D.9.HLA−B62スーパーモチーフ
HLA−B62スーパーモチーフは、エピトープの2位における一次アンカーとしての極性の脂肪族残基Qまたは疎水性の脂肪族残基(L、V、M、またはI)及びエピトープのC末端位における一次アンカーとして、疎水性残基(F、W、Y、M、I、V、LまたはA)のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。B62スーパーモチーフ(すなわち、B62スーパータイプ)に結合するHLA分子の対応するファミリーの例示的なメンバーは、少なくともB*1501、B*1502、B*1513、およびB*5201を含む。B62スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的HLA分子は、表VIに示される。対立遺伝子特異的HLA分子の各々に結合するペプチドは、一次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0107】
B62スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表XIVに記載される。
【0108】
IV.D.10.HLA−A1モチーフ
対立遺伝子特異的HLA−A1モチーフは、エピトープの2位における一次アンカー残基として、のT、SまたはM及びエピトープのC末端位における一次アンカー残基としてのYのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。代替の対立遺伝子特異的A1モチーフ(すなわち、「サブモチーフ」)は、2位よりむしろ3位における一次アンカー残基によって特徴付けられる。このサブモチーフは、エピトープの3位における一次アンカー残基としてのD、E、AまたはS及びC末端位における一次アンカー残基としてのYの存在によって特徴付けられる。伸長したサブモチーフは、3位におけるDの存在およびC末端位におけるA、I、LまたはFの存在によって特徴付けられる。HLA A1に結合するペプチドは、一次および/または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0109】
A1モチーフのいずれかを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表XVに記載される。2位にT、SまたはMを、およびC末端位にYを含むこれらのエピトープはまた、表VIIに列挙されるHLA−A1スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープの表に含まれる。
【0110】
IV.D.11.HLA−A2.1モチーフ
対立遺伝子特異的HLA−A2.1モチーフは、9個のアミノ酸エピトープの2位における一次アンカー残基としてのLまたはM及び9個のアミノ酸エピトープのC末端位における一次アンカー残基としてのLまたはVのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられることが決定された(Falkら、Nature 351:290−296、1991)。さらに、A2.1モチーフは、9個のアミノ酸ペプチドの2位においてIを含み、C末端においてIまたはAをさらに含むことが決定された(Huntら、Science 255:1261−1263、March 6、1992)。さらに、A2.1対立遺伝子特異的モチーフは、C末端位にTを含むことが見出された(Kastら、J.Immunol.152:3904−3912、1994)。続いて、本発明者らによって、A2.1対立遺伝子特異的モチーフは、V、A、TまたはQをエピトープの2位に一次アンカー残基としてさらに含むことが規定され、MをC末端位に一次アンカー残基として含むことが規定されている。従って、HLA−A2.1モチーフは、L、I、V、M、A、TまたはQを有するペプチドリガンドをエピトープの2位に一次アンカー残基として含み、L、I、V、M、AまたはTを、エピトープのC末端位における一次アンカー残基として含む。HLA−A2.1モチーフの一次アンカー位置を特徴付ける好ましくかつ寛容される残基は、A2スーパーモチーフを示す好ましい残基と同一である(関連のデータの総説については、例えば、Del Guercioら、J.Immunol.154:685−693、1995;Sidneyら、Immunol.Today 17:261−266、1996;SetteおよびSidney、Curr.Opin.in Immunol.10:478−482、1998を参照のこと)。A2.1モチーフを特徴付ける二次アンカー残基は、本明細書中で開示されるように、さらに定義されている。これらは、表IIに開示される。HLA−A2.1分子に結合するペプチドは、一次および/または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0111】
A2.1モチーフを含む代表的ペプチドエピトープは、表VIIに記載される。一次アンカー残基V、A、TまたはQを2位に含み、L、I、V、AまたはTをC末端位に含むA2.1モチーフは、本明細書中で、特許請求の範囲に記載された発明に特に最も関連するものである。
【0112】
IV.D.12.HLA−A3モチーフ
対立遺伝子特異的HLA−A3モチーフは、エピトープの2位における一次アンカー残基としてのL、M、V、I、S、A、T、F、C、GまたはD及びエピトープのC末端位における一次アンカー残基としてのK、Y、R、H、FまたはAのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。HLA−A3に結合するペプチドは、一次および/または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0113】
代表的なA3モチーフを含むペプチドエピトープは、表XVIに記載される。A3スーパーモチーフを含むペプチドエピトープも表IXに列挙される。
【0114】
IV.D.13.HLA−A11モチーフ
対立遺伝子特異的HLA−A11モチーフは、エピトープの2位における一次アンカー残基としてのV、T、M、L、I、S、A、G、N、C、DまたはF及びエピトープのC末端位における一次アンカー残基としてのK、R、YまたはHのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。HLA−A11に結合するペプチドは、一次および/または2次アンカー位置における置換によって、好ましくはモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0115】
A11モチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、表XVIIに記載され、A3対立遺伝子特異的モチーフを含むペプチドエピトープも、A3およびA11モチーフの一次アンカー特異性間の広範な重なりのため、この表に示される。さらに、A3スーパーモチーフを含むペプチドエピトープも表IXに列挙される。
【0116】
IV.D.14.HLA−A24モチーフ
対立遺伝子特異的HLA−A24モチーフは、エピトープの2位における一次アンカー残基としてのY、F、W、またはM及びエピトープのC末端位置における一次アンカー残基としてのF、L、I、またはWのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。HLA−A24分子に結合するペプチドは、一次および/または二次のアンカー位置における置換によって、好ましくはモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0117】
A24モチーフを含む代表的ペプチドエピトープは、表XVIIIに示される。これらのエピトープはまた、表X、HLA−A24スーパーモチーフ保有エピトープにも列挙される。
【0118】
HLAクラスII HTLエピトープを示すモチーフ
以下に描写したHLAクラスIIスーパーモチーフおよびモチーフの一次および二次のアンカー残基は、表IIIに要約される。
【0119】
IV.D.15.HLA−DR−1−4−7スーパーモチーフ
モチーフは、3つの共通のHLAクラスII対立遺伝子特異的HLA分子(HLA DRB1*0401、HLA DRB1*0101、およびHLA DRB1*0701)に結合するペプチドについても同定された。包括的に、これらのモチーフ由来の共通の残基は、HLA DR−1−4−7スーパーモチーフを示す。これらのDR分子に結合するペプチドは、エピトープの1位における一次アンカー残基としての大きな芳香族残基または疎水性残基(Y、F、W、L、I、V、またはM)及びエピトープの6位における一次アンカー残基としての小さな非電荷残基(S、T、C、A、P、V、I、L、またはM)によって特徴付けられるスーパーモチーフを保有する。これらのHLA型の各々についての対立遺伝子特異的二次効果および二次アンカーも同定されている。これらは、表IIIにおいて示される。HLA−DR4、DR1、および/またDR7に結合するペプチドは、一次および/または二次のアンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0120】
保存されたペプチドエピトープ(すなわち、分析のために使用された20のHBV株において保存率75%)は、DR−1−4−7スーパーモチーフを含む9残基のコアに対応し(ここで、モチーフの1位は9残基のコアの1位にある)、表XIXaにおいて示される(例えば、Madden,Annu.Rev.Immunol.13:587−622、1995も参照のこと)。15アミノ酸残基長のそれぞれの例示的なペプチドエピトープ(その各々は、保存された9残基のコアを含む)も表の「a」節において示される。例示的な15残基のスーパーモチーフ保有ペプチド(ペプチド数により命名されている)についての交差反応結合データは、表XIXbにおいて示される。
【0121】
IV.D.16.HLA−DR3モチーフ
2つの代替的なモチーフ(すなわち、サブモチーフ)は、HLA−DR3分子に結合するペプチドエピトープを特徴付ける。第1のモチーフ(サブモチーフDR3A)において、大きな疎水性残基(L、I、V、M、F、またはY)はアンカー1位に存在し、Dはエピトープのカルボキシル末端方向4位にアンカーとして存在する。
【0122】
代替のDR3サブモチーフは、エピトープのカルボキシル末端方向6位における正電荷の存在によって、アンカー1位における大きな疎水性残基、および/または4位における負に荷電したアンカー残基またはアミド様アンカー残基の欠失をもたらす。従って、代替の対立遺伝子特異的DR3モチーフ(サブモチーフDR3B)について、L、I、V、M、F、Y、A、またはYはアンカー1位に存在し;D、N、Q、E、S、またはTはアンカー4位に存在し;K、R、またはHはアンカー6位に存在する。HLA−DR3に結合するペプチドは、一次および/または二次のアンカー位置における置換によって、好ましくはモチーフのために特定したそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【0123】
DR3Aサブモチーフを含む9残基のコア(ここで、モチーフの1位は9残基のコアの1位にある)に対応する保存されたペプチドエピトープ(すなわち、分析のために使用された20のHBV株において保存率75%の配列)は、表XXaにおいて示される。15アミノ酸残基長のそれぞれの例示的なペプチドエピトープ(その各々は、保存された9残基のコアを含む)も表XXaにおいて示される。表XXbは、例示的なDR3サブモチーフA保有ペプチド(ペプチド番号によって命名)の結合データを示す。
【0124】
DR3Bサブモチーフを含む9残基コアおよびDR3サブモチーフ−Bエピトープを含む例示的な15マーのペプチドそれぞれに対応する保存されたペプチドエピトープ(すなわち、分析のために使用された20のHBV株において保存率75%)は、表XXcにおいて示される。表XXdは、例示的なDR3サブモチーフB保有ペプチド(ペプチド番号によって命名)の結合データを示す。
【0125】
本明細書中の表に示されているHLAクラスIまたはクラスIIのペプチドエピトープの各々は、それだけで本願の発明実施態様であるとみなす。さらに、各々のペプチドエピトープが、任意の他のペプチドエピトープと組み合わせて使用してもよいことも本願の発明実施態様である。
【0126】
IV.E.ワクチンの拡大された集団適用範囲
広範な集団適用範囲を有するワクチンが好ましい。なぜなら、このワクチンは、より商業的に実行可能であり、一般的にほとんどの人々に適用可能であるからである。広範な集団適用範囲は、全体で考慮した場合に集団のほとんどに存在するHLA対立遺伝子に結合するペプチドエピトープを選択することを介して、本発明のペプチド(およびこのようなペプチドをコードする核酸組成物)を用いて得ることができる。表XXIは、様々な人種におけるHLAクラスIスーパータイプの全体の頻度(表XXIa)、ならびにA2スーパータイプ、A3スーパータイプ、およびB7スーパータイプによって達成される組み合わされた集団適用範囲(表XXIb)を列挙する。このA2スーパータイプ、A3スーパータイプ、およびB7スーパータイプは、5つの主な人種の各々において40%を超える平均値でそれぞれ存在する。80%より多い範囲は、これらのスーパーモチーフの組合せを用いて達成される。これらの結果は、効果的かつ人種的に偏りのない集団適用範囲が制限された数の交差反応性ペプチドを使用した際に達成されることを示唆する。これらの3つの主なペプチド特異性を用いて達した集団適用範囲は大きいが、適用範囲を95%以上の集団適用範囲に達するように拡大することができ、さらなるスーパーモチーフ保有ペプチドまたは対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの使用の際の正確な多特異性応答をより容易に達成する。
【0127】
B44スーパータイプ、A1スーパータイプ、およびA24スーパータイプは、これらの主な人種集団において平均25%〜40%の範囲内で存在する(表XXIa)。全体的にみてあまり普及したものではないが、少なくとも1つの主な人種集団においてB27スーパータイプ、B58スーパータイプ、およびB62スーパータイプは各々25%を超える頻度で存在する(表XXIa)。表XXIbは、同定されたHLAスーパータイプの5つの主な人種における組み合わせた推定普及率を要約する。A2範囲、A3範囲、およびB7範囲がA1スーパータイプ、A24スーパータイプおよびB44スーパータイプを含むことまたは本明細書中に記載されるスーパータイプ全てを含むことにより得られる適用範囲の拡大が示されている。6つの最も頻度の高いスーパータイプ由来のエピトープを含むことによって、99%の平均集団適用範囲が5つの主な人種について得られる。
【0128】
A2スーパータイプ、A3スーパータイプおよびB7スーパータイプの上記の定義と共に本明細書中に示されるデータは、A29、B8、およびB46の除外が可能である全ての抗原が全部で9つのHLAスーパータイプに分類することができることを示す。6つの最も共通するスーパータイプに焦点を合わせると、主な人種集団すべての98%以上をカバーする集団適用範囲が与えられる。
【0129】
IV.F.免疫応答刺激ペプチドアナログ
スーパーファミリーの全ての対立遺伝子のうちの適切な交差反応性を有するペプチドが上記のスクリーニング方法によって同定されるが、交差反応性は常に完全とは限らず、その場合に、ペプチドの交差反応をさらに増加させる方法は有用であり得る;ペプチドの他の特性を改変するためにそのような方法も使用することができる。所与のモチーフまたはスーパーモチーフ内のHLA対立遺伝子のためのペプチドの交差反応を支配する一般的ルールを確立したならば、より広範な(さもなければ改変された)HLA結合能力を達成するために興味あるペプチドの構造の改変(すなわち、アナログ化)を行うことができる。より具体的には、(既知のT細胞エピトープおよび適当なスーパーモチーフを含むより伸長されたペプチドセットの双方の中で)最も広範な交差反応パターンを示すペプチドが、本明細書中の教示に従って作製され得る。
【0130】
使用したストラテジーは、特定のHLA分子への結合と相関するモチーフまたはスーパーモチーフを利用する。モチーフまたはスーパーモチーフは一次アンカーを有することによって定義されるが、二次アンカーを改変することもできる。アナログペプチドは、一次アンカー、二次アンカーにおいて、または一次アンカー位置および二次アンカー位置においてアミノ酸残基を置換することによって作製され得る。一般的には、アナログは、すでにモチーフまたはスーパーモチーフを保有するペプチドについて作製される。HLAクラスIおよびHLAクラスII結合ペプチドについて規定されているスーパーモチーフおよびモチーフの好ましい二次アンカー残基は、表IIおよびIIIにそれぞれ示される。
【0131】
本発明の多数のモチーフまたはスーパーモチーフについて、それぞれのモチーフまたはスーパーモチーフを結合するHLAスーパータイプの対立遺伝子特異的HLA分子またはメンバーに結合することが有害である残基が規定される(表IIおよびIII)。従って、結合が有害である残基の除去が、本発明に従って実行され得る。例えば、A3スーパータイプの場合、このような有害な残基を有する全てのペプチドが分析されたペプチドの集団から除去されると、交差反応性率が22%から37%に上昇する(例えば、Sidney,J.ら、Hu.Immunol.45:79、1996を参照のこと)。従って、所定のスーパーモチーフ内のペプチドの交差反応性を改善する1つのストラテジーは、単に、ペプチド内に存在する1つ以上の有害な残基を除去し、(ペプチドのT細胞認識に影響を与えない)小さな「中性」残基(例えば、Ala)を置換することである。ペプチド内の有害な残基の除去と共に、スーパーファミリー内の複数の対立遺伝子に対して高い親和性結合に関連する残基が挿入される場合、交差反応の増強が期待されるであろう。
【0132】
ワクチンとして使用される場合、アナログペプチドが、インビボでネイティブエピトープに対するCTL応答を実際に誘発する(またはクラスIIエピトープの場合、野生型ペプチドと交差反応するヘルパーT細胞を誘発する)ことを確実にするために、アナログペプチドを用いて適切なHLA対立遺伝子の個体からインビトロでT細胞を免疫することができる。その後、免疫された細胞の、野生型ペプチドに感作した標的細胞の溶解を誘導する能力が評価される。内因的に産生された抗原もが関連するT細胞によって認識されるか否かを確立するために、適切な遺伝子で感染またはトランスフェクトした抗原提示細胞として、あるいはクラスIIエピトープのみの場合はタンパク質抗原全体を用いてパルスされた抗原提示細胞として使用することが望ましい。
【0133】
適当な数の交差反応細胞結合因子を確実にする本発明の別の実施形態は、弱く結合するペプチドのアナログを作製することである。500〜5000nMの結合親和性を示し、かつ、1つまたは両方の位置において適用可能であるが最適下限の一次アンカーを有するクラスIペプチドは、それぞれのスーパータイプに従い好ましいアンカー残基を置換することによって「固定」することができる。次いで、このアナログペプチドは、交差結合活性について試験され得る。
【0134】
効果的なペプチドアナログを作製するための別の実施形態は、液体環境下でのペプチド安定性または可溶性に対して悪影響を有する残基の置換を含む。この置換は、ペプチドエピトープのいずれかの位置で生じ得る。例えば、システイン(C)は、α−アミノ酪酸を優先して置換され得る。この化学的性質のために、システインは、ジスルフィド架橋を形成する性向を有し、そしてペプチドを構造的に十分に改変し、結合能力を減少する。αアミノ酪酸でのCの置換は、この問題を多少とも解決するだけでなく、ある例(概説:A.Setteら、Persistent Viral Infections,R.AhmedおよびI.Chen編、John Wiley & Sons、英国(1999)を参照のこと)において結合能力および交差結合能力を実際に改善する。システインのα−アミノ酪酸での置換は、ペプチドエピトープのいずれかの残基(すなわち、アンカー位置または非アンカー位置のいずれか)において生じ得る。
一般的には、CTLおよびHTL応答は、全ての可能なエピトープに対して指向されない。それどころか、それらは、少数の「免疫優性(immunodominant)」決定基に制限される(Zinkernagelら、Adv.Immunol.27:5159、1979;Benninkら、J.Exp.Med.168:1935−1939(1988);Rawleら、J.Immunol.146:3977−3984(1991))。免疫優性(Benacerrafら、Science 175:273−279(1972))は、所定のエピトープの特定のHLAタンパク質を選択的に結合する能力(決定基選択理論)(Vitielloら、J.Immunol.131:1635(1983);Rosenthalら、Nature 267:156−158(1977))または既存のTCR(T細胞レセプター)特異性(レパートリー理論)によって選択的に認識する能力(Klein,J.、IMMUNOLOGY,THE SCIENCE OF SELFNONSELF DISCRIMINATION、John Wiley & Sons、New York、270−310頁(1982))のいずれかによって説明され得る。ほとんどがプロセシング事象と関連している追加の因子は、多くの潜在的な決定基のいずれが免疫優性として提示されるかについて厳密な免疫原性を超えて決定することにおいて、重要な役割をも果たし得ることが証明された(Sercarzら、Annu.Rev.Immunol.11:729−766(1993))。
【0135】
優性および亜優性の概念は、感染病および癌の両方の免疫療法と関係する。例えば、慢性ウイルス疾患の経過において、亜優性エピトープの補充は、特に、優性CTL特異性または優性HTL特異性がウイルス機構および他の機構の機能的寛容、抑制、変異によって不活化されている場合、感染を取り除くことに成功するために重要であり得る(Francoら、Curr.Opin.Immunol.7:524−531(1995))。癌抗原および腫瘍抗原の場合、最も高い結合親和性ペプチドの少なくともいくつかを認識するCTLは、機能的に不活化され得る。このような場合、より低い結合親和性ペプチドは、優先的に認識される。
【0136】
特に、公知の非ウイルス腫瘍関連抗原(TAA)由来の有意な数のエピトープが、中程度の親和性(50〜500nMの範囲のIC50)でHLAクラスIに結合することが注目されている。例えば、腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)またはCTLによって認識される15個の公知のTAAペプチドのうち8個が、50〜500nM範囲で結合することが見出されている。(これらのデータは、ペプチドとして認識される公知のウイルス抗原の90%が50nM未満のIC50を有するHLAと結合したが、50〜500nM範囲においては約10%のみが結合したという評価とは対称的である(Setteら、J.Immunol.、153:558−5592(1994))。癌の環境において、この現象は、推定ではT細胞寛容事象による、最も高い結合ペプチドのいくつかを認識するCTLの排除または機能的阻害によるものであろう。
【0137】
理論に拘束されることを意図するものではないが、優性エピトープに対するT細胞がクローン的に欠失され得るので、亜優性エピトープの選択によって残っているT細胞を補充することが可能となり、次いで、これは治療的応答を導くと考えられる。しかし、HLA分子の亜優性エピトープへの結合は、しばしば、優性のエピトープに対してよりも活動的ではない。従って、1つ以上のHLA分子に対する特定の免疫原性エピトープの結合親和性を調節し、それによって、ペプチドによって誘発される免疫応答を調節できる必要性がある。従って、より活動的な応答を誘発するアナログペプチドを調製することが求められている。この能力は、ペプチドベースのワクチンおよび治療剤の有用性を非常に増強する。
【0138】
代表的なアナログペプチドは、表XXIIに示される。表は、適切な場合、アナログペプチドおよびモチーフまたはスーパーモチーフの長さもしくは配列を示す。「固定された命名」の列にある情報は、それぞれのアナログについての示された位置番号において置換された残基を示す。
【0139】
IV.G.スーパーモチーフまたはモチーフを含有するペプチドについての、疾患関連抗原由来タンパク質配列のコンピュータスクリーニング
標的抗原におけるスーパーモチーフ保有エピトープまたはモチーフ保有エピトープを同定するために、ネイティブなタンパク質配列(例えば、腫瘍関連抗原)、または感染生物由来の配列、または移植のためのドナー組織由来の配列を、例えば、知的計算またはコンピュータなどのコンピュータ計算手段を用いてスクリーニングし、配列内のスーパーモチーフまたはモチーフの存在を決定する。ネイティブなペプチドの分析から得られた情報が、ネイティブなペプチドの状態を評価するために直接使用され得るか、またはペプチドエピトープを生成するために引き続き利用され得る。
【0140】
本願のスーパーモチーフまたはモチーフの発現のためのタンパク質配列を迅速にスクリーニングすることを可能にするコンピュータプログラムは、本発明により包含され、アナログペプチドの生成を可能にするプログラムも同様に含まれる。これらのプログラムは、任意の同定されたアミノ酸配列を分析するかまたは、未知の配列に関して操作し、そして同時に配列を決定し、そしてそのモチーフ保有エピトープを同定することが実行され;アナログが、その上、同時に決定され得る。一般的に、同定された配列は、病原性生物または腫瘍関連ペプチド由来である。例えば、本明細書中で考慮される標的分子は、すべてのHBVタンパク質(例えば、表面、コア、ポリメラーゼおよびX)が挙げられる。
【0141】
同じ標的タンパク質の複数の改変体の配列が入手できる場合、それらの保存に基づいてペプチドを選択することもできる。保存率について現在好ましい基準は、ペプチドの配列全体が、特定のタンパク質について評価された配列の75%が合計で保存されることを規定している。保存のこの規定は、本明細書中で使用されている。
【0142】
ペプチド結合の予測のために利用される選択基準は、実際の結合と最も効果的に相関するために、可能な限り正確であることが重要である。適切な一次アンカーの存在に基づいて、例えば、HLA−A*0201に結合するペプチドの予測は、約30%の割合でポジティブである(Ruppert,J.ら、Cell 74:929、1993)。しかし、広範囲のペプチド−HLA結合データベースを分析することにより、本発明者らは、一次アンカー残基単独の存在に基づく同定に対して、予測値を劇的に増大する多数の対立遺伝子特異的多項式アルゴリズムを開発した。これらのアルゴリズムは、正確な一次アンカーの存在または非存在を考慮するだけでなく、(異なる位置における異なるアミノ酸の影響を説明するために)二次アンカー残基のポジティブな存在または有害な存在も考慮に入れる。このアルゴリズムは、本質的に、ペプチドHLA相互作用の全体の親和性(またはΔG)がこの型の一次多項式関数として近似され得るという前提に基づき:
ΔG=a1i×a2i×a3i...×ani
ここで、ajiは、n個のアミノ酸のペプチドの配列に沿った、所定の位置(i)における所定のアミノ酸(j)の存在の効果を示す係数である。この方法の重要な仮定は、各位置における効果が、本質的に、各他の位置の効果と独立していることである。この仮定は、ペプチドがHLA分子に結合し、かつ、本質的に伸長したコンホメーションのT細胞により認識されることを示す研究により立証される。特定のアルゴリズム係数の誘導が、Gulukotaら(Gulukota,K.ら、J.Mol.Biol.267:1258、1997)に記載されている。
【0143】
特定のモチーフをも利用する、好ましいペプチド配列を同定するためのさらなる方法は、神経回路網の使用および分子モデルプログラムの使用を含む(例えば、Milikら、Nature Biotechnology 16:753、1998;Altuviaら、Hum.Immunol.58:1、1997;Altuviaら、J.Mol.Biol.249:244、1995;Buus,S.Curr.Opin.Immunol.11:209−213、1999;Brusic,V.ら、Bioinformatics 14:121−130、1998;Parkerら、J.Immunol.152:163、1993;Meisterら、Vaccine 13:581、1995;Hammerら、J.Exp.Med.180:2353、1994;Sturnioloら、Nature Biotechnol.17:555 1999を参照のこと)。
【0144】
例えば、A*0201モチーフペプチドのセットにおいて、少なくとも1つの好ましい二次アンカー残基を含むペプチドの69%が、任意の有害な二次アンカー残基の存在を回避しながら、500nM未満のIC50を有するA*0201を結合することが示されている(Ruppert,J.ら、Cell 74:929、1993)。これらのアルゴリズムは、カットオフスコアが、所望の通り、より高いかまたはより低い予測結合特性を有するペプチドセットを選択するように調節され得る点でも柔軟である。
【0145】
ペプチドエピトープを同定するためのコンピュータスクリーニングを利用することにおいて、タンパク質配列または翻訳された配列のすべてが、モチーフを探索するために開発されたソフトウェア(例えば、[FINDPATTERNS]プログラム(Devereuxら、Nucl.Acids Res.12:387−395、1984)またはMotifSearch 1.4ソフトウェアプログラム(D.Brown、San Diego、CA))を使用して分析され、適切なHLA結合モチーフを含む潜在的なペプチド配列を同定し得る。当業者に理解されるように、既知または未知のペプチド配列に関連して本発明のモチーフを実行するために使用され得るコンピュータプログラミングソフトウェアおよびハードウェアオプションの大きなアレイが、利用可能である。次いで、同定されたペプチドは、カスタマイズされた多項式アルゴリズムを使用してスコアされ、特異的なHLAクラスI対立遺伝子またはクラスII対立遺伝子を結合するそれらペプチドの能力を予測する。
【0146】
上記の手順に従って、HLAスーパータイプ群または対立遺伝子特異的HLA分子を結合し得るHBVペプチドおよびそのアナログが同定された(表VII−XX;表XXII)。
【0147】
IV.H.ペプチドエピトープの調製
本発明のペプチドは、組換えDNA技術または化学合成により、あるいは天然の供給源(例えば、ネイティブな腫瘍または病原性生物)から合成的に調製され得る。ペプチドエピトープは、個々に合成され得るか、またはポリエピトープペプチドとして合成され得る。このペプチドは、好ましくは、他の天然の宿主タンパク質およびそのタンパク質フラグメントを実質的に含まないが、いくつかの実施形態において、このペプチドは、ネイティブなフラグメントまたは粒子に合成的に結合され得る。
【0148】
本発明のペプチドは、種々の長さとすることができ、それらの中和(荷電していない)形態または塩の形態のいずれかとすることができる。本発明のペプチドは、グリコシル化、側鎖の酸化またはリン酸化などの改変がされていないか、あるいは該ペプチドがこれらの改変を含み、本明細書中に記載されるように、改変がペプチドの生物学的活性を破壊しない条件に供される。
【0149】
可能な場合、ポリエピトープの構築において用い得たのと同様に、約8個〜約13個のアミノ酸残基、しばしば8個〜11個、好ましくは9個〜10個のアミノ酸残基の長さに、本発明のHLAクラスI結合ペプチドエピトープを最適化することが所望され得る。HLAクラスII結合ペプチドエピトープは、約6〜約30アミノ酸長の長さ、好ましくは約13個と約20個の残基との間に、最適化され得る。ペプチドエピトープは、関連HLA分子に結合する内因的にプロセシングされた病原体由来ペプチドまたは腫瘍細胞ペプチドとサイズが比例していることが好ましいが、本発明のエピトープを含むペプチドの同定および調製も本明細書中に記載される技術を使用して実行され得る。
【0150】
代替の実施形態において、本発明のエピトープが、ポリエピトープペプチドとしてまたはポリエピトープペプチドをコードするミニ遺伝子として、連結され得る。
【0151】
別の実施形態において、高濃度のクラスIエピトープおよび/またはクラスIIエピトープを含むネイティブなペプチド領域を同定することが好まれる。このような配列は、一般に、この配列が1個のアミノ酸長あたり最も多数のエピトープを含むことに基づいて、選択される。エピトープは、入れ子型(nested)または重複する様式で存在し得ることが理解され、例えば、10個のアミノ酸長のペプチドは9個のアミノ酸長エピトープを2つおよび10個のアミノ酸長のエピトープを1つ含むことができ;細胞内プロセシングに際して、各エピトープは、そのようなペプチドの投与の際にHLA分子により曝露されかつ結合され得る。このより大きい、好ましくは複数のエピトープのペプチドが、合成的により、組換えにより、またはネイティブな供給源からの切断を介して生成され得る。
【0152】
本発明のペプチドは、広範な種々の方法において調製され得る。好ましい比較的短いサイズのため、従来の技術に従って溶液中または固体支持体上でペプチドを合成することができる。種々の自動合成装置が市販され、公知のプロトコルに従って使用され得る(例えば、Stewart & Young、SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS、2D.ED.、Pierce Chemical Co.、1984を参照のこと)。さらに、個々のペプチドエピトープが化学的連結を使用して結合され、本発明の範囲内になおある、より大きいペプチドを産生し得る。
【0153】
あるいは、目的の免疫原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を、発現ベクター中に挿入するかあるいは適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトし、発現のための適切な条件下で培養する、組換えDNA技術を用いることができる。これらの方法は一般に当該分野で公知であり、Sambrookら、MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、New York(1989)に一般に記載される。従って、本発明の1つ以上のペプチド配列を含む組換えポリペプチドが、適切なT細胞エピトープを提示するために使用され得る。
【0154】
本明細書中で実行される好ましい長さのペプチドエピトープについての配列をコードするヌクレオチドが、化学的技術(例えば、Matteucciら、J.Am.Chem.Soc.103:3185(1981)のリン酸トリエステル法)により合成され得る。ペプチドアナログは、ネイティブなペプチド配列をコードする塩基を適切かつ所望の核酸塩基に置換することにより、簡単に作製することができ;例示的な核酸置換は、本明細書中のモチーフ/スーパーモチーフにより規定されるアミノ酸をコードする核酸置換である。次いで、適切なリンカーを用いてコード配列を提供し、当該分野で市販されている発現ベクターに連結し、所望の融合タンパク質を産生するためにそのベクターを用いて適切な宿主を形質転換する。多数のこのようなベクターおよび適切な宿主系が、現在入手できる。融合タンパク質の発現のために、コード配列は、操作可能に連結される開始コドンおよび停止コドン、プロモーター領域およびターミネーター領域ならびに所望の細胞性宿主における発現のための発現ベクターを提供する通常の複製系を用いて提供される。例えば、細菌性宿主と互換性のあるプロモーター配列が、所望のコード配列の挿入のための都合の良い制限部位を含むプラスミドに提供される。得られた発現ベクターは、適切な細菌性宿主に形質転換される。もちろん、酵母細胞宿主、昆虫細胞宿主または哺乳動物細胞宿主も、適切なベクターおよびコントロール配列を使用して、使用され得る。
【0155】
IV.I.T細胞応答を検出するためのアッセイ
一旦HLA結合ペプチドが同定されると、それらはT細胞応答を惹起する能力について試験され得る。モチーフ保有ペプチドの調製および評価は、国際公開第94/20127号パンフレットおよび国際公開第94/03205号パンフレットに記載される。簡潔に、特定の抗原由来のエピトープを含むペプチドが合成され、そして適切なHLAタンパク質に結合するそれらの能力について試験される。これらのアッセイは、放射ヨウ素標識された参照ペプチドの結合に関連して、精製されたHLAクラスI分子への本発明のペプチドの結合を評価する工程を包含する。あるいは、エンプティークラスI分子(すなわち、その中のペプチドを欠く)を発現する細胞は、免疫蛍光染色およびフローマイクロ蛍光測定により、ペプチド結合について評価され得る。ペプチド結合を評価するために使用され得る他のアッセイとしては、ペプチド依存性クラスIアセンブリアッセイおよび/またはペプチド競合によるCTL認識の阻害が挙げられる。典型的に500nM以下の親和性でクラスI分子に結合するこれらのペプチドは、さらに、感染した個体または免疫した個体由来のCTLに対する標的として機能するそれらの能力、および疾患に関連した選択された標的細胞と反応し得るCTL集団を生じる1次インビトロまたはインビボCTL応答を誘導し得るそれらの能力について評価される。
【0156】
類似のアッセイは、HLAクラスII結合ペプチドの評価のために使用される。典型的には1000nM以下の親和性で結合することが示されるHLAクラスIIモチーフ保有ペプチドは、さらに、HTL応答を刺激する能力について評価される。
【0157】
T細胞応答を検出するために利用される従来のアッセイとしては、増殖アッセイ、リンホカイン分泌アッセイ、直接的細胞傷害性アッセイ、および限界希釈アッセイが挙げられる。例えば、ペプチドと共にインキュベートされる抗原提示細胞は、レスポンダー細胞集団においてCTL応答を誘導する能力についてアッセイされ得る。抗原提示細胞は、通常の細胞(例えば、末梢血単核細胞または樹状細胞)であり得る。あるいは、内部でプロセシングされたペプチドでクラスI分子を負荷(load)する能力を欠き、かつ、適切なヒトクラスI遺伝子でトランスフェクトされた変異体非ヒト哺乳動物細胞株が、インビトロ1次CTL応答を誘導するペプチドの能力を試験するために使用され得る。
【0158】
末梢血単核細胞(PBMC)は、CTL前駆体のレスポンダー細胞供給源として使用され得る。適切な抗原提示細胞をペプチドと共にインキュベートし、インキュベート後、次いでペプチド負荷された抗原提示細胞を最適化された培養条件下でレスポンダー細胞集団とともにインキュベートする。ポシティブCTL活性は、放射線標識された標的細胞(特異的ペプチドパルス標的およびペプチド配列が由来する抗原の内因的にプロセシングされた形態を発現する標的細胞の両方)を殺傷するCTLの存在について培養物をアッセイすることによって決定され得る。
【0159】
さらに、蛍光標識HLAテトラマー複合体を用いて染色することによって、抗原特異的T細胞の直接的な定量を可能にする方法が考え出されている(Altman,J.D.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10330、1993;Altman,J.D.ら、Science 274:94、1996)。他の比較的最近の技術的な発達は、細胞内リンホカインに対する染色、およびインターフェロン放出アッセイまたはELISPOTアッセイを含む。テトラマー染色、細胞内リンホカイン染色およびELISPOTアッセイは、全て、従来のアッセイより少なくとも10倍感度が高いようである(Lalvani,A.ら、J.Exp.Med.186:859、1997;Dunbar,P.R.ら、Curr.Biol.8:413、1998;Murali−Krishna,K.ら、Immunity 8:177、1998)。
【0160】
HLT活性化も、T細胞増殖およびリンホカイン(例えば、IL−2)分泌などの当業者に公知のこのような技術を使用して評価され得る(例えば、Alexanderら、Immunity 1:751−761、1994を参照のこと)。
【0161】
あるいは、HLAトランスジェニックマウスの免疫化が、ペプチドエピトープの免疫原性を決定するために使用され得る。ヒトA2.1対立遺伝子、ヒトA11対立遺伝子(これらは、HLA−A3エピトープを分析するためにさらに使用され得る)、およびヒトB7対立遺伝子を有するマウスを含むいくつかのトランスジェニックマウスモデルが特徴付けられ、そして他のもの(例えば、HLA−A1およびA24についてのトランスジェニックマウス)が開発されている。HLA−DR1およびHLA−DR3マウスモデルも開発されている。他のHLA対立遺伝子を有するさらなるトランスジェニックマウスモデルが、必要ならば作製され得る。マウスは、不完全フロイントアジュバント中に乳化されたペプチドで免疫化され得、そして生じたT細胞を、ペプチドパルスされた標的細胞および適切な遺伝子でトランスフェクトされた標的細胞を認識するそれらの能力について試験した。CTL応答が上記の細胞傷害性アッセイを使用して分析され得る。同様に、HTL応答が、T細胞増殖またはリンホカイン分泌などのアッセイを使用して分析され得る。
【0162】
免疫原性ペプチドエピトープが、表XXIIIに記載される。
【0163】
III.J.診断薬剤としての、および免疫応答を評価するためのペプチドエピトープの使用
本発明の1つの態様において、本明細書中に記載されるHLAクラスIおよびクラスII結合ペプチドは、免疫応答を評価するための試薬として使用される。評価される免疫応答は、免疫源として任意の薬剤を使用することによって誘導され、この任意の薬剤は、試薬として使用されるペプチドエピトープ(単数または複数)を認識し、それに結合する、抗原特異的CTLまたはHTLを産生を生じ得る。このペプチド試薬は、免疫原として使用される必要がない。このような分析について使用されるアッセイ系は、比較的最近の技術開発(例えば、テトラマー、細胞内リホカインの染色およびインターフェロン放出アッセイ、またはELISPOTアッセイ)を含む。
【0164】
例えば、本発明のペプチドは、病原または免疫原への暴露に続いて、抗原特異的CTLの存在について末梢血単核細胞を評価するためのテトラマー染色アッセイにおいて使用される。HLA−テトラマー複合体は、抗原特異的CTLを直接可視化するために使用され(例えば、Oggら、Science 279:2103−2106、1998;およびAltmanら、Science 174:94−96、1996)、そして末梢血単核細胞のサンプル中における抗原特異的CTL集団の頻度を決定する。
【0165】
本発明のペプチドを使用するテトラマー試薬は、以下のように生成される:HLA分子に結合するペプチドを対応するHLA重鎖およびβ2−ミクログロブリンの存在下でリフォールディリングして、3分子複合体を生成する。この複合体は、以前にタンパク質に操作された部位で重鎖のカルボキシル末端でビオチン化される。次いで、テトラマー形成がストレプトアビジンの添加によって誘導される。蛍光標識されたストレプトアビジンによって、このテトラマーは、抗原特異的細胞を染色するために使用され得る。次いで、これらの細胞は、例えば、フローサイトメトリーによって容易に同定され得る。このような手順は、診断目的または予後目的のために使用され得る。この手順によって同定された細胞はまた、治療目的のために使用され得る。
【0166】
本発明のペプチドはまた、免疫リコール応答を評価するための試薬として使用され得る。(例えば、Bertoniら、J.Clin.Invest.100:503−513、1997およびPennaら、J.Exp.Med.174:1565−1570、1991を参照のこと)。例えば、HPV感染した個体由来の患者PBMCサンプルは、特定のペプチドを使用して抗原特異的CTLまたはHTLの存在について分析され得る。PBMCを培養し、本発明のペプチドで細胞を刺激することによって、単核細胞を含む血液サンプルを評価し得る。適切な培養期間の後、拡大した細胞集団が、例えば、CTLまたはHTL活性について分析され得る。
【0167】
このペプチドはまた、ワクチンの効力を評価するための試薬として使用される。免疫原と共にワクチン接種された患者から得られたPBMCは、例えば、上記の方法のいずれかを使用して分析され得る。患者は、HLA型であり、そしてその患者に存在する対立遺伝子特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬が分析のために選択される。ワクチンの免疫原性は、PBMCサンプル中のHPVエピトープ特異的CTLおよび/またはHTLの存在によって示される。
【0168】
本発明のペプチドはまた、当該分野で周知の技術を使用して、抗体を作製するために使用され得る(例えば、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY、Wiley/Greene、NY;およびAntibodies A Laboratory Manual Harlow、Harlow and Lane、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989を参照のこと)。これらは、HPV感染を診断するための試薬として有用であり得る。このような抗体は、HLA分子のコンテクストにおいてペプチドを認識する抗体(すなわち、ペプチド−MHC複合体に結合する抗体)を含む。
【0169】
IV.K.ワクチン組成物
ワクチンおよび本明細書中に記載されるような免疫原性的に有効量の1つまたは複数のペプチドを含むワクチンを調製する方法は、本発明のさらなる実施形態である。一旦適切に免疫原性エピトープが規定されると、それらは、種々の手段によって分類され、そして送達され得、本明細書中で、「ワクチン」組成物といわれる。このようなワクチン組成物としては、例えば、リポペプチド(例えば、Vitiello,A.ら、J.Clin.Invest.95:341、1995)、ポリ(DL−ラクチド−co−グリコリド)(「PLG」)マイクロスフィアにカプセル化されたペプチド組成物(例えば、Eldridgeら、Molec.Immunol.28:287−294、1991:Alonsoら、Vaccine 12:299−306、1994;Jonesら、Vaccine 13:675−681、1995を参照のこと)、免疫刺激複合体(ISCOMS)に含まれるペプチド組成物(例えば、Takahashiら、Nature 344:873−875、1990;Huら、Clin Exp Immunol.113:235−243、1998を参照のこと)、多抗原ペプチド系(MAP)(例えば、Tam,J.P.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5409−5413、1988;Tam,J.P.、J Immunol.Methods 196:17−32、1996を参照のこと)、多価ペプチドとして処方されたペプチド;弾道的(ballistic)送達システムで使用するペプチド、典型的には結晶ペプチド、ウイルス送達ベクター(Perkus,M.E.ら、Concepts in vaccine development、Kaufmann,S.H.E.,編、379頁、1996;Chakrabarti,S.ら、Nature 320:535、1986;Hu,S.L.ら、Nature 320:537、1986;Kieny,M.−P.ら、AIDS Bio/Technology 4:790、1986;Top,F.H.ら、J.Infect.Dis.124:148、1971;Chanda,P.K.ら、Virology 175:535、1990)、ウイルスまたは合成起源の粒子(例えば、Kofler,N.ら、J.Immunol.Methods.192:25、1996;Eldridge,J.H.ら、Sem.Hematol.30:16、1993;Falo,L.D.,Jr.ら、Nature Med.7:649、1995)、アジュバンド(Warren,H.S.、Vogel,F.R.、およびChedid,L.A.Annu.Rev.Immunol.4:369、1986;Gupta,R.K.ら、Vaccine 11:293、1993)、リポソーム(Reddy,R.ら、J.Immunol.148:1585、1992;Rock,K.L.、Immunol.Today 17:131、1996)、あるいは、裸cDNAまたは粒子吸収cDNA(Ulmer,J.B.ら、Science 259:1745、1993;Robinson,H.L.、Hunt,L.A.、およびWebster,R.G.、Vaccine 11:957、1993;Shiver,J.W.ら、Concepts in vaccine development、Kaufmann,S.H.E.,編、423頁、1996;Cease,K.B.、およびBerzofsky,J.A.、Annu.Rev.Immunol.12:923、1994ならびにEldridge,J.H.ら、Sem.Hematol.30:16、1993)が挙げられる。毒素標的化送達技術(レセプター媒介標的化としても公知であり、例えば、Avant Immunotherapeutics,Inc.(Needham、Massachusetts)の技術)も使用され得る。
【0170】
本発明のワクチン組成物は、核酸媒介様式を含む。1つまたは複数の本発明のペプチドをコードするDNAまたはRNAも患者に投与され得る。このアプローチは、例えば、Wolffら、Science 247:1465(1990)ならびに米国特許第5,580,859号;同第5,589,466号;同第5,804,566号;同第5,739,118号;同第5,736,524号;同第5,679,647号;国際公開第98/04720号パンフレット;および以下により詳細に記載される。DNAベースの送達技術の例には、「裸DNA」、促進された(ブピバカイン、ポリマー、ペプチド−媒介)送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介送達(「遺伝子銃」)または圧力媒介送達(例えば、米国特許第5,922,687号を参照のこと)が挙げられる。
【0171】
治療または予防免疫目的のために、本発明のペプチドはまた、ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって発現され得る。発現ベクターの例としては、弱毒化ウイルス宿主(例えば、ワクシニアまたは鶏痘)が挙げられる。このアプローチは、例えば、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしてワクシニアウイルスの使用を含む。急性または慢性感染した宿主または非感染宿主への導入の際に、組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、それによって、宿主にCTLおよび/またはHTL応答を惹起させる。ワクシニアベクターおよび免疫化プロトコルにおいて有用な方法は、例えば、米国特許第4,722,848号に記載される。別のベクターは、BCG(カルメット−ゲラン杆菌)である。BCGベクターは、Stoverら、Nature 351:456−460(1991)に記載される。本発明のペプチドの治療的投与または免疫化のために有用な広範な種々の他のベクター(例えば、アデノウイルスおよびアデノ衛星ウイルスのベクター、レトロウイルスベクター、Salmonella typhiベクター、解毒化炭疽毒素ベクターなど)は、本明細書中の説明から当業者に明らかである。
【0172】
さらに、本発明のワクチンは、特許請求されたペプチドの1つ以上の組成物を包含する。ペプチドは、ワクチン中に個々に存在し得る。あるいは、このペプチドは、同じペプチドの複数のコピーを含むホモポリマーとして、または種々のペプチドのヘテロポリマーとして存在し得る。ポリマーは、免疫学的反応の増加という利点を有し、そして異なるペプチドエピトープが、ポリマーを作り上げるために使用される場合、免疫応答について標的化された病原性生物または腫瘍関連ペプチドの異なる抗原決定基と反応する抗体および/またはCTLを誘導するさらなる能力を有する。組成物は、抗原の天然に存在する領域であり得るか、または例えば、組換えによりまたは化学合成によって調製され得る。
【0173】
本発明のワクチンと共に使用されるキャリアは、当該分野で周知であり、例えば、サイログロブリン、ヒト血清アルブミンのようなアルブミン、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸(例えば、ポリL−リジン、ポリL−グルタミン酸)、インフルエンザ、B型肝炎ウイルスコアタンパク質などが挙げられる。このワクチンは、生理学的に許容可能な(すなわち、受容可能な)希釈剤(例えば、水、または生理食塩水、好ましくはリン酸緩衝化生理食塩水)を含み得る。このワクチンはまた、典型的に、アジュバントを含む。不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはミョウバンのようなアジュバントは、当該分野で周知の材料の例である。さらに、本明細書中に記載されるように、CTL応答は、本発明のペプチドを脂質(例えば、トリパルミトイル−S−グリセリルシステイニルセリル−セリン(P3CSS))に共役することによってプライムされ得る。
【0174】
注射、エアロゾル、経口、経皮、経粘膜、胸膜腔内、鞘内または他の適切な経路を介する、本発明のペプチド組成物を用いる免疫化の際に、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な、多量のCTLおよび/またはHTLを生成することによって、ワクチンに応答する。その結果、この宿主は、後の感染に対して少なくとも部分的に免疫となるか、または進行中の慢性感染の発症に対して少なくとも部分的に耐性となるか、あるいは抗原が腫瘍関連である場合、少なくともいくつかの治療的利点を得る。
【0175】
いくつかの実施形態において、クラスIペプチド成分を、目的の標的抗原への中和抗体応答および/またはヘルパーT細胞応答を誘導するか、または促進する成分と組み合わせることが所望され得る。このような組成物の好ましい実施形態は、本発明のクラスIおよびクラスIIエピトープを含む。このような組成物の代替的実施形態は、PanDR分子、例えば、PADRE(登録商標)(Epimmune、San Diego、CA;例えば、米国特許第5,736,142号に記載される)と共に、本発明のクラスIおよび/またはクラスIIエピトープを含む。
【0176】
本発明のワクチンはまた、本発明のペプチドを提示するためのビヒクルとして、抗原提示細胞(APC)、例えば、樹状細胞(DC)を含み得る。ワクチン組成物は、樹状細胞の動員および採取に続き、インビトロで作製され得、これによって、樹状細胞の負荷がインビトロで起こる。例えば、樹状細胞は、例えば、本発明のミニ遺伝子でトランスフェクトされるか、ペプチドでパルス処理される。次いで、この樹状細胞が、インビボで免疫応答を惹起するために、患者に投与され得る。
【0177】
ワクチン組成物は、DNAベースであれペプチドベースであれ、樹状細胞の動員と組み合わせてインビボで投与し、これにより樹状細胞のインビボでの負荷が引き起こされる。
【0178】
同様に、抗原性ペプチドが、エキソビボでCTLおよび/またはHTL応答を惹起するために使用される。得られるCTLまたはHTL細胞は、治療の他の従来の形態に応答しない、または本発明の治療的ワクチンペプチドまたは核酸に応答しない患者における慢性感染または腫瘍を処置するために使用され得る。特定の抗原(例えば、感染または腫瘍関連抗原)へのエキソビボCTLまたはHTL応答は、DCなどのAPCの供給源と共に、患者の、または遺伝子的に適合性のCTLもしくはHLT前駆細胞、および適切な免疫原性ペプチドを、組織培養でインキュベートすることによって誘導される。前駆細胞が活性化され、そしてエフェクター細胞に拡張される適切なインキュベート時間(典型的には約7〜28日間)の後、これらの細胞は、患者に注入して戻され、ここで、それらは、それらの特異的標的細胞(感染した細胞または腫瘍細胞)を破壊するか、またはこれらの破壊を促進する。トランスフェクトされた樹状細胞はまた、抗原提示細胞として使用され得る。
【0179】
本発明のワクチン組成物はまた、INFγなどのような免疫アジュバントとの組合せ使用を含め、慢性ウイルス感染に対して使用される他の処置と組み合わせて使用され得る。
【0180】
好ましくは、ワクチンにおける使用のためのポリエピトープ組成物への含有のため、またはワクチンに含まれそして/またはミニ遺伝子のような核酸によってコードされる個別のエピトープを選択するためにエピトープのアレイを選択する場合、以下の原理が利用される。以下の原理の各々は、選択をなすために釣り合いを取ることが好ましい。所定のワクチン組成物に組み込まれる複数のエピトープは、エピトープから誘導されるネイティブな抗原中の配列において連続であり得るが、その必要はない。
【0181】
1.)投与の際、HBV除去と相関されることが観測されている模倣免疫応答エピトープが選択される。HLAクラスIについて、これは、HBVの少なくとも1つの抗原由来の3〜4エピトープを含む。換言すれば、自然にHBVを解消した患者においては、彼らが少なくとも1つのHBV抗原に対して少なくとも3つのエピトープに対する免疫応答を生成したことが観察された。HLAクラスIIについて、類似の原理が使用される;再び、3〜4エピトープが、少なくとも1つのHBV抗原から選択される(例えば、Rosenbergら、Science 278:1447−1450を参照のこと)。
【0182】
2.)免疫原性を相関付けされるように確立された必要な結合親和性を有するエピトープが選択される:HLAクラスIについて、500nM以下のIC50、しばしば200nM以下のIC50;およびクラスIIについて、1000nM以下のIC50。
【0183】
3.)十分なスーパーモチーフ保有ペプチド、または対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイが、広い集団適用範囲を与えるために選択される。例えば、少なくとも80%の集団適用範囲を有することが好ましい。モンテカルロ分析(当該分野で公知の統計的評価)は、集団適用範囲の広がりまたは重複性を評価するために使用され得る。
【0184】
4.)癌関連抗原からエピトープを選択する場合、アナログを選択することがしばしば有用である。なぜなら、患者は、ネイティブのエピトープに対して発達した寛容性を有し得るからである。感染性疾患関連抗原についてのエピトープを選択する場合、ネイティブのエピトープまたはアナログエピトープのいずれかを選択することが好ましい。
【0185】
5.)「入れ子型(nested)エピトープ」といわれるエピトープが特に適切である。入れ子型エピトープは、少なくとも2つのエピトープが所定のペプチド配列において重複する場合に生じる。入れ子型ペプチド配列は、HLAクラスIおよびHLAクラスIIの両方のエピトープを含み得る。入れ子型エピトープが提供される場合、配列当たり最も大きな数のエピトープを有する配列を提供することが一般的目的である。したがって、1つの形態では、ペプチドにおけるアミノ末端エピトープのアミノ末端およびカルボキシ末端エピトープのカルボキシル末端よりも長いペプチドを提供することが回避される。複数エピトープ配列(例えば、入れ子型エピトープを含む配列)が提供される場合、一般に、病理学的または他の有害な生物学的特性を有さないことを確実にするために配列をスクリーニングすることが重要である。
【0186】
6.)ポリエピトープタンパク質が作製される場合、またはミニ遺伝子を作製する場合、目的のエピトープを包含する最も小さなペプチドを作製することが目的である。この原理は、入れ子型エピトープを含むペプチドを選択する場合に使用されるものと同じでない場合に、類似する。しかし、人工のポリエピトープペプチドの場合、サイズを最小化する目的は、ポリエピトープタンパク質中のエピトープの間の任意のスペーサー配列を組み込む必要性に対して釣り合いが取られる。スペーサーアミノ酸残基は、例えば、接合部エピトープ(免疫系によって認識されるが、標的抗原に存在せず、そしてエピトープの人工並位(man−made Juxtaposition)によって作製されるのみのエピトープ)を回避するために、またはエピトープ間の切断を容易にし、それによってエピトープ提示を増強するために、導入され得る。接合部エピトープは、一般に、回避される。なぜなら、レシピエントは、非ネイティブエピトープに対する免疫応答を生成し得るからである。「優性エピトープ」である接合部エピトープが、特に関係する。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が減少されるかまたは抑制される激しい(zealous)応答を導き得る。
【0187】
7.)同一の目標タンパク質の多数の変種の配列が利用可能な場合、その保存性に基づいて可能性のあるペプチドエピトープを選択することもできる。例えば、保存性の基準は、HLAクラスI結合ペプチドの配列全体またはHLAクラスIIの9マーのコア全体が、特定のタンパク質抗原について評価される配列の指定されたパーセンテージにおいて保存されていることを規定してもよい。
【0188】
IV.K.1.ミニ遺伝子ワクチン
複数のエピトープの同時送達を可能にする多くの異なるアプローチが利用可能である。本発明のペプチドをコードする核酸は、特に有用な、本発明の実施形態である。ミニ遺伝子の封入のためのエピトープは、好ましくは、前節に記載されるガイドラインに従って選択される。本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段は、本発明の1または複数のエピトープを含むペプチドをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。
【0189】
複数エピトープミニ遺伝子の使用は、以下および例えば、同時係属出願中の米国特許出願第09/311,784号;Ishiokaら、J.Iminunol.162:3915−3925、1999;An,L.およびWhitton,J.L.、J.Virol.71:2292、1997;Thomson,S.A.ら、J.Immunol.157:822、1996;Whitton,J.L.ら、J.Virol.67:348、1993;Hanke,R.ら、Vaccine 16:426、1998に記載される。例えば、1種または複数のHBV抗原の複数の領域由来のスーパーモチーフ保有エピトープおよび/またはモチーフ保有エピトープをコードする複数エピトープDNAプラスミド、万能(universal)ヘルパーT細胞エピトープ、例えばPADRE(登録商標)(またはHBV抗原由来の複数のHTLエピトープ)、および小胞体−転位シグナル配列が操作され得る。ワクチンは他のTAAに由来するエピトープを含んでもよい。
【0190】
多エピトープミニ遺伝子の免疫原性は、試験されるエピトープに対するCTL誘導応答の大きさを評価するために、トランスジェニックマウスにおいて試験され得る。さらに、インビボでのDNAコードエピトープの免疫原性は、DNAプラスミドでトランスフェクトされた標的細胞に対する特定のCTL系統のインビトロ応答と相関され得る。従って、これらの実験は、ミニ遺伝子が、1.)CTL応答を生成すること、そして2.)誘導されたCTLが、コードされたエピトープを発現する細胞を認識することの両方に役立つということを示し得る。
【0191】
例えば、ヒト細胞における発現のための選択されたエピトープ(ミニ遺伝子)をコードするDNA配列を作製するために、これらのエピトープのアミノ酸配列を逆転写し得る。ヒトコドン使用頻度表を使用して、各アミノ酸についてのコドン選択を導き得る。これらのエピトープコードDNA配列は、翻訳された場合に、連続的なポリペプチド配列が作製されるように、直接的に隣接され得る。発現および/または免疫原性を最適化するために、さらなるエレメントが、そのミニ遺伝子設計に組み込まれ得る。逆転写され得、そしてそのミニ遺伝子配列に含まれ得るアミノ酸配列の例としては、以下が挙げられる:HLAクラスIエピトープ、HLAクラスIIエピトープ、ユビキチン化シグナル配列および/または小胞体ターゲッティングシグナル。さらに、CTLエピトープおよびHTLエピトープのHLA提示は、そのCTLエピトープまたはHTLエピトープに隣接する、合成の(例えば、ポリアラニン)または天然に存在する隣接配列を含むことによって改変され得;そのエピトープを含むこれらのより大きいペプチドは、本発明の範囲内にある。
【0192】
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子の+鎖および−鎖をコードするオリゴヌクレオチドをアセンブルすることによってDNAに変換され得る。重複オリゴヌクレオチド(30〜100塩基長)が、周知技術を使用して適切な条件下で、合成、リン酸化、精製およびアニーリングされ得る。これらのオリゴヌクレオチドの末端は、例えば、T4 DNAリガーゼを使用して連結され得る。次いで、エピトープポリペプチドをコードする、この合成ミニ遺伝子は、所望の発現ベクターにクローニングされ得る。
【0193】
好ましくは、当業者に周知の標準的な調節配列が、標的細胞における発現を確実にするためにベクターに含まれる。以下のいくつかのベクターエレメントが所望される:ミニ遺伝子挿入物のための下流クローニング部位を含むプロモーター;効率的な転写終結のためのポリアデニル化シグナル;E.coli複製起点;およびE.coli選択マーカー(例えば、アンピシリン耐性またはカナマイシン耐性)。多くのプロモーター(例えば、ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)プロモーター)が、この目的に使用され得る。他の適切なプロモーター配列については、例えば、米国特許第5,580,859号および米国特許第5,598,466号を参照のこと。
【0194】
さらなるベクター改変が、ミニ遺伝子の発現および免疫原性を最適化するために所望され得る。いくつかの場合において、イントロンが、効率的な遺伝子発現に必要とされ、そして1以上の合成イントロンまたは天然に存在するイントロンが、ミニ遺伝子の転写される領域に組み込まれ得る。mRNA安定化配列および哺乳動物細胞における複製のための配列の包含もまた、ミニ遺伝子発現を増大するために考慮され得る。
【0195】
一旦、発現ベクターを選択すると、ミニ遺伝子を、プロモーターの下流のポリリンカー領域内にクローニングする。このプラスミドを、適切なE.coli株に形質転換し、そしてDNAを、標準的な技術を使用して調製する。ミニ遺伝子の方向およびDNA配列、ならびにベクターに含まれる他の全てのエレメントは、制限マッピングおよびDNA配列分析を使用して確認される。正しいプラスミドを保有する細菌細胞は、マスター(master)細胞バンクおよびワーキング(working)細胞バンクとして保存される。
【0196】
さらに、免疫刺激配列(ISSまたはCpG)は、DNAワクチンの免疫原性において役割を果たすようである。これらの配列は、免疫原性の増強が所望される場合に、そのベクター中のミニ遺伝子コード配列の外側に含まれ得る。
【0197】
いくつかの実施形態において、ミニ遺伝子コードエピトープおよび第2のタンパク質(免疫原性を増強または減少するために含まれる)の両方の産生を可能にする、二シストロン性(bi−cistronic)発現ベクターが使用され得る。同時発現される場合に免疫応答を有利に増強し得るタンパク質またはポリペプチドの例としては、サイトカイン(例えば、IL−2、IL−12、GM−CSF)、サイトカイン誘導分子(例えば、LeIF)、または同時刺激分子が挙げられる。ヘルパー(HTL)エピトープは、細胞内ターゲッティングシグナルに結合され得、そして発現されるCTLエピトープとは別々に発現され;これは、CTLエピトープとは異なる、HTLエピトープの細胞区画への指向を可能にする。必要ならば、これは、HLAクラスII経路へのHTLエピトープのより効率的な進入を促進し得、これによって、CTL誘導を改善する。HTL誘導またはCTL誘導とは対照的に、免疫抑制分子(例えば、TGF−β)の同時発現によって免疫応答を特異的に減少することが、特定の疾患において有利であり得る。
【0198】
治療量のプラスミドDNAは、例えば、E.coli中での発酵、その後の精製によって生成され得る。ワーキング細胞バンク由来のアリコートを使用して、培養培地に播種し、そして周知技術に従って、シェーカーフラスコまたはバイオリアクター中で飽和になるまで増殖させる。プラスミドDNAを、標準的なバイオ分離技術(例えば、QIAGEN,Inc.(Valencia、California)によって供給される固相陰イオン交換樹脂)を使用して精製し得る。必要ならば、スーパーコイルDNAを、ゲル電気泳動または他の方法を使用して、開環形態および線状形態から単離し得る。
【0199】
精製プラスミドDNAは、種々の処方物を使用して、注入用に調製され得る。これらの最も単純なものは、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中での凍結乾燥化DNAの再構成である。このアプローチ(「裸DNA」としても知られる)は、臨床試験において筋内(IM)投与のために現在使用されている。ミニ遺伝子DNAワクチンの免疫治療効果を最大化するために、精製プラスミドDNAを処方するための代替的方法が望ましくあり得る。種々の方法が記載されており、そして新しい技術が利用可能になるかもしれない。カチオン性脂質もまた、処方物中で使用され得る(例えば、国際公開第93/24640号パンフレット;ManninoおよびGould−Fogerite、BioTechniques 6(7):682(1988);米国特許第5,279,833号;国際公開第91/0630924640号パンフレット;およびFelgnerら、Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 84:7413(1987)に記載されるような)。さらに、糖脂質、融合誘導(fusogenic)リポソーム、ペプチドおよび化合物(まとめて、保護的、相互作用的、非凝縮化合物(PINC)と呼ばれる)もまた、精製プラスミドDNAに複合体化され得、安定性、筋内分散、または特定の器官または細胞型に対する輸送のような変数に影響する。
【0200】
標的細胞の感作が、ミニ遺伝子コードCTLエピトープの発現およびHLAクラスI提示についての機能的アッセイとして使用され得る。例えば、プラスミドDNAが、標準的なCTLクロム放出アッセイについての標的として適切である哺乳動物細胞系統に導入される。使用されるトランスフェクション方法は、最終処方物に依存する。エレクトロポレーションは、「裸」DNAのために使用され得、一方、カチオン性脂質が、直接的なインビトロトランスフェクションを可能にする。グリーン蛍光タンパク質(GFP)を発現するプラスミドを同時トランスフェクトして、細胞自動解析分離装置(FACS)を使用する、トランスフェクトした細胞の富化を可能にし得る。次いで、これらの細胞を、クロム51(51Cr)標識し、そしてエピトープ特異的CTL系統についての標的細胞として使用し;51Cr放出によって検出される細胞溶解が、ミニ遺伝子コードCTLエピトープの産生およびHLA提示の両方を示す。
【0201】
インビボ免疫原性は、ミニ遺伝子DNA処方物の機能的試験のための第2のアプローチである。適切なヒトHLAタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを、このDNA産物で免疫する。投与の用量および経路は、処方物依存性である(例えば、PBS中のDNAについてはIM、脂質複合体化DNAについては腹腔内(IP))。免疫後21日で、脾細胞を収集し、試験する各エピトープをコードするペプチドの存在下で1週間再刺激する。その後、CTLエフェクター細胞について、標準的な技術を使用して、ペプチドがロードされた51Cr標識標的細胞の細胞溶解についてのアッセイを行う。ミニ遺伝子コードエピトープに対応するペプチドのHLA担持によって感作された標的細胞の溶解は、CTLのインビボ誘導についてのDNAワクチン機能を実証する。HTLエピトープの免疫原性は、類似の様式でトランスジェニックマウスにおいて評価される。
【0202】
あるいは、核酸は、例えば、米国特許第5,204,253号に記載されるような、弾道的送達を使用して投与され得る。この技術を使用して、DNAのみから構成される粒子が投与される。さらなる代替的実施形態において、DNAは、粒子(例えば、金粒子)に接着され得る。
【0203】
ミニ遺伝子はまた、当技術分野で知られている他のバクテリアまたはウイルス送達システムを用いて送達することも可能であり、例えば、本発明のエピトープをコードする発現構築物をワクシニアなどのウイルス性ベクターに組み込むことができる。
【0204】
IV.K.2.CTLペプチドとヘルパーペプチドとの組合せ
本発明のCTLペプチドを含むワクチン組成物は、所望の特性、例えば、改善された血清半減期、拡大された集団適用範囲、または増強された免疫原性を提供するように改変され得る。
【0205】
例えば、CTL活性を誘導するペプチドの能力は、Tヘルパー細胞応答を誘導し得る少なくとも1つのエピトープを含む配列にペプチドを連結させることによって増強され得る。免疫原性を増強するためのCTLエピトープと組み合わせたTヘルパーエピトープの使用は、例えば、同時係属中の米国特許出願第08/820360号、米国特許出願第08/197,484号、および米国特許出願第08/464,234号に例示される。
【0206】
CTLペプチドエピトープは、Tヘルパーペプチドに直接連結され得るが、しばしば、CTLエピトープ/HTLエピトープ結合体は、スペーサー分子に連結される。スペーサーは、典型的に、比較的小さい、中性の分子(例えば、アミノ酸またはアミノ酸模倣物)からなり、これらは、生理学的条件下で実質的に非荷電性である。スペーサーは、典型的には、例えば、Ala、Glyあるいは非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意に存在するスペーサーは、必ずしも同じ残基からなる必要はなく、したがって、ヘテロオリゴマーであっても、ホモオリゴマーであってもよいことが理解される。スペーサーは、存在する場合、通常、少なくとも1残基または2残基であり、より通常は、3〜6残基であり、場合によっては10残基以上である。CTLペプチドエピトープは、CTLペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、直接的にまたはスペーサーを介してのいずれかで、Tヘルパーペプチドエピトープに連結され得る。免疫原性ペプチドまたはTヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端は、アシル化され得る。
【0207】
特定の実施形態において、Tヘルパーペプチドは、その集団の大部分で存在するTヘルパー細胞によって認識されるペプチドである。これは、多くの、ほとんどの、または全てのHLAクラスII分子に結合するペプチドを選択することによって達成され得る。これらは、「ゆるやかに(loosely)HLA拘束された」または「不規則な(promiscuous)」Tヘルパー配列として知られる。不規則なアミノ酸配列の例としては、以下のような抗原由来の配列が挙げられる:破傷風トキソイドの830〜843位(QYIKANSKFIGITE;配列番号51484)、Plasmodium falciparum スポロゾイト周囲(CS)タンパク質の378〜398位(DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS;配列番号51485)およびStreptococcus 18kDタンパク質の116位(GAVDSILGGVATYGAA;配列番号51486)。他の例としては、DR 1−4−7スーパーモチーフ、またはDR3モチーフのいずれかを保有するペプチドが挙げられる。
【0208】
あるいは、天然に見い出されないアミノ酸配列を使用して、ゆるやかなHLA拘束様式で、Tヘルパーリンパ球を刺激し得る合成ペプチドを調製し得る(例えば、国際公開第95/07707号パンフレットを参照のこと)。汎DR結合(pan−DR binding)エピトープと呼ばれるこれらの合成化合物(例えば、PADRE(登録商標)、Epimmune,Inc.、San Diego、CA)は、最も好ましくは、ほとんどのHLA−DR(ヒトHLAクラスII)分子を結合するように設計される。例えば、式:aKXVAAWTLKAAa(ここで、「X」は、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニンまたはチロシンのいずれかであり、そしてaは、D−アラニンまたはL−アラニンのいずれかである)を有する、汎DR結合エピトープペプチドは、ほとんどのHLA−DR対立遺伝子に結合し、そしてほとんどの個体由来(それらのHLA型に拘わらず)のTヘルパーリンパ球の応答を刺激することが見い出されている。汎DR結合エピトープの代替物は、全て「L」天然アミノ酸を含み、そしてこのエピトープをコードする核酸の形態で提供され得る。
【0209】
HTLペプチドエピトープはその生物学的特性を変えるためにも改変され得る。例えば、D−アミノ酸を含有してプロテアーゼ抵抗性を増大させてその血清半減期を延長させることが可能であり、脂質、タンパク質や炭水化物などの他の分子と結合させてその生物学的活性を増大させることもできる。例えば、Tヘルパーペプチドは、1個または複数のパルミチン酸鎖とアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれでも結合させ得る。
【0210】
III.K.3.CTLペプチドとT細胞プライム剤との組合せ
いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物中に、細胞傷害性Tリンパ球をプライムする(prime)少なくとも1つの成分を含むことが望ましくあり得る。脂質は、ウイルス抗原に対してCTLをインビボでプライムし得る因子として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、リジン残基のε−アミノ基およびα−アミノ基に結合され得、次いで、例えば、Gly、Gly−Gly−、Ser、Ser−Serなどのような1以上の連結残基を介して、免疫原性ペプチドに連結され得る。次いで、この脂質化ペプチドは、ミセルまたは粒子のいずれかで直接的に投与され得るか、リポソーム内に組み込まれ得るか、またはアジュバント(例えば、不完全フロイントアジュバント)中で乳化され得る。好ましい実施形態において、特に効果的な免疫原性組成物は、Lysのε−アミノ基およびα−アミノ基に結合されたパルミチン酸を含み、これは、その免疫原性ペプチドのアミノ末端に連結(例えば、Ser−Ser)を介して結合される。
【0211】
CTL応答をプライムする脂質の別の例として、E.coliリポタンパク質(例えば、トリパルミトイル−S−グリセリルステイニルセリル−セリン(P3CSS))が、適切なペプチドに共有結合された場合にウイルス特異的CTLをプライムするために使用され得る(例えば、Deresら、Nature 342:561、1989を参照のこと)。本発明のポリペプチドは、例えば、P3CSSに結合され得、そしてこのリポペプチドが、個体に投与され、標的抗原に対するCTL応答を特異的にプライムし得る。さらに、中和抗体の誘導もまた、P3CSS結合体化エピトープでプライムされ得るので、2つのこのような組成物を組み合わせて、体液性応答および細胞性応答の両方をより効果的に誘発し得る。
【0212】
CTLペプチドおよび/またはHTLペプチドはアミノ酸がペプチドの末端に付加され、ペプチドの互いの容易な連結、キャリア支持体またはより大きいペプチドへの結合、ペプチドまたはオリゴペプチドの物理的特性または化学的特性の改変などを提供し得る。チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸などのアミノ酸が、ペプチドまたはオリゴペプチド(特に、クラスIペプチド)のC末端またはN末端に導入され得る。しかし、いくつかの場合において、CTLエピトープのカルボキシル末端での改変は、ペプチドの結合特性を変更し得ることに留意すべきである。さらに、ペプチドまたはオリゴペプチド配列は、末端NH2アシル化(例えば、アルカノイル(C1〜C20)アセチル化またはチオグリコリルアセチル化)、末端カルボキシルアミド化(例えば、アンモニア、メチルアミンなど)によって改変されることによって、天然の配列とは異なり得る。いくつかの例において、これらの改変は、支持体または他の分子に連結するための部位を提供し得る。
【0213】
IV.K.4.CTLペプチドおよび/またはHTLペプチドをパルスしたDCを含むワクチン組成物
本発明のワクチン組成物の実施形態は、患者の血液由来のPBMC(またはそこから単離されたDC)へのエピトープ保有ペプチドのカクテルのエキソビボ投与を包含する。DCの収集を容易にするための医薬(例えば、Progenipoietin(登録商標)(Monsanto、St.Louis、MO)またはGM−CSF/IL−4)が使用され得る。ペプチドでのDCのパルス後および患者への再注入の前に、DCを洗浄し、結合されなかったペプチドを除去する。この実施形態において、ワクチンは、ペプチドをパルスしたDCを含み、このペプチドをパルスしたDCは、その表面上でHLA分子と複合体化された、そのパルスされたペプチドエピトープを提示する。
【0214】
DCはエキソビボでペプチドカクテル(そのうちのいくつかが、目的の1種または複数のHBV抗原に対するCTL応答を刺激する)によってパルスすることもできる。場合によっては、PADREファミリー分子などのヘルパーT細胞(HTL)ペプチドを、CTL応答を容易にするために包含することもできる。したがって、好ましくは複数HBV抗原からのエピトープを含む本発明によるワクチンは、HBV感染の治療に用いることができる。
【0215】
IV.L.治療目的または予防目的のためのワクチンの投与
本発明のペプチドならびに本発明の薬学的組成物およびワクチン組成物は、典型的には、HBV感染を処置および/または予防するために用いることができる。本発明のペプチドを含むワクチン組成物は、HBVに感染した患者、あるいはHBV感染に感受性の個体またはそうでなければHBV感染の危険性がある個体に投与され、HBV抗原に対する免疫応答を誘発し、したがって、患者自身の免疫応答能力を増強する。
【0216】
本明細書に記載するように、本発明のCTLエピトープおよび/またはHTLエピトープを含むペプチドは、HLA分子によって提示され、そしてそのペプチドに含まれるエピトープに特異的なCTLまたはHTLを接触された場合に、免疫応答を誘発する。このペプチド(またはそれらをコードするDNA)は個々に投与され得るし、1種または複数のペプチド配列の融合体として投与することもできる。ペプチドがCTLまたはHTLを接触される様式は、本発明に重要ではない。例えば、このペプチドは、インビボまたはインビトロのいずれかでCTLまたはHTLを接触され得る。その接触がインビボで生じる場合、ペプチド自体が患者に投与され得るか、他のビヒクル(例えば、1種または複数のペプチドをコードするDNAベクター、ペプチドをコードするウイルスベクター、リポソームなど)が、本明細書に記載のように、使用され得る。
【0217】
ペプチドがインビトロで接触される場合、ワクチン接種薬剤は、細胞の集団(例えば、ペプチドをパルスした樹状細胞、HPV−特異的CTL(これは、このペプチドをインビトロで抗原提示細胞にパルスすることにより、または抗原提示細胞を本発明のミニ遺伝子でトランスフェクトさせることにより誘導された)を含み得る。このような細胞集団は、その後、治療的有効用量で患者に投与される。
【0218】
治療適用において、ペプチド組成物および/または核酸組成物は、ウイルス抗原に対する効果的なCTLおよび/またはHTL応答を誘発するのに、ならびに症状および/または合併症を治癒または少なくとも部分的に阻止または遅延するのに十分な量で患者に投与される。このことを達成するための十分な量は、「治療的有効用量」として定義される。この用途のために効果的な量は、例えば、投与される特定の組成物、投与の形態、処置される疾患の段階および重篤度、患者の体重および一般的な健康状態、ならびに処方する医師の判断に依存する。
【0219】
薬学的組成物のために、本発明の免疫原性ポリペプチド、またはそれらをコードするDNAは、一般に、HBVに既に感染した患者に投与される。これらのペプチドまたはそれらをコードするDNAは、個々で投与され得るか、または1以上のペプチド配列の融合体として投与され得る。HBV感染した患者は、それらの免疫原性ペプチドで別々に処置されるか、または他の処置と適切に組み合わせて処置され得る。
【0220】
治療的用途のために、投与は、一般に、HBV感染の最初の診断で開始すべきである。この後に、少なくとも症状が実質的に寛解されるまで、およびその後の期間の間で、追加免疫用量を行う。患者に送達するためのワクチン組成物の実施形態(すなわち、ペプチドカクテル、ポリエピトープポリペプチド、ミニ遺伝子、またはHBV特異的CTLもしくはパルスした樹状細胞などの実施形態を含むがこれらに限定されない)は、病気の段階や患者の健康状態によって変わり得る。例えば、慢性HBV感染の患者においては、HBV特異的CTLを含むワクチンが、代替的実施形態よりもHBV感染細胞を殺すのにより有効であろう。
【0221】
感受性の個体が、感染前または感染中に同定される場合、その組成物を、それらの個体に標的化し得、これにより、より大きい集団への投与の必要性を最小化する。
【0222】
HBV感染の処置または予防のために使用されるペプチドもしくは他の組成物は、例えば、疾患の明らかな症状を有しない者において使用され得る。この文脈において、細胞傷害性T細胞応答を有効的に刺激するのに十分な投与の様式により送達される量のペプチドエピトープを提供することが一般的に重要であり、ヘルパーT細胞応答を刺激する組成物もまた、本発明のこの実施形態に従って与えられ得る。
【0223】
初期の治療的免疫化のための投薬量は、単位投薬量範囲において一般的に生じ、ここで、そのより低い値は約1、5、50、500または1000μgであり、そしてより高い値は、約10,000;20,000;30,000;または50,000μgである。ヒトに対する投薬量値は、典型的に、70kgの患者につき、約500μg〜約50,000μgの範囲に渡る。数週間〜数カ月に渡るブースト養生法に従う、約1.0μg〜約50,000μgの間のペプチドのブースター投薬量は、患者の血液から得られるCTLおよびHTLの比活性を測定することにより決定される患者の応答および状態に依存して投与され得る。投与は、少なくとも臨床的症状または実験室の試験が、そのウイルス感染が除去されるか、または低減されることを示すまでおよびその後の一定期間の間継続すべきである。投薬量、投与経路および用量スケジュールは、当該分野において公知の方法論に従って調整される。
【0224】
ある実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、重篤な疾患状態(すなわち、生命を脅かす状況または潜在的に生命を脅かす状況)において使用され得る。そのような場合において、本発明の好ましい組成物における最小量の外来基質および相対的非毒性のペプチドの結果として、これらの規定された投薬量に対して、実質的に過剰なこれらのペプチド組成物を投与することが可能であり、そして治療医師により所望されると感じられ得る。
【0225】
本発明のワクチン組成物はまた、予防薬剤として純粋に使用され得る。一般に、初回の予防免疫のための用量は、一般に、単位投薬範囲にあり、低い値で、約1、5、50、500または1000μg、そして高い値で、約10,000;20,000;30,000;または50,000μgである。ヒトについての投薬値は、典型的に、70キログラム患者当たり、約500μg〜約50,000μgの範囲である。これに続いて、ワクチンの初回投与後、約4週間〜6カ月の規定された間隔で投与される約1.0μg〜約50,000μgの間のペプチドのブースター投薬量で追加免疫する。このワクチンの免疫原性は、患者の血液のサンプルから得たCTLおよびHTLの比活性を測定することによって評価され得る。
【0226】
治療処置のための薬学的組成物は、非経口投与、局所的投与、経口投与、髄腔内投与または局所(例えば、クリームまたは局所用軟膏)投与のために意図される。好ましくは、この薬学的組成物は、非経口的(例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内)に投与される。従って、本発明は、非経口投与のための組成物を提供し、この組成物は、受容可能なキャリア(好ましくは、水性キャリア)に溶解されているか、または懸濁されている免疫原性ペプチドの溶液を含む。種々の水性キャリア(例えば、水、緩衝化水、0.8%生理食塩水、0.3%グリシン、ヒアルロン酸など)が使用され得る。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。得られた水溶液は、そのままかもしくは凍結乾燥された状態での使用のために包装され得、凍結乾燥された調製物は、投与の前に滅菌溶液と合わせられる。これらの組成物は、生理学的状態に近づけるために必要とされる場合、薬学的に受容可能な補助物質(例えば、pH調節剤および緩衝化剤、張度調節剤、湿潤剤、防腐剤など(例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレアートなど))を含み得る。
【0227】
薬学的処方物中の本発明のペプチドの濃度は、広範に変動し得(すなわち、約0.1質量%未満(通常は約2重量%もしくは少なくとも約2質量%)から20質量%〜50質量%以上と同程度まで)、そして選択された投与の特定様式に従って、主に流体容量、粘性などによって選択される。
【0228】
ヒト単位用量形態のペプチド組成物は、ヒト単位用量の受容可能なキャリア、好ましくは水性キャリアを含む薬学的組成物内に代表的に含まれて、そしてヒトに対してそのような組成物を投与するために使用されることが当業者に公知である一定容量の流体において投与される(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第17版、A.Gennaro、Editor、Mack Publishing Co.、Easton、Pennsylvania、1985を参照のこと)。
【0229】
本発明のペプチド、および/またはこのペプチドをコードする核酸はまた、リポソームを介して投与され得、このリポソームはまた、特定の組織(例えば、リンパ組織)に対してペプチドを標的とするためか、または感染細胞に対して選択的に標的とするため、およびペプチド組成物の半減期を増加するために役立ち得る。リポソームとしては、エマルジョン、泡沫、ミセル、不溶性単分子膜、液晶、リン脂質分散系、ラメラ層(lamellar layer)などが挙げられる。これらの調製物において、送達されるべきペプチドは、単独でか、もしくはリンパ系細胞の一般的なレセプターと結合する分子(例えば、CD45抗原に結合するモノクローナル抗体)と共にか、または他の治療組成物もしくは免疫原性組成物と共にリポソームの一部として取り込まれる。従って、本発明の所望のペプチドで満たされているか、または装飾されているかのいずれかのリポソームは、リンパ系細胞の部位に指向され得、次いで、ここで、そのリポソームは、そのペプチド組成物を送達する。本発明の使用のためのリポソームが、標準的なベシクル形成脂質から形成され、そのベシクル形成脂質としては、一般的に中性リン脂質および負電荷リン脂質ならびにステロール(例えば、コレステロール)が挙げられる。脂質の選択は、例えば、リポソームサイズ、血流におけるリポソームの酸不安定性および酸安定性を考慮して、一般的に導かれる。例えば、Szokaら、Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)および米国特許第4,235,871号、同第4,501,728号、同第4,837,028号、および同第5,019,369号に記載されるように、リポソームを調製するための種々の方法が利用可能である。
【0230】
免疫系の細胞を標的とするために、リポソーム内に組み込まれるべきリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に対して特異的な抗体またはそのフラグメントを含み得る。ペプチドを含むリポソーム懸濁物は、とりわけ、投与の様式、送達されるペプチド、および処置される疾患の段階に従って変動する用量において、静脈内に、局所に(locally)、局所的(topically)などにおいて投与され得る。
【0231】
固体組成物のために、従来の非毒性固体キャリアが使用され得、そのキャリアとしては、例えば、薬学的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。経口投与のために、薬学的に受容可能な非毒性組成物は、通常使用される任意の賦形剤(例えば、上記に列挙されたそれらのキャリア)、および一般的に10〜95%の活性成分(すなわち、本発明の1つ以上のペプチド、およびより好ましくは25%〜75%の濃度にて)を取り込むことによって形成される。
【0232】
エアロゾル投与のために、免疫原性ペプチドが、界面活性剤および噴霧剤と共に微細に分割された形態で好ましくは提供される。ペプチドの代表的な割合は、0.01質量%〜20質量%であり、好ましくは1質量%〜10質量%である。この界面活性剤は、当然ながら、非毒性でなければならず、そして好ましくは、噴霧剤に可溶性である。そのような薬剤の代表的なものは、6〜22個の炭素原子を含む、脂肪酸のエステルまたは部分エステル(例えば、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物とカプロン酸、オクタン酸、ラウリル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン(olesteric)酸およびオレイン酸との)である。混合エステル(例えば、混合グリセリドまたは天然グリセリド)が使用され得る。この界面活性剤は、組成物の0.1質量%〜20質量%、好ましくは0.25〜5質量%を構成し得る。組成物の残りは、通常、噴霧剤である。キャリアもまた、所望される場合、例えば、鼻腔内送達のためにレシチンと共に含まれ得る。
【0233】
IV.M.キット
本発明のペプチドおよび核酸組成物は、ワクチン投与のための指示と共にキット中で提供され得る。典型的には、そのキットは、容器中の、好ましくは、単位用量形態の所望のペプチド組成物および投与についての指示書を含む。別のキットは、投与についての指示書と共に、好ましくは、単位用量形態で容器中に本発明の所望の核酸を有するミニ遺伝子構築物を含む。IL−2またはIL−12などのリンホカインはまた、そのキットに含まれ得る。また所望され得る他のキット構成成分としては、例えば、滅菌シリンジ、ブースター投薬、および他の所望の賦形剤が挙げられる。
【0234】
本発明のエピトープを使用して成功裡に免疫応答を誘導した。これらのエピトープによる免疫応答はエピトープを様々な形態で投与することにより誘導された。エピトープはペプチドとして、核酸として、そして本発明のエピトープをコードする核酸を含むウイルス性ベクターとして投与された。ペプチドに基づいたエピトープ形式の投与に際しては、空のHLA分子上にエピトープの直接に負荷することにより免疫応答が誘導され、エピトープのインターナリゼーションおよびHLAクラスI経路を通じたプロセシングによって細胞上で発現された;いずれにしても、エピトープを発現するHLA分子は、次いで、CTL応答と相互作用し、CTL応答を誘導することができた。ペプチドは直接またはリポソームなどの薬剤を使用して送達することができる。それらはさらに、弾道的送達(典型的にはペプチドは結晶の形式である)を使用して送達することができる。DNAが免疫応答を誘導するために使用される場合、それは裸DNAとして一般におよそ1〜5mgの服用量範囲で、または弾道的「遺伝子銃」送達によって典型的にはおよそ10〜100μgの服用量範囲で投与される。DNAは様々な形態、例えば、線形、環状などで送達することができる。本発明に従ってエピトープをコードする核酸を含む、様々なウイルスのベクターが成功裡に使用された。
【0235】
したがって、本発明の組成物はいくつかの形式で存在する。本発明のこれらの組成物形式の各々の実施形態は、免疫応答を誘導するために成功裡に使用された。
【0236】
本発明の1つの組成物は多くのペプチドを含む。この複数すなわちペプチドカクテルは、一般に1種または複数の薬学的に許容可能な賦形剤と混合される。ペプチドカクテルは、同じペプチドの複数のコピーを含むことができるし、またはペプチドの混合物を含むことができる。ペプチドは天然に存在するエピトープのアナログであり得る。ペプチドは人工のアミノ酸および/または表面活性分子の付加(脂質化、アセチル化、糖鎖形成、ビオチン化、リン酸化など)のような化学的改変を含むことができる。ペプチドはCTLエピトープまたはHTLエピトープであり得る。好ましい実施形態では、ペプチドカクテルが多くの異なるCTLエピトープおよび少なくとも1つのHTLエピトープを含む。HTLエピトープは、天然のまたは非天然の(例えばPADRE(登録商標)(Epimmune Inc.、San Diego、CA))であり得る。本発明の実施例中の別個のエピトープの数は、一般に1〜150までの全体の単位整数である(例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、96、97、98、99、100または150)。
【0237】
本発明の組成物のさらなる実施形態は、ポリペプチド複数エピトープ構築物、つまりポリエピトープペプチドを含む。本発明のポリエピトープペプチドは、当技術分野においてよく知られた技術の使用によって調製される。知られた技術の使用によって、本発明のエピトープは互いに連結される。ポリエピトープペプチドは線形でもよいし非線形(例えば、多価)でもよい。これらのポリエピトープな構築物は、人工のアミノ酸、離隔用すなわちスペーサーアミノ酸、隣接(flanking)アミノ酸、または隣接したエピトープユニット間の化学的改変を含むことができる。ポリエピトープな構築物は、へテロポリマーでもホモポリマーでもよい。ポリエピトープな構築物は、一般に2〜150(例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、または150)の間の任意の全体の単位整数の数量であり得る。ポリエピトープな構築物は、CTLおよび/またはHTLエピトープを含むことができる。構築物中の1つ以上エピトープは改変、例えば、表面活性材料(例えば脂質)の追加によって、または化学的改変(例えばアセチル化など)されることができる。さらに、複数エピトープ構築物中の結合は、ペプチド結合以外のもの(例えば共有結合、エステル結合、エーテル結合、ジスルフィド結合、水素結合、イオン結合など)であり得る。
【0238】
あるいは、本発明の組成物は、ネイティブな配列に相同性(つまり、それと一致するか接触する)を有するアミノ酸の連続、配列、伸張などを含む構築物を含む。アミノ酸のこの伸張は、アミノ酸の少なくとも1つのアミノ酸部分配列であって、アミノ酸のより長いシリーズから開裂または分離された場合に、本発明に従ってHLAクラスIまたはHLAクラスIIエピトープとして機能する配列を含む。この実施形態では、ペプチド配列は、当技術分野で知られているか提供される多くの使用によって、ここに定義されるような構築物となるように改変される。ポリエピトープな構築物、70〜100%(例えば70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100パーセント)からの任意の全体の単位整数インクリメントにネイティブな配列への相同性を含むことができる。
【0239】
本発明の組成物のさらなる実施形態は、本発明の1つ以上エピトープを含む抗原提示細胞である。抗原提示細胞は樹状細胞のような細胞を示す「プロフェッショナルな」抗原であり得る。抗原提示細胞は、当技術分野において知られているまたは決定された任意の手段によって本発明のエピトープを含むことができる。そのような手段は、1つ以上の個々のエピトープにより、または多数のエピトープを含む1つ以上のペプチドにより樹状細胞のパルスすることを含み、弾道的核酸送達などの核酸投与によって、または核酸を投与するための当技術分野の他の技術(ベクターに基づく(例えばウイルスのベクター)核酸の送達を含む)による。
【0240】
本発明の組成物のさらなる実施形態は、本発明の1つ以上のペプチドをコードする核酸、または本発明のポリエピトープペプチドをコードする核酸を含む。当業者には理解されるように、様々な核酸組成物は、遺伝暗号の冗長性により同一のペプチドをコードする。これらの核酸組成物の各々は本発明の範囲内となる。本発明のこの実施形態はDNAまたはRNAを含み、そしてある実施形態においては、DNAとRNAの組合せを含む。本発明のペプチドをコードする核酸を含む任意の組成物または本発明の他の任意のペプチドに基づく組成物も本発明の範囲以内にあることが理解されるべきである。
【0241】
本発明のペプチドに基づく形式は(それらをコードする核酸と同様に)、当技術分野において知られているか将来知られる原理を使用して生成された本発明のエピトープのアナログを含むことができる。アナログ化と関係する原理は、現在、当技術分野の中で知られており、ここに開示される;さらに、アナログ化する原理(ヘテロクリティック(heteroclitic)アナログ化)は、1999年1月6日に出願され共に係属しているU.S.S.N.09/226,775に開示される。一般に、本発明の組成物は分離されるか精製される。
【0242】
(V.実施例)
本発明は、特定の実施例によってより詳細に記載される。以下の実施例は、例示的な目的について提供され、そして、いずれの方法においても本発明を制限することを意図するものではない。当業者は、本発明に従って、種々の重要でないパラメーターが、別の実施形態を生じるように変化され得るかまたは改変され得ることを容易に理解する。
【0243】
実施例1:HLAクラスIおよびクラスII結合アッセイ
HLA分子に結合するペプチドの以下の実施例は、HLAクラスIおよびクラスIIペプチドの結合親和性の定量を示す。結合アッセイは、モチーフ保有であるかまたはモチーフ保有でないかのどちらかであるペプチドを使用して実施し得る。
【0244】
細胞溶解物は、開示されたプロトコル(Sidneyら、Current Protocols in Immunology 18.3.1(1998);Sidneyら、J.Immunol.154:247(1995);Setteら、Mol.Imunol.31:813(1994))に従って調製し、また、HLA分子が精製された。HLA分子の源として使用される細胞系、および、細胞溶解物からのHLA分子の抽出のために使用された抗体も、これらの刊行物に記載される。
【0245】
エプスタイン−バーウイルス(EBV)で形質転換したホモ接合性細胞系統、線維芽細胞、CIR、または721.221形質転換体を、HLAクラスI分子の供給源として使用する。これらの細胞は、2mMLグルタミン(GIBCO、Grand Island、NY)、50μM 2−ME、100μg/mlストレプトマイシン、100U/mlペニシリン(Irvine Scientific)および10%の加熱不活性化されたFCS(Irvine Scientific、Santa Ana、CA)を加えたRPMI−1640培地において培養によってインビトロで維持した。細胞は、225cm2の組織培養フラスコにおいて、または大規模培養のためにローラーボトル装置において成長させた。
【0246】
細胞溶解物は以下のように調製された。簡単に言えば、細胞は、50mMトリスHCI(pH8.5、1%Nonidet P−40(Fluka Biochemika、Buchs、スイス)を含む)、150mM NaCl、5mM EDTAおよび2mM PMSF中、108個の細胞/mlの濃度で溶解した。溶解物は遠心分離(15,000×g、30分間)によって砕片および核を取り除いた。
【0247】
HLA分子からアフィニティークロマトグラフィーによって溶解物を取り出した。溶解物は、不活性化されたSepharose CL4−Bおよびタンパク質A−Sepharoseの2つのプレカラムに2度通した。次に、溶解物を、適当な抗体を結合したSepharose CL−4Bビーズカラムに通した。次いで、抗HLAカラムは10カラム容積の10mMトリス−HCL(pH8.0、1%のNP−40、PBS溶液)で、2カラム容積のPBSで、および2カラム容積の0.4%n−オクチルグリコシドを含むPBSで洗浄した。最後に、MHC分子は50mMジエチルアミン(4%のn−オクチルグリコシドを含む0.15M NaCl溶液。pH11.5)で溶出した。1/25容積の2.0Mトリス(pH6.8)を加え、溶離液pHが約8.0まで低下するように溶出した。次いで、溶離液をCentriprepコンセントレータ(Amicon、Beverly、MA)中2000rpmでの遠心分離によって濃縮した。タンパク質成分は、BCAタンパク質アッセイ((Pierce Chemical Co.、Rockford、IL)によって評価し、SDS−PAGEによって確認した。
【0248】
ペプチドのクラスIおよびクラスII MHCへの結合を測定するために利用されたプロトコルの詳細な記載は公表されている(Setteら、Mol.Immunol.31:813、1994;Sidneyら、in Current Protocols in Immunology,Margulies,Ed.、John Wiley & Sons、New York、Section 18.3、1998))。簡単に言えば、MHC分子(5〜500nM)を精製し、プロテアーゼ阻害剤剤カクテルの存在下、0.05%のNonidet P−40(NP40)(またはH−2 IA分析用の20%w/vジギトニン)を含むPBS中で48時間、様々な無標識ペプチド阻害剤および1〜10nM125I−放射標識プローブペプチドと共にインキュベートした。プロテアーゼ阻害剤(各々CalBioChem、La Jolla、CA)の最終濃度は、1mM PMSF、1.3nM1.10 フェナンスロリン(phenanthroline)、73μMペプスタチンA、8mM EDTA、6mM N−エチルマレイミド(クラスII分析用の)および200μM Nアルファ−p−トシル−L−リジンクロロメチルケトン(TLCK)であった。分析はすべて、DRB1*0301(pH4.5で実行された)およびDRB1*1601(DR2w21β1)およびDRB4*0101(DRw53)(pH5.0で実行された)を例外としてpH7.0で実行された。pHは別記した(Sidneyら、Current Protocols in Immunology、Margulies,Ed.、John Wiley & Sons、New York、Section 18.3、1998を参照のこと)ように調節した。
【0249】
インキュベーションに続いて、MHCペプチド複合体を、PBS(pH6.5、0.5%NP40および0.1%NaN3を含む)1.2mls/分で溶出し、7.8mm×15cmのTSK200カラム(TosoHaas 16215、Montgomeryville、PA)上のゲルろ過によって遊離のペプチドから分離した。DRB1*1501(DR2w21β1)アッセイに使用された大きなサイズの放射性標識ペプチドは、このような条件下で未結合ピークから結合ピークを分離することがより難しいので、全てのDRB1*1501(DR2w21β1)アッセイを、0.6mls/分で溶出する7.8mm×30cm TSK2000カラムを用いて実施した。TSKカラムからの溶出液を、Beckman170放射性標識検出器に通過させ、そして、放射活性をプロットしそしてHewlett−Packard3396Aインテグレーターを用いて積算し、そして結合したペプチドの画分を決定した。
【0250】
放射性標識ペプチドを、クロラミンT法を用いてヨウ素化した。それぞれのアッセイおよびそのアッセイ特異的IC50nMにおいて利用される代表的な放射性標識プローブペプチドを、表IVおよびVに要約した。典型的には、予備実験において、MHC調製物の各々を、総放射活性の10〜20%と結合するための必要なHLA分子の濃度を決定するために、固定量の放射性標識ペプチドの存在下で滴定した。続く全ての阻害および直接的結合アッセイを、これらのHLA濃度で行った。
【0251】
これらの条件[標識]<[HLA]および[IC50]≧[HLA]下で、測定したIC50値は、真のKD値の合理的な近似値であった。ペプチドインヒビターは、典型的には、120μg/mlから1.2ng/mlまでの範囲の濃度で試験し、そして、2〜4の完全に独立した実験で試験した。異なった実験で獲得されたデータの比較を可能にするために、試験されたそれぞれのペプチドついてのIC50で、阻害についてのポジティブコントロール(典型的には、放射性標識プローブペプチドの未標識バージョン)のIC50を割ることによって、それぞれのペプチドについて相対的な結合数値を計算する。実験間比較のために、相対結合値を編集した。これらの値は、引き続き目的のペプチドの相対結合で、阻害についてのポジティブコントロールのIC50nMを割ることによって変換され、IC50nM値に戻ることができる。データ編集のこの方法は最も正確であり、そして異なった日数で試験されたペプチドまたは異なったロットの精製MHCとの比較について一貫していることを証明する。
【0252】
HLA−DR精製(LB3.1)について使用される抗体は、α鎖特異的であるため、β1分子は、β3(および/またはβ4およびβ5)分子から分離されない。結合アッセイのβ1特異性は、DRB1*0101(DR1)、DRB1*0802(DR8w2)、およびDRB1*0803(DR8w3)の場合で明らかであるが、β3は全く発現されない。DRB1*0301(DR3)およびDRB3*0101(DR52a)、DRB1*0401(DR4w4)、DRB1*0404(DR4w14)、DRB1*0405(DR4w15)、DRB1*1101(DR5)、DRB1*1201(DR5w12)、DRB1*1302(DR6w19)およびDRB1*0701(DR7)についてもまた示されてきた。DRB1*1501(DR2w2β1)、DRB5*0101(DR2w2β2)、DRB1*1601(DR2w21β1)、DRB5*0201(DR51Dw21)、およびDRB4*0101(DRw53)アッセイついてのβ鎖特異性の問題は、線維芽細胞の使用によって回避できる。DRβ分子特異性に関するアッセイの開発および確証は、以前に記載されている(例えば、Southwoodら、J.Immunol.160:3363−3373、1998を参照のこと)。
【0253】
上記に概略される結合アッセイを、例えば、実施例2に記載されるように、スーパーモチーフおよび/またはモチーフ保有エピトープを分析するために使用し得る。
【0254】
実施例2.保存されたHLAスーパーモチーフ保有CTL候補エピトープの同定
本発明のワクチン組成物は、広範な集団の適用範囲を達成するために、多数のHLAスーパーモチーフまたはモチーフを含む多数のエピトープを含み得る。この実施例は、そのようなワクチン組成物における含有についてのスーパーモチーフ保有エピトープの同定を例示する。集団適用範囲は、下記のストラテジーを使用して計算した。エピトープは、HLA−A2、−A3もしくは−B7スーパーモチーフまたはHLA−A1もしくは−A24モチーフを保有するように選択された。
【0255】
スーパーモチーフおよび/またはモチーフ保有エピトープの同定のためのコンピュータサーチおよびアルゴリズム
HLAクラスIのスーパーモチーフもしくはモチーフまたはHLAクラスIIのスーパーモチーフもしくはモチーフを保有するエピトープについてのコンピュータサーチを、以下のように行った。全ての翻訳されたHBV単離配列を、適切なHLA結合モチーフを含む潜在的ペプチド配列を同定するために、テキストストリング(text string)サーチソフトウェアプログラム(例えば、MotifSearch1.4(D.Brown、San Diego))を用いて分析した;代替のプログラムは、本明細書中に開示されるモチーフ/スーパーモチーフを参照して、当該分野の情報に従って、容易に作製される。さらに、そのような計算は、頭の中で行われ得る。同定されたA2スーパーモチーフ配列、A3スーパーモチーフ配列、およびDRスーパーモチーフ配列を、特定のHLAクラスI分子またはHLAクラスII分子に結合するそれらの能力を推定するための多項式アルゴリズムを用いて、スコアリングした。これらの多項式アルゴリズムは、伸長したモチーフおよび精製されたモチーフの両方を考慮し(すなわち、異なる位置での異なるアミノ酸の影響を考慮するために)、かつ以下の前提に基本的に基づく。この前提とは、ペプチドHLA分子相互作用の親和性全体(言い換えるとΔG)は、以下の型の直線的な多項式関数:
「ΔG」=a1i×a2i×a3i......×ani
として近似し得、ここで、ajiは、nアミノ酸のペプチドの配列に沿って、所定の位置(i)での所定のアミノ酸(j)の存在効果を示す係数である。この方法の重要な仮説は、それぞれの位置での効果が互いに実質的に独立している(すなわち、個々の側鎖の独立した結合)ということである。残基jがペプチド中の位置iで生じる場合、定常量jiが、ペプチドの残りの配列とは無関係なペプチドの結合の自由エネルギーに貢献することが想定される。この仮説は、ペプチドが実質的に伸長したコンフォメーションでMHCに結合しかつT細胞によって認識されることを示す本発明者らの研究室の研究(データは本明細書中に示されていない)によって正当化される。
【0256】
特定のアルゴリズム係数の誘導法は、Gulukotaら、J.Mol.Biol.267:1258−126、1997;(Sidneyら、Human Immunol.45:79−93、1996;およびSouthwoodら、J.Immunol.160:3363−3373、1998もまた参照のこと)に記載されている。手短には、全てのi位置について、アンカーおよび非アンカーも同様に、jを有する全てのペプチドの平均相対結合(ARB)の相乗平均を、集団の残りと比較して計算し、そして、jiの推定値として使用した。クラスIIペプチドについて、多数のアライメントが可能な場合、反復手順に従って、最高のスコアリングのアライメントのみを利用した。試験セットにおける所定のペプチドのアルゴリズムスコアを計算するために、そのペプチドの配列に対応するARB値を乗算した。この積が選択される閾値を超える場合、そのペプチドは、結合することが推定される。適切な閾値を、所望される推定のストリンジェンシーの度合いの関数として選択する。
【0257】
HLA−A2スーパータイプ交差反応性ペプチドの選択
20のHBV単離体由来の完全配列をアライメントし、次いで、HLA−A2スーパーモチーフの一次アンカー特異性を含む保存された9および10マーの配列を同定するために、カスタマイズしたコンピュータプログラムを利用して、走査した。
【0258】
全150の保存されたモチーフ陽性配列を同定した。次いで、これらのペプチドを、A*0201特異的多項式アルゴリズムを用いてA*0201の好ましい二次アンカー残基の存在について評価した。全85の保存されたモチーフ保有配列を選択し合成した。
【0259】
これらの85の保存されたモチーフ保有9および10マーのペプチドのうち85を、精製したHLA−A*0201分子にインビトロで結合するそれらの能力について試験した。34ペプチドが良好なA*0201結合体(IC50≦500nM)であり;15が高い結合体(IC50≦50nM)であり19が中程度の結合体(IC50が50〜500nM)であることが見出された(表XXVI)。
【0260】
独立した分析の過程で、25の保存された、HBV由来の、適当なA2−スーパータイプ一次アンカーを備えた8または11のマー配列も合成し、A*0201結合について試験した。1つのペプチド、HBV env 259 1 1マー(ペプチド1147.14)は、IC50が500nM以下でA*0201に結合し、また表XXVIに含まれていた。表XXVIには、HBV pol 538 9マーペプチド(これはA*0201に5.1nMのIC50で結合する)(以下を参照))の一置換体であるアナログペプチドも示す。
【0261】
36のA*0201結合体のうちの30は、続けて、追加のA2−スーパータイプ対立遺伝子(A*0202、A*0203、A*0206およびA*6802)への結合能力について試験した。表XXVIの中で示されるように、15/30の(50%)ペプチドがA2スーパータイプ交差反応結合体(少なくとも試験した5つのA2スーパータイプ対立遺伝子のうち3つと結合する結合体)であることが見出された。さらに詳しい分析のためにこれらの15のペプチドを選択した。
【0262】
HLA−A3スーパーモチーフ保有エピトープの選択
同じ20の単離体由来の配列について、HLA−A2スーパーモチーフの一次アンカーを有する保存されたペプチドの存在を同様に調べた。合計80の保存された9−または10マーモチーフを含む配列が同定された。A03およびA11アルゴリズムを使用する詳しい分析は、いずれか一方または両方のアルゴリズムにおいて高く得点した40の配列を同定した。対応するペプチドのうちの36を合成し、HLAA*03およびHLA−A*11(2つの最も一般的なA3−スーパータイプ対立遺伝子)への結合を試験した。A3および/またはA11とIC50値≦500nMの親和性で結合する23のペプチドが同定された(表XXVI1)。
【0263】
独立した一連の研究過程で、30のHBV由来の8マーおよび24の11マー配列(単離物の75%以上保存)を選択しA*03とA*11についての結合試験を行った。4つの8マーおよび9つの11マーは、対立遺伝子のいずれかまたは両方と結合することが見出された(表XXVII)。最終的に、4つの9マー、および1つの10マーが、(上に概説した探索基準を使用して選択されていない保存されたHBV由来ペプチド。但し、それはA*03および/またはA*11を結合することが示された)同定され、表XXVIIに含まれている。これらのペプチドのうち2つは標準的でないアンカー(ペプチド20.0131および20.0130)であり、また、他の3つはアルゴリズム陰性(ペプチド1142.05、1099.03および1090.15)である。
【0264】
続いて41個のA*03および/またはA*11結合ペプチドのうち38こをを、他の共通のA3−スーパータイプ対立遺伝子(A*3101、A*3301およびA*6801)への交差反応性の結合力に関して試験した。これらのペプチドのうちの17個がA3−スーパータイプ交差反応性だったことが判明し、試験した5つのA3−スーパータイプ対立遺伝子のうち少なくとも3つと結合した(表XXVII)。
【0265】
HLA−B7スーパーモチーフ保有エピトープの選択
同じ20の単離物をHLA−B7スーパーモチーフを有する保存された9マーおよび10マーペプチドの存在について分析し、46の配列が同定された。対応する34のペプチドを合成し、HLA−B*0702(最も一般的なB7−スーパータイプ対立遺伝子)との結合を試験した。9つのペプチドが、IC50値≦500nMでB*0702と結合した(表XXVIII)。次いで、これらの9つのペプチドを、他の共通B7−スーパータイプ対立遺伝子(B*3501、B*51、B*5301およびB*5401)との結合について試験した。9つのうち5個のB*0702結合体は、試験した5つのB7−スーパータイプ対立遺伝子の3個以上に結合することができた。
【0266】
B7−スーパータイプ対立遺伝子の第2のアンカー必要条件を調査する別の研究において、B7−スーパーモチーフを有するすべての入手可能なペプチドをすべてのB7−スーパータイプ対立遺伝子との結合について試験した。その結果、上に記載した34のペプチドもすべて、他のB7との結合について試験した。これらの実験は、少なくとも1つのB7−スーパータイプ対立遺伝子とIC50値≦500nMで結合するさらに10個のペプチドを同定し、その中には3つ以上の対立遺伝子と結合する2つのペプチドが含まれていた。これらの10個のペプチドも表XXVIII中に示す。
【0267】
保存されたB7−スーパータイプ縮重HBV由来9−マーおよび10マーペプチドの数は、A2−およびA3−スーパータイプと比較して少ないため、20個の単離物を、保存モチーフ保有8−マーおよび11マーを同定するために再び検査した。この再走査は51個のペプチドを同定した。これらのうちの31個を合成し、5つの最も共通のB7−スーパータイプ対立遺伝子の各々への結合を試験した。19個の8−および11マーペプチドが、少なくとも1つのB7−スーパータイプ対立遺伝子と高いまたは中程度の親和性(IC50値≦500nM)をもって結合した(表XXVIII)。2つのペプチドが、試験した5つの対立遺伝子のうちの3つと結合する縮重した結合体であった。
【0268】
要約すれば、分析した単離体において75%以上保存された縮重B7−スーパータイプ結合体である9つのHBV由来ペプチド全体が同定された(表XXVIII)。
【0269】
A1およびA24モチーフ保有エピトープの選択
さらに集団適用範囲を拡大するため、HLA−A1および−A24エピトープを本分析に組み入れた。5つの異なる主な人種(白人、北米黒人、中国人、日本人およびラテンアメリカ人)中で、A1は平均12%以上、A24は人口におよそ29%の存在している。これらの対立遺伝子は組み合わせられて、39%の平均頻度でこれらの同じ人口の中で表わされるであろう。A1とA24がA2−、A3−およびB7−スーパータイプ対立遺伝子と合わせた場合、合計の適用範囲は主要な人種中で>95.4%である;比較すると、A2−、A3−およびB7−スーパータイプを合わせた適用範囲が86.2%である。
【0270】
A1とA24バインダーに対するHBVの系統的な分析はまだ終わっていない。しかしながら、独立した研究の過程で、A*0101に500nM未満のIC50で結合する15個の保存されたHBV由来ペプチドが同定され(表XXIX);これらのうちの7個は100nM未満のIC50で結合する。同様の文脈の中で、14個の保存されたA*2402結合HBV由来ペプチドがさらに同定され、それらのうちの6個は、A*2402に100nM未満のIC50で結合する(表XXIX)。
【0271】
実施例3:免疫原性の確認
A*0201免疫原性の評価
上に識別された15個のHBV由来HLA−A2スーパータイプ交差反応性ペプチドの免疫性分析を表XXXに要約する。ペプチドは、3つの系の少なくとも1つでの免疫原性についてスクリーニングした。ペプチドはインビトロでの主要抗原特異的CTLの誘導のためにヒトPBMC(Wentworthら、Molec.Immunol.32:603、1995)を使用してスクリーニングし;このデータは、表XXXの中「主要なCTL」として示す。
【0272】
ヒトPBMCからの主要抗原特異的CTLのインビトロ誘導用のプロトコルは、ウェントワースら(Wentworthら、Molec.Immunol.32:603、1995)に記載されている。CD8+T細胞のために正常な寄贈者からのPBMCを富裕化し、IL−7の存在下にペプチド負荷抗原提示細胞(SAC−I活性化されたPBMC)と共にインキュベートした。7日の培養後、ペプチドでパルスされた照射された自系付着細胞(autologous adherent cells)を使用して新たに培養物を刺激し、次いで、7日後に細胞傷害活性について試験した。
【0273】
さらに、HLAトランスジェニックマウスがペプチド免疫原性を評価するために使用され;このデータは表XXXの「トランスジェニックCTL」に示す。従来の研究は、A*0201/Kbトランスジェニックマウスで誘導されたCTLがヒト中で誘導されたCTLに似た特異性を示すことを示している(Vitielloら、J.Exp.Med.173:1007、1991;Wentworthら、Eur.J.Immunol.26:97、1996)。
【0274】
ペプチド免疫に続くトランスジェニックマウス中のCTL誘導はVitielloら(Vitielloら、J.Exp.Med.173:1007、1991)およびAlexanderら(Alexanderら、J.Immunol.159:4753、1997)に記載されている。簡単に言えば、合成ペプチド(50μg/マウス)およびヘルパーエピトープHBVコア128(140μg/マウス)を不完全なフロイントアジュバント(IFA)中に乳化し、尾の基部において皮下注入した。注入の11日後に、脾細胞を、ペプチド負荷した同質遺伝子的なLPS芽細胞の存在下でインキュベートした。6日後に、ペプチドパルス標的を使用して、培養物を細胞障害活性について分析した。
【0275】
また、ペプチドを、急性感染HBV患者の中のリコールCTL応答のリコールを刺激する能力に関して試験し(Bertoniら、J.Clin.Invest.100:503、1997年;Rehermannら、J.Clin.Invest.97:1655−1665、1996年;Nayersinaら、J.Immunol.150:4659、1993);これらのデータは「表XXX」中に「患者CTL」として示す。天然感染過程でペプチドが認識されることが示されるため、患者の免疫原性データは特に有益である。これらのデータは、ペプチドが、CTLの目標を表わす人間の細胞中で処理され提示されることを実証する。さらに、患者中のCTL応答の誘導が感染の解消に関連付けられたように、このデータはワクチン設計に特に関連する。
【0276】
リコールCTL応答の評価については、Bertoniら(Bertoniら、J.Clin.Invest.100:503、1997)によって記載されるようにしてスクリーニングが行われた。簡単に言えば、HBVに急性感染した患者からのPBMCを、10μg/mlの合成ペプチド存在下で培養した。7日後に、培養物をペプチドで再刺激した。ペプチドでパルスされた標的細胞を使用し、培養物を14日目に細胞障害活性についてアッセイした。
【0277】
15個のA2スーパータイプを結合するペプチドのうち11個は利用したシステムの少なくとも1つにおいて免疫原性であることが見出された。11個のペプチドのうちの5個は、以前にHBV急性感染患者中のものと同一視されている(Bertoniら、J.Clin.Invest.100:503、1997)。追加の縮重した5つのペプチド(1069.06、1090.77、1147.14、927.42および927.46)が、HLA−A*0201のトランスジェニックマウス中でCTL応答を誘導した。11個の免疫原性スーパータイプ交差反応性ペプチドは3つのHBV抗原によってコードされる;コア、エンベロープおよびポリメラーゼである。
【0278】
このセット(11個の免疫原性A2−スーパーモチーフ保有エピトープ)は、1つのアナログペプチド1090.77を含んでいる。野生体ペプチド1090.14(これからこのアナログは誘導される)はA2−スーパータイプ非交差反応性であるが、しかし急性HBV患者からのリコールCTL応答において認識され、HLA−A*0201のトランスジェニックマウスにおいてもヒトの初代培養物においても免疫原性であることが示された(表XXX)。野生体ペプチド1090.14と1090.77アナログの交差認識に取り組むさらなる研究は、以下に詳細に記載される。
【0279】
独立した分析の過程で、表XXXbに示す非交差反応性ペプチドのうち14個(1090.14を含む)は少なくとも1つの系において免疫原性であることが見出された。これらのペプチドのうち5個のペプチドが患者において認識され;4つのペプチドが、トランスジェニックマウス中のCTLを誘導した。
【0280】
結論として、11個のA2−スーパータイプ交差反応性ペプチドが、調べた3つのシステムの少なくとも1つにおいて免疫原性を示すことができることが識別された。
【0281】
A*03/11免疫原性の評価
17個のA3−スーパータイプ交差反応性ペプチドの免疫原性のうち7個を評価した(表XXXI)。前節に記載したように、A3−スーパーモチーフ保有ペプチドは初代培養物、患者の応答、またはHLA−A11トランスジェニックマウスを使用してスクリーニングした(Alexanderら、J.lmmunol.159:4753、1997)。ペプチド1.0219を例外として、表XXXI挿入表にリストされた保存された交差反応性ペプチドはすべて、免疫原性であることが見出された。
【0282】
さらに、交差反応性スーパータイプ結合を示す、保存性の弱いペプチド(1150.51;40%が保存された)は、トランスジェニックマウスにおいて免疫原性であることが見出され、表XXXIに含まれていた。同様に他の2つの保存されているが交差反応性でないペプチドも、急性感染HBV患者(Bertoniら、J.Clin.Invest.100:503、1997)において認識されることが示された。これらのエピトープは表XXXI中に示される。
【0283】
8個の保存された免疫原性HBV誘導A3スーパーモチーフ保有エピトープのうちの7個(交差反応性ペプチド6個をすべて含む)について、患者において陽性データが得られた点は注目に値する。これらのエピトープは、1つのエピトープがコアタンパク質配列に由来している他は主にポリメラーゼタンパク質配列に由来する。X抗原では多くの交差反応性ペプチドが識別されていたが(表XXXI)、現在まで、これらのペプチドは免疫原性についてスクリーニングされていない。
【0284】
要約すれば、急性感染患者においてCTLによって認識されるか、HLAトランスジェニックマウスにおいてCTLを誘導する、7個のA3−スーパーモチーフ保有交差反応性ペプチドが識別された。
【0285】
B7免疫原性の評価
HBV由来HLA−B7−スーパーモチーフ保有、交差反応性ペプチドが関係する免疫原性の研究を表XXXIIに要約する。HLA−B7ペプチドは、もっぱら、初代培養物または急性感染HBV患者のいずれかにおいて応答を測定するヒトシステムでスクリーニングした。スクリーニングされた7つの縮重したペプチドのうち4個は免疫原性を示した。交差反応性でない1つのペプチド(XRN<3)、1147.04も、急性感染HBV患者(Bertoniら、J.Clin.Invest.100:503、1997年;Table XXXIIを見る)において認識されることが示された。
【0286】
要約すれば、急性感染HBV患者において認識される、5つの保存されたHBV由来B7−スーパーモチーフ保有エピトープが識別された。これらのエピトープは、4つの異なるHBV抗原(コア、エンベロープ、ポリメラーゼおよびX)をカバーすることができる。
【0287】
実施例4:アナログを作製することによって天然のペプチドの結合能力を改善するための伸長したスーパーモチーフの実施
本明細書中に示されるように、HLAモチーフおよびスーパーモチーフ(一次および/または二次の残基を含む)は、高度に交差反応性の天然のペプチドの調製において有用である。さらに、HLAモチーフおよびスーパーモチーフの規定はまた、アナログ化、または「修正(fixed)されて」、ペプチドに特定の特徴(例えば、スーパータイプを構成するHLA分子の群内のより優れた交差反応性、および/またはそれらHLA分子のいくつかまたは全てについてのより優れた結合親和性)を与える天然のペプチド配列内の残基を同定することによって、当業者が高度に交差反応性のエピトープを操作するのを可能とする。調整された結合親和性を示すアナログペプチドの例を、この実施例に示す。
【0288】
一次アンカー残基を用いるアナログ化
クラスIペプチド配位子は、その結合親和性および/または縮重を増加させるために改変するか「固定」できることが示された(シドニーら、J.Immunol.157:3480、1996)。同様にこれらの固定されたペプチドは、野生体エピトープに特異的なT細胞により免疫原性および交差反応性認識を増加させることも示すであろう(Parkhurstら、J.Immunol.157:2539、1996年;Pogueら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:8166、1995)。特に、A2スーパータイプペプチドの主要なアンカーは「固定」してもよく、2位でLまたはVに(または天然の場合はMに)およびC末端をVにアナログ化してもよい。表XXVIに示すように、14個のうちの9個のA2−スーパータイプ交差反応性結合ペプチドは、これらの基準によって「固定可能」であり、21個の非交差反応性結合体のうち16個も同様である。固定に対する理想的候補は、少なくとも3個のA2−スーパータイプ対立遺伝子特異的分子とIC50≦5000nMで結合するペプチドである。
【0289】
より広く交差反応性なエピトープを生成するこの戦略の効能の1つの例は、ペプチド1090.14(表XXVI)のケースによって提供される。以前に、このペプチドは、検討されたそれぞれの系において高度に免疫原性であることが示された。しかし、単一のA2−スーパータイプ対立遺伝子特異的分子、A*0201に対する結合性のみを示す。このエピトープの非交差反応的結合能力は集団適用範囲を制限し、したがって候補ワクチンにこのペプチドを含む価値を制限する。結合親和性および交差反応性を増加させるための努力において、ペプチド1090.14のC−末端を「アラニン」からA2−スーパーモチーフの好適残基「バリン」に変更した。この変更はA*0201の結合能力(200nMから5.1nMまで)に劇的な増加(40倍)をもたらしたが、他の3個のA2−スーパータイプ対立遺伝子特異的分子に結合することができるペプチドをも生じた(ペプチド1090.77、表XXVI参照)。
【0290】
HLA−A*0201トランスジェニックマウスを用いた研究は、1090.77ペプチドで免疫にされたマウスからのCTL応答が天然に存在するペプチド1090.14またはバリン置換アナログ(つまり1090.77)のいずれかが負荷された標的細胞を認識することを示した。実際、1090.77誘導されたCTLによる溶解は、標的細胞を負荷するために使用されたのがアナログであるか野生型の配列であるか判別不能であった(B.Livingston、出版されていないデータ)。
【0291】
ワクチン構築物設計のためのこれらの観察の重要性は、効力のあるウイルスの応答阻害剤、ラミブジンで慢性のHBV患者が治療された研究によって示される。ラミブジンを用いた拡張治療は、1090.14エピトープにおいて2位をメチオニンからバリンに代えたHBVの薬剤耐性菌の選択をもたらし、エピトープに基づくワクチンをラミブジンと併用することが、野生体および突然変異体配列の両方を認識するCTL反応を誘導する能力を持つ必要があってもよいことを示唆する。
【0292】
交差認識がネイティブなペプチド(1090.14)とアナログペプチドおよびラミブジン誘導変異体M2ペプチドの間で可能であることを実証するために、1090.77アナログペプチドを使用してCTLを生成した。次いで、野生体ペプチド(1090.14)またはラミブジン誘導変異体M2ペプチドのいずれかによってこれらのCTL培養物を刺激した。次いで、野生体またはラミブジン誘導変異体ペプチドのいずれかが負荷された標的細胞を溶解するこれらCTLの能力を分析した。いずれかのペプチドを示す標的細胞は、同様にいずれかのCTL培養によって溶解された(表XXVI)。
【0293】
これらの研究はペプチドのアナログ化することは、どのように野生体と突然変異体のエピトープ間の交差認識を可能にすると共にHLA−A2スーパータイプ縮重の劇的な増加をもたらすことができるかを実証する。より具体的に言えば、これらの結果は、アナログペプチド1090.77を利用するワクチンが、野生株HBVおよび抗ラミブジンHBV株の両方を認識する反応を刺激していることを示す。
【0294】
同様に、HLA−A3スーパーモチーフ保有エピトープのアナログを生成してもよい。例えば、2位で好ましいV、およびC−末端でRまたはKを有するようにペプチドをアナログ化することもできる。A3−スーパータイプ縮重ペプチドのうち表XXVIIで識別された12個が主要なアンカー固定に対する候補であり、24個の非交差反応性結合体のうちの19個も同様である。
【0295】
アナログペプチドは、A*03とA*11に結合することが最初に試験され、次いで、親ペプチドと比較して等価、または改善された結合能力を示すものがA3−スーパータイプ交差応答性に関して試験されるであろう。必要な場合には、次いで、改善された交差反応性を実証するアナログを免疫原性について評価さらに評価する。
【0296】
代表的には、B7のスーパーモチーフ保有エピトープを識別することはより困難である。A2−およびA3−スーパータイプエピトープの場合と同様に、ペプチドアナログ化戦略を用いて、増加した交差反応性結合を備えた付加的なB7スーパーモチーフ保有ペプチドを生成することができる。一般に、B7のスーパーモチーフ保有ペプチドは2位でPをそれらのC−末端でIを有するように固定されるべきである。
【0297】
2つの異なるB7様ペプチド(HBV env 313およびHBV pol 541)のC−末端がI残基で置換された一次アンカー単一アミノ酸残基を表わすアナログを合成し、それらのB7−スーパータイプ結合能力に関して試験した。両方の場合において、I置換が結合親和性および/または交差反応性に全面的な肯定的な効果があったことが見出された。HBV env 313の場合には、I9の(C−末端位置9でのI)置換が、B*5401の結合親和性をほぼ400倍に増加することによって結合された4から5個の対立遺伝子からの交差反応性を増加させるのに有効であった。HBV pol 541の場合には、増加した交差反応性は、B*5401結合の実質的な増加によって同様に達成された。さらに、B*0702、B*51およびB*5301への結合親和性における著しい増加が、HBV pol 541 I9アナログで観察された。
【0298】
二次アンカー残基でのアナログ化
さらに、HLAスーパーモチーフは、交差反応性特性に関係している二次アンカー位置の特定の残基を識別することにより、高度に交差反応的なペプチドを操作することにおいて価値がある。これを実証するため、5つの異なるB7−スーパータイプ結合性ペプチドのうちの位置1および3で単一のアミノ酸置換を表わすペプチドの第2のセットを合成し、B−7スーパータイプ結合能力について試験した。4/4のケースでは、位置1でネイティブな残基を芳香性の残基F(「Fl」置換)に替える効果が、親ペプチドと比較して、交差反応性の増加をもたらし、また、ほとんどの例で、結合親和性が3倍以上に増加した(表XXVIII)。より具体的には、HBV env 313、MAGE2 170およびHBV core 168については、完全なスーパータイプ交差反応性がF1置換アナログで達成された。これらの増加はB*5401結合親和性を劇的に増加させることにより達成された。さらに、親和性における増加は、HBV core 168(B*3501とB*5301)およびMAGE2 170 (B*3501、B51およびB*5301)の場合に他の対立遺伝子について見られた。最後に、MAGE3 196の場合には、F1置換はB*0702結合における増加のために交差反応性を増加させるのに有効であった。B51の結合能力をほぼ70倍に増加させる点も注目された。
【0299】
2つのアナログが、位置3でのスーパーモチーフの肯定的なF置換(「F3」置換)を使用して作られた。両方の例で、結合親和性および交差反応性の増加が達成された。特に、HBV pol 541の場合には、F3置換は、B*5401結合に対するその影響の効力により交差反応性を増加させるのに有効であった。MAGE3 196の場合、完全なスーパータイプ交差反応性が、B*0702およびB*3501の結合能力を増加させることにより達成された。また、MAGE3 196の場合には、B*3501、B*51、B*5301およびB*5401について40倍と5000倍の間に結合能力が増加することは注目に値する。
【0300】
結論として、これらのデータは、単一のアミノ酸置換であってもその使用によって、HLAスーパータイプ分子用のペプチド配位子の結合親和性および/または交差反応性を増加させることが可能であることを実証する。
【0301】
実施例5:HLA−DR結合モチーフによる保存されたHBV誘導配列の識別 以下に概説するように、実施例1〜3に記載されたのと同様な方法論を用いることにより、HLAクラスIIスーパーモチーフまたはモチーフ保有ペプチドエピトープも識別できる。
【0302】
HLA−DR−スーパーモチーフ保有エピトープの選択
HLAクラスIl分子は、典型的には、長さで12から20残基の間でペプチドを結合する。しかし、HLAクラスIと同様に、特異性および相互作用のエネルギーは通常、約9残基の短いコア領域に含まれている。ほとんどのDR分子は、位置1(Pl)の疎水性残基が主要なアンカー(main anchor)であるこの9−マーコア内の重複する特異性を共有している(O’Sullivanら、J.Immunol.147:2663、1991;Southwoodら、J.Immunol.160:3363、1998)。さらに、位置6(P6)の中の小さいか疎水性残基の存在も、ほとんどのDRペプチド相互作用にとって重要である。この重複するP1―P6特異性は9マーコア領域内に、DRスーパーモチーフとして定義された。クラスI分子とは異なり、DR分子は結合力のある溝の両端で開いていて、したがって長さの変わるより長いペプチドを提供することができる。実際、ペプチド−DR相互作用のほとんどのエネルギーがコア領域によって寄与されるように見えている一方、側面に位置する残基は高い親和性相互作用にとって重要であると思われる。また、MHC結合には厳密に必要でないが、側方に位置する残基はT細胞認識のためのほとんどの実例において明らかに必要である。
【0303】
HBV由来DR交差反応性HTLエピトープを識別するために、HLAクラスIモチーフ配列の識別用に走査したのと同じ20個のHBVポリタンパク質モチーフ配列を、結合性HLA−DRのためのモチーフを備えた配列の存在に関して走査した。特に、9−マーコアを含むDR−スーパーモチーフで構成された15マー配列、および領域の側面を守る3残基N−末端およびC−末端が選択された。走査したHBV株の少なくとも85%(17/20)で15マー配列の100%が保存されることがさらに必要とされた。これらの基準を使用して、36個の非冗長(non−retundant)配列が識別された。これらのペプチドのうちの35個を続いて合成した。
【0304】
DR分子に結合するペプチドを予測するためのアルゴリズムも開発されている(Southwoodら、J.lmmunol.160:3363、1998)。個々のDR分子に特異的なこれらのアルゴリズムは9マーコア領域のスコアリングおよびランキングを可能にする。選択表を使用して、これらのアルゴリズムが、適当なDR分子と結合する可能性の高いペプチド配列を効率的に選択することが見出された。さらに、アルゴリズム(特にDR1、DR4w4およびDR7のためのもの)を実行すると、連続して効率的にDR交差反応性ペプチドを選択することができることが見出された。
【0305】
これらのアルゴリズムが追加のペプチドを識別するかどうか確かめるために、上述で使用したのと同じHBVポリタンパク質を、9マーコア領域の100%が85%(17/20の株)保存されている15−マーペプチドの存在を調べるために再走査した。次に、これらのペプチドの各々の9マーコア領域にDR1、DR4w4およびDR7アルゴリズムを使用して得点を付けた。その結果、8個のさらなる配列が識別され合成された。
【0306】
要約すると、9マーコア領域がDRスーパーモチーフを含んでいたか、DRの結合性配列を予測するアルゴリズムを使用して選択された、44個の15マーペプチドが識別された。これらのペプチドのうちの43個が合成された(表XXXIII)。
【0307】
上記のHBV由来ペプチドの分析を実行する一方、9つのペプチド(これらはそのDR1、DR4w4およびDR7アルゴリズムプロフィールに基づいてDR交差反応性結合力のあるペプチドであると予測されたが、9マーコア領域が80%しか保存されていない)も識別された。95%が保存されているDRスーパーモチーフコア領域を含むが、N終点から取り除かれた1つの残基だけが位置決定された追加ペプチドがあらかじめ合成された。これらの10個のペプチドもさらに分析するために選択され、表XXXIIIの中で示される。
【0308】
最後に、2つのペプチドCF−08および1186.25(上述で選択されたペプチド(27.0280)と冗長である)を追加的な分析のために考慮した。ペプチド1186.25は多数のDR−スーパーモチーフ配列を含んでいる。ペプチドCF−08は両方の27.0280および1186.25を入れ子にする20マーである。これらのペプチドは表XXXIIIの中で示される。
【0309】
上述で識別された55個のHBV由来ペプチドを、共通のHLA−DR対立遺伝子を結合するそれらの能力に関して試験した。集団適用範囲およびほとんどのDR対立遺伝子(例えばSouthwoodら、J.Immunol.160:3363、1998参照)の結合性レパートリー間の関係の両方を最大限にするために、DRアッセイの連続パネルに対する結合に関してペプチドをスクリーニングした。これらのスクリーニングパネルの構成、および関連する抗原の発現型頻度は、表XXXIVに示される。ペプチドはすべて、一次パネル中の対立遺伝子(DR1、DR4w4およびDR7)に結合するかを最初に試験した。次いで、これらの3つの対立遺伝子のうちの少なくとも2つと結合するペプチドだけが、二次分析(DR2w2β1、DR2w2β2、DR6wl9およびDR9)において結合するか試験した。最後に、4つの二次パネル対立遺伝子の少なくとも2つと結合するペプチド、したがって全部で7つの対立遺伝子の4つと結合するペプチドのみを三次分析で結合するかをスクリーニングした(DR4w15、DR5w11およびDR8w2)。
【0310】
試験に際して、もともとの55個のペプチドのうちの25個(45%)が一次パネル対立遺伝子の2つ以上と結合することが見出された。これらの25個のペプチドを続いて二次分析において試験した時、20個は一次および二次の分析パネル中の7つのDR対立遺伝子の少なくとも4つと結合することが分かった。最後に、二次スクリーニング過程を通る20個のペプチドのうちの18個を三次分析において結合するか試験した。その結果、12個のペプチドが、10個の共通HLA−DR対立遺伝子のうち少なくとも7つと結合することが示された。これらの12個のペプチド配列および一次から三次パネルに至る各分析に対するそれらの結合能力を表XXXVの中に示す。また、ペプチドCF−08および857.02(今までに試験した対立遺伝子の5/5および5/6それぞれと結合する)も示す。
【0311】
要約すると、多数のHLA−DR対立遺伝子と結合できる、HBVゲノムの12個の独立領域に由来する14個のペプチドが識別された。このペプチドセットは、Core(Nuc)、PolおよびEnv抗原から少なくとも2つのエピトープを各々含んでいる。
【0312】
保存されたDR3モチーフペプチドの選択
HLA−DR3は白人、黒人およびヒスパニック系の人口において広く分布している対立遺伝子であるので、DR3結合能力はHTLエピトープの選択において重要な基準である。しかし、以前に生成されたデータは、DR3が他のDR対立遺伝子と稀にしか交差反応しないことが示されている(Sydneyら、J.Immunol.149:2634−2640、1992;Gelukら、J.Immunol.152:5742−5748、1994;Southwoodら、J.Immunol.160:3363−3373、1998)。これは、DR3ペプチド結合性モチーフは、ほとんどの他のDR対立遺伝子の特異性とは異なるように見えるという点で完全に驚くべきではない。
【0313】
DR3と結合するペプチドを効率的に識別するために、目標タンパク質を、Gelukら(J.Immunol.152:5742−5748、1994)によって報告された2つのDR3特異的結合性モチーフのうちの1つを保持する保存された配列について分析した。18個の配列が識別された。これらの配列のうちの8つは、表XXXVIに示すペプチドと大部分は冗長であり、3個は以前に他の研究用に合成されたペプチドであった。7個のユニークな配列が合成された。
【0314】
DR3モチーフを含む18個のペプチドのうちの17個をそれらのDR3結合能力に関して試験した。4つのペプチドが、DR3に1000nMあるいはそれより良好な親和性で結合することが見出された(表XXXVI)。
【0315】
実施例6.HPV由来HTLエピトープの免疫原性
この例は、免疫原性DRスーパーモチーフおよびDR3のモチーフ保有エピトープを実施例5の中で方法論を用いて識別されたものの中から決定する。
【0316】
HTLエピトープの免疫原性は、HTL応答を刺激する能力の評価および/または適当なトランスジェニックマウスモデルの使用により、CTLエピトープの免疫原性の決定と類似したやり方で評価される。免疫原性は、1)正常なPBMCを使用するインビトロでの一次誘導、または2)癌患者PBMCからのリコール応答:に関してスクリーニングすることにより決定される。
【0317】
実施例7.集団適用範囲の広さを決定するための種々の人種背景におけるHLAスーパータイプの表現型の頻度の算出
この実施例は、複数のスーパーモチーフおよび/またはモチーフを含む複数のエピトープを構成するワクチン組成物の集団の適用範囲の広さの評価を例証する。
【0318】
集団適用範囲を分析するために、HLA対立遺伝子の遺伝子頻度を、決定した。各HLA対立遺伝子についての遺伝子頻度を、二項分布式gf=1−(SQRT(1−af))を利用して、抗原または対立遺伝子頻度から算出した(例えば、Sidneyら、Human Immunol.45:79−93、1996を参照のこと)。全体的な表現型頻度を得るために、蓄積(cumlative)遺伝子頻度を算出し、そして蓄積抗原頻度は、逆の式[af=1−(1−Cgf)2]の使用により、導かれる。
【0319】
頻度データが、DNAタイピングのレベルにおいて利用可能でない場合、血清学的に規定される抗原頻度への対応が、仮定された。合計の潜在的なスーパータイプ集団適用範囲を得るために、結合の不安定性を仮定せず、そしてスーパータイプの各々に属することが確認された対立遺伝子のみを含んだ(最小の評価)。遺伝子座中の組合せにより達成される合計の潜在的適用範囲の評価を、考えられるB対立遺伝子により含まれることが期待され得るAに含まれない集団の比率をAの適用範囲に足すことにより行った(例えば、合計=A+B*(1−A))。A3様スーパータイプの確認されたメンバーは、A3、A11、A31、A*3301、およびA*6801である。A3様スーパータイプは、A34、A66、およびA*7401を潜在的に含み得るが、これらの対立遺伝子を、全体の頻度の算出には含まなかった。同様に、A2様スーパータイプファミリーの確認されたメンバーは、A*0201、A*0202、A*0203、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207、A*6802、およびA*6901である。最終的に、B7様スーパータイプの確認された対立遺伝子は、B7、B*3501−03、B*51、B*5301、B*5401、B*5501−2、B*5601、B*6701、およびB*7801である(潜在的にはまた、B*1401、B*3504−06、B*4201、およびB*5602)。A2スーパータイプ、A3スーパータイプおよびB7スーパータイプを組み合わせることにより達成される集団適用範囲は、5つの主要な人種集団において約86%である(表XXIを参照のこと)。適用範囲を、A1モチーフおよびA24モチーフを保有するペプチドを含むことにより拡大し得る。5つの異なる主要な人種集団(白色人種、北米黒色人種、中国人、日本人、およびスペイン系人種)にまたがり、平均して、A1は、集団の12%そしてA24は、集団の29%で存在する。合わせて、これらの対立遺伝子は、これらの同じ人種集団において平均39%の頻度で示された。主要な人種にまたがる合計の適用範囲は、A1およびA24が、A2スーパータイプ対立遺伝子、A3スーパータイプ対立遺伝子およびB7スーパータイプ対立遺伝子の適用と組み合わさる場合、95%より大きい。
【0320】
HLAクラスII分子のための集団適用範囲は本開示に基づいて同様に開発することができる。
【0321】
候補HLAクラスIおよびクラスIIの要約
要約すると、先に示したデータに基づいて、34個の保存されたCTLエピトープがワクチン候補として選択された(表XXXVII)。これら34個のエピトープのうち、7個はコアから、18個はポリメラーゼから、そして9個はエンベロープから由来するものである。X抗原からのエピトープは、パッケージに含まれていない。このタンパク質は低量で発現し、したがって、免疫学的な重要性は小さいからである。
【0322】
CTLエピトープのこのパネルによって与えられた集団適用範囲は5つの主要人種の各集団において95%を超えると推測される。モンテカルロ分析(図1)を使用して、白人、北アメリカの黒人、日本人、中国人およびヒスパニック系で構成された集団中の個体のおよそ90%が、ワクチン候補エピトープの5つ以上を認識するだろうことは予測される。
【0323】
好ましいCTLエピトープは34個の個別のペプチドを含んでいるが、2つのペプチドは、より長いペプチド内に完全に入れ子にされているため、ワクチン候補に含まれなければならないペプチドの数は有効的に減っている。具体的にはA2−拘束ペプチド927.15は、B7−拘束ペプチド26.0570内に入れ子にされ、B7−拘束ペプチド988.05はA2−拘束ペプチド924.07内に入れ子にされる。同様に、A−24拘束ペプチド20.0136とA2−拘束ペプチド1013.01は、同じコア領域を含み第1のアミノ酸でのみ異なっている。関連して言えば、A2−拘束ペプチド1090.14およびB7−拘束ペプチド1147.05は、2つのアミノ酸によって重なっており、1つの連続するペプチド配列としてこれら2つのエピトープを運搬する可能性を高めている。
【0324】
ペプチドのセットは9個のA2−拘束CTLエピトープ;4つのポリメラーゼ誘導エピトープ、4つのエンベロープ誘導エピトープおよびコアエピトープを含む。これらの9個のペプチドのうちの7個は急性患者からのリコールCTL分析で認識される。患者において認識された7個のペプチドのうち、2個は非交差反応性結合ペプチドである。潜在的なワクチン候補としてのこれらのペプチドの包含は、HLA−A*0201が、検査されたすべての人種において主に発現されるA2−スーパータイプ対立遺伝子であるという観察から生じる。そのため、ペプチドを結合する交差反応性でないA*0201の包含は、抗原適用範囲および集団適用範囲の冗長性を増加させる。患者の免疫原性データを欠くわずか2つのA2−拘束ペプチドは、ペプチド1090.77および1069.06である。1090.77ペプチドは急性HBV患者の中で認識された高度に免疫原性なペプチドのアナログである。アナログペプチドを認識する能力に関して、患者におけるリコール応答が試験されていないことが、HLAトランスジェニックマウスの中で行われた免疫原性研究は、1090.77で誘導されるCTLは、天然に存在する配列を伴う標的細胞を認識することができることを示した。これらのデータは、1090.77のペプチドに対して増加されるCTLは、交差反応性であり、HBV感染細胞を認識するべきであるということを示している。A6802へのその高い結合親和性性がより大きな人口適用範囲をもたらすので、ペプチド1069.06は潜在的なワクチンエピトープとして含まれていた。該ペプチドは、HLA−A2トランスジェニックマウスおよび主なヒト培養において免疫原である。
【0325】
好ましいCTLエピトープは7個のA3−スーパータイプ拘束ペプチドを含んでおり;6個はポリメラーゼ抗原に由来し、1個はコア領域に由来する。A3−スーパータイプワクチン候補ペプチドはすべて患者において免疫原である。ペプチド1142.05は非交差反応性のA3−拘束ペプチドであるが、それは、患者の中で認識されることを示されており、結合性HLA−A1と結合することができる。
【0326】
9個のB7−拘束ペプチドが実施例において識別された好ましいCTLエピトープである。このグループのうち、3つのエピトープが、患者の中で認識されることが示された。一方、これらのペプチドのうちの1つ、1147.04は非交差反応性の結合体であり、これは主要B7スーパータイプ対立遺伝子のうちの2つにIC50または結合親和性価値100nM未満で結合する。6個のB7スーパータイプエピトープは、スーパータイプ結合に基づく好ましいエピトープとして含まれていた。ヒトにおける免疫原性研究(Bertoniら、1997;Doolanら、1997;Threlkeldら、1997)は、高度に交差反応的なペプチドは、エピトープとしてほとんど常に認識されることを実証した。これらの結果を踏まえれば、また、利用可能な免疫原性データが限定的であるという点に照らして、選択基準としてB7−スーパータイプ結合親和性の使用が適当であると考えられた。
【0327】
同様に、A1−およびA24−拘束ペプチドに関する免疫原性データは少ない。1つの好ましいCTLエピトープ1069.04は、急性HBV患者からのリコール応答において認識されることが報告された。これまでの節で議論したように結合親和性<100nMのペプチドの高い割合は免疫原性であることがわかる。この理由で、結合親和性<100nMであるすべてのA1およびA24ペプチドは好ましいCTLエピトープと見なされた。この選択基準を用いて、3個のA1−拘束ペプチドおよび6個のA24−拘束ペプチドは、候補エピトープとして確認される。詳しい分析で、3個のコア由来ペプチドが中間の親和性を有するA24と結合することが見出された。この研究の過程で、比較的少ないコアエピトープしか識別されなかったので、抗原適用範囲により大きな冗長性をもたらすために、中間のA24結合性コアペプチドも好ましいエピトープのセットに包含された。
【0328】
好ましいHBV由来HTLエピトープのリストは、表XXXVIIに要約される。HTLエピトープのセットは、12個のDRスーパーモチーフ結合性ペプチドおよび4個のDR3結合性ペプチドを含む。HTLエピトープの大部分はポリメラーゼに由来する;2個のエンベロープおよび2個のコアに由来するエピトープも好ましいHTLエピトープのセットに含まれる。HTLエピトープのパネルによって表わされる、評価された集団適用範囲の合計は、5つの主要人種集団の各々において91%を超えている(表XXXVIII)。
【0329】
実施例9:プライミング後に内因的にプロセシングされる抗原の生成の認識
この実施例は、実施例1〜5に記載されるように同定されかつ選択されたネイティブなペプチドエピトープまたは類似のペプチドエピトープにより誘導されるCTLが、内因的に合成される、すなわちネイティブな抗原を認識することを決定する。
【0330】
実施例3におけるようなペプチドエピトープ(例えば、HLA−A2スーパーモチーフ保有エピトープ)を用いて免疫されたトランスジェニックマウスから単離されたエフェクター細胞を、ペプチドでコートされた刺激細胞を使用してインビトロで再刺激する。6日後、エフェクター細胞を、細胞傷害性についてアッセイし、そしてペプチド特異的細胞傷害性活性を含む細胞株をさらに再刺激する。さらに6日後、これらの細胞株を、ペプチドの非存在下または存在下で、51Cr標識Jurkat−A2.1/Kb標的細胞に関する細胞傷害性活性について試験し、そしてまた、内因的に合成された抗原を保有する51Cr標識標的細胞(例えば、HBV発現ベクターを用いて安定にトランスフェクトされる細胞)に関して試験する。
【0331】
この結果は、ペプチドエピトープを用いてプライムされた動物から得られたCTL系統が、内因的に合成されたHBV抗原を認識することを示す。このような分析に使用されるべきトランスジェニックマウスモデルの選択は、評価されているエピトープに依存する。HLA−A*0201/Kbトランスジェニックマウスに加え、いくつかの他のトランスジェニックマウスモデル(ヒトA11を有するマウスを含む)(これはまた、A3エピトープ、およびB7対立遺伝子を評価するために使用され得る)が特徴付けられており、そして他(例えば、HLA−A1およびA24に対するトランスジェニックマウス)が開発されている。HLA−DR1マウスモデルおよびHLA−DR3マウスモデルもまた開発されており、これを、HTLエピトープを評価するために使用し得る。
【0332】
実施例9:トランスジェニックマウスにおけるCTL−HTL結合体化エピトープの活性
本実施例は、HBV CTL/HTLペプチド結合体の使用によるトランスジェニックマウスにおけるCTLおよびHTLの誘導を例示する。同様な研究はOseroffら、Vaccine 16:823−833(1998)に見出される。
【0333】
ペプチド組成物は、複数のCTLおよび/またはHTLエピトープを含むことができ、さらに、複数HPV標的抗原から選択されるエピトープを含み得る。エピトープは実施例1〜6に記載されるような方法論を用いて識別される。例えば、そのようなペプチド組成物は、例えば、多数のHLAファミリーのメンバーと500nM以下の親和性で結合する少なくとも1つのCTLエピトープ、またはそのエピトープのアナログを含む好ましいエピトープと結合するHTLエピトープを含み得る。所望であれば、ペプチドは脂質化(lipidated)されてもよい。
【0334】
免疫手順:トランスジェニックマウスの免疫は文献記載(Alexanderら、J.Immunol.159:4753−4761、1997)のように実行される。例えば、A2/Kbマウス(それらはヒトHLA A2.1対立遺伝子に関する遺伝子組換体で、HLA−A*0201モチーフまたはHLA−A2スーパーモチーフ保有エピトープの免疫原性の評価に役立つ)は、不完全フロイントアジュバント中で、またはペプチド組成物が脂質化されたCTL/HTL結合体である場合は、DMSO/食塩水の中で、もしくはペプチド組成物がポリペプチドである場合は、PBSあるいは不完全フロイントアジュバント中で、皮下に(尾の基部)に0.1mlのペプチドをプライミングされる。プライミングの7日後に、これらの動物から得られた脾細胞は、ペプチドで覆われた、照射された同質遺伝子LPS−活性化リンパ芽球で新たに刺激される。
【0335】
細胞株:ペプチド特異的細胞傷害性アッセイのための標的細胞は、HLA−A2.1/Kbキメラ遺伝子を用いてトランスフェクトされたJurkat細胞である(例えば、Vitielloら、J.Exp.Med.173:1007、1991)。
【0336】
インビトロのCTL活性:プライムの1週間後、脾臓細胞(30×106細胞/フラスコ)を、37℃において、10mlの培養培地/T25フラスコ中で、同族の、照射された(3000ラド)、ペプチドコートされたリンパ芽球(10×106細胞/フラスコ)と、共培養する。6日後、エフェクター細胞を回収し、細胞毒性活性についてアッセイする。
【0337】
細胞傷害性活性についてのアッセイ:標的細胞(1.0〜1.5×106)を、37℃において、200μlの51Crの存在下でインキュベートする。60分後、細胞を3回洗浄し、そしてR10培地で再懸濁する。1μg/mlの濃度において必要とされるペプチドを添加する。アッセイについて、104 51Cr標識標的細胞を、Uボトムの96穴プレートにおいて、異なる濃度のエフェクター細胞(200μlの最終用量)に添加する。37℃におけるインキュベーション6時間後、上清の0.1mlのアリコートを、各穴から除去し、そして放射活性を、マイクロメディック(micromedic)自動γ計測器において計測する。百分率特異的溶解を、式により測定する:百分率特異的放出=100×(実験的放出−自発的放出)/(最大放出−自発的放出)。同じ条件下の別個のCTLアッセイの実行の間で、比較を容易にするために、%51Cr放出データを、溶解単位/106個の細胞として表す。1つの溶解単位を、6時間51Cr放出アッセイにおいて10,000個の標的細胞である30%の溶解を達成するために必要とされるエフェクター細胞の数として任意に規定する。特異的な溶解単位/106を得るために、ペプチドの非存在下で得られる溶解単位/106を、ペプチドの存在下で得られる溶解単位/106から引く。例えば、30%の51Cr放出が、ペプチドの非存在下、50:1のエフェクター(E):標的(T)比(すなわち、10,000個の表TKEII標的に対して、5×105個のエフェクター細胞)において、およびペプチドの存在下、5:1のエフェクター(E):標的(T)比(すなわち、10,000個の標的に対して、5×104個のエフェクター細胞)において得られるならば、特異的溶解単位は、[(1/50,000)−(1/500,000)]×106=18LUである。
【0338】
この結果を、免疫原性CTL/HTL結合体ワクチン沈殿物を注入された動物のCTL応答の大きさを評価するために、分析し、そして実施例3で概略されるようなCTLエピトープを使用して達成されるCTL応答の大きさと比較する。これと類似する分析を、複数のCTLエピトープおよび/または複数のHTLエピトープを含むペプチド結合体の免疫原性を評価するために実施し得る。これらの手順に従って、CTL応答を誘導し、そして付随して、HTL応答を、このような組成物の投与に際して誘導することを見出す。
【0339】
実施例10.HBV特異的ワクチン中の含有のためのCTLエピトープおよびHTLエピトープの選択
本実施例は、本発明のワクチン組成物のためのペプチドエピトープの選択についての手順を例示する。この組成物中のペプチドは、核酸配列の形態で、ペプチドをコードする単一または1つまたは複数の配列(すなわち、ミニ遺伝子)であり得るか、または単一のエピトープおよび/またはポリエピトープなペプチドであり得る。
【0340】
以下の原理は、ワクチン組成物中の含有のためのエピトープアレイを選択する際に用いられる。選択を行うためには以下の原理のそれぞれのバランスを取る。
【0341】
投与の際に、HBV除去と相互に関係があることが観察されている免疫応答を模倣するエピトープを選択する。使用するエピトープの数は自然にHBVを解消する患者の観察に依存する。例えば、自然にHBVを解消する患者が少なくとも1つのHPB抗原上で少なくとも3個のエピトープに対する免疫応答を生ずることが観察された場合、次いで、3〜4個のエピトープがHLAクラスIに包含されるべきである。同様の理由がHLAクラスIIエピトープを決定するのにも使用される。
【0342】
エピトープはしばしば、HCLクラスI分子に対する500nM以下のIC50の結合親和性を有するか、またはクラスIIに対する1000nM以下のIC50の結合親和性を有するエピトープを選択する。
【0343】
十分なスーパーモチーフ保有ペプチド、または対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイを、広範な集団適用範囲を与えるために選択する。例えば、エピトープを、少なくとも80%の集団適用範囲を提供するために選択する。モンテカルロ分析(当該分野で公知の統計的評価)を使用して、集団適用範囲の広さ、または重複を評価し得る。
【0344】
ポリエピトープ組成物(例えば、ミニ遺伝子)を作製する場合、典型的には、目的のエピトープを含む可能な最も小さいペプチドを生成することが所望される。この使用される原理は、ネストされるエピトープを含むペプチドを選択する場合に使用される原理と同じでない場合、類似する。
【0345】
同一の標的タンパク質の多数の変種の配列が利用可能である場合、タンパク質ペプチドエピトープはその保存性に基づいて選択することもできる。例えば、保存性の基準は、HLAクラスI結合ペプチドの全配列またはクラスII結合ペプチドの全9マーのコアが、特定のタンパク質抗原について評価される配列の指定されたパーセンテージで保存されることを規定してもよい。
【0346】
ワクチン組成物中の含有のためのペプチドエピトープを、例えば、表XXXVIIaおよびbに列挙されるエピトープから選択する。選択されるペプチドから構成されるワクチン組成物は、投与される場合、安全で、効果的であり、そして急性HBV感染を排除する免疫応答の大きさに類似の免疫応答を誘発する。
【0347】
実施例11:ミニ遺伝子の複数のエピトープDNAプラスミドの構築
この実施例は、ミニ遺伝子発現プラスミドの構築のための誘導を提供する。ミニ遺伝子プラスミドは、もちろん、本明細書中に記載されるようなCTLおよび/またはHTLエピトープもしくはエピトープのアナログの種々の構造を含み得る。発現プラスミドの構築および評価の例を、例えば、同時に係属しているU.S.S.N.09/311,784(5/13/99に出願された)において記載する。このようなプラスミドの例を図2に示し、ミニ遺伝子構築物におけるHBVエピトープの位置を例示する。こうしたプラスミドは、例えば、複数のCTLおよびHTLペプチドエピトープも含み得る。
【0348】
ミニ遺伝子発現プラスミドは、典型的には、複数のCTLペプチドエピトープおよびHTLペプチドエピトープを含み得る。本実施例において、HLA−A2スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープ、HLA−A3スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープ、HLA−B7スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープならびにHLA−A1モチーフ保有ペプチドエピトープおよびHLA−A24モチーフ保有ペプチドエピトープを、DRスーパーモチーフ保有エピトープおよび/またはDR3エピトープと共に使用する(図2)。好ましいエピトープを、例えば、表XXVI〜XXXIIIにおいて同定する。複数のスーパーモチーフ/モチーフが広範な集団適用範囲を保証するために示されるように、複数のHBV抗原(例えば、コア、ポリメラーゼおよびXタンパク質)由来のHLAクラスIスーパーモチーフまたはモチーフ保有ペプチドエピトープを選択する。同様に、HLAクラスIIエピトープを、複数のHBV抗原から選択し、広範な集団適用範囲を提供し、すなわち、HLA DR−1−4−7スーパーモチーフ保有エピトープおよびHLA DR−3モチーフ保有エピトープを、ミニ遺伝子構築物中の含有のために選択する。次いで、選択されたCTLエピトープおよびHTLエピトープを、発現ベクターにおける発現のためにミニ遺伝子中に組み込む。
【0349】
本実施例は、このようなミニ遺伝子保有発現プラスミドの構築に使用される方法を示す。ミニ遺伝子組成物のために使用され得る他の発現ベクターは利用可能であり、そして当業者に公知である。
【0350】
ミニ遺伝子DNAプラスミドは、コンセンサスKozak配列ならびにコンセンサスマウスκIg軽鎖シグナル配列、続いて本明細書中に開示された原理に従って選択されたCTLエピトープおよび/またはHTLエピトープのストリングを含む。
【0351】
15個のヌクレオチド重複を含む平均約70ヌクレオチド長である重複オリゴヌクレオチド(例えば、8個のオリゴヌクレオチド)を合成し、そしてHPLC精製する。このオリゴヌクレオチドは、選択されたペプチドエピトープならびに適切なリンカーヌクレオチドをコードする。最終的なマルチエピトープミニ遺伝子を、PCRを用いる3セットの反応で重複オリゴヌクレオチドを伸長することによって結合する。Perkin/Elmer9600PCR機器を使用し、そして以下の条件を使用して全部で30サイクルを実施する:95℃で15分間、アニーリング温度(各プライマー対の最も低く計算されたTmより5°下)で30秒間、および72℃で1分間。
【0352】
第1回目のPCR反応について、2つのオリゴヌクレオチドの各々の5μgを、アニーリングし、そして伸長する:オリゴヌクレオチド1+2、3+4、5+6、および7+8を、Pfuポリメラーゼ緩衝液(lx=10mM KCL、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris−クロライド、pH8.75、2mM MgSO4、0.1% Triton X−100、100μg/ml BSA)、0.25mM 各dNTP、および2.5UのPfuポリメラーゼを含む100μlの反応物と合わせる。全長ダイマー生成物を、ゲル精製し、そして、2つの反応物(1+2と3+4の生成物、ならびに5+6と7+8の生成物を含む)を10サイクルにわたり混合し、アニーリングし、そして伸長させる。次いで、この2つの反応物の半分を混合し、そして、5サイクルのアニーリングおよび伸長を実施し、その後に、隣接プライマーを添加して、全長生成物をさらに25回サイクルで増幅する。全長生成物を、ゲル精製し、そしてpCR−blunt(Invitrogen)にクローン化し、そして、個々のクローンを、配列決定によってスクリーニングする。
【0353】
実施例12.プラスミド構築およびこの構築物が免疫原性を誘導する程度
プラスミド構築物(例えば、実施例11に従って構築されたプラスミド)が免疫原性を誘導し得る程度を、エピトープを発現する核酸構築物を備えたAPCの形質導入またはトランスフェクションに続くAPCによるエピトープ提示について試験することによりインビトロで評価することができる。このような研究は、「抗原性」を決定し、そして、ヒトAPCの使用を可能にする。このアッセイは、ある状況においてAPCによって提示されるこのエピトープの能力を示し、この状況は、細胞表面上のエピトープ−HLAクラスI複合体の密度を定量することによって、T細胞により認識される。定量を、APCから溶出されたペプチドの量を直接測定することによって実施し得る(例えばSijtsら、J.Immunol.156:683−692、1996;Demotzら、Nature 342:682−684、1989参照);または、ペプチド−HLAクラスI複合体の数を、感染もしくはトランスフェクトされた標的細胞によって誘導された溶解物またはリンホカイン放出の量を測定し、次いで、等価なレベルの溶解物またはリンホカイン放出を得るのに必要であるペプチドの濃度を決定することによって評価することができる(例えばKageyamaら、J.Immunol.154:567−576、1995参照)。
【0354】
あるいは、免疫原性は、マウスへのインビボ注入およびこれに続くCTLおよびHTL活性のインビトロ評価を通じて評価することができ、CTLおよびHTL活性はそれぞれ、例えば、同時係属する1999年5月13日に出願されたU.S.S.N.09/311,784およびAlexanderら、Immunity 1:751−761、1994に詳述されるように、細胞傷害性および増殖アッセイを用いて分析される。
【0355】
例えば、少なくとも1つのHLA−A2スーパーモチーフペプチドを含むDNAミニ遺伝子構築物(例えば、U.S.S.N.09/311、784に記載されているようにして生成されるpMinミニ遺伝子構築物)がCTLをインビボで誘導する能力を評価するために、HLA−A2.1/Kbトランスジェニックマウスを、例えば100μgの裸のcDNAを用いて筋内で免疫する。cDNA免疫によって誘導されたCTLのレベルを比較するための手段として、対照の動物群もまた、実際のペプチド組成物(これは、ミニ遺伝子によってコードされるのと同様に単一のポリペプチドとして合成される複数エピトープを含む)で免疫する。
【0356】
免疫動物からの脾細胞を、各それぞれの組成物(ミニ遺伝子またはポリエピトープペプチドにコードされるペプチドエピトープ)で2回刺激し、次いで、51Cr放出アッセイにおいてペプチド特異的細胞傷害活性についてアッセイする。この結果は、A2拘束エピトープに対して指向されるCTL応答の大きさを示し、したがって、ミニ遺伝子ワクチンおよびポリエピトープワクチンのインビボ免疫原性を示す。したがって、このミニ遺伝子が、ポリエピトープペプチドワクチンと同様に、HLA−A2スーパーモチーフペプチドエピトープに対して指向される免疫応答を誘発することを見出した。同様の分析がまた、他のHLA−A3トランスジェニックマウスモデルおよびHLA−B7トランスジェニックマウスモデルを用いて実施され、HLA−A3モチーフおよびHLA−B7モチーフまたはHLA−A3スーパーモチーフおよびHLA−B7スーパーモチーフによるCTL誘導を評価する。
【0357】
ミニ遺伝子をコードするクラスIIエピトープのインビボでのHTL誘導能力を評価するために、DRトランスジェニックマウスを、あるいは適当なマウスMHC分子と交差反応するそうしたエピトープについて評価するために、例えば、I−Ab拘束マウスを、プラスミドDNA100μgを用いて筋内に免疫する。DNA免疫付与により誘導されるHTLレベルと比較する手段として、対照動物の一群も完全フロイントアジュバントに乳化させた実際のペプチド組成物で免疫する。CD4+T細胞、すなわちHTLを、被免疫動物の脾細胞から精製し、各組成物(ミニ遺伝子中にコードされたペプチド)それぞれで刺激する。3H−チミジン組み込み増殖アッセイ(例えば、Alexanderら、Immunity 1:751−761、1994参照)を用いてHTL応答を測定する。結果はHTL応答の大きさを示し、従って、ミニ遺伝子のインビボでの免疫原性を実証する。
【0358】
実施例11に記載するように構築されるDNAミニ遺伝子は、プライムブーストプロトコルを用いてブースト剤と組み合わせたワクチンとして評価してもよい。ブースト剤は、組換えタンパク質(例えば、Barnettら、Aids Res.and Human Retroviruses 14、Supplement 3:S299−S309、1998)または組換えワクチン、例えば、目的の完全タンパク質をコードするミニ遺伝子またはDNAを発現するもの(例えば、Hankeら、Vaccine 16:439−445、1998;Sedegahら、Proc.Natl.Acad.Sci USA 95:7648−53、1998;HankeおよびMcMichael、Immunol.Letters 66:177−181、1999;およびRobinsonら、Nature Med.5:526−34、1999)から構成することができる
【0359】
例えば、プライムブーストプロトコルで使用されるDNAミニ遺伝子の効能は、最初はトランスジェニックマウスで評価する。この例では、A2.1/Kbトランスジェニックマウスを100μgのDNAミニ遺伝子(少なくとも1つのHLA−A2スーパーモチーフ保有ペプチドを含む免疫原性ペプチドをコードする)でIMにより免疫する。インキュベーション期間(3〜9週間の範囲)の後、DNAミニ遺伝子によってコードされるのと同一の配列を発現する組換えワクチンウイルス107pfu/マウスを用いて、マウスをIPでブーストする。対照マウスは、ミニ遺伝子配列を含まない100μgのDNAまたは組換えワクチンで免疫するか、ミニ遺伝子をコードするDNAを用いるがワクチンブーストは行わずに免疫する。さらに2週間のインキュベーション期間の後、ELISPOTアッセイにおいてペプチド特異的活性についてマウスからの脾細胞を直ちに分析する。さらに、ミニ遺伝子内にコードされるA2拘束ペプチドエピトープおよび組換えワクチンを用いて脾細胞をインビトロで刺激し、次いで、INF−γ ELISAにおいてペプチド特異的活性について分析する。
【0360】
プライムブーストプロトコルにおいて利用されるミニ遺伝子は、DNA単独よりもHLA2−A2スーパーモチーフペプチドに向けてより大きな免疫応答を誘発することが見出される。こうした分析は、HLA−A11またはHLA−B7トランスジェニックマウスモデルを用いてHLA−A3またはHLA−B7モチーフまたはスーパーモチーフエピトープにより誘導されるCTLを評価して行うこともできる。
【0361】
人間におけるプライムブーストプロトコルの使用は実施例20に記載する。
【0362】
実施例13:予防的使用のためのペプチド組成物
本発明のワクチン組成物は、感染の危険性がある人のHJBV感染を予防するのに用いることもできる。例えば、実施例9および/または実施例10に選択されるような複数のCTLエピトープおよびHTLエピトープを含むポリエピトープペプチドエピトープ組成物(またはこれを含む核酸)であって、集団の80%より多くを標的とするように選択される組成物を、HBV感染の危険性がある個体に投与する。
【0363】
例えば、複数のエピトープを包む単一のポリペプチドとしてペプチドベースの組成物を提供することができる。このワクチンは、典型的には、フロイント不完全アジュバントなどのアジュバントを含む生理学的溶液中に投与される。最初の免疫のためのペプチドの用量は、70kgの患者に対して、約1〜約50,000μg、一般的に100〜5,000μgである。ワクチンの最初の投与の後に、続いて4週でブースター投与量、PBMCサンプル中のエピトープ−特異的CTL集団の存在を決定する技術によるこの患者における免疫応答の大きさの評価が続く。必要とされるならば、さらなるブースター投与量を投与する。この組成物は、HPV感染に対する予防法として、安全かつ効果的の両方であることが見出される。
【0364】
あるいは、トランスフェクト剤を典型的に含む組成物を、当該分野で公知の方法論および本明細書中に開示される方法論に従って、核酸ベースのワクチンを投与するために使用することができる。
【0365】
実施例14:ネイティブなHBV配列由来のポリエピトープワクチン組成物
ネイティブなHBVポリタンパク質配列を、好ましくは各クラスIおよび/またはクラスIIのスーパーモチーフまたはモチーフについて規定されたコンピュータアルゴリズムを用いてスクリーニングし、複数のエピトープを含むポリタンパク質の「比較的に短い(relatively short)」領域を同定する。そして、この配列は、好ましくは、ネイティブ抗原全体よりも短い長さである。複数の異なる、重複さえしているエピトープを含むこの比較的に短い配列を選択し、そして使用してミニ遺伝子構築物を作製する。この構築物を操作して、ネイティブなタンパク質配列に対応するペプチドを発現させる。「比較的に短い」ペプチドは、一般的に、250アミノ酸長より短く、しばしば100アミノ酸長より短く、好ましくは75アミノ酸長より短く、そしてより好ましくは50アミノ酸長より短い。上述のワクチン組成物のタンパク質配列は、配列内に含まれる最大数のエピトープを有する、すなわち高いエピトープ濃度を有するので、選択される。本明細書中で述べられるように、エピトープモチーフがネスト(be nested)されてもよいし、重複(すなわち、互いに関してフレームシフトする)であってもよい。例えば、f重複エピトープを有する、2つの9マーのエピトープおよび1つの10マーのエピトープが10アミノ酸ペプチド中に存在し得る。このようなワクチン組成物を、治療目的または予防目的のために投与する。
【0366】
ワクチン組成物は、例えば、少なくとも1つのHBV標的抗原由来の3つのCTLエピトープおよび少なくとも1つのHTLエピトープを含む。このポリエピトープのネイティブな配列は、ペプチドとしてかまたはこのペプチドをコードする核酸配列としてかのいずれかで投与される。あるいは、アナログが、このネイティブな配列から作製され得、これによって、1つまたは複数のエピトープは、ポリエピトープペプチドの交差反応性および/または結合親和性特性を変化させる置換を含む。
【0367】
本実施例の実施形態は、免疫系プロセシングの今まで発見されていない態様が、ネイティブなネスト配列(nested sequence)に適用され、これによって、治療的または予防的な免疫応答を誘導するワクチン組成物の生成を容易にする可能性を提供する。さらなるこのような実施形態は、現在未知であるHLA構造に関するモチーフ保有エピトープの可能性を提供する。さらに、本実施形態(アナログを欠く)は、ネイティブなHBV抗原に実際に存在する複数のペプチド配列に対する免疫応答を指向し、したがって、任意の連結エピトープを評価する必要を回避する。最後に、本実施形態は、核酸ワクチン組成物を生成する場合に規模の経済を提供する。
【0368】
本実施例に関連して、コンピュータプログラムは、当該分野における原理に従って導かれ得、これは、標的配列において、配列長当たりの最も大きい数のエピトープを同定する。
【0369】
実施例15.複数の疾患に指向されるポリエピトープワクチン組成物
本発明のHBVペプチドエピトープを、1つまたは複数の他の疾患に関連する標的抗原由来のペプチドエピトープと共に使用し、HBVならびに他の疾患の予防または治療に有用であるワクチン組成物を作製する。他の疾患の例としては、HIVおよびHCVおよびHPVが挙げられるが、これらに限定されない。
【0370】
例えば、集団の98%より多くを標的とする複数のCTLエピトープおよびHTLエピトープを含むポリエピトープなペプチド組成物は、HBV感染およびHIV感染の両方について危険性がある個体に投与するために作製され得る。この組成物は、種々の疾患に関連される供給源由来の複数のエピトープを組み込む単一ポリペプチドとして提供され得るか、または1つまたは複数の異なるエピトープを含む組成物として投与され得る。
【0371】
実施例16.免疫応答を評価するためのペプチドの使用
本発明のペプチドを使用して、HBVを指向する特異的CTL集団またはHTL集団の存在について、免疫応答を分析し得る。このような分析は、Oggら、Science 279:2103−2106、1998に記載されるような方法で実施され得る。以下の実施例において、本発明に従うペプチドを、免疫原としてではなく、診断目的または予防目的のための試薬として使用する。
【0372】
本実施例において、高度に感受性のヒト白血球抗原テトラマー複合体(「テトラマー」)を、例えば、感染の異なる段階におけるHLA A*0201陽性個体由来のHBV HLA−A*0201特異的CTL頻度、または引き続くA*0201モチーフを含むHBVペプチドを用いた免疫の断面(cross−sectional)分析に使用する。テトラマー複合体を、記載されるように合成する(Museyら、N.Engl.J.Med.337:1267、1997)。簡潔に言うと、精製HLA重鎖(本実施例におけるA*0201)およびβ2ミクログロブリンを、原核生物発現系の手段によって合成する。この重鎖を、膜貫通細胞質テイルの欠失およびBirA酵素ビオチン化部位を含む配列のCOOH末端添加によって改変する。重鎖、β2ミクログロブリン、およびペプチドを、希釈によって再度折り畳む。45kDの再度折り畳まれた生成物を、高速タンパク質液体クロマトグラフィーによって単離し、次いで、ビオチン(Sigma、St.Louis、Missouri)、アデノシン5’三リン酸、およびマグネシウムの存在下で、BirAによってビオチン化する。ストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体を、1:4のモル比で添加し、そして、テトラマー生成物を、1mg/mlに濃縮する。得られた生成物を、テトラマー−フィコエリトリンと呼ぶ。
【0373】
患者の血液サンプルの分析に関して、約100万個のPBMCを、300gで5分間遠心分離し、そして、50μlの冷リン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁する。三色分析を、抗CD8−Tricolor、および抗CD38と共に、テトラマー−フィコエリトリンで実施する。PBMCを、テトラマーおよび抗体を用いて氷上で30〜60分間インキュベートし、次いで、ホルムアルデヒド固定の前に2回洗浄する。99.98%を越える対照サンプルを含むようにゲートを適用する。テトラマーについての対照としては、A*0201陰性個体およびA*0201陽性未感染ドナーの両方が挙げられる。次いで、テトラマーで染色された細胞の割合を、フローサイトメトリーによって決定する。この結果は、エピトープ拘束CTLを含むPBMCサンプル中の細胞数を示し、これによって、HBVエピトープに対する免疫応答の程度を直ちに示し、このようにして、HBV感染の段階、HBVへの曝露の状態または保護的応答もしくは治療的応答を誘発するワクチンへの曝露を示す。
【0374】
実施例17:リコール応答(recall response)を評価するためのペプチドエピトープの使用
本発明のペプチドエピトープを、患者における急性応答またはリコール応答などのT細胞応答を評価するための試薬として使用する。このような分析は、感染から回復した患者、HBVに慢性的に感染する患者、またはHBVワクチンをワクチン接種された患者に対して実施され得る。
【0375】
例えば、ワクチン接種された個体のクラスI拘束CTL応答を、分析し得る。ワクチンは、任意のHBVワクチンでよい。PBMCを、ワクチン接種された個体およびHLA型の個体から回収する。次いで、複数のHLAスーパータイプファミリーのメンバーとの交差反応性を提供するスーパーモチーフを最適には保有する本発明の適切なペプチドエピトープを、そのHLA型を保有する個体由来のサンプルの分析のために使用する。
【0376】
ワクチン接種された個体由来のPBMCを、Ficoll−Histopaque密度勾配(Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)上で分離し、HBSS(GIBCO Laboratories)中で3回洗浄し、RPMI−1640(GIBCO Laboratories)(これは、L−グルタミン(2mM)、ペニシリン(50U/ml)、ストレプトマイシン(50μg/ml)、およびHepes(l0mM)が補充され、10% 熱不活性化ヒトAB血清を(完全RPMI)を含む)中に再懸濁し、そして、マイクロ培養(microculture)形式を用いて平面培養する。本発明のエピトープを含む合成ペプチドを、10μg/mlで各ウェルに添加し、そしてHBVコア128〜140エピトープを、刺激の最初の週の間に、T細胞補助の供給源として1μg/mlで各ウェルに添加する。
【0377】
マイクロ培養形式において、4×105個のPBMCを、96ウェルの丸底プレートにおいて100μl/ウェルの完全RPMI中、8個の複製培養物において、ペプチドで刺激する。3日目および10日目に、100mlの完全RPMIおよび20U/ml最終濃度のrIL−2を各ウェルに添加する。7日目に、培養物を、96ウェルの平底プレートに移し、そして、ペプチド、rIL−2および105個の照射された(3,000rad)自系供給細胞で再刺激する。培養物を、14日目に、細胞傷害活性に関して試験する。陽性のCTL応答は、以前に記載されたように(Rehermannら、Nature Med.2:1104、1108、1996;Rehermannら、J.Clin.Invest.97:1655−1665、1996;およびRehermannら、J.Clin.Invest.98:1432−1440、1996)未感染の対照被験体との比較に基づいて、10%より大きい特異的51Cr放出を示すために、8個の複製培養物のうちの2つ以上を必要とする。
【0378】
標的細胞株は、自系および同種異系のEBV形質転換B−LCLであり、これらは、American Society for Histocompatibility and Immunogenetics(ASHI、Boston、MA)から購入されるか、または記載されたように(Guilhotら、J Virol.66:2670−2678、1992)患者のプールから確立されるかのいずれかである。
【0379】
細胞傷害性アッセイを、以下の方法で実施する。標的細胞は、同種異系のHLAが一致したBリンパ芽球細胞株または自系EBV形質転換Bリンパ芽球細胞株のいずれかからなり、これらの細胞株を、10μMの本発明の合成ペプチドエピトープと共に一晩インキュベートし、そして100μCiの51Cr(Amersham Corp.、Arlington Heights、IL)を用いて1時間標識し、この後、これらをHBSSを用いて4回洗浄する。
【0380】
細胞傷害活性を、3,000個の標的/ウェルを含むU底の96ウェルプレートを用いて、標準的な4−h、分裂ウェル(split well)51Cr放出アッセイにおいて決定する。刺激されたPBMCを、14日目に、20〜50:1のエフェクター/標的(E/T)比において試験する。百分率細胞傷害性を、式:100×[(実験的な放出−自発的な放出)/最大の放出−自発的な放出)]から決定する。最大の放出は、洗浄剤(2% Triton X−100;Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)による標的の溶解により決定する。自発的な放出は、全ての実験に対して、最大放出の25%未満である。
【0381】
このような分析の結果は、HLA拘束CTL集団がHBVまたはHBVワクチンへの事前の曝露によって刺激された程度を示す。
【0382】
同様にクラスII拘束HTL応答も分析され得る。精製されたPBMCを、96ウェル平底プレート中、1.5×105細胞/ウェルの密度で培養し、そして10μg/mlの合成ペプチド、全抗原、またはPHAを用いて刺激する。細胞を、慣用的に、各条件について4〜6ウェルの反復実験において平面培養する。培養の7日後、この培地を取り除き、そして、10U/mlのIL−2を含む新鮮な培地で置きかえる。2日後、1μCi 3H−チミジンを、各ウェルに添加し、そしてさらなる18時間インキュベーションを続ける。次いで、細胞性のDNAを、ガラスファイバーマット上に収集し、そして、3H−チミジン取りこみについて分析する。抗原特異的T細胞増殖を、抗原の存在下での3H−チミジン取りこみを抗原の非存在下での3H−チミジン取り込みで割った比として、算出する。
【0383】
実施例18:ヒトにおける特異的CTL応答の誘導
本発明のHBV CTLエピトープおよびHTLエピトープを含む免疫原性組成物に関するヒト臨床試験を、INDフェーズI、用量増大研究(5、50、および500μg)として設定し、そして、無作為化、二重ブラインドのプラシーボ制御された試験として実行する。このような試験は、例えば以下のように設計される:
全部で約27人の被験体を、登録し、そして3群に分ける:
群I:3人の被験体に、プラシーボを注射し、そして6人の被験体に、5μgのペプチド組成物を注射する;
群II:3人の被験体に、プラシーボを注射し、そして6人の被験体に、50μgのペプチド組成物を注射する;
群III:3人の被験体に、プラシーボを注射し、そして6人の被験体に、500μgのペプチド組成物を注射する。
【0384】
最初の注射の4週間後、全ての被験体に同じ投与量でブースター接種を受けさせる。
【0385】
本研究において測定された終点は、ペプチド組成物の安全性および寛容性ならびにこの組成物の免疫原性に関連する。ペプチド組成物に対する細胞性免疫応答は、このペプチド組成物の固有の活性の指標であり、従って、生物学的効果の測定としてみなされ得る。以下に、安全性および効果の終点に関する臨床データおよび実験室データを要約する。
【0386】
安全性:有害事象の発生率を、プラシーボ処置群および薬物処置群においてモニターし、そして、程度および可逆性に関して評価する。
【0387】
ワクチン効果の評価:ワクチン効果の評価に関して、被験体を、注射の前および注射の後に採血する。末梢血単核細胞を、新鮮なヘパリン処理された血液からFicoll−Hypaque密度勾配遠心分離によって単離し、凍結培地に等分し、そして凍結保存する。サンプルを、CTL活性およびHTL活性についてアッセイする。
【0388】
このようにして、ワクチンが、安全かつ有効であることの両方を見出される。
【0389】
実施例19:HBVに感染した患者におけるフェーズII試験
フェーズII試験を、慢性HBV感染を有する患者(男性および女性)へのCTL−HTLペプチド組成物の投与の効果を研究するために実施する。この試験の主要な目的は、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)における一過性発赤(transient flare)、ALTの正常化、およびHBV DNAの減少によって明らかにされるように、慢性的に感染されるHBV患者においてCTLを誘導するための有効な用量および投与計画を決定すること、これらの患者におけるCTL応答を誘導することの安全性を確立すること、および、どの程度までCTL活性化が慢性的に感染されるCTL患者の臨床状況を改善するかを調べることである。このような研究は、例えば以下のように設計される:
本研究は、米国およびカナダの複数のセンターで実施される。試験の設計は、オープン標識の非制御された用量増大プロトコルであって、ここで、ペプチド組成物は、単一用量として投与され、6週間後に引き続き同じ用量の単一ブースターショットによって投与される。用量は、1回の注射当たり50、500、および5,000μgである。薬物関連有害効果が記録される。
【0390】
3つの患者群が存在する。第1の群を、50μgのペプチド組成物を有して注射し、そして第2群および第3群を、それぞれ、500および5,000μgのペプチド組成を有してで注射する。各群の中の患者は、年齢が21〜65歳の範囲であり、男性および女性の両方を含む。患者は多様な人種背景を表す。この患者らは全員が、HBVに5年間以上感染しており、そして、彼ら全員は、HIV陰性、HCV陰性およびHDV陰性であるが、陽性レベルのHBe抗原およびHBs抗原を有する。
【0391】
ALT発赤の大きさおよび発生率および血液中のHBV DNAのレベルを、ペプチド組成物の投与の効果を評価するためにモニターする。血液中のHBV DNAのレベルは、治療の進行の間接的な指標である。ワクチン組成物は、慢性HBV感染の治療において、安全かつ有効であることの両方を見出される。
【0392】
実施例20.プライムブースト(prime boost)プロトコルを用いたCTL応答の誘導
同様に、プライムブーストプロトコルを、ワクチンのヒトへの投与のために使用することもできる。このようなワクチン投与計画としては、例えば裸のDNAの初回投与、続くこのワクチンをコードする組換えウイルスを用いるブースト、または組換えタンパク質/ポリペプチドもしくはアジュバント中に投与されるペプチド混合物の初回投与が挙げられる。
【0393】
例えば、初回免疫は、実施例11に構築されたような発現ベクターを用いて、複数の部位に0.5〜5mgの量で、IM(またはSCまたはID)で投与される裸の核酸の形態で、実施してよい。同様に、核酸(0.1〜1000μg)を、遺伝子銃を用いて投与することもできる。次いで、3〜4週間のインキュベーション期間の後、ブースター用量を投与する。このブースターは、5×107〜5×109pfuの用量で投与される組換え鶏痘ウイルスであり得る。MVA、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスなどの代替の組換えウイルスも同様に、このブースターに使用することができ、あるいは、ポリエピトープなタンパク質もしくはこのペプチドの混合物を投与することができる。ワクチン効果の評価のために、患者の血液サンプルを、免疫前、ならびに初期ワクチンおよびブースター用量のワクチンの投与後の間に得る。末梢血単核細胞を、新鮮なヘパリン処理された血液からFicoll−Hypaque密度勾配遠心分離によって単離し、凍結培地に等分し、そして凍結保存する。サンプルを、CTL活性およびHTL活性についてアッセイする。
【0394】
この結果は、HBVに対する保護的免疫を達成するか、またはHBV感染を治療するのに十分である大きさの応答が生成されることを示す。
【0395】
実施例21.樹状細胞(DC)を用いるワクチン組成物の投与
本発明のペプチドエピトープを含むワクチンは、DCなどのAPCを用いて投与することができる。本実施例において、ペプチドパルスされたDCを、CTL応答をインビボにおいて刺激するために患者に投与する。本方法において、樹状細胞を単離し、増殖し、そして、本発明のペプチドCTLエピトープおよびペプチドHTLエピトープを含むワクチンを用いてパルスする。樹状細胞を、患者に注入して戻し、インビボにおいてCTL応答およびHTL応答を誘発する。次いで、誘導されたCTLおよびHTLは、特定の標的細胞(この細胞は、ワクチン中のエピトープが誘導されるタンパク質を保有する)を破壊するかまたはこの細胞の破壊を容易にする。
【0396】
例えば、エピトープ保有ペプチドのカクテルをエキソビボでPBMCに投与するか、それからDCを単離する。Progenipoietin(商標)(Monsanto、St.Louis、MO)やGM−CSF/IL−4などのDCの採取を用意する薬剤を用いることもできる。DCをペプチドでパルスした後であって、患者に再注入する前に、DCを洗浄して未結合ペプチドを除去する。
【0397】
臨床的に理解されるように、また、当業者によって臨床的結果に基づいて容易に決定されるように、患者に再注入されるDCの数は変化することができる(例えば、Nature Med.4:328、1998;Nature Med.2:52、1996およびProstate 32:272、1997参照)。典型的には患者当たり2〜50×106DCが投与されるが、107または108といったより多数のDCも提供し得る。このような細胞集団は典型的には50〜90%の間のDCを含む。
【0398】
いくつかの実施形態においては、ペプチド負荷されたPBMCをDCの精製を行わずに患者に注入する。例えば、Progenipoietin(商標)などの薬剤処理後で生成されるDCを含むPBMCをDCの精製を行わずに患者に注入する。投与されるPBMCの合計数はしばしば108〜1010の範囲である。一般に患者に注入される細胞の用量は、それぞれの患者の血液中のDCのパーセンテージに基づき、例えば、特異的抗DC抗体を用いる免疫蛍光分析によって決定される。したがって、例えば、与えられた患者の末梢血においてProgenipoietin(商標)が2%のDCを可動化し、その患者が5×106のDCを受け取るべきならば、次いで、患者は、全量2.5×108のペプチド負荷されたPBMCを注入されるであろう。Progenipoietin(商標)などの薬剤により可動化されるDCのパーセントは典型的には2〜10%との間である評価されるが、当業者が理解するように、これは変化し得る。
【0399】
エキソビボでのCTL/HTL応答の活性化
あるいは、HPV抗原に対するエキソビボのCTL応答またはHTL応答は、組織培養物中、患者のまたは一般的に適合性の、CTLまたはHTL前駆体細胞をDCなどのAPCの供給源および適切な免疫原性ペプチドと共にインキュベートすることによって誘導され得る。前駆体細胞が活性化され、エフェクター細胞に拡大される適切なインキュベーション時間(典型的には約7〜28日間)の後、細胞を、患者に注射して戻し、ここで、これらの細胞は、それらの特定の標的細胞を破壊するか(CTL)またはそれらの破壊を容易にする(HTL)。
【0400】
実施例22:モチーフ保有ペプチドを同定する代替方法
モチーフ保有ペプチドを同定するための別の方法は、規定されたMHC分子を保有する細胞からこれらを溶出することである。例えば、組織型(tissue typing)に使用されるEBV形質転換されたB細胞株は、HLA分子をこの細胞が発現するかを決定するために徹底的に特徴付けられてきた。特定の場合において、これらの細胞は、単一の型のHLA分子のみ発現する。これらの細胞を、病原性生物で感染し得るか、または目的の抗原(例えば、HBVタンパク質)を発現する核酸でトランスフェクトし得る。次いで、感染の結果(またはトランスフェクトの結果として)産生されたペプチドの内因性抗原プロセシングによって産生されたペプチドは、細胞内のHLA分子に結合し、輸送され細胞表面上に提示される。次いで、ペプチドを、緩酸条件に曝露することによってHLA分子から溶出し、そしてこれらのアミノ酸配列を、例えば、質量スペクトル分析によって決定する(例えば、Kuboら、J.Immunol.152:3913、1994)。なぜなら、特定のHLA分子に結合する大部分のペプチドは、モチーフ保有であることから、これは、細胞上に発現された特定のHLA分子と関連するモチーフ保有ペプチドを得るための代替様式である。
【0401】
あるいは、内因性HLA分子を発現しない細胞株を、単一のHLA対立遺伝子をコードする発現構築物でトランススフェクトし得る。次いで、これらの細胞を、記載されるように使用し得、すなわち、これらの細胞を、病原体もしくは細胞表面上に提示された目的の抗原に対応するペプチドを単離するために、病原体で感染し得るか、または目的の抗原をコードする核酸でトランスフェクトし得る。このような分析から得られたペプチドは、この細胞中で発現される単一のHLA対立遺伝子への結合に対応するモチーフを保有する。
【0402】
当業者に明らかなように、当業者は、1より多くのHLA対立遺伝子を保有する細胞について同様の分析を実施することができ、そして引続いて発現される各HLA対立遺伝子に特異的なペプチドを決定することができる。さらに、当業者はまた、タンパク質抗原を用いる負荷(loading)のような感染またはトランスフェクト以外の手段が、細胞に抗原の供給源を提供するために使用され得ることも認識するであろう。
【0403】
本願明細書中の実施例は、本発明の範囲を制限するためではなく、本発明を例示するために提供される。本発明の他の変形は、当業者に容易に明らかであり、そして添付される特許請求の範囲に含まれる。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的に関して参照よって本明細書中に組み込まれる。
【0404】
【表2】
【0405】
【表3】
【0406】
【表4】
【0407】
【表5】
【0408】
【表6】
【0409】
【表7】
【0410】
【表8】
【0411】
【表9】
【0412】
【表10】
【0413】
【表11】
【0414】
【表12】
【0415】
【表13】
【0416】
【表14】
【0417】
【表15】
【0418】
【表16】
【0419】
【表17】
【0420】
【表18】
【0421】
【表19】
【0422】
【表20】
【0423】
【表21】
【0424】
【表22】
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【表23】
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【表26】
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【表27】
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【表28】
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【表29】
【0432】
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【0452】
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【0474】
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【0482】
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【0483】
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【0488】
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【0489】
【表87】
【0490】
【表88】
【0491】
【表89】
【0492】
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【0493】
【表91】
【0494】
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【0495】
【表93】
【0496】
【表94】
【0497】
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【0498】
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【0499】
【表97】
【0500】
【表98】
【0501】
【表99】
【0502】
【表100】
【0503】
【表101】
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【表102】
【0505】
【表103】
【0506】
【表104】
【0507】
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【0508】
【表106】
【0509】
【表107】
【0510】
【表108】
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【表109】
【0512】
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【0513】
【表111】
【0514】
【表112】
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【表113】
【0516】
【表114】
【0517】
【表115】
【0518】
【表116】
【0519】
【表117】
【0520】
【表118】
【0521】
【表119】
【0522】
【表120】
【0523】
【表121】
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、平均集団における、HLA−AおよびB分子により結合したHCV候補エピトープの数の関数としての遺伝子型の総頻度のグラフを提供する。
【図2】
図2は、実験モデルのミニ遺伝子構築物中のペプチドエピトープの位置を示す。
Claims (37)
- FLLSLGIHL、FLPSDFFPSV、LPSDFFPSV、FLLTRILTI、LLVPFVQWFV、LYSHPIILGF、STLPETTVVRRおよびGLSRYVARLからなる群から選択されるエピトープをさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記エピトープが、アミノ酸リンカーに結合されることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記エピトープが、CTLエピトープと混合されるか結合されることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記エピトープが、HTLエピトープと混合されるか結合されることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記HTLエピトープが、汎DR結合分子であることを特徴とする請求項5に記載の組成物。
- リポソームをさらに含み、前記エピトープが、リポソーム上またはリポソーム内にあることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記エピトープが脂質に結合されることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記エピトープが、ヘテロポリマーであることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記エピトープが、ホモポリマーであることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記エピトープが、HLA重鎖、β2−ミクログロブリン、およびストレパビジン複合体に結合され、それによってテトラマーが形成されることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 抗原提示細胞をさらに含み、前記エピトープが、抗原提示細胞上または抗原提示細胞内にあることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記エピトープが抗原提示細胞上のHLA分子と結合され、これにより、HLA分子に拘束される細胞傷害性Tリンパ球(CTL)が存在する場合にはCTLの受容体がHLA分子とエピトープの複合体に結合することを特徴とする請求項12に記載の組成物。
- 前記抗原提示細胞が樹状細胞であることを特徴とする請求項12に記載の組成物。
- FLLSLGIHL、FLPSDFFPSV、LPSDFFPSV、FLLTRILTI、LLVPFVQWFV、LYSHPIILGF、STLPETTVVRRおよびGLSRYVARLからなる群から選択されるエピトープをさらに含むことを特徴とする請求項15に記載の組成物。
- 1つのペプチドが、少なくとも2つのエピトープを含むことを特徴とする請求項15に記載の組成物。
- 前記1つまたは複数のペプチドの少なくとも1つが、ヘテロポリマーであることを特徴とする請求項15に記載の組成物。
- 請求項15に示す群から選択されるエピトープが、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)エピトープと結合することを特徴とする請求項15に記載の組成物。
- 請求項15に示す群から選択されるエピトープが、ヘルパーTリンパ球(HTL)エピトープと結合することを特徴とする請求項15に記載の組成物。
- 前記HTLエピトープが、汎DR結合分子であることを特徴とする請求項20に記載の組成物。
- リポソームをさらに含み、前記エピトープが、リポソーム上またはリポソーム内にあることを特徴とする請求項15に記載の組成物。
- 請求項15に示す群から選択されるエピトープが、脂質に結合されることを特徴とする請求項15に記載の組成物。
- 抗原提示細胞をさらに含み、請求項15に示す群から選択されるエピトープが、抗原提示細胞上または抗原提示細胞内にあることを特徴とする請求項15に記載の組成物。
- 前記エピトープが抗原提示細胞上のHLA分子と結合され、これにより、HLA分子に拘束される細胞傷害性Tリンパ球(CTL)が存在する場合にはCTLの受容体がHLA分子とエピトープの複合体に結合することを特徴とする、請求項24に記載の組成物。
- 前記抗原提示細胞が樹状細胞であることを特徴とする、請求項24に記載の組成物。
- 1つまたは複数のペプチドと混合される追加的なペプチドをさらに含むことを特徴とする請求項15に記載の組成物。
- 前記追加的なペプチドが、CTLまたはHTLエピトープを含むことを特徴とする請求項27に記載の組成物。
- 追加的なエピトープをさらに含むことを特徴とする請求項29に記載のワクチン組成物。
- 前記追加的なエピトープが、FLLSLGIHL、FLPSDFFPSV、LPSDFFPSV、FLLTRILTI、LLVPFVQWFV、LYSHPIILGF、STLPETTVVRRおよびGLSRYVARLからなる群から選択されることを特徴とする請求項30に記載の組成物。
- 前記追加的なエピトープが、汎DR結合分子であることを特徴とする請求項30に記載のワクチン組成物。
- 前記薬学的賦形剤が、アジュバントを含むことを特徴とする、請求項29に記載のワクチン組成物。
- 抗原提示細胞をさらに含むことを特徴とする、請求項29に記載のワクチン組成物。
- 前記エピトープが抗原提示細胞上のHLA分子と結合され、これにより、HLA分子に拘束される細胞傷害性Tリンパ球(CTL)が存在する場合にはCTLの受容体がHLA分子とエピトープの複合体に結合することを特徴とする請求項34に記載のワクチン組成物。
- 前記抗原提示細胞が樹状細胞であることを特徴とする請求項34に記載のワクチン組成物。
- リポソームをさらに含み、前記少なくとも1つのエピトープが、リポソーム上またはリポソーム内にあることを特徴とする請求項29に記載のワクチン組成物。
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