MXPA03002035A

MXPA03002035A - Induccion de respuestas inmunes celulares al virus de la hepatitis b, usando composiciones de peptidos y de acidos nucleicos.

Info

Publication number: MXPA03002035A
Application number: MXPA03002035A
Authority: MX
Inventors: Robert W Chesnut
Original assignee: Epimmune Inc
Priority date: 2000-09-08
Filing date: 2000-09-08
Publication date: 2004-12-13
Also published as: BR0017332A; EP1322288A4; EP1322288A1; WO2002019986A9; WO2002019986A1; US20070059799A1; CN1454082A; JP2004508320A; AU7828100A; KR20030055261A; CA2422506A1

Abstract

Esta invencion utiliza el conocimiento de los mecanismos por los cuales el antigeno se reconoce por celulas T para desarrollar vacunas basadas en epitopes dirigidas hacia el VHB. Mas especificamente, esta solicitud comunica el descubrimiento de composiciones farmaceuticas y metodos de uso en la prevencion y tratamiento de infeccion por VHB.

Description

INDUCCION DE RESPUESTAS INMUNES CELULARES AL VIRUS DE LA HEPATITIS B, USANDO COMPOSICIONES DE PEPTIDOS Y DE ACIDOS NUCLEICOS .

I. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN. La infección crónica del virus de la hepatitis B (VHB) afecta al menos al 5% de la población mundial y es una causa principal de la cirrosis y del carcinoma hepatocelular (Hoofnagle, J.; N. Engl . J. Med 323:337, 1990; Fields, B. and Knipe, D. en: Fields Virology 2:2137. 1990). La Organización Mundial de la Salud enlista a la hepatitis B como una causa principal de muerte a nivel mundial, justo detrás de la enfermedad pulmonar crónica, y con mayor prevalencia que el SIDA. La infección crónica por VHB puede ir desde un estado de portador asintomático hasta la necrosis hepatocelular continua e inflamación, y puede conducir a un carcinoma hepatocelula . La respuesta inmune al VHB se cree que juega un papel importante en el control de la infección de la hepatitis B. Se han identificado diversas respuestas humorales y celulares para regiones diferentes de VHB incluyendo el núcleo de la nucleocápsid , polímerasa y antígenos de superficie. La inmunidad mediada por células T, particularmente que involucra linfocitos T citotóxicos restringidos al antígeno del leucocito humano de tipo I (CTL) , se cree que es crucial Refi 145415 en el combate de una infección asentada de VHB . Las moléculas de antígeno de leucocitos humanos de clase I (HLA) se expresan en la superficie de casi todas las células enucleadas. Los CTL reconocen fragmentos de péptidos, derivados del procesamiento intracelular de diversos antígenos, en forma de un complejo con moléculas HLA de clase I . Este evento de reconocimiento resulta luego en la destrucción de la célula que soporta el complejo de péptido-HLA directamente o la activación de mecanismos no destructivos, por ejemplo, la producción de interferón que inhibe la replicac ón viral. Se han enfatizado diversos estudios con la asociación entre la hepatitis aguda auto limitante y las respuestas multiespecíficas de CTL (Penna, A. et . , al., J. Exp . Med. 174: 1565, 1991; Neyersina, R, et . , al., Immunol . 150: 4659, 1993). La depuración espontánea y relacionada con el interferón de la infección crónica por VHB se asocia también con la reaparición de una respuesta vigorosa de CTL (Guidotti, L. G. Et. Al., Proc. Nati, Acad. Sci USA 91:3764, 1994) . En todos esos casos, las respuestas de CTL son policlonales , y específicas para proteínas virales múltiples incluyendo la envolvente del VHB, antígenos de núcleo y de polimerasa. En contraste, en los pacientes con hepatitis crónica, la actividad de CTL está usualmente ausente o débil, y se restringe antigénícamente .

El papel crucial de los CTL en la resolución de la infección de VHB, se ha acentuado además por los estudios que utilizan ratones transgénicos con VHB. La transferencia adoptiva de CTL específicos de VHB dentro de los ratones transgénicos para el genoma de VHB, resulta en la supresión de la replicación del virus. Este efecto está principalmente mediado por un mecanismo basado en linfocinas, no lítico (Guidotti, L. G. et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 91:3764, 1994; Guidotti, L. G . , Guilhot, ? . , y Chisari, F. V. J. Virol 68:1265, 1994; Guidotti, L.G. et al., J. Virol 69:6158, 1995; Gilíes, P.N., Fey, G, G . , y Chisari, F. V., J. Virol 66:3955, 1992) . Como es el caso para las respuestas restringidas de clase I de HLA, las respuestas de células T restringidas de clase II de HLA se detectan usualmente en pacientes con hepatitis aguda, y están ausentes o son débiles en pacientes con una infección crónica (Chisari, F. V. y Ferrari, C, Annu. Rev. Immunol . 13:29, 1995). Las respuestas de HLA de clase II están ligadas a la activación de células T de auxilio (HLA) , linfocitos T de auxilio, que reconocen las moléculas de HLA de clase II, pueden contribuir directamente a la depuración de la infección de VHB, a través de la secreción de citocinas lo cual suprime la replicación viral (Franco, A. et al., J. Immunol. 159:2001, 1997) . Sin embargo, su principal papel en la resolución de la enfermedad se cree que está mediado por la inducción de la activación y expansión del CTL específico del virus y de las células B. En vista de la respuesta inmune heterogénea observada con la infección de VHB , la inducción de una respuesta inmune celular multiespecífica dirigida simultáneamente contra los epítopes múltiples, parece ser importante para el desarrollo de una vacuna eficaz contra el VHB. Hay una necesidad de establecer modalidades de vacuna que obtengan respuestas inmunes que correspondan a las respuestas observadas en pacientes que depuran la infección por VHB. Las vacunas basadas en epítopes parecen ser útiles. Con el desarrollo de tecnología apropiada, el uso de vacunas basadas en epítopes tiene diversas ventajas sobre las vacunas actuales. Los epítopes para su inclusión en tal vacuna se seleccionarán de regiones conservadas de antígenos asociados con tumores o virales, con objeto de reducir la probabilidad de mutantes de escape. La ventaja de un método basado en epítopes sobre el uso de antígenos completos, es que hay evidencia de que la respuesta inmune a los antígenos completos se dirige principalmente hacia regiones variables del antígeno, permitiendo un escape inmune debido a mutaciones. Además, los epítopes inmunodepresores que pueden estar presentes en los antígenos enteros, se pueden evitar con el uso de vacunas basadas en epítopes. Adicionalmente , con un enfoque de vacuna basado en epítopes, hay una capacidad de combinar los epítopes selectos (CTL y HTL) y adicionalmente modificar la composición de los epítopes, alcanzando por ejemplo, una inmunogenicidad incrementada. De esta manera, se puede modular la respuesta inmune, como sea adecuado, para la enfermedad objetivo. No es posible una ingeniería similar de la respuesta con métodos tradicionales . Otro beneficio importante de las vacunas estimuladoras inmunes de base epí ope es su seguridad. Los posibles efectos laterales patológicos provocados por agentes infecciosos o por antígenos completos de proteínas, que pudieran tener su propia actividad biológica intrínseca, se eliminan. Una vacuna basada en epítopes, también proporciona la capacidad de dirigir y focalizar una respuesta inmune a los antígenos múltiples seleccionados del mismo patógeno. Así, la variabilidad de paciente a paciente en la respuesta inmune a un patógeno particular, se puede mejorar por la inclusión de epítopes a partir de antígenos múltiples de ese patógeno en una composición de vacunas. Un patógeno, puede ser un agente infeccioso o una molécula asociada a un tumor. Sin embargo, uno de los obstáculos más formidables para el desarrollo de inmunoterapéutica basada en epítopes ampliamente eficaz, ha sido el polimorfismo extremo de las moléculas de HLA. A la fecha, ha sido una tarea de complejidad considerable la cobertura efectiva no desviada genéticamente de una población; tal cobertura ha requerido que los epítopes se usen específicos para las moléculas de HLA que corresponden a cada alelo individual de HLA, por lo tanto, se tendrían que usar números imprácticamente grandes de epítopes con objeto de cubrir poblaciones étnicamente diversas. Ha existido una necesidad de desarrollar epítopes de péptidos que se enlacen por moléculas de antígenos múltiples de HLA para su uso en vacunas basadas en epítopes. Entre mayor sea el número de moléculas de antígeno HLA enlazadas, mayor la amplitud de la cobertura de población por la vacuna. Además, como se describe en la presente en mayor detalle, ha existido la necesidad de modular propiedades de enlace de los péptidos, por ejemplo, de manera que los péptidos que puedan enlazarse a antígenos múltiples de HLA, lo hagan con una afinidad que estimulará una respuesta inmune. La identificación de epítopes restringidos por más de un alelo de HLA a una afinidad que se correlacione con la inmunogenicidad, es importante para proporcionar una cobertura completa de la población, y para permitir la obtención de respuestas de un vigor suficiente con lo cual las respuestas inmunes naturales observadas en la hepatitis aguda autolimitante, o de una depuración espontánea de una infección crónica de VHB, se inducen en un segmento diverso de la población. Tal respuesta también puede atacar una amplia configuración de epítopes. La tecnología aquí descrita proporciona tales respuestas inmunes favorecidas . La información proporcionada en esta sección, pretende describir el estado del arte actualmente comprendido en cuanto a la fecha de presentación de la solicitud actual. La información que se incluye en esta sección se generó posterior a la fecha de prioridad de esta solicitud. De esta manera, los antecedentes en esta sección no pretenden de ninguna manera delinear la fecha de prioridad de la invención.

II. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención aplica el conocimiento de los mecanismos por los cuales, el antígeno se reconoce por las células T, por ejemplo, para desarrollar vacunas basadas en epítopes dirigidas hacia el VHB . Más específicamente, esta solicitud comunica el descubrimiento de composiciones farmacéuticas de epítopes específicos y métodos de uso en la prevención y tratamiento de una infección por VHB. Con el desarrollo de la tecnología adecuada, el uso de vacunas basadas en epítopes tiene diversas ventajas sobre las vacunas actuales, particularmente cuando se compara con el uso de antígenos completos en composiciones de vacunas. Hay una evidencia de que la respuesta inmune a los antígenos completos se dirige principalmente hacia regiones variables del antígeno, permitiendo un escape inmune debido a mutaciones. Los epítopes para la inclusión en una vacuna de base epítope se seleccionan a partir de regiones conservadas de antígenos asociados con tumores o virales, lo cual, por lo tanto, reduce la probabilidad de mutantes de escape. Además, los epítopes inmunodepresores que pueden estar presentes en los antígenos completos, se pueden evitar con el uso de vacunas basadas en epítopes . Una ventaja adicional de un método de vacuna basado en epítopes, es la capacidad de combinar epítopes selectos (CTL y HLA) y además, modificar la composición de los epítopes, logrando, por ejemplo, una inmunogenicidad mejorada. De esta manera, se puede modular la respuesta inmune como sea adecuado, para la enfermedad objetivo. No es posible una ingeniería similar de la respuesta con métodos tradicionales.

Otro beneficio principal de las vacunas estimuladoras inmunes de base epítope es su seguridad. Los efectos laterales patológicos posibles provocados por agentes infecciosos o por los antígenos completos de proteínas, que pudiera tener su propia actividad biológica intrínseca, se eliminan . Una vacuna basada en epítopes también proporciona la capacidad de dirigir y focalizar una respuesta inmune a los antígenos múltiples seleccionados del mismo patógeno. Así, la variabilidad de paciente a paciente en la respuesta inmune a un patógeno particular, se puede mejorar por la inclusión de epítopes de antígenos múltiples de ese patógeno en una composición de vacunas . Un "patógeno" puede ser un agente infeccioso o una molécula asociada a un tumor. Uno de los obstáculos más formidables para el desarrollo de inmunoterapéuticos basados en epítopes ampliamente eficaces, ha sido el polimorfismo extremo de las moléculas de HLA. A la fecha, ha sido una tarea de complejidad considerable la cobertura efectiva no desviada genéticamente de una población; tal cobertura ha requerido que los epítopes se usen específicos para las moléculas de HLA que corresponden a cada alelo individual de HLA, por lo tanto, se tendrían que usar números imprácticamente grandes de epítopes con objeto de cubrir poblaciones étnicamente diversas. Ha existido una necesidad de desarrollar epítopes de péptidos que se enlacen por moléculas de antígenos múltiples de HLA para su uso en vacunas basadas en epítopes . Entre mayor sea el número de moléculas de antígeno HLA enlazadas, mayor la amplitud de la cobertura de población por la vacuna. Además, como se describe en la presente en mayor detalle, ha existido la necesidad de modular propiedades de enlace de los péptidos, por ejemplo, de manera que los péptidos que puedan enlazarse a antígenos múltiples de HLA, lo hagan con una afinidad que estimulará una respuesta inmune. La identificación de epítopes restringidos por más de un alelo de HLA a una afinidad que Be correlacione con la inmunogenicidad, es importante para proporcionar una cobertura completa de la población, y para permitir la obtención de respuestas de un vigor suficiente con lo cual las respuestas inmunes naturales observadas en la hepatitis aguda autolimitante , o de una depuración espontánea de una infección crónica de VHB, se inducen en un segmento diverso de la población. Tal respuesta también puede atacar una amplia configuración de epítopes . La tecnología aquí descrita proporciona tales respuestas inmunes favorecidas. En una modalidad preferida, los epítopes para inclusión en composiciones de vacunas de la invención, se seleccionan por un proceso por el cual las secuencias de proteínas de antígenos conocidos se evalúan para la presencia de epítopes que soportan porciones o superporciones . Los péptidos que corresponden a un epítope que soporta una porción o superporción se sintetizan luego y se prueban por su capacidad de enlazar a la molécula de HLA que reconoce la porción seleccionada. Aquellos péptidos que se enlazan en una afinidad intermedia o alta, por ejemplo un valor IC50 (o un valor KD) de 500 nM o menos para moléculas HLA de clase I, ó 1000 nM o menos para moléculas HLA de clase II, se evalúan además por su capacidad de inducir una respuesta de CTL o HTL. Los péptidos inmunogénicos se seleccionan para su inclusión en composiciones de vacunas.

Los péptidos que soportan superporciones pueden adicionalmente probarse por su capacidad de enlazarse a alelos múltiples dentro de la familia del supertipo HLA. Además, los epítopes de péptidos se pueden formar análogos para modificar una afinidad de enlace y/o la capacidad de enlazarse a alelos múltiples dentro del supertipo HLA. La invención también incluye una modalidad que comprende un método para observar la actividad inmunogénica de una vacuna para el VHB en un paciente que tiene un tipo conocido de HLA, el método comprende incubar una muestra de linfocitos T del paciente con una composición de péptidos que comprende un epítope VHB, que consiste esencialmente de una secuencia de aminoácidos descritas en las Tablas VI hasta Tabla XX o Tabla XXII, que se enlaza al producto de al menos un alelo HLA presente en el paciente, y detectar la presencia de un linfocito T que se enlaza al péptido. En una modalidad preferida, el péptido comprende un complejo tetramérico. Una modalidad alternativa para definir los péptidos de conformidad con la invención, es mencionar las propiedades físicas tales como longitud; estructura primaria, potencialmente secundaria y/o terciaria o carga, que se correlacionan con el enlace a una molécula de HLA específica de alelo particular, o grupo de moléculas HLA específicas de alelo. Una modalidad adicional para definir péptidos, es mencionar las propiedades físicas de una cavidad de enlace de HLA o propiedades compartidas por diversas cavidades de enlace HLA especificas de alelo (por ejemplo, configuración de cavidad y distribución de cargas) y mencionar que el péptido se ajusta y se enlaza a la cavidad o cavidades. Como será evidente de la discusión a continuación, también se contemplan otros métodos y modalidades. Además, los péptidos sintéticos novedosos producidos por cualquiera de los métodos aqui descritos también son parte de la invención. III. BREVE DESCRIPCIÓN DE IAS FIGURAS. Figura 1: La Figura 1 proporciona una gráfica de la frecuencia total de genotipos como una función del número de epitopes candidato VHB enlazados por las moléculas HLA-A y B en una población promedio. Análisis de cobertura de población Monte Cario para epitopes candidatos HBV Agrupado de la frecuencia total de genotipos como una función del número de epitopes candidato HBV ligados por alelos HLA-A y B, en una población promedio. Los valores de genotipo se derivan al promediar las frecuencias del gen en poblaciones de Caucásicos, Negros Norteamericanos, Japoneses, Chinos, e Hispanos. También se muestra la frecuencia acumulativa de genotipos. Usando datos de tipificado HLA actualmente disponibles, una fracción residual (alrededor del 15%) de los genes, en una población promedio, no son específicos. Para llevar al 100% de genes contados, una fracción del residuo se ha agregado a cada linea de población del ramo dentro de la población especifica de HLA.

Figura 2 : Las Figuras 2A-2D ilustran la posición de los epitopes de péptidos en constructos de minigenes de un modelo experimental. IV. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN. Los péptidos y las composiciones correspondientes de ácido nucleico de la presente invención/ son útiles para estimular una respuesta inmune al VHB al estimular la producción de respuesta de CTL o HTL. Los péptidos, que se derivan directa o indirectamente de secuencias de origen de aminoácidos de VHB, pueden enlazarse a moléculas de HIA y estimular una respuesta inmune al VHB. La secuencia completa de poliproteinas del VHB y sus variantes, se pueden obtener del Genbank. También se pueden determinar fácilmente los péptidos a partir de la información de secuencias que puede posteriormente descubrirse para variantes hasta ahora desconocidas del VHB como estará claro de la descripción proporcionada a continuación. Los péptidos de la invención se han identificado de diversas maneras como se discute a continuación. Además, los péptidos análogos se han derivado y la actividad de enlace para las moléculas HIA se ha modulado al modificar residuos específicos de aminoácidos para crear análogos de péptidos que muestran una inmunogenicidad alterada. Además, la presente invención proporciona composiciones y combinaciones de composiciones que permiten vacunas basadas en epitopes que puedan interactuar con antigenos múltiples de HIA para proporcionar una cobertura de población más amplia que las vacunas previas. IV.A. Definiciones. La invención también se puede entender mejor con referencia a las siguientes definiciones que se enlistan alfabéticamente. Una "computadora" o "sistema de computadora" incluye generalmente : un procesador; al menos un aparato de recuperación/ almacenamiento de la información tal como, por ejemplo, un disco duro, un lector de disco o un lector de cinta; al menos un aparato de entrada tal como, por ejemplo, un teclado, un ratón, una pantalla sensible al tacto o un micrófono y una estructura de despliegue . Adicionalmente, la computadora puede incluir un canal de comunicación en comunicación con una red. Tal computadora puede incluir más o menos de lo que se enlista arriba . Un "constructo" como se usa en la presente, denota generalmente una composición que no se presenta en la naturaleza . Se puede producir un constructo por tecnología s intética, por ej emplo, preparación y expresión de ADN recombinante o técnicas químicas sintéticas para aminoácidos o ácidos nucleicos . También se puede producir un constructo por la adición o afiliación de un material con otro de tal manera que el resultado no se encuentre en la naturaleza en esa forma. El "enlace reactivo cruzado" indica que un péptido se enlaza por más de una molécula de HLA, un sinónimo es un enlace degenerado . Un "epitope críptico" obtiene una respuesta por inmuni zación con un péptido aislado, pero la respuesta no es de reacción cruzada in vitro cuando está intacta la proteina completa lo cual comprende que el epitope se use como un antígeno . Un "epítope dominante" es un epítope que induce una respuesta inmune con la inmunización con un antígeno de origen completo (ver, por ejemplo, Sercarz, et al., Annu. Rev. Immunol. 11:729-766, 1993). Tal respuesta es de reacción cruzada in vitro con un epítope de un péptido aislado. Con respecto a la secuencia particular de aminoácidos, un epítope es un conjunto de residuos de aminoácidos que está involucrado en el reconocimiento por una inmunoglobulina particular, o en el contexto de células T, esos residuos son necesarios para el reconocimiento por proteínas del receptor de células T (TCR) y/o receptores del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) . En un entorno de un sistema inmune, in vivo o in vitro, un epítope son las características colectivas de una molécula, tal como la estructura del péptido primaria, secundaria y terciaria, y la carga, lo que junto forman un sitio reconocido por una inmunoglobulina, molécula TCR o HLA. A través de esta descripción, se usan a menudo intercambiablemente epítope y péptido. Se apreciará que la proteína o moléculas de péptido que comprenden un epítope de la invención así como aminoácidos adicionales, están todavía dentro de las fronteras de la invención. En ciertas modalidades, hay una limitación en la longitud de un péptido de la invención que no es de otra forma un constructo. Una modalidad que está limitada por la longitud, sucede cuando el péptido/ proteína que comprende un epítope de la invención, comprende una región (esto es, una serie contigua de aminoácidos) que tiene una identidad al 100% con una secuencia nativa. Con objeto de evitar la definición de epítope de la lectura, por ejemplo, en moléculas naturales completas, hay una limitación en cuanto a la longitud de alguna región que tenga 100% de identidad con una secuencia de péptidos de origen. Así, para un péptido que comprende un epítope de la invención y una región con un 100% de identidad con una secuencia nativa de péptidos (y que no es de otra forma un constructo) , la región con un 100% de identidad para una secuencia nativa, tiene generalmente una longitud de menos de o igual a 600 aminoácidos, a menudo menos de 500 aminoácidos, a menudo menos de o igual a 400 aminoácidos, a menudo menos de o igual a 250 aminoácidos, a menudo menos de o igual a 100 aminoácidos, a menudo menos de o igual a 85 aminoácidos, a menudo menos de o igual a 75 aminoácidos, a menudo menos de o igual a 65 aminoácidos, a menudo menos de o igual a 50 aminoácidos. En ciertas modalidades, un "epítope" de la invención, comprende un péptido que tiene una región con menos de 51 aminoácidos que tiene una identidad al 100% con una secuencia nativa de péptidos en cualquier incremento de (49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5) hasta 5 aminoácidos. De esta manera, las secuencias de péptidos de proteínas más grandes que 600 aminoácidos están dentro del alcance de la invención, con tal de que no comprendan alguna secuencia contigua de más de 600 aminoácidos que tengan un 100% de identidad con una secuencia nativa de péptidos, si no son de otra manera un constructo. Para algún péptido que tenga 5 residuos contiguos o menos que correspondan a una secuencia nativa, no hay limitación en cuanto a la longitud máxima de ese péptido con objeto de que caiga dentro del alcance de la invención. Es actualmente preferido que un epítope CTL tenga menos de 600 residuos de longitud en cualquier incremento hasta 8 residuos de aminoácidos. El "antígeno de leucocito humano" o "HLA" es una proteína de un complejo de histocompatibilidad principal humano de clase I o clase II (MHC) (ver, Stites, et al., IM UNOLOGY, 8*' ED . , Lange Publishing, Los Altos CA (1994) . Un "supertipo o f milia de HLA" , como se usa en la presente, describe conjuntos de moléculas de HLA agrupadas sobre la base de especificidades de enlace de péptidos compartidos. Las moléculas de clase I de HLA que comparten de alguna manera una afinidad de enlace similar para los péptidos que soportan ciertas porciones de aminoácidos, se agrupan en los supertipos de HLA. Los términos superfamilia de HLA, familia del supertipo HLA y moléculas del supertipo del tipo HLA xx (en donde xx denota un tipo particular de HLA) son sinónimos. A través de esta descripción, se expresan los resultados en términos de "IC50" . El ICSo es la concentración de péptido en un ensayo al cual se observa una inhibición al 50% del enlace de un péptido de referencia. Dadas las condiciones a las cuales se corren los ensayos (esto es, proteínas limitantes de HLA y concentraciones etiquetadas de péptidos) estos valores se aproximan a los valores de KD. Los ensayos para determinar el enlace se describen en detalle, por ejemplo, en las publicaciones PCT WO 94/20127 y WO 94/03205. Se debe observar que los valores IC50 pueden cambiar, a menudo dramáticamente, si se varían las condiciones de ensayo, y dependiendo de los reactivos particulares usados (por ejemplo, preparación de HLA, etc) . Por ejemplo, las concentraciones excesivas de moléculas de HLA incrementarán el IC50 aparente medido de un ligando dado. Alternativamente, el enlace se expresa con relación a un péptido de referencia. Aunque cuando un ensayo particular se vuelve más o menos sensible, los IC50 de los péptidos probados pueden cambiar de alguna manera, el enlace relativo al péptido de referencia no cambiará significativamente. Por ejemplo, en un ensayo operado bajo condiciones tales que el IC50 del péptido de referencia se incremente 10 veces, los valores IC5o de los péptidos de prueba también cambiarán aproximadamente 10 veces. Por lo tanto, para evitar las ambigüedades, la evaluación de si un péptido es un buen aglutinante intermediario, débil o negativo, se basa generalmente en su ICSo, con relación al ICS0 de un péptido estánda . También se puede determinar el enlace usando otros sistemas de ensayo incluyendo aquellos que utilizan células vivas (por ejemplo, Ceppellini et al., Nature 339:392, 1989; Christnick et al., Nature 352:67, 1991; Busch et al-, Immunol . 2:443, 1990 Hill et al., J. Immunol . 147:189, 1991; del Guercio et al., J. Immunol. 154:685, 1995), sistemas libres de células que utilizan lisados de detergentes (por ejemplo, Cerundolo et al., J. Immunol. 21:2069, 1991), MHC purificado e inmovilizado (por ejemplo, Hill et . Al., J. Immunol. 152,2890, 1994; Marshall et al., J. Immunol. 152:4946, 1994), sistemas ELISA (por ejemplo, Reay et al., EMBO J. 11:2829, 1992), resonancia de un plasmón de superficie (por ejemplo, Khilko et al., Biol . Chern. 268:15425, 1993); ensayos de fases solubles en flujo alto (Hammer et al., J. Exp. ed 180:2353, 1994), y la medición de la estabilización de MHC de clase 1 ó el ensamble (por ejemplo, Ljunggren et al., Nature 346:476, 1990; Schumacher et al., Cell 62:563, 1990; Townsend et al., Cell 62:285, 1990; Parker et al., J. Immunol. 149:1896, 1992) .

Como se usa en la presente, "alta afinidad" con respecto a las moléculas de HLA de clase I, se define como el enlace con un valor ICE0 o KD de 50 n o menos; "afinidad intermedia" es el enlace con un valor IC50 o KD entre alrededor de 50 y alrededor de 500 nM. La "alta afinidad", con respecto al enlace de moléculas de clase II de HLA, se define como un enlace con un valor ICS0 o KD de 100 nM o menos; "afinidad intermedia" es un enlace con un valor IC50 o KD de entre alrededor de 100 y alrededor de 1000 nM. Los términos "idéntico" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más secuencias de péptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, cuando se mide usando algoritmos de comparación de secuencias o por alineación manual e inspección visual. Un "péptido inmunogénico" o "ep tope de péptido" es un péptido que comprende una porción especifica de alelo o superporción tal que el péptido se enlazará con una molécula HLA e induce una respuesta CTL y/o HTL. Así, los péptidos inmunogénicos de la invención pueden enlazarse con una molécula adecuada de HLA y de ahí en adelante inducir una respuesta de células T citotóxicas, o una respuesta de células T de ayuda, al antígeno del cual se deriva el péptido inmunogénico . Las f ases "aislado" o "biológicamente puro" , se refieren a un material que está libre esencialmente o substancialmente de componentes que acompañan normalmente al material como se encuentra en su estado natural. Así, los péptidos aislados de conformidad con la invención, no contienen preferiblemente materiales normalmente asociados con los péptidos en su medio ambiente in situ. "Ligadura" o "unión" se refiere a cualquier método conocido en el arte, para conectar funcionalmente péptidos, incluyendo, sin limitación, fusión recombinante , enlace covalente, enlace con bisulfuro, enlace iónico, enlace de hidrógeno y enlace electrostático. El "complejo principal de histocompatibilidad" o "MHC" es un grupo de genes que juega un papel en el control de las interacciones celulares responsables para las respuestas inmunofisiológicas . En los humanos, el complejo MHC también se conoce como el complejo HLA. Para una descripción detallada de los complejos MHC y HLA, ver, Paul, FUNDAMENTAL IMMU OLOGY, 3". ED., Raven Press, New York, 1993. El término "porción" se refiere a un patrón de residuos en un péptido de longitud definida, usualmente un péptido desde alrededor de 8 hasta alrededor de 13 aminoácidos para una porción HLA de clase I y desde alrededor de 6 y hasta alrededor de 25 aminoácidos para una porción HLA de clase II, que se reconoce por una molécula particular de HLA. Las porciones de péptidos son típicamente diferentes para cada proteína codificada por cada alelo humano de HLA y difieren en el patrón de los residuos de anclaje primarios y secundarios. Un "residuo de enlace negativo" o "residuo perjudicial" es un aminoácido que, si está presente a ciertas posiciones (típicamente no principalmente posiciones de anclaje) de un epítope de péptido, resulta en una afinidad de enlace disminuida del péptido para la molécula de HLA que corresponde al péptido. Cualquier residuo que no sea "perjudicial", es un residuo "no perjudicial". Una secuencia "no nativa" o "constructo" se refiere a una secuencia que no se encuentra en la naturaleza, esto es, no se presenta naturalmente. Tales secuencias incluyen, por ejemplo, péptidos que están lipidados o modificados de otra manera, y composiciones poliepitópicas que contienen epítopes que no son contiguos en una secuencia de proteína de origen.

El término "péptido" se usa intercambiablemente con "oligopéptido" en la presente especificación, para designar una serie de residuos, típicamente aminoácidos L, conectados uno al otro típicamente por enlaces de péptidos entre los grupos a-amino y carboxilo de los aminoácidos adyacentes. En algunas modalidades, los oligopéptidos que inducen el CTL preferidos de la invención, son de 13 residuos o menos de longitud y consisten usualmente de entre alrededor de 8 y alrededor de 11 residuos, preferiblemente 9 ó 10 residuos. En algunas modalidades, los oligopéptidos preferidos que inducen el HTL son de menos de alrededor de 50 residuos de longitud y consisten usualmente de entre alrededor de 6 y alrededor de 30 residuos, más usualmente del alrededor de 12 y 25, y a menudo alrededor de 15 y 20 residuos. "Farmacéu icamente aceptable" se refiere a una composición fisiológicamente compatible generalmente no tóxica e inerte. Un "residuo primario de anclaje", es un aminoácido en una posición específica junto con una secuencia de péptidos que se entiende que proporciona un punto de contacto entre el péptido inmunogénico y la molécula de HLA. De uno a tres, usualmente dos, residuos de anclaje primarios dentro de un péptido de longitud definida, definen generalmente una "porción" para un péptido inmunogénico. Estos residuos se entiende que se ajustan en un contacto estrecho con los canales de enlace de péptido de una molécula HLA, con sus cadenas laterales sepultadas en las cavidades específicas de los canales de enlace mismos. En una modalidad, los residuos de anclaje primarios se localizan en la posición 2 (a partir de la posición de la terminal amino) y en la posición de la terminal carboxilo de un péptido de 9 residuos de acuerdo con la invención. Las posiciones de anclaje primario para cada porción y superporción se establecen en la Tabla I . Por ejemplo, se pueden crear péptidos análogos al alterar la presencia o ausencia de residuos particulares en estas posiciones primarias de anclaje. Tales análogos se usan para modular finamente la afinidad de enlace de un péptido que comprende una porción o superporción particular. Un "reconocimiento promiscuo" es donde un péptido diferente se reconoce por el mismo clon de células T en el contexto de moléculas múltiples de HLA. Un enlace promiscuo es sinónimo de un enlace de reacción cruzada. Una "respuesta inmune protectora" o "respuesta inmune terapéutica" se refiere a una respuesta de CTL y/o de HTL para un antígeno derivado de un agente infeccioso o un antígeno de tumor, que evita o al menos suspende parcialmente los síntomas o el avance de la enfermedad. La respuesta inmune también puede incluir una respuesta de anticuerpo que se ha facilitado por la estimulación de células T de ayuda. El término "residuo" se refiere a un aminoácido o a un aminoácido mimético incorporado en un oligopéptido por un enlace amida o una enlace amida mimético. Un "residuo de anclaje secundario", es un aminoácido en una posición diferente a la posición de anclaje primaria en un péptido que puede tener influencia en el enlace de péptido. Un residuo de anclaje secundario se presenta con una frecuencia significativamente superior entre los péptidos enlazados que se esperarían por distribución aleatoria de aminoácidos en una posición. Los residuos de anclaje secundarios se dicen que se presentan en "posiciones de anclaje secundarias". Un residuo de anclaje secundario se puede identificar como un residuo que está presente a una frecuencia superior entre los péptidos de alta afinidad, o un residuo asociado de otra manera con un enlace de alta afinidad. Por ejemplo, se pueden crear péptidos análogos al alterar la presencia o ausencia de residuos particulares en estas posiciones de anclaje secundarias. Tales análogos se usan para modular finamente la afinidad de enlace de un péptido que comprende una porción o superporción particular.

Un "epítope subdominante" es un epítope que evoca poca o ninguna respuesta con la inmunización con antígenos completos, que comprenden el epítope, pero para el cual se puede obtener una respuesta por inmunización con un péptido aislado, y esta respuesta (a diferencia del caso de los epítopes críticos) se detecta cuando se usa la proteína completa para volver a llamar la respuesta in vi tro o in vivo. Una "superporción", es una especificidad de enlace de péptidos compartida por moléculas HLA codificadas por dos o más alelos HLA. Un epítope que soporta una superporción se reconoce preferiblemente con una afinidad alta o intermedia (como se define en la presente) por dos o más antígenos HLA.

Un "péptido sintético" se refiere a un péptido que está hecho por el hombre usando métodos tales como la síntesis química o la tecnología recombinante de ADN. Como se usa en la presente, una "vacuna" es una composición que contiene uno o más péptidos de la invención. Existen diferentes modalidades de vacunas de conformidad con la invención, tal como por un cóctel de uno o más péptidos, uno o más epítopes de la invención que comprenden un péptido poliepitópico, o ácidos nucleicos que codifican tales péptidos o polipéptidos, por ejemplo, un minigen que codifica un péptido poliepitópico. El "uno o más péptidos" puede incluir cualquier unidad completa entera de 1-150, por ejemplo, al menos de 2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, ó 150 ó más péptidos de la invención. Los péptidos o polipéptidos se pueden modificar opcionalmente tal como por lipidación, adición de secuencias objetivo u otras secuencias. Los péptidos de HLA de clase I de la invención, se pueden mezclar con, o ligarse a, péptidos de enlace de clase II HLA, para facilitar la activación de los linfocitos T citotóxicos y de los linfocitos T de ayuda. Las vacunas también pueden comprender células que presentan antígenos pulsadas por péptidos, por ejemplo, células dendríticas.

La nomenclatura usada para describir compuestos de péptidos sigue la práctica convencional en donde el grupo amino se presenta a la izquierda (del término N) y el grupo carboxilo a la derecha (el término C) de cada residuo de aminoácidos. Cuando las posiciones de residuos de aminoácidos se refieren a un epítope de péptido, se enumeran en una dirección de amino a carboxilo con la posición uno que está en la posición más cercana a la terminal amino. En las fórmulas que representan modalidades específicas seleccionadas de la presente invención, los grupos terminales amino y carboxilo, aunque no se muestran específicamente, están en la forma que supondrían valores fisiológicos de pH, a menos que se especifique de otra manera. En las fórmulas de estructura de aminoácidos, cada residuo se representa generalmente por designaciones estándar de tres letras o de letras sencillas. La forma L de un residuo de aminoácido está representada por una letra mayúscula sencilla o una primera letra mayúscula de un símbolo de tres letras, y la forma D para aquellos aminoácidos que tienen forma D se representa por una letra sencilla minúscula o un símbolo de tres letras minúsculas . La glicina no tiene un átomo de carbono asimétrico y se refiere simplemente como "Gly" o G. Los símbolos para los aminoácidos son los que se muestran a continuación.

Símbolo de Letra Símbolo de Tres Aminoácidos Sencilla Letras A Ala Al niña C Cys Cisteína D Asp Ácido aspártico E Glu Ácido glutámico F Phe Fenilalanina G Gly Glicina H His Histidina I lie Isoleucina K Lys Lisina L Leu Leucina M Met Metionina N Asn Asparagina P Pro Prolina Q Gln Glutamina R Arg Arginina S Ser Serina T Thr Treonina V Val Valina W Trp Triptof no Y Tyr Tirosina IV. B. Estimulación de las Respuestas de CTL y HTL contra VHB El mecanismo por el cual las células T reconocen antígenos se ha delineado durante los últimos diez años. Con base en el nuevo entendimiento del sistema inmune, se han generado composiciones de vacunas de epí opes de péptidos eficaces, que pueden inducir una respuesta inmune terapéutica o profiláctica para una invención por VHB en una población amplia. Para un entendimiento del valor y eficacia de las composiciones reivindicadas, se proporciona una breve revisión de la tecnología. Un complejo de una molécula de HLA y un antígeno peptídico actúan como el ligando reconocido por las células T restringidas en HLA (Buus, S. et al., Cell 47:1071, 1986; Babbitt, B. P. et al., Nature 317:359, 1985; Townsend, A. y Bodmer, H. , Annu. Rev. Inmuno1. 7:601, 1989; Germain, R. N. , Annu. Rev. Immunol . 11:403, 1993) . A través del estudio de análogos de antígenos substituidos con aminoácidos sencillos, y la formación de secuencias de péptidos procesados naturalmente, que se enlazan endógenamente, se han identificado residuos críticos que corresponden a las porciones requeridas para el enlace específico para moléculas de antígeno HLA y se describen en la presente y ae establecen en las Tablas I, II, y III (ver también, por ejemplo, Southwood, et al., J. Immunol. 160:3363, 1998; Rammensee, et al., Jmmunogerzetics 41:178, 1995; Rammensee et al., SYFPEITHI, acceso por medio de la red en: http : //134.2.96.221/scripta .hlaserver .dll/home .htm; Sette, A. y Sidney, J. Curr. Opin. Inwnunol . 10:478,1998; Engelhard, V.H., Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994; Sette, A. y Grey, H. M., Curr. Opin. Inmuno1. 4:79, 1992; Sinigaglia, F. y Hammer, J. Curr. Biol . 6:52, 1994; Ruppert et al., Cell 74:929-937, 1993; Kondo et al., J". Inmuno1. 155:4307-4312, 1995; Sidney et al., J. Immunol. 157:3480-3490, 1996; Sidney et al., Human Immunol. 45:79-93, 1996; Sette, A. y Sidney, J. Immunogenetics, en la prensa, 1999) . Además, el análisis cristalográfico de rayos X de los complejos de péptidos HLA, ha revelado cavidades dentro de la hendidura de enlace del péptido de las moléculas HLA las cuales se acomodan, en un modo específico de alelos, residuos soportados por los ligandos de péptidos; estos residuos a su vez determinan la capacidad de enlace del HLA de los péptidos en los cuales están presentes (ver, por ejemplo, Madden, D.R. Annu. Rev. Immunol. 13:587, 1995; Smith, et al., Immunity 4:203, 1996; Fremont et al., Immunity 8:305, 1998; Stern et al., Structure 2:245, 1994; Jones, E.Y. Curr. Opin. Immunol. 9:75, 1997; Brown, J. et al., Nature 364:33, 1993; Guo, H. C. et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90:8053, 1993; Guo, H. C. et al., Nature 360:364, 1992; Silver, M. L. et al., Nature 360:367, 1992; Matsumura, M. et al., Science 257:927, 1992; Madden et al., Cell 70:1035, 1992; Fremont, D. H. et al., Science 257:919, 1992; Saper, M. A., Bjorkman, P. J. y Wiley, D. C, J. Mol. Biol. 219:277, 1991) . De esta manera, la definición de las porciones de enlace de HLA específicas de un alelo de clase I y de clase II, o las superporciones de clase I, permiten la identificación de regiones dentro de una proteína, que tienen el potencial de enlazarse a antígenos particulares HLA (ver también, por ejemplo, Sette, A. y Grey, H. M. , Curr. Opin. Immunol. 4:79, 1992; Sinigaglia, F. y Hammer, J. , Curr. Biol. 6:52, 1994; Engelhard, V. H. , Curr. Opin. Inmuno1. 6:13, 1994; Kast, W. M. et al., J. Immunol., 152:3904, 1994) . Además, también se han establecido diversos ensayos para cuantificar la afinidad de la interacción entre el péptido y el HLA. Tales ensayos incluyen, por ejemplo, medidas de los valores IC5oi inhibición de la presentación de antígenos (Sette et al., J. Immunol. 141:3983, 1991) , ensayos de ensamble in vitro (Townsend et al., Ce 62:285, 1990) , medidas de las tasas de disociaciones (Parker et al., J. Immunol. 149:1896-1904, 1992), y ensayos basados en FACS usando células mutadas tales como RMA.S ( elief, et al., Eur. J. Immunol. 21:2963, 1991) . Los inventores actuales han encontrado que la correlación de la afinidad de enlace con la inmunogenicidad, es un factor importante a considerarse cuando se evalúan péptidos candidatos. Así, por una combinación de búsquedas de porciones y ensayos de enlace de HLA, se han identificado candidatos para vacunas basadas en epítopes. Después de determinar su afinidad de enlace, ae puede efectuar un trabajo confirmatorio adicional para seleccionar, entre estos candidatos de vacuna, los epítopes con las características preferidas en términos de antigenicidad e inmunogenicidad. Se pueden utilizar diversas estrategias para evaluar la inmunogenicidad incluyendo: 1) Evaluación de los cultivos primarios de células T a partir de individuos normales ( entworth, P. A. et al., Mol. Immunol. 32:603, 1995; Celis, E et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:2105, 1994; Tsai , V. et al., Immunol. 158:1796, 1997; Kawashima, I. et al., Human Immunol. 59:1, 1998); Este procedimiento involucra la estimulación del PBL a partir de sujetos normales con un péptido de prueba en presencia de células que presentan antígenos in vitro, sobre un periodo de varias semanas. Las células T específicas para el péptido, se activan durante este tiempo y se detecta un ensayo de liberación de 51Cr que involucra células objetivo sensibilizadas a los péptidos. 2) Inmunización de ratones transgénicos HLA (Wentworth, P. A. et al., J. Immunol. 26:97, 1996; Wentworth, P. A. et al., Int. Immunol. 8:651, 1996; Alexander, J. et al., J Immunol. 159:4753, 1997); En este método, se administran métodos en un adyuvante incompleto de Freund subcutáneamente a los ratones transgénicos HLA. Varias semanas después de la inmunización, se separan y cultivan los eaplenocitos in vi tro en presencia de un péptido de prueba por aproximadamente una semana. Las células T específicas del péptido se detectan usando un ensayo de liberación de 1Cr- involucrando células objetivo sensibilizadas a los péptidoa y células objetivo que expresan un antígeno generado endógenamente. 3) Demostración de las respuestas de recordación de las células T a partir de individuos inmunes que tienen recuperación de la infección y/o de pacientes crónicamente infectados (Rehermann, B. et al., J. Exp. Med. 181:1047, 1995; Doolan, D. L. et al., Inwnunity 7:97, Bertoni ; R. et al., J. Clin. Invest. 100:503, 1997; Threlkeld, S. C. et al., J. Immunol. 159:1648, 1997; Diepolder, H. M. et al., J. Virol. 71:6011, 1997). Al aplicar esta estrategia, las respuestas de recordación se detectarán por el cultivo de PBL de los sujetos que habían estado naturalmente expuestos al antígeno, por ejemplo, a través de infección, y así habían generado una respuesta inmune "naturalmente" . El PBL de los sujetos se cultiva in vitro por 1-2 semanas en presencia de un péptido de prueba más células que presentan antígenos (APC) para permitir la activación de la "memoria" de las células T, en comparación con las células T "nuevas". Al final del periodo de cultivo, se detecta la actividad de las células T usando ensayos para actividad de células T que incluyen la liberación de 51Cr que involucra objetivos sensibilizados a los péptidos, proliferación de células T o liberación de linfocinas. Lo siguiente describe los epitopes de péptidos y los ácidos nucleicos correspondientes de la invención.

IV. C. Afinidad de Enlace de los Epitopes de Péptidos para las Moléculas HLA. Como se indica en la presente, el amplio grado de polimorfismo de HLA es un factor importante a tomarse en cuenta con el método basado en epitopes para el desarrollo de vacunas. Para atender este factor, se utiliza preferiblemente la selección de epitopes que abarca la identificación de péptidos capaces de enlazarse en una afinidad alta o intermedia a moléculas múltiples de HLA, más preferiblemente estos epitopes se enlazan a una afinidad alta o intermedia con dos o más moléculas HLA específicas de alelos. Los péptidos que inducen CTL de interés para las composiciones de vacuna incluyen preferiblemente aquellos que tienen un IC50 o un valor de afinidad de enlace para moléculas HLA de clase I de 500 nM o menos. Los péptidos que incluyen HTL, incluyen preferiblemente aquellos que tienen un IC50 o una afinidad de enlace con un valor para moléculas HLA de clase II de 1000 nM o menos. Por ejemplo, el enlace de péptidos se evalúa por la prueba de capacidad de un péptido candidato para enlazarse con una molécula purificada de HLA in vi tro. Los péptidos que muestran una afinidad alta o intermedia se consideran luego para un análisis posterior. Los péptidos seleccionados se prueban en otros miembros de la familia del supertipo. En modalidades preferidas, los péptidos que muestran un enlace de reacción cruzada se usan luego en vacunas o en análisis de separación por exclusión celula . Como se describe en la presente, la alta afinidad de enlace de HLA se correlaciona con una inmunogenicidad superior. La inmunogenicidad superior se puede manifestar de diversas formas diferentes. La inmunogenicidad corresponde a si se obtiene completamente una respuesta inmune y al vigor de alguna respuesta en particular. Por ejemplo, un péptido podría obtener una respuesta inmune en una configuración diversa de la población, aunque en ningún caso producir una respuesta vigorosa. De acuerdo con estos principios, cerca del 90% de los péptidos de alto enlace se han encontrado por ser inmunogénicos, en contraste con alrededor del 50% de los péptidos que se enlazan con afinidad intermedia. Además, los péptidos de afinidad superior de enlace conducen a respuestas inmunogénicas más vigorosas. Como resultado, se requieren menos péptidos para obtener un efecto biológico similar, si se usa un péptido de alta afinidad. Así, en modalidades preferidas de la invención, son particularmente deseados los epítopes de alto enlace.

La relación entre la afinidad de enlace para lae moléculas de clase I de HLA y la inmunogenicidad de epítopes de péptidos discretos sobre antígenoa enlazados, se ha determinado por primera vez en la técnica por los inventores actuales . La correlación entre la afinidad de enlace y la inmunogenicidad se analizó en dos métodos experimentales diferentes (Sette, et al., J. Inmuno1. 153:5586-5592, 1994). En el primer método, la inmunogenicidad de los epítopes potenciales que van en una afinidad de enlace de HLA de más de 10,000 veces en rango, se analizaron en ratones transgénicos HLA-A*0201. En el segundo método, la antigenicidad de aproximadamente 100 diferentes epítopes potenciales derivados del virus de la hepatitis B (VHB) , todos llevaban porciones de enlace A*020l, se evaluó al usar PBL (linfocitos de sangre periférica) de pacientes con hepatitis aguda. Siguiendo estos métodos, se determinó que un umbral de afinidad de aproximadamente 500 nM (preferiblemente un valor IC50 de 500 nM o menos) determina la capacidad de un epítope de péptidos para obtener una respuesta CTL. Estos datos son verdaderos para las mediciones de afinidad de enlace de clase I para péptidos procesados naturalmente y para epítopes sintetizados de células T. Estos datos también indican el papel importante de la selección determinante en la formación de respuestas de células T. Un umbral asociado con la inmunogenicidad en el contexto de las moléculas DR de clase II de HLA también se ha delineado (Southwood et al. J. Immunology 160:3363-3373,1998, y U.S.S.N 60/087192 presentada el 29/5/98) . Con objeto de definir un umbral biológicamente importante de la afinidad de enlace DR, se compiló una base de datos de las afinidades de enlace de los epítopes restringidos 32 DR, para su elemento de restricción. En aproximadamente la mitad de los casos (15 de 32 epítopes) , se asoció la restricción DR con altas afinidades de enlace, esto es, afinidades de enlace con un valor ICS0 de 100 nM o menos. En la otra mitad de los casos (16 de 32) , se asoció la restricción DR con una afinidad intermedia (afinidades de enlace en el rango de 100-1000 nM) . Solamente en uno de los 32 casos se asoció la restricción DR con un IC50 de 1000 nM o superior. Así, se puede definir el 1000 nM como un umbral de afinidad asociado con la inmunogenicidad en el contexto de las moléculas DR. La afinidad de enlace de los péptidos para las moléculas HLA se puede determinar como se describe en el Ejemplo 1 a continuación .

IV. D . Porciones y Superporciones de Enlace de Epítopes de Péptidos . En los últimos años recientes se ha acumulado evidencia para demostrar que se puede clasificar una fracción grande de moléculas de clase I de HLA, y posiblemente de moléculas de clase II/ dentro de unos relativamente pocos supertipos caracterizados por repertorios de enlace de péptidos principalmente traslapantes, y estructuras de consenso de las cavidades de enlace principales de los péptidos. Para los análisis de cavidades de moléculas de HLA, los residuos que comprenden las cavidades B y F de las moléculas de clase I de HLA, como se describen en estudios cristalográficos (Guo, H. C. et al., Nature 360:364, 1992; Saper, M. A. Bjorkman, P. J. y iley, D. C, J Mol. Biol. 219:277, 1991; Madden, D. R. Garboczi, D. N. y Wiley, D. C, Cell 75:693, 1993), se han compilado a partir de la base de datos de Pharham, et al. (Parham, P., Adams, E. J., y Amett, K. L., I unol. Rev. 143:141, 1995). En estos análisis, los residuos 9, 45, 63, 66, 67, 70, y 99 se consideró que preparaban la cavidad B, y que determinaban la especificidad para el residuo en la segunda posición de los ligandos de péptidos. Similarmente , los residuos 77, 80, 81, y 116 se consideraron que determinaban la especificidad de la cavidad F, y que determinaban la especificidad para el residuo de la terminal C de un ligando de péptido enlazado por la molécula de HLA. A través del estudio de análogos de antígenos substituidos con aminoácidos sencillos, y la formación de secuencias de péptidos procesados naturalmente, enlazados endógenamente, se han identificado residuos críticos requeridos para el enlace específico de alelos a moléculas HLA. La presencia de estos residuos se correlaciona con la afinidad de enlace para las moléculas HLA. La identificación de porciones y/o superporciones que se correlacionan con un enlace de alta e intermedia afinidad, es una cuestión importante con respecto a la identificación con epítopes de péptidos inmunogénicos para la inclusión en una vacuna. Kast et al. (J". Immunol. 152:3904-3912, 1994), ha demostrado que los péptidos de soporte de porciones cuentan por 90% de los epítopes que se enlazan a moléculas de tipo I HLA específicas de alelos. En este estudio, todos los péptidos posibles de 9 aminoácidos de longitud y que se traslapan por 8 aminoácidos (240 péptidos) , que cubren la secuencia completa de las proteínas E6 y E7 del virus de papiloma humano de tipo 16, se evaluaron para el enlace a cinco moléculas HLA específicas de alelos, que se expresan con alta frecuencia entre diferentes grupos étnicos. Este conjunto sin desviación de péptidos, permite una evaluación del valor predictivo de las porciones HLA de clase I. Del conjunto de 240 péptidos, se identificaron 22 péptidos, que se enlazan a moléculas HLA específicas de alelos con una afinidad alta o intermedia. De estos 22 péptidos, 20 (esto es, 91%), soportan porciones. Así, este estudio demuestra el valor de las porciones para la identificación de epítopes de péptidos para la inclusión en una vacuna: la aplicación de técnicas de identificación basadas en porciones elimina la separación por exclusión del 90% de los epítopes potenciales. Tales epítopes de péptidos se identifican en las tablas descritas a continuación. Las tablas para los epítopes HLA de clase I, incluyen más del 90% de los péptidos que se enlazaran a una molécula de clase I HLA específica de alelos con una afinidad alta o intermedia. Los péptidos de la presente invención, también pueden incluir epítopes que se enlazan a moléculas MHC clase II DR. Una diferencia importante entre las moléculas HLA de clase I y de clase II, es que, aunque existe una restricción severa de tamaño para el enlace del péptido para las moléculas de clase I, se puede demostrar un grado superior de heterogeneidad en ambos tamaños y posiciones de estructura de enlace de la porción, con relación a los términos N y C del péptido, para los ligandos de péptido de la clase II. Esta heterogeneidad creciente se debe a la estructura del canal de enlace de la clase II que, a diferencia de su contraparte de la clase I, está abierto en ambos extremos. El análisis cristalográfico de los complejos de péptidos DRB*010l (ver, por ejemplo, Madden, D.R. Ann. Rev. Immunol 13:587, 1995) , muestra que los residuos que ocupan la posición 1 y la posición 6 de los péptidos que forman complejos con DRB*0101, se acoplan en dos cavidades de complementariedad en las moléculas DRB*0101, correspondiendo la posición Pl al residuo de anclaje más crucial y a la cavidad hidrofóbica más profunda. Otros estudios también han señalado a la posición P6 como un residuo de anclaje crucial para el enlace con otras diversas moléculas DR. Así, los péptidos de la presente invención se identifican por alguna de las porciones de aminoácidos específicas de diversos HLA (ver por ejemplo. Tablas I-III) . Si la presencia de una porción corresponde a la capacidad de enlazarse con diversos antígenos HLA específicos de alelos se refiere como una superporción . Las moléculas HLA específicas de alelos que se enlazan a los péptidos que poseen una superporción particular de aminoácido se refieren colectivamente como un supertipo de HLA. Las porciones y superporciones de péptidos descritas a continuación, proporcionan la guía para la identificación y uso de péptidos de conformidad con la invención. Los ejemplos de los epítopes de péptidos que soportan la porción o superporción respectiva se incluyen en las tablas como se designa en la descripción de cada porción o superporción. Las tablas incluyen un listado de la relación de afinidad de enlace para algunos de los epítopes de péptidos. La relación se puede convertir a IC50 por el uso de la siguiente fórmula: IC50 de una relación de péptido estándar es = a IC50 de péptido de prueba (esto es el epítope de péptido) . Los valores IC50 de los péptidos estándar usados para determinar las afinidades de enlace de los péptidos de clase I se muestran en la Tabla IV. Los valores IC50 de los péptidos estándar usados para determinar afinidades de enlace para la clase II de péptidos se muestran en la Tabla V. Los péptidos usados como estándares para el ensayo de enlace, son ejemplos de estándares; también se pueden usar péptidos estándar alternativos cuando se efectúe tal análisis. Para obtener las secuencias de epítopes de péptidos enlistadas en cada tabla, los datos de la secuencia de proteínas de 20 cepas de VHB (HPBADR, HPBADR1CG, HPBADRA, HPBADRC, HPBADRCG, HPBCGADR, HPBVADRM, HPBADW, HPBADW1 , HPBADW2, HPBADW3, HPBADWZ, HPBHEPB, HPBVADW2 , HPBAYR, HPBV, HPBVAYWC, HPBVAYWCI, NAD HPBVAYWE) se evaluaron para la presencia de la porción o superporción designada. También se seleccionaron los epítopes de péptidos sobre la base de conservación. Un criterio de conservación requiere que la secuencia completa de un péptido, se conserve totalmente en el 75% de las secuencias disponibles para una proteína específica. El porcentaje de conservación de los epítopes de los péptidos seleccionados se indica en las tablas. La frecuencia, esto es, el número de cepas de las 20 cepas en las cuales se identifica la secuencia de péptidos, también se muestra. La columna en la "posición 1" en las tablas designa la posición de aminoácidos de la proteína VHB que corresponde con el primer residuo de aminoácido del epítope. El "número de aminoácidos" indica el número de residuos en la secuencia de epítopes .

Porciones de HLA de Clase X Indicadoras de Epítopes de Péptidos que inducen CTL: Los resultados del anclaje primario de las superporciones y porciones de epítopes de péptidos de HLA de clase I delineados a continuación, se resumen en la Tabla I. Las porciones de HLA de clase I establecidas en la tabla I (a) , son aquellas más particularmente relevantes para la invención aquí reivindicada. Las posiciones de anclaje primaria y secundaria se resumen en la Tabla II. Las moléculas de HLA específicas de alelos que comprenden familias del supertipo de la clase I de HLA se enlistan en la Tabla VI.

IV.DI. Superporción HLA-Al . La superporción HLA-A1 se caracteriza por la presencia en los ligandos de péptidos de un residuo de anclaje primario pequeño (T o S) o hidrofóbico (L, I, V, o M) en la posición 2, y un residuo de anclaje primario aromático (Y, F, o W) en la posición de la terminal C del epítope. La familia correspondiente de moléculas HLA que se enlazan a la superporción Al (esto es, el supertipo HLA-A1) comprenden de al menos de A*0101, A*2601, A*2602, A*2501, y A*3201 (ver, por ejemplo, DiBrino, M. et al., J. Inmuno1. 151:5930, 1993; DiBrino, M. et al., J. Immunol . 152:620, 1994; Kondo, A et al., Immunogenetics 45:249, 1997). Otras moléculas de HLA específicas del alelo que se predice que son miembros de la superfamilia Al se muestran en la Tabla VI. Los péptidos que se enlazan a cada una de las proteínas individuales HLA, se pueden modular por substituciones en las posiciones de anclaje primarias y/o secundarias, preferiblemente escogiendo los residuos respectivos especificados para la superporción. Los epítopes de péptidos representativos que comprenden la superporción Al, se establecen en la Tabla VII adjunta.

IV.D2. Superporción HLA-A2. Se han descrito las especificidades de anclaje primario para las moléculas HLA A2.1 específicas de alelo (Falk et al., Nature 351:290-296 1991; Hunt et al., Science 255:1261-1263, 1992) y el enlace reactivo cruzado con la familia HLA A2 (Fruci et al., Human Immunol. 38:187-192, 1993; Tanigaki et al., Human Immunol. 39:155-162, 1994). Los inventores actuales han definido residuos adicionales de anclaje primario que determinan el anclaje reactivo transversal para moléculas múltiples HLA A2 específicas de alelos (Del Guercio et al., J. Iwmunol. 154:685-693, 1995). La superporción HLA-A2 comprende ligandos de péptidos con L, I, V, M, A, T, o Q como los residuos primarios de anclaje en la posición 2 y L, I, V, M, A, o T como el residuo de anclaje primario en la posición terminal C del epítope. La familia correspondiente de moléculas HLA (esto es, el supertipo HLA-A2 que se enlaza con estos péptidos) comprende de al menos A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*0207, A*0209, a*0214, A*6802, y A*6901. Otras moléculas HLA especificas de alelos que se predice que son miembros de la superfamilia A2 se muestran en la Tabla VI . Como se explica en detalle a continuación, el enlace a cada una de las moléculas individuales HLA específicas de alelos, se puede modular por la substituciones en las posiciones de anclaje primario y/o anclaje secundario, preferiblemente escogiendo los residuos respectivos especificados para la superporción .

Los epítopes de péptidos representativos que comprenden una superporción A2 se establecen en la Tabla VIII anexa. Las porciones que comprenden los residuos de anclaje primario V, A, T, o Q en la posición 2 y L, I, V, A, o T en la posición terminal C son aquellos más particularmente relevantes para la invención aquí reivindicada.

IV.D.3. Superporción HLA-A3. La superporción HLA-A3 se caracteriza por la presencia en ligandos de péptidos de A, L, I, V, M, S, o T como un anclaje primario en la posición 2, y un residuo positivamente cargado, R o K, en la posición terminal C epítope (por ejemplo, en la posición 9 de los nonámeros) . Los miembros ejemplares de la familia correspondiente de moléculas HLA (el supertipo HLA-A3) que se enlazan a la superporción A3 incluyen al menos A*0301, A*1101, ?*3101, A*3301, y A*6801. Otras moléculas HLA específicas del alelo que se predice que son miembros de la superfamilia A3 se muestran en la Tabla VI. Como se explica en detalle a continuación, el enlace de péptidos a cada una de las proteínas HLA individuales específicas del alelo se puede modular por las substituciones de aminoácidos en las posiciones de anclaje primarias y/o secundarias del péptido, pref riblemente escogiendo los residuos respectivos especificados para la superporción. Los epítopes de péptidos representativos que comprenden la superporción A3 se establecen en la Tabla IX adjunta.

IV.D. . Superporción HLA-A24. La superporción HLA-A24 se caracteriza por la presencia en los ligandos del péptido de un residuo aromático (F, W, o Y) como un anclaje primario en la posición 2, y un residuo hidrofóbico (Y, F, L, I, V, o M) como anclaje primario en la posición terminal C del epítope. La familia correspondiente de moléculas HLA que se enlazan a la superporción A24 (esto es, el supertipo A24) incluye al menos A*2402, A*3001, y A*2301. Otras moléculas HLA específicas de alelos que se predice que son miembros de la superfamilia A24 se muestran en la Tabla VI. El enlace de péptidos para cada una de las moléculas HLA específicas del alelo se puede modular por substituciones en las posiciones primarias de anclaje preferiblemente escogiendo los residuos respectivos especificados por la superporción. Los epítopes de péptidos representativos que comprenden la superporción A24 se establece en la Tabla X anexa.

IV. D.5. Superporción HLA-B7. La superporción HLA-B7 se caracteriza por péptidos que soportan a la prolina en la posición 2 como un anclaje primario, y un aminoácido hidrofóbico o alifático (L, I, V, M, A, F, , o Y) como el anclaje primario en la posición de la terminal C del epítope. La familia correspondiente de moléculas HLA que se enlazan a la superporción B7 (esto es, el supertipo HLA-B7) comprende al menos 26 proteínas HLA-B que incluyen: B*0702, B*0703, B*0704, B*0705, B*1508, B*3501, B*3502, B*3503, B*3504, B*3505, B*3506, B*3507, B*3508, B*5101, B*5102, B*5103, B*5104, B*5105, B*5301, B*5401, B*5501, B*5502, B*5601, B*5602, B*6701, y B*7801 (ver por ejemplo, Sidney, et al., J. Immunol . 154:247, 1995; Barker, et al., Curr Biol . 5:179, 1995; Hill, et al., Nature 360:434, 1992; Rammensee, et al., I munogenetics 41:178, 1995). Otras moléculas HLA específicas del alelo que se predice que son miembros de la superfamilia B7 se muestran en la Tabla VI.

Como se explicará en detalle a continuación, el enlace de péptidos a cada una de las proteínas HLA individuales específicas del alelo, se puede modular por substituciones en las posiciones de anclaje primarias y/o secundarias del péptido, escogiendo preferiblemente los residuos respectivos especificados para la superporción. Los epítopes de péptidos representativos que contienen la superporción B7 se establecen en la Tabla XI adjunta.

IV. D.6. Superporción HLA-B27. La superporción HLA-B27 se caracteriza por la presencia en ligandos de péptidos de un residuo cargado posi ivamente (R, H, o ) como un anclaje primario en la posición 2, y un residuo hidrofóbico (F, Y, L, W, M, I, A, o V) como un anclaje primario en la posición de la terminal C del epítope. Los miembros ejemplares de la familia correspondiente de moléculas HLA que se enlazan a la superporción B27 (esto es, el supertipo B27) incluyen al menos B*1401, B*1402, B*1509, B*2702, B*2703, B*2704, B*2705, B*2706, B*3801, B*3901, B*3902, y B*7301. Otras moléculas HLA específicas del alelo que se predicen que son miembros de la superfamilia B27 se muestran en la Tabla VI. El enlace de péptidos a cada una de las moléculas HLA específicas de alelos, se pueden modular por las substituciones en las posiciones primarias de anclaje, preferiblemente escogiendo los residuos especificados por la superporción. Los epítopes representativos de péptidos que comprenden la superporción B27 se establecen en la Tabla XII adjunta.

IV.D.7. Superporción HLA-B44. La superporción HLA-B44 se caracteriza por la presencia en los ligandos de péptidos de residuos cargados negativamente (D o E) como un anclaje primario en la posición 2, y residuos hidrofóbicos (F, W, Y, L, I, M, V, o A) como un anclaje primario en la posición de la terminal C del epítope. Los miembros ejemplares de la familia correspondiente de moléculas HLA que se enlazan a la superporción B44 (esto es, el supertipo B44) incluyen al menos B*1801, B*1802, B*3701, B 001, B 002, B 006, B 402, B*4403, y B 006. El enlace de péptidos a cada una de las moléculas HLA específicas de alelos, se puede modular por las substituciones en las posiciones de anclaje primarias, preferiblemente escogiendo los residuos respectivos especificados para la superporción.

IV. D.8. Superporción HLA-B58. La superporción HLA-B58 se caracteriza por la presencia en los ligandos de péptidos de un residuo alifático pequeño (A, S, o T) como un residuo de anclaje primario en la posición 2, y un residuo aromático o hidrofóbico (F, W, Y, L, I, V, M, o A) como un residuo de anclaje primario en la posición de la terminal C del epítope. Los miembros ejemplares de la familia correspondiente de moléculas HLA que se enlazan a la superporción B58 (esto es, el supertipo B58) incluyen al menos: B*1516, B*1517, B*5701, B*5702, y B*5801. Otras moléculas HLA específicas de alelos que se predice que son miembros de la superfamilia B58 se muestran en la Tabla VI. El enlace de péptidos a cada una de las moléculas HLA específicas de alelos, se puede modular por las substituciones en las posiciones de anclaje primarias, preferiblemente escogiendo los residuos respectivos especificados para la superporción. Los epítopes de péptidos representativos que comprenden la superporción B58 se establecen en la Tabla XIII anexa.

IV. D.9. Superporción HLA-B62. La superporción HLA-B62 se caracteriza por la presencia en ligandos de péptidos del residuo alifático polar Q o un residuo alifático hidrofóbico (L, V, M, o I) como un anclaje primario en la posición 2, y un residuo hidrofóbico (F, W, Y, M, I, V, L, o A) como un anclaje primario en la posición terminal del epítope. Los miembros ejemplares de la familia correspondiente de moléculas HLA que se enlazan a la superporción B62 (esto es, el supertipo B62) incluyen al menos B*1501, B*1502, B*1513, y B5201. Otras moléculas HLA específicas de alelos que se predice que son miembros de la superf milia B62 se muestran en la Tabla VI. El enlace de péptidos a cada una de las moléculas HLA específicas de alelos se puede modular por las substituciones en las posiciones primarias de anclaje, preferiblemente escogiendo los residuos respectivos especificados para la superporción .

Los epítopes representativos de péptidos que comprenden la superporción B62, se establecen en la Tabla XIV adjunta.

IV.D.10. Porción HLA-Al . La porción HLA-A1 específica de alelos se caracteriza por la presencia en los ligandos de péptidos de T, S, o M o un residuo de anclaje primario en la posición 2, y la presencia de Y como un residuo primario de anclaje en la posición de la terminal C del epítope. Una porción Al específica de alelo alternativa (esto es, una "subporción") se caracteriza por un residuo primario de anclaje en la posición 3 más que en la posición 2. Esta subporción se caracteriza por la presencia de D, E, A, o S como un residuo de anclaje primario en la posición 3, y un Y como un residuo primario de anclaje en la posición de la terminal C del epítope. Una subporción prolongada se caracteriza por la presencia de D en la posición 3 y de A, I, L, o F en la terminación C. El enlace de péptidos al HLA-A1 se puede modular por las substituciones de anclaje primarias y/o secundarias, preferiblemente al escoger los residuos respectivos especificados por la porción. Los epítopes representativos de péptidos que comprenden la porción Al, se establecen en la Tabla XV anexa. Aquellos epítopes que comprenden T, ?, o M a una posición 2 e Y en la posición de la terminal C también se incluyen en el listado de los epítopes de péptidos que soportan la superporción HLA-Al enlistados en la Tabla VII.

IV.D.ll. Porción HLA-A2.1. Una porción HLA-A2.1 específica de alelo, se determinó primero para caracterizarse por la presencia en los ligandos de péptidos L o como el residuo primario de anclaje en la posición 2, y L o V como un residuo primario de anclaje en la posición de la terminal C de un epítope 9 aminoácidos (Falk et al., Nature 351:290-296 1991). Además, la porción A .1 se determinó para comprender además un I en la posición 2 y un I o un A en la posición de la terminal C del péptido de nueve aminoácidos (Hunt et a.1., Science 255:1261-1263, Marzo 6, 1992). Adicionalmente , la porción específica del alelo A2.1 se ha encontrado que comprende una T en una posición terminal C (Kast et al., J. Immunol . 152:3904-3912, 1994). Posteriormente, la porción específica del alelo A2.1 se ha definido por los inventores actuales para comprender adicionalmente V, A, T, o Q como un residuo de anclaje primario en la posición 2, y M como un residuo primario de anclaje en la posición de la terminal C del epitope. Así, la porción HLA-A2.1 comprende ligandos de péptidos con L, I, V, M, A, T, o Q como los residuos primarios de anclaje en la posición 2 y L, I, V, M, A, o T como el residuo primario de anclaje en la posición terminal C del epitope. Los residuos preferidos y tolerados que caracterizan las posiciones primarias de anclaje de la porción HLA-A2.1 son idénticos a los residuos preferidos de la superporción A2 (para las revisiones de los datos relevantes ver por ejemplo, Del Guercio et al., J. Immunol . 154:685-693, 1995; Sidney et al., I unol. Today 17:261-266 1996; Sette y Sidney, Curr Opin. in Immunol. 10:478-482 1998). Los residuos de anclaje que caracterizan la porción A2.1 se han definido adicionalmente como se describen en la presente. Estos se describen en la Tabla II. El enlace de péptidos a las moléculas HLA-A2.1 se puede modular por las substituciones en las posiciones de anclaje primaria y/o secundaria, preferiblemente al escoger los residuos preferidos especificados para la porción.

Los epítopes representativos de péptidos que comprenden una porción A2.1 , se establecen en la Tabla VII adjunta. Las porciones A2.1 que comprenden los residuos primarios de anclaje V, A, T, o Q en la posición 2 y L, I, V, A, o T en la posición de la terminal C son aquellos más particularmente relevantes a la invención aquí reivindicada.

IV.D.12. Porción HLA-A3. La porción HLA-A3 específica de aleloa se caracteriza por la presencia en ligandos de péptidos de L, M, V, I, ?, A, T, F, C, G, o D como un residuo primario de anclaje en la posición 2, y la presencia de K, Y, R, H, F, o A como un residuo primario de anclaje en la posición terminal C del epítope. El enlace de péptidos de HLA-A3 se puede modular por las substituciones en las posiciones primarias y/o secundarias de anclaje, preferiblemente al escoger los residuos respectivos especificados por la porción. Los epítopes representativos de péptidos que comprenden la porción A3 se establecen en la Tabla XVI adjunta. Aquellos epítopes de péptidos que también comprenden la superporción A3 también se enlistan en la Tabla IX.

IV.D.13. Porción HLA-A11. La porción HLA-A11 de alelos se caracteriza por la presencia en los ligandos de péptidos de V, T, M, L, I, S, A, G, N, C, D, o F como un residuo primario de anclaje en la posición 2, y K, Y, o H como un residuo primario de anclaje en la posición terminal C del epítope. El enlace de péptidos para HLA-A11 se puede modular por las substituciones en las posiciones primarias y/o secundarias de anclaje, preferiblemente al escoger los residuos respectivos especificados para la porción.

Los epítopes representativos de péptidos que comprenden la porción All se establecen en la Tabla XVII anexa; los epítopes de péptidos que comprenden la porción específica del alelo A3 también están presentes en esta tabla debido al amplio traslape entre las especificidades de anclaje primarias de la porción A3 y All. Además, aquellos epítopes de péptidos que comprenden la superporción A3 también se enlistan en la Tabla IX.

IV.D.14. Porción HLA-A2 . La porción HLA-A24 específica del alelo se caracteriza por la presencia en los ligandos de péptidos de Y, F, , o M como un residuo de anclaje primario en la posición 2, y de F, L, I, o como un residuo de anclaje primario en la posición de la terminal C del epítope. El enlace de péptidos para las moléculas HLA-A24 se puede modular por las substituciones en las posiciones de anclaje primarias y/o secundarias, preferiblemente al escoger los residuos respectivos especificados para la porción.

Los epítopes representativos que comprenden la porción A24 se establecen en la Tabla XVIII. Estos epítopes también se enlistan en la Tabla X, epítopes que soportan la superporción HLA-A24.

PorcloneB Indicativas de los Epítopes HTL de Clase II de HLA.

Los residuos de anclaje primarios y secundarios de las superporciones de clase II de HLA y las porciones abajo delineadas se resumen en la Tabla III.

IV.D.15. Superporción HLA-DR-1-4-7. Se han identificado también porciones para péptidos que se enlazan con trea moléculas comunes de HLA específicas del alelo HLA de clase II: HLA DRB1*0401, DRB1*0101, y DRB1*0701. Colectivamente, los residuos comunes de estas porciones delinean la superporción HLA DR-1-4-7. Los péptidos que se enlazan a estas moléculas DR llevan una superporción caracterizada por un gran residuo aromático o hidrofóbico (Y, F, W, L, I, V, o M) como un residuo de anclaje primario en la posición 1, y un residuo pequeño sin carga (S, T, C, A, P, V, I, I, o M) como un residuo de anclaje en la posición 6 del epítope . Los efectos secundarios específicos del alelo y los anclajes secundarios para cada uno de estos tipos de HLA también se han identificado. Estos se establecen en la Tabla III. El enlace de péptidos a HLA-DR4 , DR1 y/o DR7 se puede modular por las substituciones en las posiciones de anclaje primaria y secundaria, preferiblemente escogiendo los residuos respectivos especificados para la superporción. Los epítopes de péptidos conservados (esto es, 75% de conservación en las 20 cepas VHB usadas para el análisis) , corresponden al núcleo de nueve residuos que comprende la superporción DR-1-4-7 (en donde la posición 1 de la porción esta en la posición 1 del núcleo de nueve residuos) se establecen en Tabla XlXa (ver, por ejemplo, Maddden, Annu. Rev. Immunol . 13:587-622, 1995). Los epítopes de péptidos ejemplares respectivos de los 15 residuos de aminoácidos en longitud, cada uno de los cuales comprende un núcleo conservado de nueve residuos, también se muestra en la sección "a" de la tabla. Los datos de enlace de reacción cruzada para los péptidos que soportan superporciones ejemplares de 15 residuos denotadas por un número de péptidos se muestran en la Tabla XlXb.

IV.D.16. Porciones HLA DR3. Dos porciones alternas (estos es, subporciones) caracterizan a los epítopes de péptidos que se enlazan a las moléculas HLA-DR3. En la primera porción (subporción DR3A) , un residuo grande, hidrofóbico (L, I, V, M, F, o Y) está presente en la posición de anclaje 1, y D está presente como un anclaje en la posición 4, hacia la terminación carboxilo del epítope . La subporción alternativa DR3 proporciona la carencia de un residuo hidrofóbico grande, en la posición de anclaje 1, y/o la carencia de un residuo de anclaje del tipo amida o cargado negativamente en la posición 4, por la presencia de una carga positiva en la posición 6 hacia la terminación carboxilo del epítope . Así, para la porción DR3 específica del alelo alternativo (subporción DR3B) : L, I, V, M, F, Y, A, o Y están presentes en la posición de anclaje 1; D, N, Q, E, S, o T están presentes en la posición de anclaje 4; y K, R, o H están presentes en la posición de anclaje 6. El enlace de péptidos a HLA-DR3 se puede modular por las substituciones en las posiciones de anclaje primaria y/o secundaria, escogiendo preferiblemente los residuos respectivos especificados para la porción. Los epítopes de péptidos conservados (esto es, secuencias que tienen 75% conservadas en las 20 cepas de VHB usadas para el análisis) , corresponden al núcleo de nueve residuos que comprende la subporción DR3A (en donde la posición 1 de la porción está en la posición 1 del núcleo de nueve residuos) establecido en la Tabla XXa . Los epítopes de péptidos respectivos de los 15 residuos de aminoácidos de longitud, cada uno de los cuales comprende un núcleo conservados de nueve residuos, también se muestran en la sección "a" de la tabla. La Tabla XXb muestra datos de enlace de la subporción ejemplar DR3 de péptidos que soportan A denotados por un número de péptidos. Epítopes de péptidos conservados (esto es, 75% de porción en las 20 cepas de VHB usadas para el análisis) , que corresponden a un núcleo de nueve residuos que comprende la subporción DR3B y los péptidos 15-meros respectivos ejemplares comprenden el epí ope DR3 de la subporción B en la Tabla XXc . La Tabla XXd muestra datos de enlace de los péptidos que soportan la subporción B de DR3 ejemplares denotados por un número de péptidos. Cada uno de los epitopes de los péptidos de clase I o clase II de HLA establecidos en las tablas en la presente, merecen simplemente ser un aspecto inventivo de esta solicitud. Además, también es un aspecto inventivo de esta solicitud que cada epítope de péptido se pueda usar en combinación con algún otro epítope de péptido.

IV. E. Incremento de la Cobertura de la Población de la Vacuna . Son preferidas las vacunas que tienen una amplia cobertura de población, debido a que son comercialmente más viables y generalmente aplicables a la mayoría de las personas. Una cobertura amplia de población se puede obtener usando los péptidos de la invención (composiciones de ácidos nucleicos que codifican tales péptidos) a través de la selección de epitopes de péptidos que se enlazan a los alelos HLA los cuales, cuando se consideran en total, están presentes en la mayoría de la población. La Tabla XXI, enlista las frecuencias generales de los supertipos HLA de clase I en diversas etnicidades (Tabla XXIa) y la cobertura combinada de población alcanzada por los supertipos A2-,A3-, y B7- (Tabla XXIb) . Los supertipos A2-, A3-, y B7 están más de uno presentes en el promedio de más de 40% en cada uno de estos cinco grupos étnicos principales. La cobertura en exceso de 80% se alcanza con una combinación de superporciones . Estos resultados sugieren que la cobertura de la población inclinada no étnicamente y efectiva, se logra con el uso de un número limitado de péptidos de reacción cruzada. Aunque es alta la cobertura de población alcanzada con estas tres principales especificidades de péptidos, se puede expandir la cobertura para alcanzar una cobertura del 95% de la población y superior, y alcanzar más fácilmente respuestas verdaderamente multiespecíficas con el uso de una superporción adicional o péptidos de soporte de las porciones específicas de alelos . Los supertipos B44-, Al-, y A24- están presentes en promedio, en un rango de 25% a 40% de estas principales poblaciones étnicas (Tabla XXIa) . Aunque es menos prevaleciente en lo global, los supertipos B27-, B58-, y B62 están cada uno presentes con una frecuencia de >25% en al menos un grupo étnico principal (Tabla XXIa) . La Tabla XXIb, resume la prevalencia estimada combinada en cinco grupos étnicos principales de los supertipos de HLA que se han identificado. La cobertura incremental obtenida por la inclusión de los supertipos Al,-A24-, y B44- con la cobertura A2, A3, y B7 o de todos IOB supertipos descritos en la presente se muestra. Al incluir los epítopes de los seis supertipos más frecuentes, se obtiene una cobertura promedio de población del 99% para cinco grupos étnicos principales. Los datos aquí presentados, junto con la definición previa de los supertipos A2-, A3-, y B7, indica que todos los antígenos, con la excepción posible de A29, B8, y B46, se pueden clasificar dentro de un total de nueve supertipos HLA. Al focalizarse en los seis supertipos más comunes, resulta en una cobertura de población mayor al 98% para todas las poblaciones étnicas principales.

IV. F. Análogos do Péptidos Estimuladores de la Respuesta Inmune . Aunque se identifican péptidos con una reactividad cruzada adecuada entre todos los alelos de una superfamilia , por IOB procedimientos de separación por exclusión antes descritos, la reactividad cruzada no siempre está completa y en tales casos puede ser útiles procedimientos para incrementar además la reactividad cruzada de los péptidos; tales procedimientos también se pueden usar para modificar otras propiedades de los péptidos. Habiendo establecido las reglas generales que gobiernan la reactividad cruzada de los péptidos para los alelos HLA dentro de una porción o superporción dada, se puede efectuar la modificación (esto es, la formación de análogos) de la estructura de péptidoa de interés particular, con objeto de lograr una capacidad de enlace más amplia de los HLA (o modificada de otra manera) . Más específicamente, se pueden producir los péptidoa que muestran los patrones de reactividad cruzada más amplios (entre los epítopes de células T conocidos, así como en el conjunto más amplio de péptidoa que contienen la superporciones apropiadas) , de acuerdo con las enseñanzas de la presente. La estrategia empleada utiliza las porciones o superporciones que se correlacionan con el enlace a ciertas moléculas de HLA. Las porciones o superporciones se definen por tener anclajes primarios, también se pueden modificar a través de anclajes secundarios. Los péptidos análogos se pueden crear al substituir residuos de aminoácidos en el anclaje primario, anclaje secundario o en las posiciones de anclaje primario y secundario. Generalmente, los análogos se hacen para los péptidos que ya soportan una porción o superporción . Los residuos de anclaje secundarios preferidos de las superporciones y porciones que se han definido para los péptidos de enlace de HLA de clase I y de clase II se muestran en las Tablas II y III respectivamente. Para varias de las porciones y superporciones de conformidad con la invención, se definen residuos que son perjudiciales al enlace de moléculas HLA específicas de alelos, o a miembros de los supertipos HLA que se enlazan con la porción o superporción respectiva (Tablas II y III) . De esta manera, la eliminación de residuos que son perjudiciales al enlace, se puede llevar a cabo de conformidad con la presente invención. Por ejemplo, en el caso del supertipo A3 , cuando se eliminan todos los péptidos que tienen tales residuos perjudiciales de la población de péptidos analizados, se incrementa la incidencia de la reactividad cruzada desde 22% a 37% (ver por ejemplo, Sidney, J. et al., Hu. Immunol . 45:79, 1996). Así, una estrategia para mejorar la reactividad cruzada de péptidos dentro de una superporción dada, es simplemente eliminar uno o más de los residuos per udiciales presentes dentro de un péptido, y substituir un residuo "neutral" pequeño tal como Ala (que puede no tener influencia en el reconocimiento de las células T del péptido) . Se espera una probabilidad creciente de reactividad cruzada, si junto con la eliminación de los residuos perjudiciales dentro de un péptido, se insertan residuos asociados con el enlace de alta afinidad a los alelos múltiples dentro de una superfamilia . Para asegurarse de que un péptido análogo cuando se usa como una vacuna, obtenga realmente una respuesta CTL al epítope nativo in vivo (o en el caso de los epítopes de clase II, obtener células T de ayuda que reaccionen cruzado con los péptidos de tipo silvestre) , se puede usar el péptido análogo para inmunizar células T in vitro de individuos del alelo apropiado HLA. Posteriormente, la capacidad de las células inmunizadas para inducir la lisis de las células objetivo sensibilizadas a los péptidos de tipo silvestre se evalúa. Será deseable usar como células que presentan antígenos, las células que se han infectado o transfectado con los genes adecuados, o en el caso solamente de los epítopes de clase II, las células que se han pulsado con antígenos de proteínas completos, para establecer si también se reconoce el antígeno producido endógenamente por las células T relevantes. Otra modalidad de la invención para asegurar números adecuados de enlazadores celulares de reacción cruzada, es crear análogos de péptidos de enlace débil. Se pueden fijar los péptidos de clase I que muestran afinidades de enlace de 500-50000nM, y que llevan un residuo de anclaje primario aceptable pero subóptimo en una de las posiciones puede "fijarse" al substituir los residuos de anclaje preferidos de acuerdo con el supertipo respectivo. Luego se pueden probar los péptidos análogos para la actividad de enlace cruzado. Otra modalidad para generar análogos efectivos de péptidos, involucra la substitución de residuos que tienen un impacto adverso en la estabilidad o solubilidad del péptido en un medio ambiente líquido. Esta substitución puede suceder en cualquier posición del epítope del péptido. Por ejemplo, se puede substituir un cisteína (C) a favor del ácido a-amino butírico. Debido a su naturaleza química, la cisteína tiene la propensión a formar puentes disulfuro y altera suficientemente al péptido de forma estructural de manera de reducir la capacidad de enlace. Al substituir el ácido a-amino butírico por C, no solamente mejora este problema, sino que de hecho mejora la capacidad de enlace y de enlace cruzado en ciertos casos (revisión: A. Sette et al., In: Persistent Viral Infections . Eds . R. Ahmed y I. Chen, John Wiley & Sons, England, 1999) . La substitución de la cisteína con el ácido alfa amino butírico, puede presentarse en cualquier residuo de un epítope de péptido, esto es, en las posiciones de anclaje o de no anclaje. En general, las respuestas CTL y HTL no se dirigen contra todos los epítopes posibles. Más bien, están restringidos a unos cuantos determinantes inmunodominantes (Zinkernagel , et al., Adv. Inmuno1. 27:5159, 1979; Bennink, et al., J. Exp. Med. 168:19351939, 1988 ; Rawle, et al., J. Immunol. 146:3977-3984, 1991). Se ha reconocido que la inmunodominación (Benacerraf, et al., Science 175:273-279, 1972) , se puede explicar por la capacidad de un epítope dado para enlazarse selectivamente con una proteína particular de HLA (teoría de selección determinante) (Vitiello, et al., J. Immunol. 131:1635, 1983); Rosenthal , et al., Nature 267:156-158, 1977), o ser reconocidas selectivamente por las especificidades existentes de TCR (receptores de células T) (teoría del repertorio) (Klein, J. , IM UNOLOGY, THE SCIENCE OF SELFNONSELF DISCRIMINATION; John iley & Sons, New York, pp. 270-310, 1982). Se ha demostrado que factores adicionales, principalmente ligados a eventos de procesamiento, también pueden jugar un papel clave en definir más allá de la inmunogenicidad estricta, cuales de los muchos determinantes potenciales se presentarán como inmunodominantes (Sercarz, et al., Annu. Rev. Inmuno1. 11 :729-766, 1993) . El concepto de dominancia y subdominancia es relevante para la inmunoterapia de enfermedades infecciosas y del cáncer. Por ejemplo, en el curso de una enfermedad viral crónica, puede ser importante el reclutamiento de epítopes subdominantes para una depuración exitosa de la infección, especialmente si las especificidades CTL o HTL dominantes se han inactivado por la tolerancia funcional, supresión, mutación de virus y otros mecanismos (Franco, et al., Curr. Opin. Inimunol. 7:524-531, (1995)). En el caso de antígenos de tumor y de cáncer, los CTL que reconocen al menos algunos de los péptidos de afinidad de enlace más altos, pueden inactivarse funcionalmente . Los péptidos de afinidad de enlace inferior se reconocen preferiblemente en estos tiempos . En particular, se ha observado que un número importante de epítopes derivados de antígenos asociados con tumores no vírales conocidos (TAA) , se enlazan al HLA de clase I con afinidad intermedia (IC50 en el rango de 50-500 nM) . Por ejemplo, se ha encontrado que 8 de 15 péptidos conocidos TAA reconocidos por linfocitos que infiltran al tumor (TIL) o que se enlazan a CTL en el rango de 50-500 nM. (Estos datos están en contraste en los estimados de que 90% de los antígenos vírales conocidos que se reconocieron como péptidos se enlazan a la HLA con IC50 de 50 nM o menos, mientras que son aproximadamente 10% se enlazaron en el rango de 50-500 nM (Sette, et al., J. Immunol . , 153:558-5592 (1994)). En el ambiente del cáncer, este fenómeno se debe probablemente a la eliminación, o inhibición funcional de los CTL que reconocen diversos de péptidos de enlace más elevado, presumiblemente debido a eventos de tolerancia de células T. Sin pretender apegarse por la teoría, se cree que debido a las células T para los epítopes dominantes pueden haber sido eliminadas por clonación, la selección de epítopes subdominantes pueden permitir que se recluten las células T en existencia, lo cual luego conducirá a una respuesta terapéutica. Sin embargo, el enlace de las moléculas HLA a los epítopes subdominantes, es a menudo menos vigorosa que a los dominantes. De esta manera, hay una necesidad de poder modular la afinidad de enlace de los epítopes inmunogénicos particulares para una o más moléculas HLA, y por lo tanto modular la respuesta inmune obtenida por el péptido. Así, existe la necesidad de preparar péptidos análogos que obtengan una respuesta más vigorosa. Esta capacidad aumentaría ampliamente la utilidad de las vacunas basadas en péptidos y los agentes terapéuticos. Los péptidos análogos representativos se establecen en la Tabla XXII. La tabla indica la longitud y secuencia del péptido análogo así como la porción o superporción si es adecuado. La información en la columna de "Nomenclatura Fija" indica que los residuos se substituyen en los números de posición indicados para el análogo respectivo.

IV. G. Separación por Exclusión en Computadora de las Secuencias de Proteínas a partir de Antígenos Relacionados con la Enfermedad para los Péptidos que Contienen la Porción o Superporción. Con objeto de identificar los epítopes que soportan la porción o superporción en un antígeno objetivo, se separa por exclusión una secuencia de proteínas nativas, por ejemplo, un antígeno asociado al tumor, o secuencias de un organismo infeccioso, o un te ido de donador para trasplante, usando medios para cálculo, tal como un cálculo intelectual o una computadora, para determinar la presencia de una porción o superporción dentro de la secuencia. La información obtenida del análisis del péptido nativo se puede usar directamente para evaluar el estado del péptido nativo o se puede utilizar posteriormente para generar el epítope del péptido. Los programas de computadora que permiten la separación por exclusión rápida de secuencias de proteínas para la presencia de las porciones o superporciones objetivo, se abarcan por la presente invención; como lo son los programas que permiten la generación de péptidos análogos. Estos programas se implementan para analizar cualquier secuencia identificada de aminoácidos, o para operar en una secuencia desconocida y determinar simultáneamente la secuencia e identificar los epítopes que soportan las porciones del mismo; también se pueden determinar simultáneamente los análogos. Generalmente, las secuencias identificadas serán de un organismo patogénico o de un péptido asociado al tumor. Por ejemplo, las moléculas objetivo consideradas en la presente, incluyen todas las proteínas VHB (por ejemplo, de superficie, núcleo, polimerasa y X) . En los casos en donde la secuencia de variantes múltiples de la misma proteína objetivo está disponible, también se pueden seleccionar los péptidos sobre la base de su conservación. Un criterio actualmente preferido para la conservación, define que la secuencia completa de un péptido esté totalmente conservada en el 75% de las secuencias evaluadas para una proteína específica; esta definición de conservación se ha empleado en la presente. Es importante que los criterios de selección utilizados para la predicción del enlace de péptidos sean lo más preciso posibles, para correlacionarse más eficientemente con el enlace actual. La predicción de los péptidos que se enlazan, por ejemplo, al HLA-A*0201, sobre la base de la presencia de los anclajes primarios adecuados, es positivo alrededor de una tasa del 30% (Ruppert, J. et al. Cell 74:929, 1993). Sin embargo, al analizar una base de datos de enlace de HLA de péptidos amplios, los inventores actuales han desarrollado diversos algoritmos polinomiales específicos de alelos, que incrementan dramá icamente el valor predictivo sobre la identificación en la base de la presencia solamente de residuos de anclaje primario. Estos algoritmos toman en cuenta no solamente la presencia o ausencia de los anclajes primarios correctos, sino también consideran la presencia positiva o perjudicial de los residuos de anclajes secundarios (para contar por el impacto de diferentes aminoácidos en posiciones diferentes) . Los algoritmos se basan esencialmente en la premisa de la afinidad global (o ?? de las interacciones HLA-péptidos se pueden aproximar como una función polinomial lineal del tipo: AG=aii x a2i x a3i...x ani. en donde aij es un coeficiente que representa el efecto de la presencia de un aminoácido dado (j) en una posición dada (i) junto con la secuencia de un péptido de n aminoácido. Una suposición importante de este método, es que los efectos de cada posición son esencialmente independientes uno del otro. Esta suposición se justifica por estudios que demuestran que los péptidos se enlazan a las moléculas HLA y se reconocen por las células T en esencialmente una conformación prolongada. La derivación de los coeficientes de algoritmos específicos ha sido descrita por Gulukota et al. (Gulukota, K. et al., J. Mol. Biol. 267:1258, 1997). Los métodos adicionales para identificar secuencias preferidas de péptidos, que también hacen uso de porciones especificas, incluyen el uso de redes neurales y programas de modelaje molecular (ver, por ejemplo, Milik et al., Nature Biotechnology 16:753, 1998; Altuvia et al., Hu Immunol . 58:1, 1997; Altuvia et al., J. Mol. Biol. 249:244, 1995; Buus, S. Curr Opin. Immunol: 11:209-213, 1999; Brusic, V. et al., Bioinformatics 14:121-130, 1998; Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1993; eister et al., Vaccine 13:581, 1995; Hammer et al., J. Exp. Med. 180:2353, 1994; Sturniolo et al., Nature Biotechnol . 17:555 1999). Por ejemplo, se ha demostrado que en los conjuntos de los péptidos de porción A*0201, el 69% de los péptidos que contienen al menos un residuo de anclaje secundario preferido mientras evitan la presencia de algunos residuos de anclaje secundarios perjudiciales, se enlazarán a A*0201 con IC50 menor a 500 nM (Ruppert, J. et al. Cell 74:929, 1993). Estos algoritmos también son flexibles en que los registros de corte se pueden ajustar a conjuntos seleccionados de peptidos con mayores o menores propiedades de enlace pronosticadas como se desee. Al utilizar la separación por exclusión en computadora para identificar epítopes de péptidos, todas las secuencias de proteínas o la secuencia traducida se puede analizar un programa de cómputo desarrollado para la búsqueda de porciones, por ejemplo, el programa "FINDPATTERNS" (Devereux, et al. Nucí. Acids . Res. 12:387-395, 1984) o el programa de cómputo MotifSearch 1.4 (D. Brown, San Diego, CA) para identificar secuencias de péptidos potenciales que contienen porciones de enlace de HLA adecuadas . Como se apreciará por alguien experto ordinario en la técnica, está disponible una gran configuración de opciones de programas de cómputo y de equipo de cómputo, que se pueden emplear para incrementar las porciones de la invención con relación a las secuencias conocidas o desconocidas de péptidos. Los péptidos identificados se calificarán luego usando algoritmos polinomiales hechos a la medida, para predecir su capacidad para enlazarse a alelos específicos de HLA de clase I o de clase II. De acuerdo con los procedimientos antes descritos, los péptidos y análogos de VHB de los mismos pueden enlazarse al supertipo de HLA o moléculas HLA específicas de alelos que se han identificado (Tablas VII-XX; Tabla XXII) .

IV. H. Preparación de los Epítopee de Péptidos. Los péptidos de conformidad con la invención, se pueden preparar sintéticamente, por tecnología de ADN recombinante o por síntesis química, o a partir de fuentes naturales tales como tumores nativos u organismos patogénicos. Los epítopes de péptidos se pueden sintetizar individualmente o como péptidos poliepitópicos . Aunque el péptido estará preferiblemente substancialmente libre de otras proteínas de células hospedadoras que se presentan naturalmente y fragmentos de las mismas, en algunas modalidades los péptidos se pueden conjugar sintéticamente a los fragmentos o partículas nativos. Los péptidos de conformidad con la invención pueden ser de una diversidad de longitudes, y en sus formas neutrales (sin carga) o en formas que sean sales. Los péptidos de conformidad con la invención, están libres de modificaciones tales como la glicosilación, oxidación de cadena lateral o fosforilación; o contienen estas modificaciones, sujetas a la condición de que las modificaciones no destruyen la actividad biológica de los péptidos como se describe en la presente. Cuando es posible, puede ser deseable optimizar los epítopes de enlace de clase I de HLA de la invención, tales que se puedan usar en un constructo poliepitópico, hasta una longitud de alrededor de 8 hasta alrededor de 13 residuos de aminoácidos, a menudo de 8 a 11, preferiblemente de 9 a 10.

Los epítopes de enlace de clase II de HLA de la invención, ae pueden optimizar hasta una longitud de alrededor de 6 hasta alrededor de 30 aminoácidos de longitud, preferiblemente entre hasta alrededor de 13 y alrededor de 20 residuos. Preferiblemente, los epítopes de péptidos son iguales en tamaño con los péptidos derivados de patógenos procesados endógenamente o péptidos de células de tumor que se enlazan a las moléculas relevantes de HLA, sin embargo, la identificación y preparación de los péptidos que comprenden los epítopes de la invención, también se puede llevar a cabo usando las técnicas aquí descritas . En modalidades alternativas, los epítopes de la invención se pueden ligar con un péptido poliepitópico, o como un minigen que codifica a un péptido poliepitópico. En otra modalidad, se prefiere identificar regiones de péptidos nativas que contengan una alta concentración de epítopes de clase I y/o clase II. Tal secuencia se selecciona generalmente sobre la base de que contenga el número más grande de epítopes por longitud de aminoácidos. Se apreciará que los epítopes pueden estar presentes en una forma alojada o traslapante, por ejemplo, un péptido de 10 aminoácidos de longitud, puede contener dos epítopes de 9 aminoácidos de longitud y un epítope de 10 aminoácidos de longitud, con un procesamiento intracelular, se puede exponer cada epítope y enlazarse por una molécula de HLA con la administración de tal péptido. Este péptido más grande, preferiblemente multiepítopico , ae puede generar sintéticamente, de forma recombinante o por medio de desdoblamiento de fuente nativa.

Los péptidos de la invención se pueden preparar en una amplia variedad de formas. Para el tamaño corto relativamente preferido, se pueden sintetizar los péptidos en solución, o en un soporte sólido de conformidad con las técnicas convencionales. Están comercialmente disponibles diversos sintetizadores automáticos, y se pueden usar de acuerdo con protocolos conocidos (ver, por ejemplo, Stewart & Young, SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS; 2A. ED . , Pierce Chemical Co . , 1984). Además, se pueden unir los epítopes de péptidos individuales usando ligación química para producir péptidos más grandes que estén todavía dentro de las fronteras de la invención. Alternativamente, se puede emplear tecnología recombinante de ADN, en donde una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido inmunogénico de interés, se inserta en un vector de expresión, transformado o transfectado dentro de una célula hospedadora adecuada y cultivada bajo condiciones apropiadas para la expresión. Estos procedimientos se conocen generalmente en la técnica, como se describe generalmente en Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). Así, los polipéptidos recombinantes que comprenden una o más secuencias de péptidos de la invención, se pueden usar para presentar el epítope adecuado de células T. La secuencia codificadora de nucleótidos para los epítopes de péptidos de las longitudes preferidas contempladas en la presente, se puede sintetizar por técnicas químicas, por ejemplo, el método de fosfotriéster de Matteucci, et al. J. Am. Chem, Soc. 103:3185 (1981). Los análogos de péptidos pueden hacerse simplemente al substituir las bases de ácido nucleico adecuadas y deseadas, por aquellas que codifican la secuencia nativa de péptidos; substituciones ejemplares de ácidos nucleicos son aquellas que codifican un aminoácido definido por las porciones/superporciones en la presente. La secuencia de codificación puede luego suministrarse con ligadores adecuados y ligarse en vectores de expresión comúnmente disponibles en el arte, y los vectores usados para transformar hospedadores apropiados para producir la proteína de fusión deseada. Están ahora disponibles diversos de tales vectores y sistemas hospedadores apropiados. Para la expresión de las proteínas de fusión, la secuencia de codificación se proporcionará con codones de partida y de detención ligados operativamente, regiones de promotor y determinador, y usualmente un sistema de replicación para proporcionar un vector de expresión, para la expresión en el hospedador celular deseado. Por ejemplo, la secuencias de promotor compatibles con hospedadores bacterianos, se proporcionan en plásmidos que contienen sitios de restricción convenientes para la inserción de la secuencia de codificación deseada. Los vectores de expresión resultantes se transforman en hospedadores bacterianos apropiados. Por supuesto, se pueden también usar hospedadores de células de mamíferos o de insectos, levaduras, empleando vectores apropiados y secuencias de control .

IV. I. Ensayos para Detectar Respuestas de Células T. Una vez que se identifican los péptidos de enlace HLA, se pueden probar por la capacidad de obtener una respuesta de células T. La preparación y evaluación de los péptidos que soportan las porciones se describen las publicaciones PCT WO 94/20127 y WO 94/03205. Brevemente los péptidos que comprenden epítopea de un antígeno particular, se sintetizan y prueban por su capacidad para enlazarse a proteínas HLA adecuadas. Estos ensayos pueden involucrar la evaluación del enlace de un péptido de la invención, a moléculas purificadas de HLA de clase I con relación al enlace de un péptido de referencia radioyodado. Alternativamente, las células que expresan moléculas vacías de clase I (por ejemplo, que carecen del péptido en ella) se pueden evaluar para el enlace de péptidos por tinción inmunofluorescente y microfluorometría de flujo. Otros ensayos que se pueden usar para evaluar el enlace de péptidos incluyen ensayos de ensamble de clase I dependientes de péptidos y/o la inhibición del reconocimiento de CTL por la competencia con péptidos. Aquellos péptidos que se enlazan a la molécula de clase I, típicamente con una afinidad de 500 nM o menos, se evalúan además por su capacidad para servir como objetivos para los CTL derivados de individuos infectados o inmunizados, así como por su capacidad para inducir respuestas primarias in vitro o in vivo de CTL que puedan dar lugar a poblaciones CTL capaces de reaccionar con las células objetivo seleccionadas asociadas con una enfermedad. Se usan ensayos análogos para la evaluación de péptidos de enlace de clase II de HLA. Los péptidos que soportan porciones HLA de clase II que se muestra que se enlazan, típicamente a una afinidad de 1000 nM o menos, se evalúan además por su capacidad para estimular respuestas de HTL. Los ensayos convencionales utilizados para detectar respuestas de células T, incluyen ensayos de proliferación, ensayos de secreción de linfocinas, ensayos de citotoxicidad directa, y ensayos de dilución limitante. Por ejemplo, las células que presentan antígenos que se han incubado con un péptido, se pueden ensayar por su capacidad para inducir respuestas CTL en las poblaciones de células con respuesta. Las células que presentan antígenos pueden ser células normales tales como células mononucleares de sangre periférica o células dendríticas. Alternativamente, las líneas celulares mutantes de mamíferos no humanos que son deficientes en su capacidad para cargar moléculas de clase I con péptidos procesados internamente, y que han sido transíectadas con el gen de clase I humano adecuado, se pueden usar para probar la capacidad del péptido para inducir respuestas CTL primarias in vi tro. Se pueden usar las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) como la fuente de células de respuesta de los precursores CTL. Las células que presentan antígenos adecuados, se incuban con el péptido, después de lo cual luego se incuban las células que presentan antígenos cargadas con el péptido, con la población de células de respuesta bajo condiciones optimizadas de cultivo. Se puede determinar la activación CTL positiva al ensayar el cultivo por la presencia de CTL que exterminan células objetivo radioetiquetadas , objetivos específicos pulsados con péptidos así como células objetivo que expresan formas procesadas endógenamente del antígeno, a partir del cual se deriva la secuencia de péptidos. Adicionalmente , se ha vislumbrado un método que permite la cuantificación directa de células T específicas de antígenos por la tinción con complejos tetraméricos HLA etiquetados con fluoresceína (Altman, J. D. et al., Proc.

Nati. Acad. Sci . USA 90:10330, 1993; Altman, J. D. et al., Science 274:94, 1996). Otros desarrollos técnicos relativamente recientes incluyen la tinción para linfocinas intracelulares , y ensayos de liberación de interferón o ensayos ELISPOT. La tinción con tetrámeros, la tinción con linfocinas intracelulares y los ensayos ELISPOT, parecen ser todos al menos 10 veces más sensibles que los ensayos más convencionales (Lalvani, A. et al., J. Exp. Med. 186:859, 1997; Dumbar, P. . et al., Biol . 8:413, 1998; Murali-Krishna, K. et al., Immunity 8:177, 1989). La activación de HTL se puede también evaluar usando técnicas conocidas por aquellos en el arte, tal como la proliferación de células T y la secreción de linfocinas, por ejemplo, IL-2 (ver, por ejemplo, Alexander et al., Immunity 1:751-761, 1994) . Alternativamente, se puede usar la inmunización de ratones transgénicos HLA para determinar la inmunogenicidad de los epítopes de péptidos. Se han caracterizado diversos modelos de ratones transgénicos incluyendo ratones con A2.1 , All humano (que se usaron adicionalmente para analizar los epítopes HLA-A3) , y los alelos B7 y otros (por ejemplo, ratones transgénicos para HLA-A1 y A24) se desarrollan. También se han desarrollado modelos de ratones HLA-DR1 y HLA-DR3. Se pueden generar modelos de ratón transgénico adicionales con otros alelos de HLA como sea necesario. Se pueden inmunizar los ratones con péptidos emulsificados en un adyuvante incompleto de Freund y las células T probarse por su capacidad para reconocer células objetivo pulsadas con péptidos y células objetivo transíectadas con genes adecuado. Se pueden analizar las respuestas CTL usando ensayos de citotoxicidad antes descrito. Similármente , se pueden analizar las respuestas HTL usando ensayos tales como la proliferación de células T o la secreción de linfocinas. Los epítopes de péptidos inmunogénicos se establecen en la Tabla XXIII.

III. J. Uso de Epítopes de Péptidos como Agentes de Diagnóstico para la Evaluación de Respuestas Inmunes. En un aspecto de la invención, los péptidos de enlace HLA de clase I y clase II como se describen en la presente, se pueden usar como reactivos para evaluar una respuesta nmune. La respuesta inmune a evaluarse, se induce al usar como un inmunógeno, cualquier agente que pueda resultar en la producción de CTL o HTL específicos del antígeno, que reconozcan y se enlacen a los epítopes de péptido a emplearse como el reactivo. El reactivo de péptidos no necesita usarse como el inmunógeno. Los sistemas de ensayo que se usan para tal análisis incluyen desarrollos técnicos relativamente recientes tales como tetrámeros, tinción para linfocinas intracelulares y ensayos de liberación de interferón o ensayos ELISPOT. Por ejemplo, se usa un péptido de la invención en un ensayo de tinción de tetrámero para evaluar las células mononucleares de sangre periférica por la presencia de CTL específicos de antígeno, que siguen a la exposición a un patógeno o inmunógeno. Se usa el complejo tetramérico de HLA para visualizar directamente CTL específicos de antígeno (ver, por ejemplo, Ogg et al., Science 279:2103-2106, 1988; y Altman et al., Science 174:94-96, 1996) y determinar la frecuencia de la población CTL específica de antígenos en una muestra de células mononucleares de sangre periférica. Un reactivo de tetrámero que utiliza un péptido de la invención se genera como sigue: Un péptido que se enlaza a una molécula de HLA se repliega en presencia de la cadena pesada de HLA correspondiente y la ß2 microglobulina para generar un complejo trimolecular. El complejo se biotinila en el extremo terminal carboxilo de la cadena pesada, en un sitio que se preparó previamente por ingeniería en la proteína. Se induce luego la formación del tetrámero por la adición de estreptavidina . Por medio de estreptavidina etiquetada fluorescentemente, se puede usar el tetrámero para teñir células específicas de antígeno. Las células se pueden luego identificar fácilmente, por ejemplo, por citometría de flujo. Tales procedimientos se usan para propósitos de diagnóstico o de prognosis. También se pueden usar células identificadas por el procedimiento para propósitos terapéuticos . Los péptidos de la invención también se usan como reactivos para evaluar respuestas de recordación inmune (ver, por ejemplo, Bertoni et al., J. Clin. Invest. 100:503-513, 1997 y Penna et al., J. Exp. Med. 174:1565-1570, 1991). Por ejemplo, las muestras de pacientes PBMC de individuos infectados con VHB, se analiza para la presencia de CTL o HTL específicos de antígenos usando péptidos específicos. Una muestra de sangre que contiene células mononucleares , se puede evaluar al cultivar los PBMCs y estimular las células con un péptido de la invención. Después de un periodo de cultivo apropiado, se puede analizar la población de células expandidas, por ejemplo, para la actividad CTL o para la actividad HTL. Los péptidos también se usan como reactivos para evaluar la eficacia de una vacuna. Los PBMC obtenidos de un paciente vacunado con un inmunógeno se analizan usando, por ejemplo, cualquiera de los métodos antes descritos. El paciente tiene un tipo HLA, y los reactivos de epítopes de péptidos que reconocen las moléculas específicas de alelos presentes en ese paciente se seleccionan para el análisis. La inmunogenicidad de la vacuna se indica por la presencia de CTLs y/o HTLs específicos del epítope HPV en la muestra PBMC. Los péptidos de la invención también se usarán para hacer anticuerpos, usando técnicas bien conocidas en el arte (ver, por ejemplo, CURRENT PROTOCOLS IN IMNUNOLOGY, Wilwy/Greene , NY; y Antibodies A Laboratory Manual Harlow, Harlow y Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), que pueden ser útiles como reactivos para diagnosticar una infección por HPV. Tales anticuerpos incluyen aquellos que reconocen un péptido en el contexto de una molécula HLA, esto es, anticuerpos que se enlazan a un complejo péptido-MHC.

IV. K. Composiciones de Vacunas. Las vacunas y métodos de preparación de vacuna que contienen una cantidad inmunogénicamente efectiva de uno o más péptidos como se describen en la presente, son modalidades adicionales de la invención. Una vez que se han definido adecuadamente los epítopes inmunogénicos , se pueden seleccionar y suministrar por diversos medios, referidos en la presente como composiciones de "vacuna" . Tales composiciones de vacuna pueden incluir, por ejemplo, lipopéptidos (por ejemplo, Vitiello, A. et al., J. Clin. Invest. 95:341, 1995), composiciones de péptidos encapsuladas en microesferas de poli (DL-lacturo-co-glicolido) ("PLG") (ver, por ejemplo, Eldridge, et al., Molec. Inmuno1. 28:287-294, 1991: Alonso et al., Vaccine 12:299-306, 1994; Jones et al., Vaccine 13:675-681, 1995), composiciones de péptidos contenidas en complejos de estimulación inmune (ISCOMS) (ver, por ejemplo, Takahashi et al., Nature 344:873-875, 1990; Hu et al., Clin Exp Immunol. 113:235-243, 1998) , sistemas de péptidos de antígenos múltiples (MAPs) (ver, por ejemplo, Tam J. P., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 85:5409-5413, 1988; Tam J. P., J. Immunol. Methods 196:17-32, 1996) , péptidos formulados como péptidos multivalentes; péptidos para su uso en sistemas de suministro balístico, típicamente péptidos cristalizados, vectores de suministro viral (Perkus, M. E. et al., en: Concepta in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 379, 1996; Chakrabarti, S. et al., Nature 320:535, 1986; Hu, S. L. et al . , Nature 320:537, 1986; Kieny, M-P. et al., AIDS Bio/Techonoly 4:790, 1986; Top, F. H. et al., J. Infect. Dis. 124:148, 1971; Chanda, P. K. et al., Virology 175:535, 1990) , partículas de origen viral o sintético (por ejemplo, Kofler, N. et al., J. Immunol. Methods. 192:25, 1996; Eldrige, J. H. et al., Sem. Hematol. 30:16, 1993; Falo, L. D., Jr. et al., Nature Med. 7:649, 1995), adyuvantes (Warren, H. S., Vogel, F. R. , y Chedid, L. A. Annu. Rev. Immunol. 4:369, 1986; Gupta, R. K. et al., Vaccine 11:293, 1993), liposomas (Reddy, R. et al., Immunol. 148:1585, 1992; Rock, K. L., Immunol. Today 17:131, 1996), o, ADNc desnudo o absorbido por partículas (Ulmer, J. B. et al., Science 259:1745, 1993 ; Robinson, H. L., Hunt , L. A., y Webster, R. G . , Vaccine 11:957, 1993; Shiver, J. . et al., en: Concepts in vaccine development , Kaufmann, S. H. E., ed. , p. 423, 1996; Cease, K. B., y Berzofsky, J. A., Arxnu. Rev. Inmuno1. 12:923, 1994 y Eldridge, J. H. et al . , Sem. Hematol. 30:16, 1993). Las tecnologías de suministro dirigidas por toxinas, también conocidas por direccionamiento mediado por el receptor, tales como aquellas de Avant Immunotherapeutics , Inc. (Needham, Massachusetts) también se pueden usar. Las composiciones de vacuna de la invención incluyen modalidades mediadas por ácido nucleicos. El ADN o el AR que codifica uno o más de los péptidos de la invención, también se puede administrar a un paciente. Este enfoque se describe, por ejemplo, en Wolff et. al., Science 247:1465 (1990), así como las patentes de E.U.A. números 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; WO 98/04720; y con mayor detalle a continuación. Los ejemplos de las tecnologías de suministro basadas en ADN incluyen "ADN desnudo", suministro facilitado (bupivicaina , polímeros, mediado por péptidos), complejos de lípidos catiónicos, y suministro mediado por presión o mediado por partículas ("pistola de genes") (ver, por ejemplo, patente de E.U.A. 5, 922, 687) . Para propósitos de inmunización terapéutica o profiláctica, los péptidos de la invención se pueden expresar por vectores virales o bacterianos. Los ejemplos de los vectores de expresión incluyen hospedadores virales atenuados, tales como vacuna o viruela de aves de corral.

Este método involucra el virus de vacuna por ejemplo, como un vector para expresar secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos de la invención. Con la introducción dentro de un hospedador infectado crónica o agudamente, o dentro de un hospedador no infectado, el virus de vacuna recombinante expresa el péptido inmunogénico, con lo cual se obtiene una respuesta de hospedador CTL y/o HTL. Los vectores de vacuna y métodos de los protocolos de inmunización se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. número 4,722,848. Otro vector es el BCG (Bacille Calmette Guerin) . Los vectores BCG se describen en Stover et al., Nature 351:456-460 (1991). Una amplia variedad de otros vectores útiles para administración terapéutica o para inmunización de los péptidos de la invención, por ejemplo, vectores de virus adeno y asociados con adeno, vectores retrovirales , vectores de Salwonella typhi, vectores de toxina de ántrax destoxificada y similares, serán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción en la presente. Además, las vacunas de conformidad con la invención abarcan composiciones de uno o más de los péptidos reivindicados. Un péptido puede estar presente en una vacuna individualmente. Alternativamente, el péptido puede existir como un homopolímero que comprende copias múltiples del mismo péptido o como un heteropolímero de diversos péptidos. Los polímeros tienen la ventaja de una reacción inmunológica en aumento y, en donde los epítopes de péptidos diferentes se usan para elaborar el polímero, y la capacidad adicional para inducir anticuerpos y/o CTL que reaccionan con diferentes determinantes antigénicos del organismo patogénico, o péptidos relacionados con el tumor dirigidos para una respuesta inmune. La composición puede ser una región que se presenta naturalmente de un antígeno, o se puede preparar, por ejemplo, por vía recombinante o por síntesis química. Son bien conocidos en la técnica los portadores que se pueden usar con las vacunas de la invención e incluyen, por ejemplo, tiroglobulin , albúminas, tales como albúmina de suero humano, toxoide tetánico, poliaminoácidos tales como poli -L-lisina , ácido poli-L-glutámico, influenza, virus de la hepatitis B, proteína de núcleo y similares. Las vacunas pueden contener un diluyente fisiológicamente tolerable (esto es, aceptable) o solución salina, preferiblemente solución salina amortiguada de fosfato. Las vacunas incluyen también típicamente un adyuvante. Los adyuvantes tales como el adyuvante incompleto de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio o alumbre, son ejemplos de materiales bien conocidos en la técnica. Adicionalmente , como se describe en la presente, las respuestas CTL se pueden cebar por la conjugación de los péptidos de la invención con lípidos tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinliseril-serina (P3CSS) .

Con la inmunización con un composición de péptidos de conformidad con la invención, por medio de vías de inyección, aerosol, oral, transdermal, transmucosal , intrapleural , intratecal u otras vías adecuadas, el sistema inmune del hospedador responde a la vacuna al producir grandes cantidades de CTL o HTL específicos para el antígeno deseado. Consecuentemente, el hospedador se convierte al menos parcialmente inmune a una infección posterior, o al menos parcialmente resistente al desarrollo de una infección crónica continua, o deriva al menos algún beneficio terapéutico cuando el antígeno se asocia con el tumor. En algunas modalidades, puede ser deseable combinar los componentes del péptido de clase I, con componentes que induzcan o faciliten la neutralización del anticuerpo y/o las respuestas de células T de ayuda al antígeno de objetivo de interés. Una modalidad preferida de tal composición, comprende epítopes de clase I y de clase II de acuerdo con la invención. Una modalidad alternativa de tal composición, comprende un epítope de clase I y/o clase II de conformidad con la invención, junto con una molécula PanDR, por ejemplo, PADRE™ (Epimmune, San Diego, CA; descrita, por ejemplo, en la patente de E.U.A. número 5,736,142). Una vacuna de la invención también puede incluir células que presentan antígenos (APC) , tales como células dendríticas (DC) , como un vehículo para presentar los péptidos de la invención. Las composiciones de vacunas se pueden crear in vi tro, siguiendo la movilización y recolección de células dendríticas, con lo cual la carga de células dendríticas se presenta in vitro. Por ejemplo, se transfectan las células dendríticas, por ejemplo, con un minigen de acuerdo con la invención, o se pulsan con péptidos. La célula dendrítica puede luego administrarse a un paciente para obtener respuestas inmunes in vivo. Las composiciones de vacunas, ya sean basadas en péptido o en ADN se pueden también administrar in vivo en combinación con la movilización de células dendríticas con lo cual la carga de células dendríticas se presenta in vivo. Los péptidos antigénicos se usan para obtener una respuesta CTL y/o HTL ex vivo también. Las células resultantes CTL o HTL, se pueden usar para tratar infecciones crónicas, o tumores en pacientes que no responden a otras formas convencionales de terapia, o que no responderán a un péptido de vacuna terapéutica o ácido nucleico de conformidad con la invención. Las respuestas CTL o HTL ex vivo para un antígeno particular (antígeno infeccioso o asociado con tumor) se inducen al incubarse en cultivos de tejidos las células precursoras CTL o HTL del paciente, o genéticamente compatibles, junto con una fuente de APC, tal como DC, y el péptido inmunogénico apropiado. Después de un tiempo de incubación apropiado (típicamente alrededor de 7-28 días) , en el cual se activan y expanden las células precursoras dentro de las células del efector, las células se colocan por infusión de vuelta en el paciente, en donde destruirán o facilitarán la destrucción de sus células específicas objetivo (una célula infectada o una célula de tumor) . También se pueden usar células dendríticas transíectadas como células que presentan antígenos. Las composiciones de vacuna de la invención, también se pueden usar en combinación con otros tratamientos usados para la infección crónica viral, incluyendo el uso en combinación con adyuvantes inmunes tales como IFN-? y similares. Preferiblemente, se utilizan los siguientes principios cuando se selecciona una configuración de epítopes para la inclusión en una composición poliepitópica para su uso en una vacuna, o para seleccionar epítopes discretos a incluirse en una vacuna y/o para codificarse por ácidos nucleicos tales como un minigen. Se prefiere que cada uno de los siguientes principios estén balanceados con objeto de hacer la selección. Los epítopes múltiples a incorporarse en una composición dada de vacuna pueden ser, pero no necesitan ser, contiguos en secuencia en el antígeno nativo del cual se derivan los epítopes. 1) Los epítopes que se seleccionan los cuales, con administración, imitan respuestas inmunes que se han observado para correlacionarse con la depuración del VHB .

Para el HLA de clase I esto incluye 3-4 epítopes que vienen de al menos un antígeno de VHB . En otras palabras, se ha observado que en pacientes que depuran espontáneamente el VHB, que han generado una respuesta inmune para al menos 3 epítopes en al menos un antígeno VHB. Para la clase II de HLA, se emplea un razonamiento similar, nuevamente se seleccionan 3-4 epítopes de al menos un antígeno VHB (ver, por ejemplo, Rosenberg et al. Science 248:1447-1450). 2) Se seleccionan epítopes que tienen la afinidad requerida de enlace establecida para correlacionarse con la inmunogenicidad : para la clase I de HLA un IC50 de 500 nM o menor, a menudo 200 nM o menor, y para la clase II un IC50 de 1000 nM o menor. 3) Los péptidos que soportan superporciones suficientes, o una configuración suficiente de péptidos que soportan una porción especifica de alelos, se seleccionan para dar una cobertura amplia de la población. Por ejemplo, es preferible tener al menos una cobertura de población de 80%. Se puede emplear un análisis Monte Cario, una evaluación estadística conocida en la técnica para evaluar la amplitud o redundancia de la cobertura de la población. 4) Cuando se seleccionan epítopes a partir de antígeno relacionados con el cáncer, a menudo es útil seleccionar análogos debido a que el paciente puede haber desarrollado tolerancia al epítope nativo. Cuando se seleccionan epítopes para antígenos infecciosos relacionados con enfermedades, es preferible seleccionar epítopes análogos o nativos. 5) De relevancia particular son los epítopes referidos como "epítopes alojados". Los epítopes alojados se presentan en donde al menos dos epítopes se traslapan en una secuencia dada de péptidos. Una secuencia alojada de péptidos puede comprender epítopes de clase I HLA y de clase II HLA. Cuando se suministran epítopes alojados, un objetivo general es proporcionar el número más grande de epítopes por secuencia. Así, un aspecto es evitar suministrar un péptido que es más grande que la terminación amino del epítope de terminal amino y la terminación carboxilo del epítope de terminal carboxilo en el péptido. Cuando se proporciona una secuencia multiepitópica, tal como una secuencia que comprende epítopes alojados, es generalmente importante separar por exclusión la secuencia con objeto de asegurarse que no tenga propiedades biológicas, patológicas u otras propiedades perjudiciales. 6) Si se crea una proteína poliepitópica, o cuando se crea un minigen, un objetivo es generar el péptido más pequeño que abarque los epítopes de interés. El principio es similar, sino es que el mismo a aquel empleado cuando se selecciona un péptido que comprende epítopes alojados. Sin embargo, con un péptido poliepitópico artificial, el objetivo de minimización de tamaño se balancea contra la necesidad de integrar algunas secuencias espadadoras entre los epítopes en la proteína poliepitópica . Los residuos espaciadores de aminoácidos pueden, por ejemplo, introducirse para evitar epítopes de unión (un epitope reconocido por el sistema inmune, no está presente en el antígeno objetivo, y solamente está creado por una yuxtaposición hecha por el hombre de los epítopes) , o para facilitar el desdoblamiento entre epítopes con lo cual se enriquece la presentación de epítopes. Los epítopes de unión se evitarán generalmente debido a que el receptor puede generar una respuesta inmune a ese epitope no nativo. De preocupación particular es un epitope de unión que es un "epitope dominante" . Un epitope dominante puede conducir a una respuesta entusiasta tal que las respuestas inmunes para los otros epítopes se disminuyan o supriman. 7) En los casos en donde las secuencias de variantes múltiples de la misma proteína objetivo están disponibles, también se pueden seleccionar epítopes de péptidos potenciales sobre la base de su conservación. Por ejemplo, un criterio para la conservación puede definir que la secuencia completa de un péptido de clase I de HLA o el núcleo completo de 9-mero de un péptido de enlace de clase II se conserve en un porcentaje designado de secuencias evaluadas para un antígeno de proteína específica.

IV.K.l. Vacunas de Minigen. Están disponibles una variedad de métodos diferentes que permiten el suministro simultáneo de epítopes múltiples. Los ácidos nucleicos que codifican a los péptidos de la invención son una modalidad particularmente útil de la invención. Los epítopes para la inclusión en un minigen se seleccionan preferiblemente de acuerdo con los lineamientos establecidos en la sección previa. Un medio preferido de administración de ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la invención, usa constructos de minigenes que codifican un péptido que comprende uno o más epítopes múltiples de la invención. El uso de minigenes de epítopes múltiples se describe a continuación y, por ejemplo, en la solicitud copendiente U. S. S. N. 09/311,784; Ishioka et al., J. Immunol. 162:3915-3925, 1999; An, L . y Whitton, J. L., J. Virol . 71:2292, 1997; Thomson, ?. A. et aJ., Immunol. 157:822, 1996; Whitton, J. L. et al., J. Virol. 67:348, 1993; Hanke, R. et al., Vaccine 16:426, 1998. Por ejemplo, un plásmido de ADN multiepítope que codifica epítopes que soporta una porción y/o superporción derivada de regiones múltiples de uno o más antígenos VHB, un epítope de células T de ayuda universal, por ejemplo, PADRE™ (o epítopes múltiples HTL a partir de antígenos VHB) , y una secuencia de señal transubicadora del retículo endoplásmico se puede preparar por ingeniería. Una vacuna también puede comprender epítopes que se derivan de otros TAA . La inmunogenicidad de un minigen multiepitópico se puede probar en ratones transgénicos , para evaluar la magnitud de las respuestas de inducción de CTL contra los epítopes probados. Además, la inmunogenicidad de epítopes codificados por ADN ín vivo, se puede correlacionar con las respuestas in vi tro de líneas específicas CTL contra células objetivo transíectadas en el plásmido de ADN. Así, estos experimentos pueden mostrar que el minigen sirve para 1) generar una respuesta CTL y 2) que las células reconocidas por CTL inducidas expresan los epítopes codificados. Por ejemplo, para crear una secuencia de ADN que codifica los epítopes seleccionados (minigenes) para la expresión en células humanas, las secuencias de aminoácidos de los epítopes pueden traducirse de forma inversa. Se puede usar una tabla de uso del codón humano para guiar la elección del codón para cada aminoácido. Estas secuencias de ADN que codifican el epítope se pueden adjuntar directamente, de manera que cuando se traducen, se crea una secuencia continua de polipéptido. Para optimizar la expresión y/o inmunogenicidad, se pueden incorporar elementos adicionales dentro del diseño del minigen. Los ejemplos de las secuencias de aminoácidos que pueden traducirse de forma inversa e incluirse en la secuencia del minigen incluyen epítopes de clase I de HLA, epítopes de clase II de HLA, una secuencia de señal de ubicación, y/o una secuencia de dirección de retículo endoplásmico . Además, la presentación de HLA de epítopes CTL y HTL se puede mejorar al incluir secuencias de flanqueo que se presentan naturalmente o sintéticas (por ejemplo polialanina) adyacentes a los epítopes CTL o HTL; estos péptidos más grandes comprenden los epítopes están dentro del alcance de la invención. La secuencia de minigenea se puede convertir a ADN por ensamble de oligonucleótidos que codifican las hebras menos y más del minigen. Se puede sintetizar los oligonucleótidos de traslape (30-100 bases de longitud) , fosforilarse, purificarse, y combinar sus pares base bajo condiciones adecuadas usando técnicas bien conocidas. Las terminaciones de los oligonucleótidos se pueden unir, por ejemplo, usando una ligasa de ADN T4. Este minigen sintético, que codifica el polipéptido de los epítopes, se puede luego clonar en un vector de expresión deseado. Las secuencias regulatorias estándar bien conocidas por aquellos expertos en la técnica se incluyen preferiblemente en el vector para asegurar la expresión en las células objetivo. Son deseables diversos elementos del vector: un promotor con un sitio de clonación en la dirección descendente para la inserción del minigen; una señal de poliadenilación para la terminación eficiente de la transcripción; un origen de replicación de E. coli; y un marcador de selección de E. coli (por ejemplo, de resistencia a la ampicilina o a la canamicina) . Se pueden usar numerosos promotores para este propósito, por ejemplo, el promotor del citomegalovirus humano (hCMV) . Ver, por ejemplo, patentes de E.U.A. números 5,580,859 y 5,589,466 para otras secuencias de promotor apropiadas . Se pueden desear modificaciones adicionales del vector para optimizar la expresión de minigenes y la inmunogenicidad. En algunos casos, se requieren intrones para la expresión eficiente de genes, y/o uno o más intrones que se presentan naturalmente o sintéticos se pueden incorporar dentro de la región transcrita del minigen. La inclusión de las secuencias de estabilización de ARNm y las secuencias para replicación en células mamíferas también se pueden considerar para incrementar la expresión de minigenes. Una vez que se selecciona un vector de expresión, se clona el minigen dentro de una región de polienlace en la dirección descendente del promotor. Este plásmido se transforma dentro de una cepa adecuada de E. coli, y se prepara el ADN usando técnicas estándar. La orientación y secuencia del ADN del minigen, así como todos los elementos incluidos en el vector, se confirman usando un mapeo de restricción y un análisis de secuencias de ADN. Las células bacterianas que alojan el plásmido correcto se pueden almacenar como un banco de células maestras y un banco de células de trabajo. Además, las secuencias inmunoestimuladoras (ISSs o CpGs) parecen jugar un papel en la inmunogenicidad de las vacunas de ADN. Estas secuencias se pueden incluir en el vector, fuera de la secuencia de codificación del minigen, si se desea para incrementar la inmunogenicidad. En algunas modalidades, un vector de expresión bi-cistrónico que permite la producción de epitopes codificados por el minigen y una segunda proteína (incluyendo para aumentar o reducir la inmunogenicidad) puede usarse. Los ejemplos de proteínas o polipéptidos que podrán aumentar benéficamente la respuesta inmune si co-expresan citocinas incluidas (por ejemplo, IL-2, IL-12, GM-CSF) , moléculas que inducen citocinas (por ejemplo, LelF) o moléculas co-estimuladoras. Los epítopes auxiliares (HTL) pueden unirse a señales objetivo intracelulares y expresarse separadamente de epítopes CTL expresados; esto permite la dirección de los epítopes HTL a un compartimiento de célula diferente al de los epítopes CTL. Sí se requiere, esto facilitaría la entrada más eficiente de los epítopes HTL en la trayectoria de clase II HLA, por lo cual se mejora la inducción de CTL. En contraste a la inducción de HTL o CTL, específicamente reduciendo la respuesta inmune por la co-expresión de moléculas inmunosupresoras (por ejemplo, TGF-ß) puede beneficiar en ciertas modalidades) . Las cantidades terapéuticas del ADN plásmido pueden producirse, por ejemplo, por fermentación en E.coli, seguido por purificación. Las alícuotas del banco celular de trabajo se usan para inocular el medio de crecimiento, y crecen hasta una saturación en matraces agitadores o un bioreactor de conformidad con técnicas bien conocidas. El ADN plásmido puede purificarse usando tecnología de bioseparación estándar, tales como resinas de intercambio de anión de fase sólida suministradas por QIAGEN, Inc. (Valencia, California). Si se requiere, el ADN de súper-rizo puede aislarse de las formas lineales y circulares abiertas usando electroforesis en gel u otros métodos. El ADN plásmido purificado puede prepararse por inyección usando una variedad de formulaciones. La más simple de estas es la reconstitución de ADN liofilizado en solución salina amortiguada en fosfato estéril (???) . Este enfoque, conocido como "ADN desnudo" , actualmente se usa para administración intramuscular (IM) en ensayos clínicos. Para maximizar los efectos inmunoterapéuticos de las vacunas de ADN de minigen, un método alternativo para formular ADN de plásmido purificado puede ser deseable. Una variedad de métodos se han descrito, y nuevas técnicas pueden estar disponibles. Los lípidos catiónicos también pueden usarse en la formulación (ver, por ejemplo, como se describe por WO 93/24640; Mannino & Gould-Fogerite , BioTechniques 6(7): 682 (1988); patente E.U.A. No. 5,279,833; WO 91/06309; y Felgner, et al., Proc . Nat'l Acad. Sci. USA 84: 7413 (1987). Además, los glicolípidos, liposomas fusogénicas, péptidos y compuestos referidos colectivamente como compuesto colectores interactivos no condensados (PINC) también podrán estar en complejo para purificar el plásmido de ADN para influenciar variables tales como estabilidad, dispersión intramuscular, o tráfico a los órganos específicos o tipos de células. La sensibilización de células objetivo puede usarse como un ensayo funcional para la expresión y presentación de la clase I de HLA de epítopes CTL codificados por el minigen. Por ejemplo, el ADN plásmido se introduce en la línea celular de mamífero que es apropiada como un objetivo para ensayos de liberación de cromo de CTL estándar. El método de transfección usado dependerá de la formulación final. Puede usarse la electroporación para ADN "desnudo" , mientras que los lípidos catíónicos permiten la transfección in vitro directa. Un plásmido que expresa la proteína fluorescente verde (GFP) puede co-transíectarse para permitir el enriquecimiento de células transíectadas usando distribución de células activada fluorescente (FACS) . Estas células se etiquetan luego con cromo-51 (51Cr) y se usan como células objetivo para líneas CTL específicas de epítope; citólisis, detectada por la liberación de 51Cr, indica la producción de, y la presentación HLA de, epítopes CTL que codifican al minigen .

La inmunogenicidad in vivo es un segundo enfoque para probar funcionalmente las formulaciones de ADN de minigen. Ratones transgénicos que expresan proteínas HLA humanas apropiadas se inmunizan con el producto de ADN. La dosis y ruta de administración son dependientes de la formulación (por ejemplo, IM para ADN en PBS, intraperitoneal (IP) para ADN de complej o-lípido) . Veintiún días después de la inmunización, se cosechan los esplenocitos y se vuelven a estimular durante 1 semana en presencia de péptidos que codifican cada epítope a probarse. Posteriormente, para células efectoras CTL, se conducen ensayos para citólisis de células objetivo etiquetadas con 51Cr cargadas con péptidos usando técnicas estándar. La lisis de las células objetivo sensibilizadas por la carga de HLA de péptidos correspondientes a los epítopes codificados por minigen, demuestran que la función de la vacuna de ADN para la inducción in vivo de CTL. La inmunogenicidad de epítopes HTL se evalúa en ratones transgénicos de manera análoga. Alternativamente, los ácidos nucleicos pueden administrarse usando una entrega balística como se describe por ejemplo, en la patente E.U.A. No. 5,204,253. Usando esta técnica, las partículas que comprenden únicamente ADN son las administradas. En una modalidad alternativa adicional, el ADN puede adherirse a partículas, tales como partículas de oro. Los minigenes también pueden entregarse usando otros sistemas de entrega bacteriales o virales bien conocidos en la técnica, por ejemplo, epítopes que codifican un constructo de expresión de la invención pueden incorporarse en un vector viral tal como un vacuna.

IV.K.2. Combinaciones de péptidos CTL con péptidos auxiliares . Las composiciones de vacuna que comprende los péptidos CTL de la invención puede modificarse para proporcionar atributos deseados, tal como vida media del suero mejorada, cobertura de la población ampliada o aumento de la inmunogeni idad. Por ejemplo, la capacidad del péptido para inducir la actividad CTL puede aumentarse por el enlace del péptido a una secuencia que contiene al menos un epítope que es capaz de inducir la respuesta de la célula auxiliar T. El uso de los epítopes auxiliares T en conjunto con epítopes CTL para aumentar la inmunogenicidad se ilustra, por ejemplo, en las solicitudes co-pendientes U.S.S.N. 08/820,360, U.S.S.N. 08/197,484 Y U.S.S.N. 08/464,234. No obstante que un péptido CTL puede enlazarse directamente a un péptido auxiliar T, frecuentemente el conjugado epítope CTl/epítope HTL se enlaza por una molécula espadadora. La espaciadora típicamente comprende moléculas neutrales, relativamente pequeñas, tales como aminoácidos o imitaciones de aminoácidos, que están substanc almente sin cargar bajo condiciones fisiológicas. Los espaciadores se seleccionan típicamente de, por ejemplo, Ala, Gly, u otros espaciadores neutrales de aminoácidos no polares o aminoácidos polares neutrales;. Se entenderá que el espaciador opcionalmente presente no necesita comprender los mismos residuos y de esta manera puede ser un hetero- u homo-oligómero. Cuando está presente, el espaciador usualmente tendrá al menos uno o dos residuos, más usualmente tres hasta seis residuos y algunas veces 10 o más residuos. El epítope de péptido CTL puede enlazarse al epítope de péptido auxiliar T ya sea directamente o por medio de un espaciador, ya sea en la terminación amino o carboxi del péptido CTL. La terminación amino, tanto del péptido inmunogénico o del péptido auxiliar T, puede acilarse. En ciertas modalidades, el péptido auxiliar T es uno que se reconoce por las células auxiliares T presentes en la mayoría de la población. Esto puede realizarse seleccionando péptidos que se enlazan a muchas, la mayoría, o todas las moléculas de clase II HLA. Esto se conoce como secuencias auxiliares T "promiscuas" o "restringidas por HLA sin cohesión". Los ejemplos de secuencias de aminoácidos que son promiscuas incluyen secuencias de antígenos tales como toxoide tetánico en las posiciones 830-843 (QYIKANSKFIGITE ; SEQ ID NO; 51484) , proteína de Plasmodíum falciparum circunesporozoita (SC) en las posiciones 378-398 (DIEKKIAKMEKASSVFNWNS; SEQ ID NO: 51485) , y proteína de Streptococcus de 18kD en la posición 116 (GAVDSILGGVATYGAA; SEQ ID NO: 51486) . Otros ejemplos incluyen péptidos que portan una superporción DR 1-4-7 o alguna de las porciones DR3. Alternativamente, es posible preparar péptidos sintéticos capaces de estimular los linfocitos auxiliares T, de una manera restringida por el HLA sin cohesión, usando secuencias de aminoácidos no encontradas en la naturaleza (ver, por ejemplo, publicación PCT WO 95/07707) . Estos compuesto llamados epítopes enlazados a Pan-DR- (por ejemplo, PADRE™, Epimmune, Inc., San Diego, CA) se designan para enlazar preferiblemente la mayoría de moléculas HLA-DR (clase II HLA humanas) . Por ejemplo, un péptido de epítope enlazado a pan-DR que tiene la fórmula: aKXVAAWTLKAAa, donde "X" es ciclohexilalanina, fenilalanina , o tirosina, y a es ya sea D-alanina o L-alanina, se encuentran para enlazarse a la mayoría de los alelos HLA-DR, y para estimular las respuestas de linfocitos auxiliares T de la mayoría de los individuos, sin tomar en cuenta su tipo de HLA. Una alternativa de un epítope enlazado a pan-DR comprende todos los aminoácidos naturales "L" y pueden proporcionarse en forma de ácidos nucleicos que codifican el epítope. Los epítopes de péptido HTL también pueden modificarse para alterar sus propiedades biológicas. Por ejemplo, pueden modificarse para incluir aminoácidos D, para incrementar su resistencia a las proteasas y de esta manera extender su vida media de suero, o pueden conjugarse a otras moléculas tales como lípidos, proteínas, carbohidratos y similares para incrementar su actividad biológica. Por ejemplo, un péptido auxiliar T puede conjugarse a una o más cadenas de ácido palmítico ya sea en la terminación amino o carboxilo.

III. K.3. Combinaciones de péptidos CTL con agentes de cebado de células T. En algunas modalidades puede ser deseable incluir en las composiciones f rmacéuticas de la invención al menos un componente que es cebador de los linfocitos T citotóxicos. Los lípidos se han identificado como agentes capaces de proporcionar cebado in vivo de CTl contra antígenos virales. Por ejemplo, los residuos de ácido palmítico pueden enlazarse a los grupos e- y a-amino de un residuo de lisina y luego enlazarse, por ejemplo, por medio de uno o más residuos de ligado tales como Gly, Gly-Gly, Ser, Ser-Ser, o similares, a un péptido inmunogénico . El péptido lipidado puede luego administrase ya sea directamente o en una micela o partícula, incorporado en un liposoma, o emulsificado en un adyuvante, por ejemplo, adyuvante de Freund incompleto. En una modalidad preferida, una composición inmunogénica particularmente efectiva comprende ácido palmitico enlazado a grupos e- y alamino de Lys, que se enlaza por medio de una ligadura, por ejemplo, Ser-Ser, al término amino del péptido inmunogénico .

Como otro ejemplo del cebado lípido de respuestas CTL, lipoproteínas E.coli, tales como tripalmitoil -S-glicerilcisteinliseril-serina (P3CSS) pueden usarse para proporcionar cebado al virus específico CTL cuando se enlazan covalentemente a un péptido apropiado (ver, por ejemplo, Deres, et al., Nature 342; 561, 1989). Los péptidos de la invención puede acoplarse al P3CSS, por ejemplo, y el lipopéptido suministrase a un individuo para cebar específicamente una respuesta P3CSS para un antígeno objetivo. Por otro lado, debido a que la inducción de anticuerpos neutralizantes también puede cebarse con epítopes conjugados P3CSS, dos de tales composiciones puede combinarse para sacar más efectivamente las respuestas tanto humorales como mediadas por las célula. Los péptidos CTL y/o HTL pueden también modificarse por la adición de aminoácidos a la terminación de un péptido para proporcionar la facilidad de que los péptidos se enlacen uno al otro, por acoplamiento a un soporte portador o un péptido más largo, para modificar las propiedades físicas o químicas del péptido u oligopéptido, o similares. Los aminoácidos tales como tirosina, cisteína, lisina, ácido glutámico o aspártico, o similares, pueden introducirse en la terminación C o N del péptido u oligopéptido, particularmente peptidos de clase I. Sin embargo, se notará que la modificación en la terminación carboxilo de un epítope CTL puede, en algunos casos, alterar las características de enlazado del péptido. Además, las secuencias de péptido u oligopéptido pueden diferir de la secuencia natural al modificarse por acilación de terminal NH2 , por ejemplo, por acetilación de alcanoilo (C1-C20) o tioglicolilo, amidac ón de terminal carboxilo, por ejemplo, amoniaco, metilamina, etc. En algunos casos, estas modificaciones pueden proporcionar sitios de enlace al soporte u otra molécula.

IV. K.4. Composiciones de vacuna que comprenden DC pulsadas con peptidos CTL y/o HTL. Una modalidad de una composición de vacuna de conformidad con la invención comprende la administración ex vivo de un cóctel de péptido que portan epítopes para PB C, o DC aisladas de los mismos, de la sangre del paciente. Un farmacéutico para facilitar la cosecha de DC puede usarse, tal como Progenipoietin™ (Monsaont , ST . Louis, MO) o GM-CSF/IL-4. Después de pulsar las DC con peptidos y antes de la reinfusión en pacientes, las DC se lavan para remover péptidos no enlazados. En esta modalidad, la vacuna comprende DC pulsadas por péptidos que presentan los epítopes de péptidos pulsados en complejo con moléculas HLA en su superficie . Las DC puede pulsarse ex vivo con un cóctel de péptidos, algunos de los cuales estimulan las respuestas CTL a uno o más de los antígenos VHB de interés. Opcionalmente, un péptido de células T auxiliar (HTL) , tal como la molécula de la familia PADRE, puede incluirse para facilitar la respuesta CTL. De esta manera, una vacuna de conformidad con la invención, que comprende preferiblemente epítopes de antígenos VHB múltiples, se usa para tratar la infección VHB .

IV. L. Administración de vacunas para propósitos profilácticos o terapéuticos . Los péptidos de la presente invención y composiciones farmacéuticas y vacunas de la invención se usan típicamente para tratar y/o prevenir la infección. Las composiciones de vacuna que contienen los péptidos de la invención se administran a un paciente tratado con VHB o a un individuo susceptible a, o de otra manera en riesgo de, una infección por VHB, para sacar una respuesta inmune contra antígenos VHB y de esta manera aumentar las capacidades de respuesta inmune del propio paciente. Como se discute en la presente, los péptidos que comprende epítopes CTL y/o HTL de la invención inducen respuestas inmunes cuando se presentan por moléculas HLA y se ponen en contacto con un CTL o HTL específico para un epítope que está comprendido por el péptido. Los péptidos (o ADN que los codifican) puede administrase individualmente como fusiones de una o más secuencias de péptidos. La manera en el cual el péptido se pone en contacto con el CTL o HTL no es crítica para la invención. Por ejemplo, el péptido puede ponerse en contacto con el CTL o HTL ya sea in vivo o in vitro. Si el contacto ocurre in vivo, el péptido por sí mismo puede administrase al paciente, u otros vehículos, por ejemplo, vectores de ADN que codifican uno o más péptidos, vectores virales que codifican los péptidos, liposomas y similares, pueden usarse como se describen en la presente. Cuando el péptido se pone en contacto in vitro, el agente vacunante puede comprender una población de células, por ejemplo, células dendríticas pulsadas por péptido, o CTL específicas de HPV, que se han inducido por células que presentan antígeno pulsado in vitro con el péptido o por la transfección de células que presentan antígeno con un minigen de la invención. Tal población celular se administra posteriormente a un paciente en una dosis terapéuticamente efectiva. En las aplicaciones terapéuticas, el péptido y/o las composiciones de ácido nucleico se administran en un paciente en una cantidad suficiente para sacar una respuesta efectiva de CTL y/o HTL al antígeno de virus, y para curar o al menos detener parcialmente o reducir los síntomas y/o complicaciones. Una cantidad adecuada para realizar esto se define como "dosis terapéuticamente efectiva" . Las cantidades efectivas para este uso dependerán de, por ejemplo, la composición particular administrada, la manera de administración, la etapa y severidad de la enfermedad a tratarse, el peso y el estado general del paciente y el juicio del medico que prescribe. Para composiciones farmacéuticas, los péptidos inmunogénicos de la invención, o el ADN que los codifica, se administran generalmente a un individuo infectado con VHB. Los péptidos o el ADN que los codifican puede administrase individualmente o como fusiones de una o más secuencias de péptido. Los pacientes infectados con VHB pueden tratarse con péptidos inmunogénicos separadamente o en conjunto con otros tratamientos como sea apropiado. Para uso terapéutico, la administración generalmente comenzará al primer diagnóstico de la infección de VHB. Esto se sigue por dosis elevadas hasta que al menos los síntomas se abaten substancialmente y durante un periodo posterior. La modalidad de la composición de vacuna (esto es, que incluye, pero no se limita a, modalidades tales como cócteles de péptido, polipéptidos poliepitópicos , minigenes, o CTL específicos de antígeno VHB o células dendríticas pulsadas) que se entregan al paciente pueden variar de conformidad con la etapa de la enfermedad o la etapa de salud del paciente.

En un paciente con una infección de VHB crónica, una vacuna que comprende un CTL específico de VHB puede ser más eficiente para eliminar células infectadas con VHB que modalidades alternativas. Cuando los individuos susceptibles se identifican antes de o durante la infección, la composición puede dirigirse a estos minimizando de esta manera la necesidad para la administración a una población mayor. El péptido u otras composiciones usadas para el tratamiento o profilaxis de la infección por VHB pueden usarse, por ejemplo, en personas que no manifiestan los síntomas. En este contexto, generalmente es importante proporcionar una cantidad del epitope de péptido entregado a modo de administración suficiente para estimular la respuesta de la célula T citotóxica; las composiciones que estimulan las respuestas de células T auxiliares también se dan de conformidad con esta modalidad de la invención. La dosis para una inmunización terapéutica inicial se presenta generalmente en un rango de dosis unitaria donde el valor inferior es de alrededor de 1, 5, 50, 500 ó 1,000 µ<3 y el valor superior es de alrededor de 10,000; 20,000; 30,000; ó 50,000 µ¾ . Los valores de dosis para un humano típicamente están en el rango desde alrededor de 500 µg hasta alrededor de 50,000 µg por 70 kilogramos del paciente. Las dosis elevadas de entre alrededor de 1.0 µ9 hasta alrededor de 50,000 µg del péptido consiguiente a un régimen elevado durante semanas o meses, puede administrase dependiendo de la respuesta y condición del paciente como se determina midiendo la actividad específica de CTL y HTL obtenida de la sangre del paciente. La administración continuará hasta que al menos los síntomas clínicos o pruebas de laboratorio indiquen que la infección viral se ha eliminado o reducido durante un periodo posterior. La dosis, rutas de administración, y horarios de dosis se ajustan de conformidad con las metodológicas conocidas en la técnica. En ciertas modalidades, los péptidos y composiciones de la presente invención se emplean en etapas de enfermedad serias, esto es, situaciones que amenazan la vida o que amenazan potencialmente la vida. En tales casos, como resultado de la cantidades mínimas de substancias extrañas y las naturaleza relativamente no tóxica de los péptidos, en composiciones preferidas de la invención, es posible y puede ser deseable por el médico que trata administrar un exceso substancial de estas composiciones de péptidos con relación a estas cantidades de dosis establecidas. Las composiciones de vacuna de la invención también pueden usarse puramente como agentes profilácticos. Generalmente, la dosis para una inmunización profiláctica inicial generalmente se presenta en un rango de dosis unitaria donde el valor inferior es de alrededor de 1, 5, 50, 500, 6 1000 µ9 y el valor superior es de alrededor de 10,000; 20,000; 30,000; 6 50,000 9. Los valores de dosis para un humano típicamente están en el rango de alrededor de 500 µ hasta alrededor de 50,000 µ9 por 70 kilogramos del paciente. Esto se sigue por dosis elevadas de entre alrededor de 1.0 µg hasta alrededor de 50,000 µg del péptido a intervalos definidos desde alrededor de 4 semanas hasta 6 meses después de la administración inicial de la vacuna. La inmunogenicidad de la vacuna puede evaluarse midiendo la actividad específica del CTL y HTL obtenido de una muestra de la sangre del pacient . Las composiciones farmacéuticas para tratamiento terapéutico se pretenden para administración parenteral , tópica, oral, intratecal, o local (por ejemplo, como una crema o pomada) de aplicación local. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se administran parenteralmente , por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente, intradermalmente , o intramuscularmente . De esta manera, la invención proporciona composiciones para administración parenteral que comprenden una solución de los péptidos inmunogénicos disuelta o suspendida en un portador aceptable, preferiblemente un portador acuoso. Puede usarse una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, agua, agua amortiguada, solución salina al 0.8%, glicina al 0.3%, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones pueden esterilizarse por técnicas de esterilización bien conocidas, convencionales, o pueden esterilizarse por filtrado. Las soluciones acuosas resultantes pueden empacarse para usarse como tal, o liofilizarse, la preparación liofilizada puede combinarse con una solución estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como se requiera para aproximar condiciones fisiológicas, tales como ajuste de pH y agentes amortiguantes, agentes que ajustan la tonicidad, agentes humectantes, conservadores, y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina , etc. Las concentraciones de péptidos de la invención en formulaciones farmacéuticas pueden variar ampliamente, esto es, desde menos de alrededor de 0.1%, usualmente a o menos de alrededor de 2% hasta tal como 20% hasta 50% o m s en peso, y se seleccionarán primariamente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., de conformidad con el modo particular de administración seleccionada. Una forma de dosis unitaria humana de la composición de péptido se incluye típicamente en la composición farmacéutica que comprende una dosis unitaria humana de un portador aceptable, preferiblemente un portador acuoso, y se administra en volumen de fluido que se conoce por aquellos expertos en la técnica para usarse en la administración de tales composiciones a humanos (ver, por ejemplo, Remington Pharmaceutical Sciences. 17til Edition, A. Gennaro, Editor, Mack Publising Co . , Easton, Pennsylvania , 1985) . Loa péptidos de la invención, y/o ácidos nucleicos que codifican los péptidos, también puede administrase por medio de liposomas, que pueden también servir como objetivo de los péptidos a un tejido particular, tal como un tejido linfoide, o para dirigirse selectivamente hasta células infectadas, así como para incrementar la vida media de la composición de péptido. Las liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fosfolípidos , capas lamelares y similares. En estas preparaciones, el péptido a entregarse se incorpora como parte de un liposoma solo o en conjunto con una molécula que se liga a un receptor prevalente entre células linfoides, tal como anticuerpos monoclonales que se ligan al antígeno CD45, o con otras composiciones terapéuticas o inmunogénicas . De esta manera, las liposomas, ya sean rellenos o decorados con un péptido deseado de la invención, puede dirigirse al sitio de células linfoides, donde las liposomas entregan las composiciones de péptido. Las liposomas para usarse de conformidad con la invención se forman de lípidos que forman vesículas estándar, que generalmente incluyen fosfolípidos cargados negativamente y un esterol, tal como colesterol . La selección de lípidos generalmente son una guía a consideración de, por ejemplo, el tamaño de liposoma, capacidad ácida y estabilidad de las liposomas en el torrente sanguíneo. Una variedad de métodos están disponibles para preparar liposomas como se describe en, por ejemplo, Szoka, et al., Ann. Rev. Biophys . Bioeng. 9: 467 (1980) y patentes E.U.A. Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028 y 5,019,369. Para dirigirse a las células del sistema inmune, puede incluirse un ligando para incorporarse en el liposoma, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos específicos para una superficie celular determinantes de las células del sistema inmune deseado. Una suspensión de liposoma que contiene un péptido puede administrarse intravenosamente, localmente, tópicamente, etc, en un dosis que varía de conformidad con, entre otros, la manera de administración, el péptido a entregarse, y el estado de enfermedad a tratarse. Para composiciones sólidas, los portadores sólidos no tóxicos convencionales pueden usarse que incluyen, por ejemplo, grados f rmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, y similares. Para administración oral, una composición no tóxica f rmacéuticamente aceptable se forma al incorporar cualquiera de los excipientes normalmente empleados, tales como aquellos portadores enlistados previamente, y generalmente 10-95% del ingrediente activo, que es, uno o más péptidos de la invención, y más preferiblemente una concentración de 25%-75% . Para administración en aerosol, los péptidos inmunogénicos suministran preferiblemente en forma finamente dividida junto con una tensoactivo y un propelente. Los porcentajes típicos de los péptidos son 0.01%-20% en peso, preferiblemente l%~10%. El tensoactivo, deberá por supuesto, ser no tóxico, y preferiblemente ser soluble en el propelente. Los representativos de tales agentes son los ésteres o ásteres parciales de ácidos grasos que contienen desde 6 hasta 22 átomos de carbono, tales como ácidos capróico, octanóico, láurico, palmítico, esteárico, linoléico, linolénico, olestérico y oléico con el alcohol polihídrico alif tico o sus anhídridos cíclicos. Los ésteres mezclados tales como glicéridos mezclados o naturales pueden emplearse. El tensoactivo puede constituir el 0.1%-20% en peso de la composición, preferiblemente el 0.25-5%. El balance de la composición es ordinariamente el propelente. También puede incluirse un portador, como se desee, junto con, por ejemplo, leticina para entrega intranasal .

IV. M. Kit (s) . Los péptidos y composiciones de ácido nucleico de esta invención pueden proporcionarse en forma de kit(s) junto con instrucciones para la administración de vacunas. Típicamente, los kit(s) deberán incluir las composiciones de péptido deseadas en un recipiente, preferiblemente en forma de dosis unitaria e instrucciones para la administración. Un kit alternativo incluirá un constructo de minigen con los ácidos nucleidos deseados de la invención en un recipiente, preferiblemente en una forma de dosis unitaria junto con instrucciones para administración. Las linfocinas tales como IL-2 ó IL-12 también puede incluirse en el kit. Otros componentes del kit que también pueden ser deseables incluyen, por ejemplo, una jeringa estéril, dosis elevadas y excipientes deseados. Los epítopes de conformidad con la presente invención se usan exitosamente para inducir una respuesta inmune. Las respuestas inmunes con estos epítopes se han inducido al administrar los epítopes de varias formas. Los epítopes que se han administrado como péptidos, como ácidos nucleicos y como vectores virales que comprenden ácidos nucleicos que codifican el epí ope de la invención. Durante la administración de las formas de epítope con base en péptido, se han inducido respuestas inmunes al cargar directamente un epítope en una molécula HLA vacía que se expresa en la célula, por medio de la internalización del epítope y procesamiento por medio de la trayectoria de clase I HLA; en ambos eventos, la molécula HLA que expresa el epítope fue entonces capaz de interactuar con, e inducir, una respuesta CTL . Los péptidos pueden entregarse directamente o usando agentes tales como liposomas. Estos pueden adicionalmente entregarse usando entrega balística en los cuales los péptidos típicamente están en una forma cristalina. Cuando se usa ADN para inducir respuestas inmunes, se administra ya sea como ADN desnudo, generalmente en un rango de dosis de aproximadamente l-5mg, o por medio de la entrega de "pistola de gen" balística, típicamente en un rango de dosis de aproximadamente 10-100 µg . El ADN puede entregarse en una variedad de conformaciones, por ejemplo, lineal, circular, etc. Varios vectores virales también han sido exitosos para usarse de manera que comprende ácidos nucleicos que codifican epítopes de conformidad con la invención. En consecuencia, las composiciones de conformidad con la invención existen en varias formas. Las modalidades de cada una de estas formas de composición de conformidad con la invención se han usado exitosamente para inducir una respuesta inmune. Una composición de conformidad con la invención comprende una pluralidad de péptidos. Esta pluralidad o cóctel de péptido se mezcla generalmente con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. El cóctel de péptido puede comprender copias múltiples del mismo péptido que puede comprender una mezcla de péptidos. Los péptidos pueden ser análogos o epítopes que se presentan naturalmente. Los péptidos puede comprender aminoácidos artificiales y/o modificaciones químicas tales como la adición de una molécula de superficie activa, por ejemplo, lipidación; acetilacíón, glicosilación , biotinilación, fosforilación, etc. Los péptidos pueden ser epítopes CTL o HTL. En una modalidad preferida, el cóctel de péptido comprende una pluralidad de diferentes epítopes CTL y al menos un epítope HTL. El epítope HTL puede ser natural o no natural (por ejemplo, PADRE®, Epimmune Inc., San Diego, CA) . El número de epítopes distintos en una modalidad de la invención generalmente es un entero de unidad completa desde 1 hasta 150 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29, 30, 31, 32 , 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 , 59, 60 , 61, 62 , 63 , 64, 65, 66 , 67, 68 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 , 81, 82 , 83, 84, 85, 86, 87, 88 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ó 150 ) · Una modalidad adicional de una composición de conformidad con la invención comprende un constructo de epítopes múltiples de polipéptido, esto es, un péptido poliepitópico . Los péptidos poliepitópicos de conformidad con la invención se preparan al usar las tecnologías bien conocidas en el arte. Al usar estas tecnologías conocidas los epítopes de conformidad con la invención se conecta uno al otro. Los péptidos poliepitópicos pueden ser lineales o no lineales, por ejemplo, multivalentes . Estos constructos poliepitópicos pueden comprender aminoácidos artificiales, aminoácidos espaciadores o espaciantes, aminoácidos de flanqueo, o modificaciones químicas entre las unidades epítopes adyacentes. El constructo poliepitópico puede ser un heteropolímero o un homopolímero . Los constructos poliepitópico comprenden generalmente epítopes en una cantidad desde cualquier unidad completa entera entre 2-150 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, €5, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ó 150) . El constructo poliepitópico puede comprende epítopes CTL y/o HTL . Uno o más de los epítopes en el constructo puede modificarse, por ejemplo, por la adición de un material de superficie activa, por ejemplo, un lípido o modificarse químicamente, por ejemplo, acetilación, etc. Sin embargo, los enlaces en el constructo multiepitópico puede ser diferentes de los enlaces péptidos, por ejemplo, enlaces covalentes, enlaces de éster o éter, enlaces de disulfuro, enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, etc. Alternativamente, una composición de conformidad con la invención comprende un constructo que comprende una serie, secuencia, expansión, etc., de aminoácidos que tienen homología a (esto es, corresponden a o son continuas con) una secuencia nativa. Esta extensión de aminoácidos comprende al menos una subsecuencia de aminoácidos que si se desdobla o aisla de la serie mayor de aminoácidos, funciona como un epítope de clase II HLA o de clase I HLA de conformidad con la invención. En esta modalidad, la secuencia de péptidos se modifica, de manera que se vuelve un constructo como se define en la presente, para usarse en cualquier número de técnicas conocidas o que se proporcionan en el arte. Los constructos poliepitópicos puede contener una homología en la secuencia nativa para cualquier unidad completa de entero incrementada desde 70-100%, por ejemplo, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ó 100 por ciento. Una modalidad adicional de la composición de conformidad con la invención es un antígeno que presenta células que comprenden uno o más epítopes de conformidad con la invención, Las células que presentan antígeno pueden ser una célula que presenta antígeno "profesional" , tal como una célula dendrítica. La célula que presenta antígeno puede comprender el epítope de la invención por cualquier medio conocido o por determinarse en el arte. Tales medios incluyen pulsado de células dendríticas con uno o más epítopes individuales o con uno o más péptidos que comprenden epítopes múltiples, por administración de ácido nucleico tal como entrega balística de ácido nucleico, o por otras técnicas en el arte para la administración de ácidos nucleicos, incluyendo entrega de ácidos nucleicos basadas en vector, por ejemplo, vector viral. Las modalidades adicionales de las composición de conformidad con la invención comprenden ácidos nucleicos que codifican uno o más péptidos de la invención, o ácidos nucleicos que codifican un péptido poliepitópico de conformidad con la invención. Como se aprecia por alguien de experiencia ordinaria en la técnica, varias composiciones de ácido nucleico codificarán el mismo péptido debido a la redundancia del código genético. Cada una de estas composiciones de ácido nucleico caen dentro del alcance de la presente invención. Esta modalidad de la invención comprende ADN o ARN, y en ciertas modalidad una combinación de ADN y ARN. Se apreciará que cualquier composición que comprende ácidos nucleicos que codifican un péptido de conformidad con la invención, o cualquier otra composición basada con un péptido de conformidad con la invención, cae dentro del alcance de esta invención. Se apreciará que las formas basadas en péptido de la invención (así como los ácidos nucleicos que los codifican) puede comprender análogos de epítopes de la invención usando generalmente principios ya conocidos o por conocerse en la técnica. Los principios relacionados a la analogía son ahora conocidos en la técnica y se describen en la presente; por otro lado, los principios de analogía (analogía heteroclítica) se describen en la solicitud co-pendiente número de serie U.S.S.N. 09/226,775 presentada el 6 de enero de 1999. Generalmente, las composiciones de la invención se asilan o purifican.

V. EJEMPLOS. La invención se describirá en mayor detalle a modo de ejemplos específicos. Los siguientes ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos, y no se pretenden que limiten la invención de ninguna manera. Aquellos de experiencia en la técnica reconocerán una variedad de parámetros no críticos que pueden cambiarse o modificarse para producir modalidades alternativas de conformidad con la invención.

Ejemplo 1: Ensayos de enlace de HLA clase I y clase II . El siguiente ejemplo de péptido enlazados a moléculas HLA demuestra la cuantificación de afinidades de enlace de los péptidos HLA de clase I y clase II. Los ensayos de ligado pueden realizarse con péptidos que porten una porción o que no porten una porción. Los lisados celulares se preparan y las moléculas HLA se codifican de conformidad con protocolos descritos (Sidney et al., Current Protocola in Immunology 18.3.1 (1998); Sidney, et al., J. Immunol . 154: 247 (1995); Sette, et al., Mol. Immunol . 31: 813 (1994)) . Las líneas celulares usadas como fuentes de moléculas HLA y los anticuerpos usados para la extracción de las moléculas HLA de los lisados celulares también se describen en estas publicaciones. Líneas de célula homocigóticas transformadas por virus Epstein-Barr (EBV) , fibroblastos, CIR, o transíectantes 721.221 se usaron como fuentes de moléculas HLA de clase I. Estas células se mantienen in vitro por cultivo en un medio RPMI 1640 complementado con 2 mM de L-glutamina (GIBCO, Grand Island, NY) , 50µ? de 2 -ME, 100 µ9/t?1 de estreptomicina, l00U/ml de penicilina (Irvine Scientific) y FCS inactivado por calor al 10% (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) . Las células se hacen crecer en matraces de cultivo de tejido de 225-cm2 o, para cultivos a gran escala, en aparatos de botella de rodillo. Los lisados celulares se preparan como sigue. Brevemente, las células se lisan a una concentración de 10s células/ml en 50 mM Tris-HCL, pH 8.5, conteniendo Nonidet P-40 al 1% (Fluka Biochemika, Buchs , Suiza) , NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, y PMSF 2 mM. Los lisados se clarifican de residuos y se forman núcleos por centrifugación a 15,000 x g durante 30 minutos . Las moléculas HLA se purifican de lisados por cromatografía de afinidad. Los lisados se pasan dos veces a través de dos precolumnas de Sepharose CL4-B inactivadas y proteína A-Sepharose. A continuación, los lisados se pasan sobre una columna de perlas de Sepharose CL-4B acopladas a un anticuerpo apropiado. La columna anti-HLA se lava luego con 10 volúmenes de columna Tris-HLC 10 mM, pH 8.0, en NP-40 al 1%, PBS, 2- volúmenes por columna de PBS, y 2 volúmenes por columna de PBS que contiene n-oct iglucósido al 0.4%. Finalmente, las moléculas MHC se eluyen con dimetil amina 50 mM en NaCl 0.15 M conteniendo n-octiglucósido al 0.4%, pH 11.5. Un volumen de 1/25 de Tris, 2.0M, pH 6.8 , se agregó al eluido para reducir el pH hasta ~8.0. Los eluidos se concentran luego por centrifugación en concentradores Centriprep 30 a 2000 rpm (Amicon, Beverly, MA) . El contenido de proteínas se evalúa por un ensayo de proteína BCA (Pierce Chemical Co . , Rockford, IL) y se confirma por SDS-PAGE. Una descripción detallada del protocolo utilizado para medir el ligado de péptidos a MHC de clase I y clase II se ha publicado (Sette et al., Mol. Immunol . 31: 813, 1994; Sidney et al., en Current Protocols in Immunology, Margulies, Ed. , John Wiley & Sons, New York, Sección 18.3, 1998) . Brevemente, las moléculas MHC purificadas (5 hasta 500 nM) se incubaron con varios inhibidores de péptidos etiquetados y péptidos de sonda radioetiquetada125I 1-10 nM durante 48 horas en PBS que contiene Nonidet P-40 (NP40) al 0.05% (o digitonina al 20% p/v para ensayo H-2 IA) en presencia de un cóctel inhibidor de proteasa. Las concentraciones finales de inhibidores de proteasa (cada una de CalBioChem, La Jolla, CA) fueron PMSF 1 mM, fenantrolina 1.10 1.3 nM, pepstatina A 73 µ?, EDTA 8 mM, N-etilmaleimida 6 mM (para ensayo de clase II) , y 200 µ? de N alfa-p-tosil-L-lisin clorometil cetona (TLCK) . Todos los ensayos se realizaron a un pH 7.0 con la excepción del D B1*0301, que se realizó a pH 4.5, y el DRB1*1601 (DR2w2ipi) y DRB4*0101 (DRw53) , que se realizaron a pH 5.0. El pH se ajustó como se describe en otra parte (ver Sidney et al., en Current Protocols in Immunology, Margulies, Ed., John Wiley & Sons, New York, sección 18.3, 1998). Después de la incubación, los complejos péptido-MHC se separaron del péptido libre por filtración en gel en columnas 7.8 mm x 15 cm TSK200 (TosoHaas 16215, Montgomeryville , PA) , eluyendo a 1.2 mls/min con PBS pH 6.5 que contiene 0.5% NP40 y 0.1% NaN3. Debido al gran tamaño del péptido etiquetado usado para los ensayos DRB1*1501 (DR2w2p!) , se hace la separación del ligado de picos no ligados más difíciles bajo estas condiciones, todos los ensayos DRB1*1501 (DR2w2 i) se realizaron usando una columna 7.8 mm x 30 cm TS 2000 eluida a 0.6 mls/min. El eluido de las columnas TS se pasó a través de un detector de radioisótopos Beckman 170, y la radioactividad se agrupó y se integró usando un integrador Hewlett-Packard 3396A y la fracción de péptido ligado se determinó . Los péptidos radioetiquetados se yodaron usando el método de cloramina-T. Los péptidos de sonda radioetiquetada representativos utilizados en cada ensayo, y su ensayo específico IC50nM, se resumen en las Tablas IV y V. Típicamente, en los experimentos preliminares, cada preparación HC se tituló en presencia de cantidades fijas de péptidos radioetiquetados para determinar la concentración de moléculas HLA necesarias para ligar el 10-20% de radioactividad total. Toda la inhibición posterior y los ensayos de ligado directos se realizaron usado estas concentraciones HLA. Debido a estas condiciones [etiqueta] < [HLA] y IC50=[HLA] , la medición de los valores IC50 son aproximaciones razonables de los valores KD reales. Los inhibidores péptidos se prueban típicamente en concentraciones en el rango desde 120 µg/ml a 1.2 ng/ml, y se prueban en dos hasta cuatro experimentos completamente independientes. Para permitir la comparación de los datos obtenidos en diferentes experimentos, se calcula una figura de ligado relativo para cada péptido al dividir el IC50 de un control positivo para la inhibición por el IC50 para cada péptido probado (típicamente versiones no etiquetadas del péptido de sonda radioetiquetado) . Para comparaciones entre experimentos, se compilan valores de ligados relativos. Estos valores pueden posteriormente convertirse de nuevo a valores IC50nM al dividir el IC50n de los controles positivos para la inhibición por el ligado relativo del péptido de interés. Este método de compilación de datos se ha proporcionado para ser el más exacto y consistente para comparar péptidos que se han probado en diferentes días, o con diferentes lotes de MHC purificado. Debido a que el anticuerpo usado para la purificación de HLA-DR (LB3.1) es específico de cadena a, las moléculas ß2 no se separan de las moléculas ß3 (y/o ß4 y ß5) . La especificidad de ? de los ensayos de enlace es obvia en los casos de DRB1*0101 (DR1) , DRB1*0802 (DR8 2) , y DRB1*0803 (DR8w3) , donde no se expresa ß3. También se demuestra para DRB1*0301 (DR3) y DRB3*0101 (DR52a) , DRB1*0401 (DR4w4), DRB1*0404 (DR4W14) , DRB1*0405 (DR4wl5) , DRB1*1101 (DR5) , DRB1*1201 (DR5wl2), DRB1*1302 (DR6wl9) y DRB1*0701 (DR7) . El problema de la especificidad de cadena para ensayos de ß DRB1*1501 (DR2wpi) ( DRB5*0101 (DR2w2p2) , DRB1*1601 (??2 2?ß1), DRB5*0201 (DR51Dw21) , y DRB4*0101 (DR 53) es evitada por el uso de fibroblastos. El desarrollo y validación de los ensayos con respecto a la especificidad de la molécula DRp se han descrito previamente (ver, por ejemplo, Southewood et al., J.

Immunol. 160: 3363-3373, 1998). Los ensayos de ligado como se resumen arriba pueden usarse para analizar epítopes que portan superporciones y/o porciones como, por ejemplo, se describen en el Ejemplo 2.

Ejemplo 2. Identificación de epitopes candidatos CTL de superporción HLA conservados. La composiciones de vacuna de la invención pueden incluir múltiples epítopes que comprenden múltiples porciones o superporciones HLA para realizar una amplia cobertura de la población. Este ejemplo ilustra la identificación de epítopes que portan superporciones para la inclusión de tales en una composición de vacuna. El cálculo de la población cubierta se realiza usando la estrategia descrita a continuación. Los epítopes se seleccionan para portar una superporción HLA-A2 , -A3 , o -B7 o una porción HLA-A1 o -A24.

Búsquedas en computadora y algoritmos para identificación de epítopes que portan superporción y/o porción. Las búsquedas en computadora para algunos epítopes que portan superporciones o porciones de HLA de clase I o clase II, se realizaron como sigue. Todas las secuencias aisladas de VHB traducidas se analizaron usando un programa de búsqueda de hilera de textos, por ejemplo, MotifSearch (D. Brown, San Diego) para identificar secuencias de péptidos potenciales que contienen las porciones de ligado HLA apropiadas; se producen fácilmente programas alternativos de conformidad con la información en la técnica en vista de las porciones/superporciones descritas en la presente. Adicionalmente , tales cálculos pueden hacerse mentalmente. Identificando las secuencias de superporción A2-, A3-, y DR se registran usando algoritmos polinominales para predecir su capacidad para ligarse a moléculas de HLA de clase I o clase II especificas. Estos algoritmos polinominales toman en cuenta la extensión y refinamiento de las porciones (esto es, toman en cuenta el impacto de diferentes aminoácidos a diferentes porciones) , y esencialmente se basan en la premisa de que la afinidad general (o ?T) de las interacciones de molécula HLA-péptido pueden aproximarse como una función polinominal lineal del tipo: "AG" = a x a2i x a3i x ani donde a-¡i es el coeficiente que representa el efecto de la presencia de un aminoácido dado (j) en una posición dada (i) a lo largo de la secuencia del péptido de los aminoácidos n. La suposición crucial de este método es que los efectos en cada posición son independientemente esenciales uno del otro (esto es, ligados independientes de cadenas laterales individuales. Cuando el residuo j se presenta en la posición i en el péptido, se supone que contribuye a una cantidad constante ji para la energía libre de ligado del péptido sin tomar en cuenta la secuencia del resto del péptido. Esta suposición se justifica por los estudios de estos laboratorios que demuestran que los péptidos se ligan al MHC y se reconocen por células T en una conformación esencialmente extendida (en la presente se omiten los datos) .

El método de derivación de coeficientes de algoritmos específicos se ha descrito en Gulukota et al., J. Mol. 267: 1258-126, 1997; (ver también Sidney et al., Human Immunol . 45: 79-93,. 1996; y Southwood et al., J. Immunol. 160: 3363-3373, 1998). Brevemente, para todas las posiciones i, igualmente de anclaje o no de anclaje, el medio geométrico del ligado relativo promedio (A B) para todos los péptidos que portan j se calcula con relación al resto del grupo y se usa como el estimado de ji. Para los péptidos de clase II, si son posibles alineaciones múltiples, solo se utiliza la alineación de resultado más alta, después de un procedimiento repetidor. Para calcular un resultado de algoritmo de un péptido dado en conjunto de prueba, los valores ARB correspondientes a la secuencia del péptido se multiplican. Si el producto excede un umbral elegido, el péptido se predice para ligarse. Los umbrales apropiados se eligen como función del grado de severidad de la predicción deseada.

Selección de péptidos de reacción cruzada del supertipo HLA-A2. Las secuencias completas de los 20 aislados de VHB se alinean, luego se revisan, utilizando un programa de computadora regular, para identificar secuencias conservadoras 9- y 10-mer que contienen la especificidad de anclaje principal de supertipo HLA-A2. Un total de 150 secuencias de porción positiva y conservada se identifican. Estos péptidos se evalúan luego para la presencia de residuos de anclaje secundarios preferidos A*0201 usando un algoritmo polinominal específico de A*O20l. Un total de 85 secuencias de porción positiva, conservadas, se seleccionan y se sintetizan. Estos 85 péptidos 9- y 10-meros que contienen una porción, conservados, se prueban luego para su capacidad de enlace a moléculas HLA-A*0201 purificadas in vitro. Se encontraron 34 péptidos que son buenos ligandos de A*0201 (IC50=500 nM) ; 15 son ligandos superiores (IC50=50 nM) y 19 son ligandos intermedios (IC50 de 50-500 nM) (Tabla XXVI) . En el curso de análisis independientes, 25 secuencias 8-u 11 -meros, derivadas de VHB, conservadas con anclajes principales de supertipo A2 también se sintetizaron y se probaron para ligando A*0201. Un péptido, VHB env 259 11-mero (péptido 1147.14), se enlaza a A*0201 con un IC50 de 500 nM, o menos, y se incluye en la Tabla XXVI. También se muestra en la Tabla XXVI un péptido análogo, que representa una substitución sencilla del péptido VHB pol 538 9-mero, que liga A*0201 con un IC50 de 5.1 nM (ver abajo) . Treinta de los 36 ligandos A*0201 se prueban posteriormente para la capacidad de ligarse a alelos del supertipo A2 adicionales (A*0202, A*0203, A*0206 y A*6802). Como se muestra en la Tabla XXVI, 15/30 péptidos (50%) se encuentra que son ligandos de reacción cruzada del supertipo A2 , ligando al menos 3 de los 5 alelos del supertipo A2 probados. Estos 15 péptidos se seleccionan para análisis posteriores .

Selección de epítopes que portan la superporcion HLA-A3. Las secuencias de los mismos 20 aislados se examinaron también para la presencia de péptidos conservados con anclajes primarios de superporción HLA-A3. Un total de 80 secuencias que contienen la porción 9- ó 10 -mero conservada se identificaron. Los análisis adicionales usando los algoritmos A03 ó All identifican 40 secuencias de marcado alto en ambos o uno de los algoritmos. Treinta y seis de los correspondientes péptidos que sintetizan o se prueban para ligado a HLA-A*03 y HLA-A*11, los dos más prevalecientes alelos del supertipo A3. Veintitrés péptidos se identifican que se ligan al A3 y/o All con afinidades o valores IC50 de <500 nM (Tabla XXVII) .

En el curso de una serie independiente de estudios, 30 secuencias de 8 -mero y 24 de 11 -mero derivadas de VHB, conservadas en 75% o más de los aislados, se seleccionaron y se probaron para ligado de A*03 y A*ll. Cuatro de las 8-mero y 9 11 -mero se encontraron que se ligan a uno o ambos de los alelos (Tabla XXVII) . Finalmente, cuatro 9-mero y un 10-mero, péptidos derivados de VHB conservados no seleccionados usando el criterio de búsqueda resumido arriba, pero que se muestra que se ligan a A*03 y/o A*ll, se han identificado y se incluyen en la Tabla XXVII. Dos de estos péptidos contienen anclajes no canónicos (péptidos 20.0131 y 20.0130), y los otros 3 son algoritmos negativo (péptidos 1142.5, 1099.03 y 1090.15) . Treinta y ocho de los 41 péptidos ligados a A*03 y/o A*ll se prueban posteriormente para reacción cruzada de ligado a los otros alelos de supertipo A3 comunes (A*3101, A*3301 y A*6801) . Se ha encontrado que 17 de estos péptidos son de reactividad cruzada de supertipo A3 , ligando al menos 3 de los 5 alelos de supertipo A3 probados (Tabla XXVII) .

Selección de epítopes que portan la superporción HLA-B7. Cuando los mismos 20 aislados se analizan también para la presencia de péptidos 9 ó 10 -meros conservados con la superporción HLA-B7, se identifican 46 secuencias. Treinta y cuatro de los correspondientes péptidos se sintetizan y se prueban para ligarse a HLA-B*0702, el alelo de supertipo B7 más común. Nueve péptidos ligados a B*0702 con un valor IC50 de = 500 n (Tabla XXVIII) . Estos 9 péptidos se prueban luego para ligarse a otros alelos de supertipo B7 comunes (B*3501, B*51, B*530l, y B*5401) . Cinco de los 9 ligados B*0702 son capaces de ligase a 3 ó más de los 5 alelos de supertipo B7 probados . En estudios separados que investigan los requerimientos de anclaje secundario de los alelos de supertipo B , todos los péptidos disponibles con la superporción B7 se probaron para ligarse a todos los alelos del supertipo B7. Como resultado, todos los 34 péptidos descritos arriba también se probaron para ligarse a otros alelos del supertipo B7. Estos experimentos identifican 10 péptidos adicionales que se ligan a al menos un alelo del supertipo B7 con un valor ICS0 de <500 nM, incluyendo 2 péptidos que ligan a 3 o más alelos. Estos 10 péptidos también se muestran en la Tabla XXVIII. Debido a los bajos números de péptidos 9- y 10-mero derivados de VHB del supertipo B7 comparados a los del supertipo A2- y A3 , los 20 asilados se examinaron nuevamente para identificar 8- y 11-mero que contienen porción, conservados. Esto volvió a identificar 51 péptidos. Treinta y uno de estos se sintetizaron y se probaron para ligarse a cada uno de los 5 más comunes alelos del supertipo B7. Diecinueve péptidos 8- y 11-mero se enlazaron con una afinidad alta o intermedia a al menos un alelo del supertipo B7 (IC50<500 nM) (Tabla XXVIII) . Dos péptidos fueron ligados degenerados, ligando 3 de los 5 alelos probados. En resumen, un total de 9 péptidos derivados de VHB, conservados en 75% o más de los aislados analizados, se han identificado que son ligados del supertipo B7 degenerados (Tabla XXVIII) .

Selección de epí topes que portan la porción Al y A24. Para cubrir una población incrementada adicional, epítopes HLA-A1 y A24 se han incorporado en el presente análisis. El Al está, en promedio, presente en el 12%, y el A24 está presente en aproximadamente el 29%, de la población a través de los cinco diferentes grupos étnicos mayores (Caucásico, Negro Norteamericano, Chino, Japonés, e Hispano) . Combinados, estos alelos representaran una frecuencia promedio del 39% en estas mismas poblaciones. La cobertura total a través de las etnias mayores cuando Al y A24 se combinan con la cobertura de los alelos del supertipo A2 - , A3 - y B7- es de >95.4% en comparación, la cobertura combinando los supertipos A2-, A3- y B7 es del 86.2%. Los análisis sistemáticos de VHB para ligados Al y A24 aún no se han completado. Sin embargo, durante estudios independientes, 15 péptidos derivados VHB conservados se han identificado que se ligan a A*0101 con un IC50 de menos de 500 nM (Tabla XXIX) ; 7 de estos se ligan con un IC50 de menos de 100 nM. En un contexto similar, 14 péptidos derivados de VHB ligados a A*2402 también sean identificado, 6 de los cuales se ligan a A*2402 con un IC50 de menos de 100 nM (Tabla XXIX) . Ejemplo 3: Confirmación de Inmunogenicidad . Evaluación de la inmunogenicidad A*0201. El análisis de inmunogenicidad de 15 péptidos de reacción cruzada del supertipo HLA-A2 derivados de VHB identificados arriba se resumen en la Tabla XXX. Los péptidos se revisan para inmunogenicidad en al menos uno de tres sistemas. Los péptidos se revisan para la inducción de CTL especifica de antígeno primaria in vitro usando PBMC humano (Wentworth et al., Molec. Immunol . 32:603, 1995); estos datos se indican como "CTL primario" en la Tabla XXX. El protocolo para la inducción in vitro de un CTL específico de antígeno primario de PBMC humano se ha descrito por Wentworth et al (Wentworth et al., Molec. Immunol. 32: 603, 1995) . El PBMC de donadores normales que se han enriquecido de células CD8 + T se incubaron con células que presentan en antígeno cargado en péptido (PBMC activado por SAC-I) en la presencia de IL-7. Después de siete días, los cultivos se vuelven a estimular usando células adherentes autólogas y irradiadas pulsadas con péptido y luego se prueban para actividad citotóxica siete días después. Además, se usaron ratones transgénicos HLA para evaluar la inmunogenicidad del péptido; estos datos se indican como "CTL transgénico" en la Tabla XXX. Estudios previos han mostrado que el CTL inducido en ratones transgénicos A*020l/Kb exhibe una especificidad similar al CTL inducido en humanos (Vitiello et al., J. Exp. Med . 173: 1007, 1991; Wentworth et al; Eur. J. Immunol . 26: 97, 1996) . La inducción de CTL en ratones transgénicos después de la inmunización de péptidos se ha descrito por Vitiello et al. (Vitiello et al., J. Exp. Med. 173: 1007, 1991) y Alexander et al. (Alexander et al., J. Immunol. 159: 4753, 1997). Brevemente, péptidos sintéticos (50 g/r ón) y el epítope auxiliar VHB de núcleo 128 (140 µg/ tón) se emulsificaron en adyuvante de Freund incompleto (IFA) y se inyectaron subcutáneamente en la base de la cola. Once días después de la inyección, se incubaron esplenocitos en presencia de blastos LPS singénicos cargados en péptidos. Después de seis dias, los cultivos se evaluaron para actividad citotóxica usando objetivos pulsados en péptido. Los péptidos también se prueban para la capacidad de estimular respuestas CTL de recordación en pacientes infectados agudamente con VHB (Bertoni et al., J. Clin. Invest. 100: 503, 1997; Rehemann et al., J. Clin. Invest. 97: 1655-1665, 1996; Nayersina et al., J. Immunol. 150: 4659, 1993); estos datos se indican como "paciente CTL" en la Tabla XXX. Los datos de inmunogenicidad del paciente informan particularmente como se indica, que el péptido se reconoce durante el curso de una infección natural . Estos datos demuestran que el péptido se procesa y presenta en células humanas que representaran los objetivos para CTL. Por otro lado, estos datos son especialmente relevantes para el diseño de vacunas como la inducción de respuestas CTL en pacientes que están correlacionados con la resolución de la infección.

Para la evaluación de las respuestas CTL de recordación, se lleva a cabo una revisión como se describe por Bertoni et al. (Bertoni et al., J. Clin. Invest . 100: 503, 1997) . Brevemente, el PBMC de pacientes infectados agudamente con VHB se cultivan en presencia de 10 9/p?1 de péptido sintético. Después de siete días, los cultivos se vuelven a estimular con péptidos. Los cultivos se evalúan para actividad citotóxica el día 14 usando células objetivo pulsadas con péptido. De los 15 péptidos enlazados de supertipo A2 , 11 se encontraron que son inmunogénicos en al menos unos de los sistemas utilizados. Cinco de los 11 péptidos se han identificado previamente en los pacientes con VHB agudo (Bertoni et al., J. Clin. Invest. 100: 503, 1997). Cinco péptidos degenerados adicionales (1069.06, 1090.77, 1147.14, 927.42 y 927.46) inducen respuestas CTL en ratones transgénicos HLA-A*0201. Los 11 péptidos de reacción cruzada del supertipo inmunogénico se codifican por tres antígenos VHB; núcleo, envoltura y polimerasa. Este conjunto de 11 epítopes que portan la superporción A2 inmunogénicos incluye un péptido análogo, 1090.77. El péptido de tipo silvestre, 1090.14, del cual se deriva este análogo es de reactividad no cruzada del supertipo A2 , pero se ha mostrado que se reconoce en las respuestas CTL de recordación de pacientes con VHB agudo, y que es inmunogénico en ratones transgénicos HLA-A*0201, así como cultivos humanos primarios (Tabla XXX) . Estudios adicionales dirigidos al reconocimiento cruzado del péptido de tipo silvestre 1090.14 y el análogo 1090.77 se describen en detalle a continuación.

En el curso de los análisis independiente, 14 de los péptidos de reacción no cruzada mostrados en la Tabla XXXb, incluyendo 1090.14, se encontraron que son inmunogénicos en al menos un sistema. Cinco péptidos de estos péptidos se reconocen en pacientes; 4 péptidos inducen CTL en ratones transgénicos . En conclusión, 11 péptidos de reacción cruzada del supertipo A2 se han identificado que son capaces de exhibir inmunogenicidad en al menos uno de tres sistemas examinados.

Evaluación de inmunogenicidad A* 03 /All . Siete de los 17 péptidos de reacción cruzada del supertipo A3 se han evaluado para inmunogenicidad (Tabla XXXI) . Como se describe en la sección previa, los péptidos que portan la superporción A3 se revisaron usando cultivos primarios, de respuesta de paciente, o ratones transgénicos HLA-A11 (Alexander et al., J. Immunol . 159: 4753, 1997) . Con excepción del péptido 1.0219, todos los péptidos de reacción cruzada conservados y listados en la Tabla insertada en la Tabla XXXI se encontraron que son inmunogénicos . Adicionalmente, un péptido pobremente conservado (1150.51; 40% de conservado) que exhibe un ligado del supertipo de reacción cruzada se encontró que es inmunogénico en ratones transgénicos, y se incluye en la Tabla XXXI. Dos de los otros péptidos conservadores, pero no de reacción cruzada, también se muestran que se reconoce en pacientes agudamente infectados con VHB (Bertoni et al., J. Clin. Invest . 100: 503, 1997). Estos epítopes se muestran en la Tabla XXXI . Es de notar que 7 de los 8 epítopes que portan la superporción A3 derivados de VHB inmunogénicos, incluyendo todos los 6 péptidos de reacción cruzada, obtienen datos positivos en pacientes. Estos epítopes se derivan predominantemente de la secuencia de proteína de polimerasa, solo con un epítope siendo derivado de la secuencia de proteína de núcleo. Aunque un número de péptidos de reacción cruzada se ha identificado en el antígeno X (Tabla XXXI) , a la fecha estos péptidos no se han revisado para inmunogenicidad .

En resumen, 7 de los péptidos de reacción cruzada, que portan la superporción A3 , se han identificado que se reconocen por CTL en pacientes agudamente infectados, o inducen CTL en ratones transgénicos HLA.

Evaluación de la inmunogenicidad de B7. Los estudios de inmunogenicidad que involucran péptidos de reacción cruzada, que portan la superporción B7 HLA derivados de VHB, se resumen en la Tabla XXXII . Los péptidos HLA-B7 se revisan exclusivamente en sistemas humanos midiendo las respuestas en cultivos primarios o pacientes agudamente infectados con VHB. De los 7 péptidos degenerados revisados, 4 se muestran que son inmunogénicos . Un péptido de reacción no cruzada (XRN<3), 114701, también se muestra que se reconoce en pacientes agudamente infectados con VHB (Bertoni et al., J. Clin. Invest. 100: 503, 1997; ver Tabla XXXVII). En resumen, 5 epítopes que portan la superporción B7 derivados de VHB conservados que se reconocen en pacientes agudamente infectados con VHB se han identificado. Estos epítopes proporcionan la cobertura de 4 diferentes antígenos VHB (núcleo, cobertura, polimerasa y X) .

Ejemplo 4: Implementación de la superporción extendida para mejorar la capacidad de ligado de péptidos nativos por análogos creados .

Las porciones y superporciones HLA (que comprenden residuos primarios y/o secundarios) son útiles para preparar péptidos nativos de reacción altamente cruzada, como se demuestra en la presente. Por otro lado, la definición de porciones y superporciones HLA también permite que uno de los epítopes de reacción altamente cruzada producidos por ingeniería genética identifiquen residuos dentro de la secuencia de péptido nativo que puede ser análoga, o "fija", para conferir al péptido ciertas características, por ejemplo, una reacción cruzada mayor dentro del grupo de moléculas HLA que hacen el supertipo, y/o una mayor afinidad de ligado para algunas o todas las moléculas HLA. Los ejemplos de péptidos análogos que exhiben afinidad de ligado modulado se proporcionan, Analogía en residuos de anclaje primario . Se ha mostrado que los ligandos de péptido de clase I pueden modificarse, o "fijarse" para incrementar su afinidad de ligado y/o su degeneración (Sidney et al., J. Immunol . 157: 3480, 1996). Estos péptido fijos pueden también demuestran una inmunogenicidad incrementada y un reconocimiento de reactividad cruzada por células T específicas para el epítope de tipo silvestre (Parkhurst et al., J. Immunol. 157: 2539, 1996; Pogue et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 92: 8166, 1995). Específicamente, los anclajes principales de los péptidos del supertipo A2 pueden "fijarse", o ser análogos, a L o V (o M, si es natural) en la posición 2, y V en la terminación C. Como se indica en la Tabla XXVI, 9 de los 14 péptidos de ligado de reacción cruzada del supertipo A2 se "fijan" por estos criterios, como son 16 de los 21 ligados de reactividad no cruzada. Los candidatos ideales para fijase serían péptidos que ligan al menos 3 moléculas específicas de alelo del supertipo A2 con IC50 = 5000 nM. Un ejemplo de la eficacia de esta estrategia para generar epítopes de reacción cruzada más ampliamente se proporciona por el caso del péptido 1090.14 (Tabla XXVI). Previamente, este péptido se muestra que es altamente inmunogénico en cada uno de los sistemas examinados. Sin embargo, solo exhibe ligado a un molécula específica de alelo del supertipo A2 sencilla, A*020l. La capacidad de ligado de reacción no cruzada de este epítope limita la cobertura de población y en consecuencia el valor de incluir este péptido en una vacuna candidato. En un esfuerzo para incrementar la afinidad de ligado y la reacción cruzada, la terminación C del péptido 1090.14 se altera desde la "alanina" hasta el residuo preferido de la superporcion A2 "valina" . Este cambio resulta en un incremento dramático (40 veces) en la capacidad de ligado para A*0201 (desde 200 nM hasta 5.1 nM) , pero también produce un péptido capaz de ligar 3 de otras moléculas específicas de alelo del supertipo A2 (ver péptido 1090.77, Tabla XXVI) . Los estudios con ratones transgénicos HLA-A*020l muestran que la respuesta CTL de los ratones inmunizados con el péptido 1090.77 reconocen células objetivo dadas con el péptido que se presenta naturalmente 1090.14 o el análogo substituido de valina (esto es, 1090.77) . De hecho, la lisis efectuada por 1090.77 induce el CTL indistintamente sin tener en cuenta el análogo o la secuencia de tipo silvestre que se va a usar para cargar las células objetivo (B. Livingston, datos no publicados) . La relevancia de estas observaciones para el diseño de constructos de vacuna indicada por estudios en log cuales los pacientes crónicos con VHB tratan con el inhibidor de replicación viral potente, lamivudina. La terapia extendida con lamivudina resulta en la selección de cepas de VHB resistentes al fármaco que tienen una substitución de valina para metionina en la posición 2 en el epítope 1090.14, lo que sugiere que las vacunas basadas en el epítope usadas en combinación con lamivudina, pueden necesitar tener la capacidad de inducir respuestas CTL que reconocen la secuencias tanto del tipo silvestre como mutantes . Para demostrar que el reconocimiento cruzado es posible entre el péptido nativo (1090.14), el péptido análogo, el péptido M2 mutante inducido por lamivudina, el CTL se genera usando el péptido análogo 1090.77. Esto cultivos CTL se estimulan luego con el péptido de tipo silvestre (1090.14), o el péptido M2 mutante inducido por lami udina. La capacidad de estos CTL para cargar luego células objetivo lisadas con el péptido tipo silvestre, o con el mutante inducido por lamivudina, se ensaya después. Las células objetivo presentes en cualquiera de los péptidos se lisan similarmente por el cultivo CTL (Tabla XXVI) . Estos estudios demuestran que la analogía del péptido puede resultar en un incremento dramático de la degeneración del supertipo HLA-A2 mientras que permite aún el reconocimiento cruzado entre epítopes del tipo silvestre y mutantes . Más específicamente, estos resultados indican que la vacuna que utiliza el péptido análogo 1090.77 deberá estimular una respuesta que se reconocería tanto por las cepas resistentes a lamivudina y del tipo silvestre de VHB. Similarmente, análogos de epítopes que portan la superporción HLA-A3 también pueden generarse. Por ejemplo, los péptidos deberán ser análogos para poseer una V preferida en la posición 2 y R o K en la terminación C. Doce de los péptido generados del supertipo A3 identificados en la Tabla XXVII son candidatos para fijar anclajes principales, como son 19 de los 24 ligados de reacción no cruzada. Los péptidos análogos se prueban inicialmente para ligarse a A*03 y A*ll, y aquellos que demuestran equivalencia, o mejora, en la capacidad de ligado con relación al péptido precursor, deberían luego probarse para la reacción cruzada del supertipo A3. Los análogos que demuestran una reacción cruzada mejorada se evalúan luego además para inmunogenicidad, como sea necesario. Típicamente, es más difícil identificar epítopes que portan la superporción B7. Como en el caso de los epítopes del supertipo A2 y A3 , puede utilizarse una estrategia análoga del péptido para generar epítopes que portan la superporción B7 adicionales que incrementan el ligado de reacción cruzada. En general, los péptidos que portan la superporción B7 deberán fijarse para poseer P en la posición 2, e I en su terminación C. Los análogos que representan los residuos de aminoácidos sencillos de anclaje primario substituidos con residuos I en la terminación C para dos diferentes péptidos tipo B7 (VHB env 313 y VHB pol 541) se sintetizan y se prueban para su capacidad de ligado al supertipo B7. Se ha encontrado que la substitución I tiene un efecto positivo general en la afinidad de ligado y/o la reacción cruzada en ambos casos. En el caso de VHB env 313, el 19 (I en la terminal C posición 9) el reemplazado es efectivo para incrementar la reacción cruzada de 4 hasta 5 alelos ligados en virtud de un incremento de casi 400 veces la afinidad de ligado de B*5401. En el caso de VHB pol 541, el incremento de reacción cruzada se realizó similarmente por un incremento substancial en el ligado de B*5401. También, se observan ganancias significantes en la afinidad de ligado para B*0702, B51 y B*5301 con el análogo de VHB pol 541 19.

Analogía en los residuos de anclaje secundarios. Por otro lado, la superporciones HLA son de valor en los péptidos producidos por ingeniería genética de reacción altamente cruzada para identificar residuos particulares en posiciones de anclaje secundarias que se asocian con tales propiedades de reacción cruzada. Demostrando esto, la capacidad de un segundo conjunto de péptidos que representan substituciones de aminoácidos sencillos discretas en las posiciones uno y tres de cinco diferentes péptidos de ligado de supertipo B7, se sintetizan y prueban para su capacidad de ligado al supertipo B7. En 4/4 casos, el efecto de reemplazar el residuo nativo en la posición 1 con el residuo aromático F (una substitución "Fl" ) resulta en un incremento en la reacción cruzada, comparado con el péptido precursor y en la mayoría de las veces,- se incrementa la afinidad de ligado tres veces o aún mejor (Tabla XXVIII) . Más específicamente, para reacción cruzada del supertipo completo de VHB env 313, MAGE2 170 y VHB de núcleo 168, se realiza con los análogos de substitución Fl . Estas ganancias se realizan por el incremento dramático de la afinidad de ligado B*5401.

También, las ganancias en la afinidad se notan para otros alelos en el caso del VHB de núcleo 168 (B*3501 y B*5301) y MAGE2 170 (B*3501,B51 y B*5301) . Finalmente, en el caso de AGE3 196, el reemplazo Fl es efectivo para incrementar la reacción cruzada debido a las ganancias en ligado B*0702. Un incremento de casi 70 veces en la capacidad de ligado B51 también se nota. Se hacen también dos análogos usando las substitución F positiva de superporción en la posición tres (una substitución "F3") . En ambos casos, el incremento en la afinidad de ligado y la reacción cruzada se realizaron. Específicamente, en el caso de VHB pol 541, la substitución F3 fue efectiva para incrementar la reacción cruzada en virtud de su efecto en el ligado B*540l. En el caso de MAGE3 196, la reacción cruzada del supertipo completo se realizó al incrementar la capacidad de ligado B*0702 y B*3501. También, en el caso de A.GE3 196, es notable que el incremento en la capacidad de ligado entre 40 y 5000 veces se obtiene para B*3501, B51, B*5301 y B*5401. En conclusión, estos datos demuestran que por el uso de substituciones de aminoácido aún sencillas, es posible incrementar la afinidad de ligado y/o reacción cruzada de los ligandos de péptido a las moléculas del supertipo HLA.

Ejemplo 5: Identificación de secuencias derivadas de VHB conservadoras con porciones de ligado HLA-DR. Los epítopes de péptidos que portan la superporción o porción de HLA de clase II también pueden identificarse como se resume a continuación usando una metodología similar a la que se describe en los Ejemplos 1-3.

Selección de epítopea que portan la superporción HUí-DR. Las moléculas de HLA de clase II ligan péptidos típicamente de entre 12 y 20 residuos de longitud. Sin embargo, de manera similar al HLA de clase I, la especificidad y energía interacción usualmente contenida dentro de una región de núcleo corta de alrededor de 9 residuos. La mayoría de las moléculas DR porta una especificidad traslapante dentro de este núcleo 9-mero en el cual un residuo hidrofóbico en la posición 1 (Pl) es el anclaje principal (O'Sullivan et al., J. Immunol . 147: 2663, 1991; Southwood et al., J. Immunol. 160: 3363, 1998). La presencia de residuos hidrofóbicos o pequeños en la posición 6 (P6) también es importante para la mayoría de la interacciones DR-péptido. Esta especificidad P1-P6 traslapante, dentro de la región de núcleo 9-mero, se define como la superporción DR. Diferente a las moléculas de clase I, las moléculas DR son abiertas en ambos extremos de la ranura de ligado y puede, por lo tanto, acomodarse a lo largo de péptidos de longitud variada. En efecto, mientras que la mayoría de la energía de las interacción péptido-DR aparece para contribuir por la región de núcleo, los residuos de flanqueo aparecen para ser importantes para interacciones de alta afinidad. También, no obstante que no es estrictamente necesario para el ligado de HC, los residuos de flanqueo son necesarios claramente la mayoría de las veces para el reconocimiento de células T. Para identificar epí opes HTL de reacción cruzada DR derivados de VHB, las mismas 20 poliproteínas de VHB se han revisado para la identificación de secuencia de porción de HLA de clase I revisadas para la presencia de secuencias con porciones para HLA-DR ligado. Específicamente, las secuencias de 15 -mero comprenden una superporción DR que contiene un núcleo 9-mero, y tres residuos de regiones de flanqueo de terminal N y C, se seleccionan. También se requiere que el 100% de la secuencia de 15-mero se conserve en al menos 85% (17/20) de las cepas VHB revisadas. Usando estos criterios, 36 secuencias no redundantes se identifican. Treinta y cinco de estos péptidos se analizan posteriormente. Los algoritmos para predecir el ligado de péptido a moléculas DR también se ha desarrollado (Southwood et al., J. Immunol . 160: 3363, 1998) . Esto algoritmos, específicos para evaluar DR individuales, permiten el registro y colocación de regiones de núcleo 9-mero. Usando tablas de selección, se ha encontrado que estos algoritmos seleccionan eficientemente secuencias de péptido con una alta probabilidad de ligado a moléculas DR apropiadas. Adicionalmente , se ha encontrado que corriendo los algoritmos, específicamente aquellos para DR1 , DR4w4 , y DR7 , secuencialmente , puede seleccionarse eficientemente péptidos de reacción cruzada DR. Para ver si estos algoritmos identificarán péptidos adicionales, las mismas poliproteínas VHB usadas arriba se vuelven a revisar para la presencia de péptidos de 15-mero donde el 100% de la región de núcleo 9-mero es 385% (17/20 cepas) conservada. A continuación, la región del núcleo 9-mero de cada uno de estos péptidos se revisa usando los algoritmos DR1 , DR4w4 , y .JR7. Como resultado, se identifican y sintetizan 8 secuencias adicionales. En resumen, 44 péptidos 15-meros en los cuales una región de núcleo de 9-mero contiene la superporción DR, o se selecciona usando un algoritmo que predice la secuencias de ligado DR, se identifican. Cuarenta y tres de estos péptidos se sintetizan (Tabla XXXIII) . Mientras se realizaron los análisis para los péptidos derivados de VHB descritos arriba, también se identifican 9 péptidos predichos en la base de sus perfiles de algoritmos DRl , DR4w4 , y DR7 son péptidos de ligados de reacción cruzada DR, pero los cuales tienen regiones de núcleo 9-mero que solo son 80% conservadas. Un péptido adicional que contiene una región de núcleo de superporción DR que es el 95% conservada, pero se localiza solo un residuo removido de la terminación N, fue sintetizada previamente. Estos 10 péptidos también se seleccionan para un análisis adicional, y se muestran en la Tabla XXXI II . Finalmente, 2 péptidos, CF-08 y 1186.25, que son redundantes con un péptido seleccionado arriba (27.0280), se consideran para análisis adicionales. El péptido 1186.25 contiene secuencias de superporción DR múltiples. El péptido CF-08 es un 20-mero que se aloja tanto al 27.0280 y 1186.25. Estos péptidos se muestran en la Tabla XXXIII. Los 55 péptidos derivados de VHB identificados arriba se prueban para su capacidad para ligar alelos HLA-DR comunes. Para maximizar tanto la cobertura de población, y las relaciones entre los repertorios de ligado de la mayoría de los alelos DR (ver, por ejemplo, Southwood et al., J. Immunol . 160: 3363, 1998), los péptidos se revisan para ligado a paneles de secuencia de ensayos DR. La composición de esto paneles aleatorios, y la frecuencia fenotípica de antígenos asociados, se muestran en la Tabla XXXIV. Todos los péptidos se prueban inicialmente para ligarse a los alelos en el panel primario: DR1 , DR4w4 , y DR7. Sólo los péptidos ligados al menos 2 de estos 3 alelos se prueban luego para ligarse en ensayos secundarios (DR2w2 ß?, DR2w2 ß2 , DR6wl9 y DR9) . Finalmente, solo los péptidos que se ligan al menos 2 de los 4 alelos de panel secundario, y de esta manera 4 de los 7 alelos totales, se revisan para ligarse en ensayos terciarios (DR4wl5, DRSwll, y DR8w2) . Una vez probados, se ha encontrado que 25 de los 55 péptidos originales (45%) enlazan dos o más de los alelos de panel primario. Cuando estos 25 péptidos se prueban posteriormente en ensayos secundarios, 20 se encuentran que se ligan al menos 4 de los 7 alelos DR en los paneles de ensayo primario o secundario. Finalmente, 18 de los 20 péptidos pasan la fase de revisión secundaria probándose para ligado en ensayos terciarios. Corno resultado, 12 péptidos se muestran que se ligan al menos 7 de 10 alelos HLA-DR comunes. Las secuencias de estos 12 péptidos, y su capacidad de ligado para cada ensayo en los paneles primario hasta terciario, se muestran en la Tabla XXXV. También se muestran los péptidos CF-08 y 857.02, que enlazan 5/5 y 5/6 de los alelos probados a la fecha respectivamente. En resumen, 14 péptidos, derivados de 12 regiones independientes del genoma VHB, se han identificado que son capaces de ligarse a alelos HLA-DR múltiples. Este conjunto de péptidos incluye al menos 2 epítopes para cada una de los antígenos Núcleo (Nuc) , Pol , y Env.

Selección de péptidos de porciones DR conservadores. Debido a que el HLA-DR3 es un alelo que es prevaleciente en poblaciones Caucásicas, Negras, e Hispanas, la capacidad de ligado de DR3 es un criterio importante en la selección de epítopes HTL. Sin embargo, los datos generados previamente indican que el DR3 sólo reacciona de manera cruzada raramente con otros alelos DR (Sidney et al., J. Immunol . 149: 2634-2640, 1992; Geluk et al., J. Immunol. 152: 5742-5748; Southwood et al., J. Immunol. 160: 3363-3373, 1998) . No es complemente sorprendente que la porción de ligado a péptido DR3 aparezca para ser distinta de la especificidad de la mayoría de los otros alelos DR. Para identificar eficientemente péptidos que se ligan a DR3 , las proteínas objetivo se analizan para secuencias conservadoras que porten una de las 2 porciones de ligado específico DR3 reportadas por Geluk et al. (J. Immunol. 152:5742-5748, 1994) . Dieciocho secuencias se identifican. Ocho de estas secuencias son mayormente redundantes con péptidos mostrados en la Tabla XXXVI, y 3 con péptidos que se han sintetizado previamente para otros estudios. Se sintetizaron 7 secuencias únicas. Diecisiete de los dieciocho péptidos que contienen la porción DR3 se han probado para su capacidad de ligado a DR3. Cuatro péptidos se ha encontrado que ligan a DR3 con una afinidad de 1000 Nm o mejor (Tabla XXXVI) .

Ejemplo 6: Immunogenicidad de epitopes HTL derivados de HPV . Este ejemplo determina los epitopes que portan la porción DR3 y la superporción DR entre aquellos identificados usando la metodología en el Ejemplo 5. La inmunogenicidad de los epítopes HTL se evalúa de manera análoga a la determinación de la inmunogenicidad de epítopes CTL al evaluar la capacidad para estimular la respuestas HTL y/o al usar modelos de ratón transgénico apropiados. La inmunogenicidad se determina revisando: 1.) la inducción primaria in vitro usando PBMC 6 2.) la respuesta de recordación de pacientes de cáncer PBMC.

Ejemplo 7: Cálculo de frecuencias fenotípicas del supertipo HLA. en varias columnas étnicas para determinar la extensión de la cobertura de població . Este ejemplo ilustra la evaluación de la amplitud de cobertura de población de una composición de vacuna que comprende epítopes múltiples que comprenden superporciones y/o porciones múltiples. Con objeto de analizar la cobertura de población, se determinan frecuencias de gen alelos HLA. Las frecuencias de gen para cada uno de los alelos HLA se calculan de la frecuencia de antígeno o alelo utilizando las fórmulas de distribución binominal gf =1- (SQR (laf ) ) (ver, por ejemplo, Sibney et al., Human Immunol . 45: 79-93, 1996) . Para obtener frecuencias fenotípicas generales, se calculan frecuencias de gen acumulativas y las frecuencias de antígeno acumulativas derivadas por el uso de la fórmula inversa [af=1- ( 1-Cgf) 2] . Donde los datos de frecuencia no están disponibles al nivel tipificado de ADN, se asume el correspondiente a las frecuencias de antígeno definidas serológicamente . Para obtener la cobertura de población del supertipo potencial total se asume un desequilibrio no enlazado, y solo los alelos confirmados para pertenecer a cada uno de los supertipos se incluyen (estimados mínimos) . Los estimados de la cobertura potencial en total realizadas por combinaciones inter-localizaciones se hacen al agregar a la cobertura A la proporción de la población cubierta no A que se esperará que se cubra por los alelos B considerados (por ejemplo, total=A+B* (1-A) ) . Los miembros confirmados del supertipo A3 son A3, All, A31, A*3301 y A*6801. No obstante que el supertipo similar a A3 incluye potencialmente A34, A66 y A*7401, estos alelos no se incluyen en cálculos de frecuencias generales. Similarmente , se confirma que la familia del supertipo similar a A2 son A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*0207, A*6802 y A*6901. Finalmente, los alelos confirmados del supertipo similar a B7 son: B7, B*3501-03, B51, B*5301, 13*5401, B*5501-2, 13*5601, B*6701 y B*7801 (potencialmente también B*1401, B*3504-06, B 201 y B*5602) . La población cubierta realizada por la combinación de los supertipos A2-, A3 - y B7 es de aproximadamente de 86% en los 5 grupos étnicos mayores (ver Tabla XXI) . La cobertura puede ser extendida para incluir péptidos que portan las porciones Al y A24. En promedio, Al está presente en el 12% y A24 está en el 29% de la población a través de los 5 diferentes grupos étnicos mayores (Caucásico, Negro Norteamericano, Chino, Japonés, e Hispano) . De manera conjunta, estos alelos se representan con una frecuencia promedio de 39% en las mismas poblaciones étnicas. El total de cobertura a través de las etnias principales cuando se combinan Al y A24 con la cobertura de los alelos de supertipo A2-, A3- y B7- es del >95%. La cobertura de población para las moléculas de HLA de clase II puede desarrollarse análogamente con base en la presente descripción.

.Resumen de epí topes de HLA de clase I y clase II candidatos .

En resumen, en base a los datos presentados arriba, 34 epítopes CTL conservados se seleccionan como candidatos de vacuna (Tabla XXXVII) . De estos 34 epítopes, 7 se derivan del núcleo, 18 de la polimerasa y 9 de la cobertura. No se incluyen epítopes del antígeno X en el paquete cuando esta proteína se expresa en bajas cantidades y es, por lo tanto, de menos interés inmunológico . La cobertura de población proporcionada por este panel de epítopes CTL se estima para exceder el 95% en cada una de las 5 poblaciones étnicas mayores. Usando un análisis Monte Cario (figura 1), se predice que aproximadamente el 90% de los individuos en una población que comprende Caucásicos, Negros Norteamericanos, Japoneses, Chinos e Hispanos, reconocería cinco o más de los epítopes candidatos de vacuna. Aunque los epítopes CTL preferidos incluyen 34 peptidos discretos, 2 peptidos se agrupan complemente junto con peptidos más grandes, reduciendo de esta manera efectivamente el número de péptidos que se incluirán en un candidato de vacuna. Específicamente, el péptido de restricción A2 927.15 se agrupa con el péptido de restricción B7 26.0570 y el péptido de restricción B7 988.05 se agrupa con el péptido de restricción A2 924.07. Similarmente , el péptido de restricción A24 20.0136 y el péptido de restricción A2 10.1301 contienen la misma región de núcleo, solo con diferencia en el primer aminoácido. En una nota relacionada, el péptido de restricción A2 1090.14 y el péptido de restricción B7 1147.05 traslapados por dos aminoácidos, elevan la posibilidad de entregar estos dos epítopes con una secuencia de péptido contigua. El conjunto de péptidos incluye 9 epítopes CTL restringidos A2 ; 4 epítopes derivados de polimerasa, 4 epítopes derivados de la cobertura y un epítope de núcleo. Siete de estos 9 péptidos se reconocen en los ensayos CTL de recordación de pacientes agudos. De los 7 péptidos reconocidos en pacientes, 2 son péptidos enlazados no de reacción cruzada. La inclusión de estos péptidos como candidato de vacuna potenciales se detiene de la observación que HLA-A*0201 es el alelo del supertipo A2 predominantemente expresado en todas las etnias examinadas. Como tal, la inclusión de péptidos ligados , A*0201 de reacción no cruzada incrementa la redundancia de la cobertura del antígeno en la cobertura de población. Los únicos dos péptidos de restricción A2 que carecen de datos de inmunogenicidad del paciente son los péptidos 1090.77 y 1069.06. El péptido 1090.77 es un análogo de un péptido altamente inmunogénico reconocido en pacientes con VHB agudo. No obstante las respuestas de llamado a pacientes que no se han probado para la capacidad de reconocer el péptido análogo, los estudios de inmunogenicidad conocidos en ratones HLA transgénicos muestran que el CTL inducido con 1090.77 son capaces de reconocer células objetivo cargadas con la secuencia que se presenta naturalmente. Estos datos indican que el CTL se levanta para el péptido 1090.77 que son de reacción cruzada y reconocerán células infectadas con VHB. El péptido 1069.06 se incluye como un epítope de vacuna potencial debido a su alta afinidad de ligado para A*6802 resultando en una mayor población cubierta. El péptido es inmunogénico en ratones transgénicos HLA-A2 y cultivos humanos primarios. Los epítopes CTL preferidos incluyen 7 péptidos restringidos del supertipo A3 ; 6 derivados del antígeno de polimerasa y uno de la región del núcleo. Todos los péptidos candidatos de vacuna del supertipo A3 son inmunogénicos en pacientes. No obstante que el péptido 1142.05 es un péptido restringido A3 de reacción no cruzada, se muestra que se reconocen en pacientes y es capaz de ligarse a HLA-A1. Nueve péptidos restringidos B7 se prefieren como epítopes CTL identificados en los ejemplos. De este grupo, 3 epítopes se han mostrado que se reconocen en pacientes . Aunque uno de estos péptidos, 1147.04, es un ligador de reacción no cruzada, este liga 2 de los mayores alelos del supertipo B7 con un IC50 o valor de afinidad de enlace de menos de 100 n . Seis epítopes del supertipo B7 se incluyen como epítopes preferidos con base en el ligado del supertipo. Los estudios de inmunogenicidad en humanos (Bertoni et al., 1997; Doolan et al., 1997; Threlkeld et al., 1997) han demostrado que los péptidos de reactividad altamente cruzada son casi siempre reconocidos como epítopes. Dado estos resultados y a la luz de los datos de inmunogenicidad limitados disponibles, el uso de la afinidad de ligado del supertipo B7 como un criterio de selección se observa como apropiado . Similarmente , estos son datos de inmunogenicidad pequeños con respecto a los péptidos restringidos Al- y A2 . Un epítope CTL preferido, 1069.04, se ha reportado para reconocerse en respuesta de recordatorio de pacientes con VHB agudo. Como se discute en el párrafo precedente, un alto porcentaje de péptidos con afinidades de ligado de <100 nM se encuentra que son inmunogénicos . Por estas razones, todos los péptidos Al y A24 con afinidades de ligado de <100 nM se consideran como epítopes CTL preferidos. Usando este criterio de selección, 3 péptidos restringidos Al y 6 péptidos restringidos A24 se identifican como epítopes candidatos. El análisis adicional encuentra que 3 péptidos derivados del núcleo se ligan a A24 con una afinidad intermediaria. Ya que relativamente algunos epítopes de núcleo se identifican durante el curso de este estudio, los péptidos de núcleo de ligado A24 intermediario también se incluyen en el conjunto de epítopes preferidos para proporcionar un grado mayor de redundancia en la cobertura del antígeno. La lista de epítopes HTL derivados de VHB preferida se resumen en la Tabla XXXVII. El conjunto de epítopes HTL incluye 12 péptidos de ligado de superporción DR y 4 péptidos de ligado DR3. El volumen de epítopes HTL se deriva de la polimerasa; 2 de cobertura y 2 epítopes derivados del núcleo también se incluyen en el conjunto de epítopes HTL preferidos. La cobertura de población estimada total representada por el panel de epítopes HTL es de más del 91% en cada uno de los 5 grupos étnicos mayores (Tabla XXXVIII) .

Ejemplo 9: Reconocimiento de la generación de antígenos procesados endógenamente después del cebado. Este ejemplo determina que el CTL inducido por epítopes nativos o analogados, identificado y seleccionado como se describe en los Ejemplos 1-5 reconoce antígenos nativos, esto es, sintetizados endógenamente. Células efectoras aisladas de ratones transgénicos inmunizados con epítopes de péptido como en el Ejemplo 3, por ejemplo, epítopes que portan la superporción HLA-A2 , se re-estimulan in vitro usando células estimuladoras recubiertas con péptidos. Seis días después, las células efectoras se evalúan para citotoxicidad y las líneas de célula que contienen la actividad citotóxica específica de péptido se vuelven a estimular adicionalmente . Seis días adicionales después, estas líneas de célula se prueban para actividad citotóxica en células objetivo Jurkat-A2. l/Kb etiquetadas con 51Cr, en ausencia o presencia de un péptido y también se prueban en células objetivo etiquetadas B1Cr que portan un antígeno endógenamente sintetizado, por ejemplo, células que se transfectan establemente con vectores de expresión del VHB. Los resultados muestran que las líneas CTL obtenidas de animales cebados con el epítope de péptido reconocen antígenos VHB endógenamente sintetizados. La elección del modelo de ratón transgénico a usarse para tal análisis depende de los epítopes que se evaluarán. Además de los ratones transgénicos HLA-A*020l/Kb, varios otros modelos de ratón transgénicos, incluyendo ratón con All humano, que puede también usarse para evaluar los epítopes A3 y alelos B7 , se han caracterizado y otros (por ejemplo, ratones transgénicos para HLA-A1 y A24) se han desarrollado. Los modelos de ratón HLA-DR1 y HLA-DR3 también se han desarrollado, los cuales pueden usarse para evaluar epítopes HTL.

Ejemplo 9: Actividad de epítopes conjugados CTL-HTL en ratones transgénicos. Este ejemplo ilustra la inducción de CTL y HTL en ratones transgénicos por el uso del conjugado péptido VHB CTL/HTL. Un estudio análogo puede encontrarse en Oseroff et al. Vaccine 16: 823-833 (1998). La composición de péptido puede comprender epítopes CTL y/o HTL múltiples y además, puede comprender epítopes seleccionados de antígenos objetivo HPV múltiples. Los epítopes se identifican usando la metodología como se describe en los Ejemplos 1-6. Por ejemplo, tal composición de péptido puede comprender un epítope HTL conjugado para un epítope CTL preferido que contiene, por ejemplo, al menos un epítope CTL que liga a miembros de la familia HLA múltiples en una afinidad de 500 nM o menos, o análogos de tal epítope. Los péptidos pueden lipidarse, si se desea.

Procedimientos de inmunización: La inmunización de ratones transgénicos se realiza como se describe (Alexander et al., J. Immunol . 159:4753-4761, 1997) . Por ejemplo, ratones A2 /Kb , que son transgénicos para el alelo HLA A2.1 humano y son útiles para la evaluación de la inmunogenicidad de epítopes que portan la porción HLA-A*0201 o la superporción HLA-A2 , se ceban subcutáneamente (con base en la cola) con 0.1 mi de péptido en un adyuvante de Freund incompleto, o si en la composición de péptido es un conjugado CTL/HTL lipidado, en solución salina/DMSO o si la composición de péptido en un polipéptido, en PBS o adyuvante de Freund incompleto. Siete días después del cebado, los esplenocitos obtenidos de estos animales se reestimulan con linfoblastos activados por LSP singénicamente irradiados recubiertos con péptido. Líneas celulares: Células objetivo para ensayos de sito toxicidad específicos de péptido son células Jurkat transíectadas con el gen quimérico HLA-A2.l/Kb (por ejemplo, Vitiello et al., Exp. ed. 173:1007, 1991) . Activación CTL in vitro: Una semana después del cebado, las células de bazo (30xl06 Células/ matraz) se co-cultivan a 37°C con linfoblastos recubiertos con péptido irradiados (3000 rads) , singénicos, (10x10s células/ matraz) en 10 mi de medio de cultivo/ matraz T25. Después de seis días, las células efectoras se cosechan y se evalúan para actividades citotóxicas . Ensayo para actividad citotóxica: Se incuban células objetivo (1.0 a l.SxlO6) a 37°C en presencia de 200µ1 de 51Cr. Después de 60 minutos, se lavan las células tres veces y se vuelven a suspender en un medio RIO. Se agrega péptido cuando se requiera a una concentración de 1 µ9/tt?1. Para el ensayo, se agregan células objetivo etiquetadas en 104 51Cr- a diferentes concentraciones de células efectoras (volumen final de 200 µ?) en placas de 96 pozos de fondo en U. Después de 6 horas de un periodo de incubación a 37 °C, se remueve 0.1 mi de alícuota de sobrenadante de cada pozo y se determina la radioactividad en un contador gamma automático Micromedic. El porcentaje de lisis específica se determina por la fórmula: porcentaje de liberación específico = 100 x (liberación experimental - liberación espontánea) / (liberación máxima -liberación espontánea) . Para facilitar la comparación entre ensayos CTL separados corridos bajo las mismas condiciones, se expresan los datos de liberación de %51Cr como unidades líticas/células 106. Una unidad lítica se define arbitrariamente como el número de células efectoras requeridas para realizar el 30% de lisis de 10,000 células objetivo en un ensayo de liberación de 51Cr de 6 horas. Para obtener unidades líticas específicas/106, las unidades líticas/106 obtenidas en ausencia de péptido se substraen de las unidades líticas/106 obtenidas en presencia del péptido.

Por ejemplo, si el 30% de liberación 1Cr se obtiene como el efector (E) : la relación objetivo (T) de 50:1 (esto es, 5 x 105 células efectoras para 10,000 objetivos) en ausencia del péptido y 5:1 (esto es, 5 x 104 células efectoras para 10,000 objetivos) en presencia del péptido, las unidades iíticas especificas serán [ (1/50 , 000) - (1/500, 000) ] x 10e = 18LU. Los resultados se analizan para evaluar la magnitud de las respuestas CTL de animales inyectados con la preparación de vacuna conjugada CTL/HTL inmunogénica y se comparan con la magnitud de respuesta CTL alcanzada usando el epítope CTL como se resume en el Ejemplo 3. Pueden realizarse análisis similares a este para evaluar la inmunogenicidad de conjugados péptidos que contienen epítopes CTL múltiples y/o epítopes HTL múltiples. De conformidad con estos procedimientos, se ha encontrado que las respuestas CTL se inducen, y concomitantemente que se induce una respuesta HTL durante la administración de tales composiciones .

Ejemplo 10. Selección de epítopes CTL y HTL para inclusión en una vacuna específica de VHB. Este ejemplo ilustra el procedimiento para la selección de epítopes de péptido para composiciones de vacuna de la invención. Los péptidos en la composición pueden estar en la forma de secuencias de ácido nucleico, ya sea sencillas o una o más secuencias (esto es, minigen) que codifican péptido9, o pueden ser péptidos sencillos y/o poliepitópicos . Los siguientes principios se utilizan cuando se selecciona un conjunto de epítopes para la inclusión en una composición de vacunas. Cada uno de los siguientes principios se balancean con objeto de hacer la selección. Los epítopes se seleccionan de manera que, durante la administración, se observen respuestas inmunes imitadas para correlacionarse con la liberación de VHB . El número de epítopes usados depende de las observaciones de pacientes que espontáneamente liberan VHB. Por ejemplo, si se observa que los pacientes que espontáneamente liberan VHB generan una respuesta inmune para al menos 3 epítopes en al menos un antígeno HPB, entonces deberán incluirse 3-4 epítopes para la HLA de clase I . Se usa una racionalidad similar para determinar epítopes de HLA de clase II. Los epítopes se seleccionan frecuentemente para que tengan una afinidad de enlace de un IC50 de 500 nM o menos para una molécula de HLA de clase I, o para la clase II, un ICS0 de 1000 nM o menos. Se seleccionan péptidos que portan la superporción suficiente, o un conjunto suficiente de péptidos que portan la porción específica de alelo, para dar una amplia cobertura de población. Por ejemplo, los epítopes se seleccionan para proporcionar al menos un 80% de cobertura de población. Un análisis Monte Cario, una evaluación estadística conocida en el arte, puede emplearse para evaluar la extensión, o redundancia, de la cobertura de la población. Cuando se crea una composición poliepitópica , por ejemplo un mini gen, es deseable típicamente generar el péptido mas pequeño posible que abarca loa epitopes de interés. Los principios empleados son similares, si no los mismos, como aquellos empleados cuando se selecciona un péptido que comprende epitopes agrupados. En casos en donde las secuencias de variantes múltiples de la misma proteína objetivo están disponibles, los epitopes de péptido potenciales también pueden seleccionarse en base a su conservación. Por ejemplo, un criterio para conservación puede definirse en que la secuencia completa de péptido ligado de HLA de clase I o el núcleo 9-mero completo del péptido de ligado de clase II puede conservarse en un porcentaje designado de secuencia evaluado para un antígeno de proteína específico. Los epitopes para la inclusión en composiciones de vacunas son, por ejemplo, seleccionados de aquellos enlistados en la Tabla XXXVIIa y b. Una composición de vacuna comprende péptidos seleccionados, cuando se administran, si es seguro, eficaz, y permite una respuesta inmune similares magnitud de una respuesta inmune que libre una infección VHB aguda.

Ejemplo 11: Construcción de plásmidos de ADN de epítope múltiple Minigen. Este ejemplo proporciona una guía para la construcción de un plásmido para de expresión de Minigen. Los plásmidos de minigen pueden, por su puesto, contener varias configuraciones de epítopes CTL y/o HTL o análogos de epítope como se describe en la presente. Los ejemplos de la construcción y evaluación de plásmidos de expresión se describen, por ejemplo, en la co-pendiente U.S.S.N. 09/311,784 presentada el 13/5/99. Un ejemplo de tal plásmido se muestra en la figura 2, el cual ilustra la orientación de los epítopes de VHB en constructos de minigen. Tal plásmido puede, por ejemplo, también incluir múltiples epítopes de péptido CTL y HTL. Un plásmido de expresión de minigen incluye típicamente epítopes de péptido CTL y HTL múltiples. En el presente caso, los epítopes de péptido que portan la superporcion HLA-A2 , -A3 , -B7 y los epítopes de péptido que portan la porción HLA-Al y A24, se usan en conjunto con los epítopes que portan la superporcion DR y/o el epítope DR3 (figura 2). Los epítopes preferidos se identifican, por ejemplo, en las Tablas XXVI-XXXIII, los epítopes de péptido que portan la porción o superporcion de HLA de clase I derivados de antígeno VHB múltiples, por ejemplo, el núcleo, polimerasa, cobertura y proteínas X, se seleccionan de tal manera que la superporción / porciones múltiples se representan para asegurar la amplia cobertura de población. Simil rmente , los epítopes de HLA de clase II se seleccionan de antígenos VHB múltiples para proporcionar una amplia cobertura de población, esto es, los epítopes que portan la superporción HLA DR-l—4-7 y los epítopes que portan la porción HLA DR-3 se seleccionan para la inclusión en el constructo de minigen. Los epítopes CTL y HTL seleccionados se incorporan luego en un minigen para la expresión en un vector de expresión. Este ejemplo ilustra los métodos para usarse para la construcción de tal plásmido de expresión que porta el minigen. Otros vectores de expresión que pueden usarse para las composiciones de minigen están disponibles y se conocen por aquellos expertos en la técnica. El plásmido de ADN de minigen contiene una secuencia Kozak de consenso y una secuencia de señal de cadena Ig-ligera kappa de murino de consenso seguido por una hilera de epítopes CTL y/o HTL seleccionada de conformidad con los principios descritos aquí . Los oligonucleótidos traslapados, por ejemplo, ocho oligonucleótidos , promediando aproximadamente 70 nucleótidos en longitud con 15 nucleótidos traslapados, se sintetizan y se purifican por CLAR. Los oligonucleótidos codifican los epítopes de péptidos seleccionados así como nucleótidos de enlace apropiados. El minigen multiepítope final se ensambla al extender los nucleotidos traslapados en tres conjuntos de reacciones usando PCR. Se usa una máquina Perkin/Elmer 9600 PCR y un total de 30 cicloa se realizan usando las siguientes condiciones: 95°C durante 15 segundos, temperatura de recocido (5 o debajo del Tm más bajo calculado de cada par cebador) durante 30 segundos, y 72 °C durante 1 minuto. Para la primera reacción PCR, se combinan los pares base de 5 µg de cada uno de los dos oligonucleó idos y se extienden: los oligonucleótidos 1+2, 3+4, 5+6, y 7+8 se combinan en reacciones de 100 µ? que contienen solución amortiguadora de polimerasa Pfu (lx=10mM KCL, 10 mM (N¾)2S0,., 20 mM tris-cloruro, pH 8.75, 2 mM MgS04 , 0.1% tritón X-100100 µg/ml BSA) , 0.25 mM de cada uno de dNTP , y 2.5 de polimerasa Pfu. Los productos del dímero de longitud completa se purifican en gel, y dos reacciones que contienen en el producto de l + 2 y 3 + 4, y el producto de 5 + 6 y 7 + 8 se mezclan, recosen, y se extienden durante 10 ciclos. La mitad de las dos reacciones se mezclan luego y se llevan a cabo 5 ciclos de recocido y extensión antes de que se agreguen los cebadores de franqueo para amplificar el producto de longitud completado durante 25 ciclos adicionales. El producto de longitud completa se purifica por gel y se clona en pCR-blunt (Invitrogen) y los clones individuales se separan por exclusión para secuenciado.

Ejemplo 12. El constructo de plásmido y el grado al cual se induce la inmunogenicidad. El grado al cual el constructo de plásmido, por ejemplo, un plásmido construido de conformidad con el Ejemplo 11, es capaz de inducir la inmunogenicidad, puede evaluarse in vitro probando la presentación de epítope por APC seguido por la transducción o transfección del APC con un constructo de ácido nucleico que expresa el epítope. Tal estudio determina la "antigenicidad" y permite el uso de APC humano. El ensayo determina la capacidad del epítope para presentarse como el APC en un contexto que se reconoce por una célula T para cuantificar la densidad de complejos epítope-HLA de clase I en la superficie celular. La cuantif icación puede realizarse midiendo directamente la cantidad de péptido incluido del APC (ver, por ejemplo, Sijts et al., J. I munol . 156:683-592, Demotz et al., Nature 342:682-684, 1989); o el número de complejos péptido-HLA de clase I puede estimarse al medir la cantidad de lisis o liberación de linfocina inducida para infectar o transfectar células objetivo, y luego se determina la concentración de péptido necesaria para obtener niveles equivalente de lisis o liberación de linfocina (ver, por ejemplo Kageyama et al., J. Immunol. 154:567-576, 1995) . Alternativamente, la inmunogenicidad puede evaluarse a través de inyecciones in vivo en ratones y posteriormente evaluación in vitro de actividad CTL y HTL, que se analizan copiando ensayos de citotoxicidad y proliferación, respectivamente, como se detalla, por ejemplo, en la co-pendiente U.S.S.N. 09/311,784 presentada el 13/5/99 y Alexander et al., Immunity 1:751-761, 1994. Por ejemplo, para evaluar la capacidad de un constructo de minigen de ADN (por ejemplo, un constructo de minigen U.S.S.N. 09/311,784 generado como se describe) que contiene al menos un péptido de la superporción HLA-A2 para inducir CTL in vivo, ratones transgénicos HA-A2.1/K, por ejemplo, se inmunizan intramuscularmente con ???µ? de ADNc desnudo. Con un medio para comparar el nivel de los CTL inducidos por la inmunización de ADNc, un grupo de control de animales también se inmuniza con una composición de péptido actual que comprende epítopes múltiples sintetizados con un polipéptido sencillo los cuales se codifican por el minigen. Se estimulan esplenocitos de animales inmunizados dos veces cada una con las composiciones respectivas (epítopes de péptidos codificados en el minigen o el péptido poliepitópico) , se evalúan luego para actividad citotóxica específica de péptido en un ensayo de liberación de 51Cr. Los resultados indican la magnitud de la respuesta CTL dirigida contra el epítope de restricción A2 , indicando de esta manera la inmunogenicidad in vivo de la vacuna de minigen y la vacuna poliepitópic . Por lo tanto, se ha encontrado que el minigen saca respuestas inmunes dirigidas a los epítopes de péptido de superporción HLA-A2 como no lo hace la vacuna de péptido poliepitópica. También se realiza un análisis similar usando otros modelos de ratón transgénico HLA-A3 y HLA-B7 para evaluar la inducción de CTL por los epítopes de porción o superporción HLA-A3 y HLA-B7. Para evaluar la capacidad del epítope de clase II que codifica el minigen para inducir HTLs in vivo, ratones transgénicos DR, o para aquellos epítopes que tienen reacción cruzada con la molécula MHC de ratón apropiado, ratones restringidos I-Ab, por ejemplo, se inmunizan intramuscularmente con ???µ? del ADN plásmido. Como medio para comparar el nivel de las HTLs inducidas por la inmunización de ADN, un grupo de animales de control también se inmuniza con una composición de péptido actual emulsificada con adyuvante Freund completo. Células CD4+T, esto es HTLs, se purifican de esplenocitos de animales inmunizados y se estimulan con cada una de las composiciones respectivas (péptidos codificados en el minigen) . La respuesta HTL se mide usando el ensayo de proliferación de incorporación de 3H-timidina (ver, por ejemplo, Alexander et al. Immunity 1:751-761, 1994) . Los resultados indican la magnitud de la respuesta HTL, demostrando de esta manera la inmmunogenicidad in vivo del minigen. Los minigenes de ADN, construidos como se describen en el Ejemplo 11, también pueden evaluarse como una vacuna en combinación con un agente de refuerzo usando un protocolo de aumento de cebado. El agente de aumento puede consistir de proteína recombinante (por ejemplo, Barnett et al, Aids Res. And Human Retroviruses 14, Supplement 3:S299-S309, 1998) o vacuna recombinante, por ejemplo, que expresa un minigen ADN codificando la proteína completa de interés (ver, por ejemplo, Hanke et al., Vaccine 16:439-445, 1998; Sedegah et al., Proc. Nati. Acad Sci USA 95:7648-53, 1998; Hanke and Me Michael, Immunol . Letters 66:177-181, 1999; and Robinson et al., Nature Med. 5:526-34, 1999). Por ejemplo, la eficacia del minigen de ADN usado en un protocolo de aumento cebado se evalúa inicialmente en ratones transgénicos . En este ejemplo, se inmunizan ratones transgénicos A2.l/kb 1M con ???µ? de un minigen de ADN que codifica los péptidos inmunogénicos incluyendo al menos un péptido que porta la superporción HLA-A2. Después de un periodo de incubación (en el rango desde 3-9 semanas), los ratones se les aumenta IP con 107 pfu /ratón de un virus de vacuna recombinante que expresa la misma secuencia codificada por el minigen de ADN. Los ratones de control se inmunizan con 100 µ? de ADN o vacuna recombinante sin la secuencia de minigen, o con ADN que codifica el minigen, pero sin el aumento de vacuna. Después de un periodo de incubación adicional de dos semanas, se evalúan inmediatamente los esplenocitos de los ratones para actividad específica de péptido en un ensayo ELIPSOT. Adicionalmente , los espleniecitos se estimulan in vitro con los epítopes de péptido restringido A2 codificado en el minigen y la vacuna recombinante , después se evalúa para actividades específicas de péptido en un IFN-? ELISA. Se ha encontrado que el minigen utilizado en un protocolo de refuerzo del cebado elige respuestas inmunes mayores hacia los péptidos de superporción HLA-A2 que solo con el ADN. Tal análisis también puede realizarse usando modelos de ratones transgénicos HLA-B7 o HLA-A11 para evaluar la inducción del CTL por epítopes de porción o superporción HLA-A3 o HLA-B7. El uso de los protocolos de refuerzo del cebado en humanos se describe en el Ejemplo 20.

Ejemplo 13: Composición de Péptido para Usos Profilácticos . Las composiciones de vacuna de la presente invención pueden usarse para prevenir la infección por HJBV en personas que están en riesgo de tal infección. Por ejemplo, una composición epítope de péptido poliepitópico (o un ácido nucleico que comprende el mismo) contiene múltiples epítopes CTL y HTL tales como aquellos seleccionados en los Ejemplos 9 y/o 10, que también se seleccionan para dirigir más del 80% de la población, se administra a individuos en riesgo de una infección por VHB .

Por ejemplo, una composición basada en péptido puede proporcionarse como un polipéptido sencillo que abarca epítopes múltiples. La vacuna se administra típicamente en una solución fisiológica que comprende un adyuvante, tal como Adyuvante de Freund Incompleto. La dosis del péptido para la inmunización inicial es desde alrededor de 1 hasta alrededor de 50,000 µ9, generalmente 100-5,000 µg, para un paciente de 70 kg . La administración inicial de la vacuna se sigue por dosis elevadas a 4 semanas seguido por la evaluación de la magnitud de la respuesta inmune en el paciente, por técnicas que determinan la presencia de poblaciones CTL de epítope específico en una muestra de PBMC . Se administran dosis elevadas adicionales como se requiera. La composición se encuentra que es tanto segura como eficaz como una profilaxis contra la infección por VHB . Alternativamente, la composición comprende típicamente agentes transfectantes que pueden usarse para la administración de una vacuna basada en ácido nucleico con metodologías conocidas en la técnica y descritas aquí .

Ejemplo 14: Composiciones de Vacuna Poliepitópica Derivada de Secuencias de VHB Nativas . Se separa por exclusión una secuencia de poliproteína VHB nativa, preferiblemente usando algoritmos de computadora definidos para cada porción o superporción de clase I y/o clase II, para identificar las regiones "relativamente cortas" de la poliproteína que comprende epítopes múltiples y preferiblemente es menor en longitud que un antígeno nativo entero. Esta secuencia relativamente corta que contiene múltiples epítopes distintos, aún traslapada, se selecciona y se usa para generar un constructo de minigen. El constructo se produce por ingeniería genética para expresar el péptido, que corresponde a la secuencia de proteína nativa. El péptido "relativamente corto" generalmente es de menos de 250 aminoácidos de longitud, frecuentemente menos de 100 aminoácidos de longitud, preferiblemente menos de 75 aminoácidos en longitud, y más preferiblemente menos de 50 aminoácidos en longitud. La secuencia de proteína de la composición de vacuna se selecciona debido a que tiene un número máximo de epítopes contenidos dentro de la secuencia, esto es, tiene una alta concentración de epítopes. Como se nota en la presente, las porciones de epítope pueden ser agrupadas o traslapadas (esto es, cambiadas en estructura con relación una a la otra) . Por ejemplo, con epítopes traslapados f, dos epítopes 9-mero y un epítope 10-mero pueden presentarse en un péptido de 10 aminoácidos. Tal composición de vacuna se administra para propósitos terapéuticos y profilácticos. La composición de vacuna incluirá, por ejemplo, tres epítopes CTL de al menos un antígeno objetivo VHB y al menos un epítope HTL . Esta secuencia poliepitópica nativa se administra ya sea como un péptido o como una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido. Alternativamente, puede hacerse un análogo de esta secuencia nativa, por lo cual uno o más epítopes comprenden substituciones que alteran la reacción cruzada y/o las propiedades de afinidad de ligado del péptido pol iepitópico . La modalidad de este ejemplo se proporciona para la posibilidad de que un aspecto aún no descubierto del procesamiento del sistema inmune se aplique a la secuencia agrupada nativa y por ello se facilite la producción de composiciones de vacuna que inducen la respuesta inmune profiláctica. Adicionalmente , tal modalidad proporciona la posibilidad de epitopes que portan porciones para hacer HLA que actualmente se desconoce. Adicionalmente, esta modalidad (análogos ausentes) dirige la respuesta inmune para secuencias de péptido múltiples que se presentan actualmente en antígenos VHB nativos evitando de esta manera la necesidad de evaluar cualesquiera de los epítopes conjuntos. Por último, la modalidad proporciona una economía de escala cuando se producen composiciones de vacuna de ácido nucleico.

Con relación a esta modalidad, pueden derivarse programas de computadora de conformidad con los principios en la técnica, que identifican una secuencia objetivo, el número más grande de epítopes por longitud de secuencia.

Ejemplo 15. Composiciones de Vacuna Poliepitópica Dirigida a Enfermedades Múltiples . Los epítopes de péptido VHB de la presente invención se usan en conjunto con epítopes de péptido de antígenos objetivo relacionados a una o más de otras enfermedades, para crear una composición de vacuna que es útil para la prevención o tratamiento de VHB así como otras enfermedades. Los ejemplos de otras enfermedades incluyen, pero no se limitan a, VIH, HCV, y HPV. Por ejemplo, una composición de péptido poliepitópica comprende CTL múltiple y epítopes HTL que puede crear un objetivo de más del 98% de la población para la administración a individuos en riesgo de infección tanto por VHB y VIH. La composición puede proporcionarse como un polipéptido sencillo que incorpora los epítopes múltiples de las fuentes asociadas a diversas enfermedades, o pueden administrar como una composición que comprende uno o más epítopes discretos .

Ejemplo 16. Uso de péptidos para evaluar respuestas inmunes .

Los péptidos de la invención pueden usarse para analizar una respuesta inmune para la presencia de poblaciones de CTL o HTL específicas dirigidas al VHB. Tal análisis puede realizarse de manera como se describe por Ogg et al., Science 279:2103-210, 1998. En el siguiente ejemplo, los péptidos de conformidad con la invención se usan como un reactivo para propósitos de diagnóstico o prognosis, no como un inmunógeno . En este ejemplo, se usan complejos tetraméricos de antígenos de leucocitos humanos sensibles ("tetrámeros") para un análisis transversal de, por ejemplo, frecuencias CTL específicas de VHB HLA-A*0201 a partir de individuos positivos de HLA A*020l en diferentes etapas de infección o después de la inmunización usando un péptido de VHB que contiene una porción A*0201. Los complejos tetraméricos se sintetizan como se describe (Musey et al., N. Engl . J. Med. 337:1267, 1997). Brevemente, la cadena pesada de HLA purificada (A*0201 en este ejemplo) y microglobulina ß2 se sintetizan por medio de un sistema de expresión procariotico. La cadena pesada se modifica quitando la extremidad citosólica de transmembrana y la adición de la terminal COOH de una secuencia que contiene un sitio de biotinilación enzimático BirA. La cadena pesada, microglobulina ß2 , y el péptido, se vuelven a doblar por dilución. El producto redoblado 45-kD se aisla por cromatografía líquida de proteína rápida y luego se biotinila por BirA en presencia de biotina (Sigma, St. Louis, Missouri), 5'trifosfato de adenosina y magnesio. El conjugado de estreptavidina-ficoeritrina se agrega en una r elación molar de 1:4, y el producto tetramerico se concentra hasta 1 mg/ml . El producto resultante se refiere como tetrámero-ficoeritrina . Para el análisis de muestras sanguíneas de pacientes, se centrifugan aproximadamente un millón de PBMC9 a 300g durante 5 minutos y se vuelven a suspender en 50 µ? de solución salina amortiguada en fosfato fría. Se realiza el análisis tricolor con el tetrámero-ficoeritrina, junto con anti-CD8-tricolor, y anti-CD38. Los PBMC se incuban con tetrámero y anticuerpos en hielo durante 30 hasta 60 minutos y luego se lavan dos veces antes de la fijación en formaldehído . Se aplican Gates para contener 99.98% de muestras de control. Los controles para los tetrámeros incluyen individuos tanto A*0201 negativos como donadores no infectados A*0201 positivos. El porcentaje de células teñidas con el tetrámero se determina luego por citometría de flujo. Los resultados indican que el número de células en la muestra de PBMC que contienen CTL restringidos de epítope, por ello indicando fácilmente la extensión de respuestas inmunes al epítope VHB, y de esta manera la etapa de infección con VHB, el estado de exposición al VHB, o la exposición a la vacuna que saca una respuesta protectora o terapéutica.

Ejemplo 17; Uso de Epítopes de Péptido para Evaluar Respuestas de Retorno. Los epítopes de péptido de la invención se usan como reactivos para evaluar las respuestas de células T, tal como respuestas agudas o de retorno, en pacientes. Tal análisis puede realizarse en pacientes que se han recuperado de la infección, que están crónicamente infectados con VHB , o que se han vacunado con una vacuna para VHB. Por ejemplo, la clase I que restringe respuestas de CTL de personas que se han vacunado puede analizarse. La vacuna puede ser cualquier vacuna de VHB. Las PB C se colectan de individuos vacunados y del tipo HLA. Los epítopes de péptido apropiados de la invención que, óptimamente, portan superporciones para proporcionar una reacción cruzada con miembros de la familia del supertipo HLA múltiples, se usan luego para el análisis de muestras derivadas de individuos que portan el tipo HLA. Los PBMC de individuos vacunados se separan en gradientes de densidad Ficoll -Histopaco (Sigma Chemical Co . , St . Louis, MO) , se lavan tres veces en HBSS (GIBCO Laboratories) , se vuelve a suspender en RPMI-1640 (GIBCO Laboratories) complementado con L-glutamina (2mM) , penicilina (50U/ml) , estreptomicina (50µ9/p?\) , y Hepes (lOmM) que contiene suero AB humano inactivado por calor al 10% (RPMI completo) y se colocan usando formatos de microcultivo . Un péptido sintético que comprende el epítope de la invención se agrega a 10 g/ml a cada pozo y se agrega el epítope de núcleo 128-140 VHB a 1 µg/ml a cada pozo como una fuente de célula T auxiliar durante la primera semana de estimulación.

En el formato de microcultivo, se estimulan 4 x 105 PBMC con el péptido en 8 cultivos de replicado en una placa de fondo redondo de 96 pozos en ???µ?/???? de RPMI completo. Al día 3 y 10, se agregan 100 mi de RPMI completo y 20 U/ml concentración final de rIL-2 a cada pozo. Al día 7 los cultivos se transfieren en una placa de fondo plano de 96 pozos y se vuelven a estimular con el péptido, rIL-2 y 105 células alimentadoras autólogas irradiadas (3,000 rad) . Los cultivos se prueban para actividad citotóxica el día 14. una respuesta positiva CTL requiere dos, o más de los ocho cultivos de replicación para exhibir una liberación mayor al 10% de 51Cr específica, con base en la comparación con sujetos de control no infectados como se describe previamente (Rehermann, et al., Nature Med. 2:1101, 1108, 1996; Rehermann et al., J. Clin, Invest. 97:1655-1665, 1996; y Rehermann et al. J. Clin Invest. 98:1432-1440, 1996) . Las líneas de células objetivo son B-LCL transformadas por EBV autólogas y alogénicas que se adquieren ya sea de la American Society for Histocompatibility and Immunogenetics (ASHI , Boston, MA) o se estabilizan del conjunto de pacientes como se describe (Guilhot, et al., J. Virol. 66:2670-2678, 1992) . Los ensayos de citotoxicidad se realizan de la siguiente manera. Células objetivo que consisten de línea de célula linfoblastoide B transformada en EBV autóloga o marcada con HLA alogénica que se incuban durante la noche con epítope de péptido sintético de la invención a 10 µ?, y se etiquetan con 100 µ?? de 51Cr (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) durante 1 hora después de lo cual se lava cuatro veces con HBSS. La actividad citotóxica se determina en un ensayo de liberación de 1Cr de pozo partido, de 4 horas estándar, usando placas de 96 pozos de fondo en U que contiene 3,000 objetivos/pozo. Las PBMC estimuladas se prueban a relaciones de efector/objetivo (E/T) de 20-50:1 el día 14. El porcentaje de citotoxicidad se determina de la fórmula: 100 [ (liberación experimental-liberación espontánea) /liberación máxima-liberación espontánea) ] . La liberación máxima se determina por la lisia de los objetivos por detergente (Tritón X-100 al 2%; Sigma Chemical Co., St . Louis, MO) . La liberación espontánea es <25% de la liberación máxima para todos los experimentos . Los resultados de tal análisis indican el grado hasta el cual las poblaciones de CTL restringidas con HLA se han estimulado por la exposición previa de VHB o una vacuna de VHB . También se analizan las respuestas de HTL restringidas de clase II . Las PBMC purificadas se cultivan en una placa de fondo plano de 96 pozos a una densidad de 1.5xl05 células/pozo y se estimulan con 10 [íg/ml de péptido sintético, antígeno completo, o PHA. Las células se colocan rutinariamente en replicados de 4-6 pozos para cada condición. Después de siete días de cultivo, el medio se remueve y se coloca con medio fresco que contiene 10U/ml de IL-2. Dos días después, se agrega 1 µ?? de 3H-timidina a cada pozo y la incubación continúa durante 18 horas adicionales. El AEN celular se cosecha en tapetes de fibra de vidrio y se analizan para incorporación de 3H-timidina. Se calcula la proliferación de células T específicas de antígeno como la relación de incorporación de 3H-timídina en presencia de antígeno dividido por la incorporación de 3H-timidina en ausencia de antígeno.

Ejemplo 18. Inducción de Respuesta CTL Especifica en Humanos. Un ensayo clínico humano para una composición inmunogénica que comprende epítopes CTL y HTL VHB de la invención se colocan como una Fase I IND, estudio de escala de dosis (5, 50 y 500 g) y se llevó a cabo como un ensato controlado por placebo, de doble ciego, aleatorio. Tal ensayo se diseña, por ejemplo, como sigue: Un total de 27 sujetos se enrollan y dividen en 3 grupos : Grupo I: 3 sujetos se inyectan con placebo y 6 sujetos se inyectan con 5 µg de composición de péptido; Grupo II: 3 sujetos se inyectan con placebo y 6 sujetos se inyectan con 50 µ de composición de péptido; Grupo III: 3 sujetos se inyectan con placebo y 6 sujetos se inyectan con 500 µ¾ de composición de péptido. Después de 4 semanas de la primera inyección, todos los sujetos reciben una inoculación elevada a la misma dosis. Las mediciones de los puntos finales en este estudio se refieren a la seguridad y tolerabilidad de la composición de péptido así como su inmunogenicidad . Las respuestas inmunes a la composición de péptido son un índice intrínseco de esta composición de péptido, y puede, por lo tanto, apreciarse como una medida de la eficacia biológica. Lo siguiente resume los datos clínicos y de laboratorio que se refieren a los puntos finales de seguridad y eficacia. Seguridad: La incidencia de eventos adversos se observa en el grupo de tratamiento con placebo y fármaco y se evalúa en términos de grado y convertibilidad. Evaluación de la Eficacia de la Vacuna: Para la evaluación de la eficacia de la vacuna, los sujetos se sangran antes y después de la inyección. Se aislan células mononucleares sanguíneas periféricas de sangre heparinizada fresca por centrifugación de gradiente de densidad Ficoll-Hypaque, se colocan en alícuotas en un medio de congelación y se almacenan en congelado. Las muestras se analizan para actividad CTL y HTL . De esta manera, la vacuna se encuentra que es tanto segura como eficaz.

Ejemplo 19. Ensayos de Fase II en Pacientes Infectados con VHB . Se realizan ensayos de Fase II para estudiar el efecto de la administración de las composiciones de péptido CTL-HTL a pacientes (hombres y mujeres) que tienen una infección por VHB crónica. Un objetivo principal de los ensayos es determinar una dosis y régimen efectivo para inducir las CTL en pacientes infectados crónicamente con VHB, para establecer la seguridad de inducir la respuesta CTL en paciente, y para observar que la activación extendida de las CTL mejora el cuadro clínico de pacientes CTL infectados crónicamente, como se manifiesta por una abertura transitoria en la alanina aminotransferasa (ALT) , normalización de ALT, y reducción en ADN VHB. Tal estudio se diseña, por ejemplo, como sigue: Los estudios se realizaron en centros múltiples en los E.U.A. y Canadá. El diseño del ensayo es un protocolo de escala de dosis, no controlado, de etiqueta abierta, en donde la composición de péptido se administra como una dosis sencilla seguido seis semanas más tarde por una inyección de refuerzo sencilla de la misma dosis. Las dosis son 50, 500 y 5,000 microgramos por inyección. Se registran los efectos adversos asociados con el f rmaco. Son tres agrupaciones de pacientes. El primer grupo se inyecta con 50 microgramos de la composición de péptido y el segundo y tercer grupos con 500 y 5,000 microgramos de la composición de péptido, respectivamente. Los pacientes dentro de cada grupo están en un rango de edad desde 21-65 e incluye tanto hombres como mujeres. Los pacientes representan diversas estructuras étnicas. Todos están infectados con VHB durante cinco años y son negativos al VIH, HCV y HDV, pero tienen niveles positivos de antígeno HBe y antígeno HBs . La magnitud e incidencia de la apertura de ALT y los niveles de ADN VHB en la sangre se observan para evaluar los efectos de administrar las composiciones de péptido. Los niveles de ADN VHB en la sangre son una indicación indirecta del progreso del tratamiento. La composición de vacuna se encuentra que es tanto segura como eficaz en el tratamiento de una infección por VHB crónica.

Ejemplo 20. Inducción de Respuestas CTL Usando un Protocolo de Refuerzo de Cebador. Un protocolo de refuerzo de cebador también puede usarse para la administración de la vacuna a humanos. Tal régimen de vacuna puede incluir una administración inicial de, por ejemplo, ADN desnudo seguido por un aumento usando el virus recombinante que codifica la vacuna, o la proteína/polipéptido recombinante o una mezcla de péptido administra en un adyuvante.

Por ejemplo, la inmunización inicial puede realizarse usando un vector de expresión, tal como el construido en el Ejemplo 11, en la forma de ácido nucleico desnudo administrado I (o SC o ID) en las cantidades de 0.5-5 mg a sitios múltiples. El ácido nucleico (0.1 hasta 1000 µg) puede también administrarse usando una pistola de genes. Después de un periodo de incubación de 3-4 semanas, se administra luego una dosis aumentada. El aumento puede ser virus de viruela de aves de corral recombinante a una dosis de 5-107 hasta 5xl09 pfu. Un virus recombinante alternativo, tal como un M A, viruela del canario, adenovirus, o virus asociado con adeno, también puede usarse para el aumento, o la proteína poliepitópica o una mezcla de los péptidos puede administrarse. Para la evaluación de la eficacia de la vacuna, muestras sanguíneas del paciente se obtendrán antes de la inmunización así como a intervalos después de la administración de la vacuna inicial y dosis aumentadas de la vacuna. Se aislan células mononucleares sanguíneas periféricas de sangre heparinizada fresca por centrifugación de gradiente de densidad Ficoll -Hypaque , con alícuotas en un medio de congelado y almacenada congelada. Las muestras se analizan para la actividad CTL y HTL. Los resultados indican que la magnitud de la respuesta suficiente para realizar la inmunidad protectora contra VHB o para tratar la infección por VHB se genera.

Ejemplo 21. Administración de Composiciones de Vacuna Usando Células Dendríticas (DC) . Las vacunas que comprende epítopes de péptido de la invención pueden administrarse usando APCs, tales como DC. En este ejemplo, las DC pulsadas por péptido se administran a una paciente para estimular una respuesta CTL in vivo. En este método, las células dendríticas se aislan, expanden, y pulsan con una vacuna que comprende epítopes CTL y HTL de péptido de la invención. Las células dendríticas se infunden nuevamente en el paciente para obtener respuestas CTL y HTL in vivo. Las CTL y HTL inducidas destruyen luego o facilitan la destrucción de las células objetivo específicas que portan las proteínas de las cuales se derivan los epítopes en la vacuna. Por ejemplo, un cóctel de péptidos que portan el epítope se administra ex vivo para PBMC, o DC aisladas del mismo. Puede usarse un farmacéutico para facilitar la cosecha de DC, tal como Progenipoietin® (Monsanto, St . Lous, MO) o GM-CSF/IL-4. Después de pulsar las DC con péptidos y antes de la reinfusión en pacientes, las DC se lavan para remover los péptidos no ligados. Como se aprecia clínicamente, y se determina fácilmente por alguien de experiencia con base en los resultados clínicos, el número de DC reinfusionadas en el paciente puede variar (ver, por ejemplo, Nature ed. 4:328, 1998; Nature Med. 2:52, 1996 y Prostate 32:272, 1997) . No obstante que se administran típicamente 2-50 x 106 DC por paciente, también puede proporcionarse un número más grande de DC, tal como 107 ó 10ß. Tales poblaciones de célula contienen típicamente entre 50-90% DC. En algunas modalidades, los PBMC cargados de péptido se inyectan en pacientes sin purificación del DC. Por ejemplo, los PBMC que contienen DC generados después del tratamiento con un agente tal como Progenipoietin® se inyectan en pacientes sin purificación de las DC . El número total de PBMC que se administran f ecuentemente está en rangos desde 10a hasta 1010. Generalmente, las dosis inyectadas e células en pacientes se basan en el porcentaje de DC en la sangre en cada paciente, como se determina, por ejemplo, por análisis de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-DC específicos. De esta manera, por ejemplo, si la Progenipoietin® moviliza el 2% de las DC en la sangre periférica de un paciente dado, y tal paciente recibe 5 x 106 DC, entonces al paciente se le inyectará un total de 2.5 x 108 PBMC cargados con péptido. El porcentaje de DC movilizado por un agente como Progenipoietin® se estima típicamente para ser de entre 2-10%, pero puede variar como se aprecia por alguien de experiencia en la técnica.

Activación ex vivo de respuestas CTL/HTL . Alternativamente, las respuestas CTL o HTL ex vivo para antígenos HPV pueden inducirse al incubar en cultivo de tejido células precursoras CTL o HTL del paciente, o genéticamente compatibles, junto con una fuente de APC, tal como DC, y los péptidos inmunogénicos apropiados. Después de un tiempo de incubación apropiado (típicamente alrededor de 7-28 días) , en el cual las células precursoras se activan y expanden en células efectoras, las células se infunden de nuevo en el paciente, estas destruirán (CTL) o facilitarán la destrucción (HTL) de sus células objetivo específicas.

Ejemplo 22. Método Alternativo para Identificar Péptidos que Portan Porciones . Otro método para identificar péptidos que portan porciones es la elución de las células que portan moléculas MHC definidas. Por ejemplo, las líneas de célula B transformadas con EBV usadas para marcar el tejido se han caracterizado extensivamente para determinar las moléculas HLA que las expresan. En ciertos casos estas células sólo expresan un tipo sencillo de molécula de HLA. Estas células pueden infectarse con un organismo patogénico o transfectarse con ácidos nucleicos que expresan el antígeno de interés, por ejemplo, proteínas del VHB . Los péptidos producidos por procesamiento de antígeno endógeno de péptidos producidos en consecuencia a la infección (o como resultado de la transfección) se ligan entonces a las moléculas HLA dentro de la célula y se transportan y exhiben en la superficie celular. Los péptidos se eluyen entonces de las moléculas HLA por exposición a condiciones acidas suaves y se determina su secuencia de aminoácido, por ejemplo, por análisis espectral de masa (por ejemplo, Kubo et al., J. Immunol . 152:3913, 1994) . Debido a que la mayoría de los péptidos que se ligan a una molécula HLA particular son portadores de porción, es una modalidad alternativa para obtener los péptidos que portan porción correlacionados con la molécula HLA particular expresada en la célula. Alternativamente, las líneas de célula que no expresan las moléculas HLA endógenas pueden transíectarse con un constructo de expresión que codifica un alelo sencillo. Estas células pueden entonces usarse como se describe, esto es, pueden infectarse con un patógeno o transfectarse con un ácido nucleico que codifica un antígeno de interés para aislar péptidos que corresponden al patógeno o antígeno de interés que se presentan en la superficie celular. Los péptidos obtenidos de tal análisis portarán porciones que corresponden al ligado al alelo HLA sencillo que se expresa en la célula. Como se apreciará por alguien en la técnica, puede realizarse un análisis similar en una célula que porta más de un alelo HLA y posteriormente determinar los péptidos específicos para cada alelo expresado. Por otro lado, alguien de experiencia también reconocería que medios diferentes a la infección o transíección, tales como carga con antígeno de proteína, pueden usarse para proporcionar una fuente de antígeno a la célula. Los ejemplos en la presente se proporcionan para ilustrar la invención, pero no para limitar su alcance. Otras variantes de la invención serán fácilmente aparentes para alguien de experiencia ordinaria en la técnica y se abarcan por las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes, y solicitudes de patentes citadas en la presente, se incorporan por ello por referencia para todos los propósitos .

TABLA I SUPERPORCIONES POSICION POSICION POSICIÓN 2 (Anclaje 3 (Anclaj e Terminal C Primario) Secundario) (Anclaj e Primario) Al T, I, L, V,M, S F,W, Y A2 L,I,V,M,A,T,0 I,V,M,A,T,L A3 V,S,M,A, T,L,I R,K A24 Y,F, W, I,V,L,M, T F#I, Y, W,L,M B7 P V,I,L,F,M, W, Y, A B27 R,H,K F,Y,L, W, ?,?,?,? B44 E,D F,W,L,I, ,V,A B58 A,T,S F,W, Y,L, I, V, M, A B26 Q,-L,I,V,M,P F,V¡,Y,M, I, V,L,A PORCIONES Al T, S,M Y Al D,E, A, S Y A2.1 L,M, V,Q,I,A,T V,L, ?,?,?, T A3 L,M, V, I, S, A,T, F , Y,R,H, F, A C, G,D All V,T ,?,??,?, S,A,G K,R, Y, H ,N, C,D,F A24 Y,F,W,M F,L,I,W A*3101 M,V,T, A,L, I,S R, K A*3301 M,V,A,L,F, I,£, T R, K A*6801 A.V,T,M,S,L,I R, K B*0702 P L , M, F, W, ?,?, I, V B*3501 P L,M,F,W,Y,I, V,A B51 P L,I,V,F, W, ?,?,? B*5301 P .H.Y,JR. .A,L, V B*5401 P ?,?,?,?^,?,?, W, Y Se prefieren los residuos en negritas, los residuos en cursiva son menos preferidos: Un péptido se considera que porta una porción si tiene anclajes primarios en cada posición de anclaje primaria para una porción o superporción como se especifica en la tabla anterior.

TABLA la SUPERPORCIONES POSICIÓN POSICIÓN POSICIÓN 2 (Anclaje 3 (Anclaj e Terminal C Primario) Primario) (Anclaj e Primario) Al T,I,L,V,M,S F,W, Y A2 V,Q,A,T I,V,L,M,A,T A3 V,S,M,A,T,L, I R, K A24 Y,F,W, I,V,L,M, F,I,Y, ,L,M T B7 P V,I,L,F,M,W,Y ,A B27 R, H, K F,Y,L,W,M, I,V ,A B58 A,T,S F,W,Y,L, I,V,M ,A B62 Q,L,I,V,M, P F,W,Y,M, I,V,L ,A PORCIONS Al T,S,M Y Al D,E,A, S, Y A2.1 V,Q,A,T* V,L,I,M,A,T A3.2 L,M,V,I,S,A,T, K, Y, R, H, F , A F,C,G,D All V,T,M,L,I,S,A, K, R, H, Y G,N, C,D,F A24 Y,F,W F,L,I,W * Si 2 es V, o Q, la terminal C no es L.

Se prefieren los residuos en negritas, los residuos en cursiva son menos preferidos: Un péptido se considera que porta una porción si tiene anclajes primarios en cada posición de anclaje primaria para una porción o superporción como se especifica en la tabla anterior TABLA II SUPERPORCION 1 2 3 4 5 6 7 8 Terminal C ES Al 1° 1° Anclaje Anclaje F,W,Y T,I,L,V,M ,s A2 1° 1° Anclaje Anclaje L,I,V,M,A, L,I,V,M,A T ,T,Q A3 preferido 1° Y,F,W( Y,F, Y-F, P, (4/ 1° Anclaje Ancla e (4/5) W, (3 W(4/ 5) R,K V,S, ,A,T /5) 5) Nocivo D,E, ,L,I D,E, (4 (3/5) ; /5) P, (5/5) A24 1° 1° Anclaje Anclaje F,I,Y, ,L, Y,F,W,I,V M ,L,M,T B7 preferido F,W,Y(5 1° F,W,Y( F,W,Y 1° Anclaje /5) Anclaje 4/5) , (3/5 V,I,L,F,M, L,I,V,M P ) ,Y,A (3/5) Nocivo D,E(3/5 D,E(3 G, (4 Q,N( ); /5) /5) 4/5) P(5/5) ; G(4/5) ; A(3/5) ,- G,N(3/5 D,E, ( ) 4/5) B27 1° 1° Anclaje Ancla e F,Y,L,W,M, R,H,K V,A B44 1° 1° Anclaje Anclaje F,W,Y,L,I, E,D M,V,A B58 1° 1° Anclaje Anclaje F,W,Y,L,I, A,T,S V,M,A B62 1° 1° Anclaje Anclaje F, ,Y, ,I, Q,L,IV,M, V,L,A P POSICIÓN PORCIONES 1 2 3 4 5 6 7 8 Terminal C Al preferido G,F,Y,W 1° D,E,A, Y, P, D,E, Y,F,W 1° Anclaje 9-raer Anclaje F, Q,N, Y S,T,M, W, Nocivo D,E, R,H,K, A, G, A, L,I,V, M,P, Al preferido G,R,H,K A,S,T,C,L 1° G, A,S, L,I, D,E, 1° Anclaje 9-mer ,I,V,M, Anclaj s, T(C, V,M, Y e T, D,E,A, c, S nocivo A R,H,K,D,E D, P,Q,N R,H, P,G, G,P ,P,Y,F,W, E, POSICIÓN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ó Terminal terminal C C Al preferido Y,F l°Anclaj D, E,A A, Y,F, P,A G,D P, 1"Anclaj 10-mer ,w, e ,Q,N ,Q,N, ,s, ,E e S,T,M T,C Y Nocivo G,P R,H,K D, R,H, Q, R,H R,H A ,G,L, E, r N, ,K, ,K, I,V,M A, Y,, F,W A3 preferido ,H 1°Ancla Y,F,W P, A, Y, P, 1°Anclaj , , e r R, F, e L,M,V,I, H, w, K,Y,R,H, S,A,T,F, K, F,A C,G,D Y, F, nocivo DEP DE W, All A, l°Anclaj Y,F, Y, A, Y, Y;F P, l°Anclaj preferido e FW F, w, e V,T,L,M, W K, ,RY,H I,S,A,G, N,C,D,F Nocivo D,E A G, ,P, A24 Y,F l°Anclaj s, Y,F Y,F l°Anclaj preferido ,w, e T, ,w ,w e 9-mer R,H Y,F, ,M c F,L,I,W ,K, Nocivo D,E D,E, G, Q,N,P D, G, A,Q ,G, E, ,N, R, H, K, A24 1°Anclaj P, Y,F,W P, 1°Anclaj preferido e ,P, e 10-mer Y,F,W,M F,L,I,W Nocivo G,D,E G, R,H, K D, A Q,N D, E,A Q E A3101 R,H l°Anclaj Y,F,W P, Y, Y,F A,P 1°Anclaj preferido ,K, e F, ,W e M,V,T,A, W R,K L,I,S Nocivo D,E D, E, A,D,E D, D,E D;E P, E, POSICIÓN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ó Terminal terminal C C A3301 l°Anclaj Y,F,W A, Y l°Anclaj preferido e ,F, e M,V,A,L, W R,K F,I,S,T nocivo G,P D,E A6801 Y,F 1°Anclaj Y,F,W Y, F P, 1°Anclaj preferido , , e ,L,I, ,w e S,T A,V,T,M; V,M R,K , c, S,L,I nocivo G,P D,E,G R,H,K A, B0702 R,H l°Anclaj R,H,K R,H,K R, R,H P,A 1°Ancl j preferido ,K, e H, , , e F, P K, L,M,F,W, ,Y, Y.A,I,V nocivo D,E D,E,P D, D,E, G, Q,N D,E ,Q, E, D, N,P E B3501 F,W 1"Ancl j F,W,Y F,W l°Anclaj preferido ,Y, e ,Y, e L,I P L,M,F,W, ,v, Y,I,V,A M, nocivo A,G G, G, ,P, POSICIÓN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ó Terminal terminal C C B51 L,I l°Anclaj F,W,Y s, F,W,Y G, F,W l°Anclaj preferido V,M e T, ,Y, e ,F, P c, L,I,V,F, W,Y W,Y,A,M nocivo A,G D,E, G, D,E G,D ,P, ,Q, ,E D, E N, ,R, H,K ,s, T,C B5301 L,I 1° Ancla j F,W,Y s. F,W,Y L,I F,W l°Anclaj preferido ,v, e T, ,v, ,Y e M,F P c; M, F I,M,F,W, , , Y,A,L,V Y, Y, nocivo A,G G, R,H D,E ,P, , , . Q,N Q,N y B5401 F,W 1 "Ancla F,W,Y L,1,V A,L F,W l°Anclaj preferido ,Y, e ,L,I, ,M, ,1, ,Y, e P V,M V,M A,P A,T,I,V, L,M,F,W, Y nocivo G,P G,D,E R,H,K D, Q,N D,E ,Q, ,S,T, ,?,?, E, ,D, N,D c. G,E ,E, Los residuos en cursiva indican residuos menos preferidos o "tolerados" . La información en la Tabla II es específica para 9-mers salvo que se especifique lo contrario. Las especificidades de anclaje secundario se designan para cada posición independientemente.

TABLA III Los residuos en cursiva indican residuos menos preferidos "tolerados" . Las especificidades de anclaje secundario s designan para cada posición independientemente.

Tabla IV. Afinidad de Ligado de Péptido Estándar HLA de Clase I ALELO PEPTIDO SECUENCIA AFINIDAD DE ESTANDAR LIGADO (nM) A*0101 944.02 YLEPAIAKY 25 A*0201 941.01 FLPSDYFPSV 5.0 A*0202 941.01 FLPSDYFPSV 4.3 A*0203 941.01 FLPSDYFPSV 10 A*0205 941.01 FLPSDYFPSV 4.3 A*0206 941.01 FLPSDYFPSV 3.7 A*0207 941.01 FLPSDYFPSV 23 A*6802 1141.02 FTQAGYPAL 40 A*0301 941.12 KVFPYALINK 11 A*1101 940.06 AVDLYHFL 6.0 A*3101 941.12 KVFPYALINK 18 A*33Q1 1083.02 STLPETYWRR 29 A*6801 941.12 KVFPYALINK 8.0 A*2402 979.02 AYIDNYNKF 12 B*0702 1075.23 APRTLVYLL 5.5 B*3501 1021.05 FPFKYAAAF 7.2 B51 1021.05 FPFKYAAAF 5.5 B*5301 1021.05 FPFKYAAAF 9.3 B*5401 1021.05 FPFKYAAAF 10 TABLA V Alelo nomenclatura péptido secuencia Afinidad estándar de ligado (nM) DRB1*0101 DR1 515.01 PKYV QNTLKLAT 5.0 DRB1*0301 DR3 829.02 YKTIAFDEEARR 300 DRB1*0401 DR4w4 515.01 PKYVKQNTLKLAT 45 DRB1*0404 DR4W14 717.01 YARFQSQTTLKQKT 50 DRB1*0405 DR4wl5 717.01 YARFQSDTTLKQKT 38 DRB1*0701 DR7 553.01 QYIKANSKFIGITE 25 ;DRB1*0802 DR8w2 553.01 QYIKANSKFIGITE 49 DRB1*0803 DR8w3 553.01 QYIKANSKFIGITE 1600 DRB1*0901 DR9 553.01 QYIKANSKFIGITE 75 DRB1*1101 DR5wll 553.01 QYIKANSKFIGITE 20 DRB1*1201 DR5wl2 1200.05 EALIHQLKINPYVLS 298 DRB1*1302 DR6 l9 650.22 QYIKANAKFIGITE 3.5 DRB1*1501 DR2w2pl 507.02 GRTQDENPWHFFKN 9.1 IVTPRTPPP DRB3*0101 DR52a 511 NGQIGNDPNRDIL 470 DRB4*0101 DR 53 717-01 YARFQSQTTLKQKT 58 DRB5*0101 DR2W2 2 553.01 QYIKANSKFIGITE 20 TABLA VI Miembros del supertipo HLA específicos de alelo Supertipo HLA Verificado* Predi chob Al A*0101, A*2501, A*2601, A*2602, A*0102, A*2604, A*3601, A*3201 A*4301, A*8001 A2 A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0208, A*0210, A*0211, A*0205, A*0206, A*0207, A*0209, A*0212, A*0213 A*0214, A*6802, A*6901 A3 A*0301, A*1101, A*3101, A*3301, A*0302, A*1102, A*2603, A*6801 A*3302, A*3303, A*3401, A*3402, A*6601, A*6602, A*7401 A24 A*2301, A*2402, A*3001 A*2403, A*2404, A*3002, A*3003 B7 B*0702, B*0703, B*0704, B*0705, B*1511, B*4201, B*5901 B*1508, B*3501, B*3502, B*3503, B*3503, B*3504, B*3505, B*3506, B*3507, B*3508, B*5101, B*5102, B*5103, B*5104, B*5105, B*5301, B*5401, B*5501, B*5502, B*5601, B*5602, B*6701, B*7801 B27 B*1401, B*1402, B*1509, B*2702, B*2701, B*2707, B*2708, B*2703, B*2705, B*2706, B*3801, B*3802, B*3903, B*3904, B*3901, B*3902, B*7301 B*3905, B*4801, B*4802, B*1510, B*1518, B*1503 B44 B*1801, B+1802, B*3701, B*4402, B*4101, B*4501, B*4701, B*4403, B*4404, B*4001, B*4002, B*4901, B*5001 B*4006 B58 B*5701, B*5702, B*5801, B*5802, B*1516, B*1517 B62 B*1501, B*1502, B*1513, B*5201 B*1301, B*1302, B*1504, B*1505, B*1506, B*1507, B*1515, B*1520, B*1521, B*1512, B*1514, B*1510 Alelos verificados que incluyen aquellos alelos que se han determinado específicamente por análisis de secuencia agrupado, ensayos de enlace de péptido, o por análisis de las secuencias de epítopes CTL. Alelos predichos son aquellos alelos que se predice específicamente con base en la estructura de cavidad B y F para traslaparse con la especi icidad del supertipo TABLA VII SUPERPORCIÓN HBV AOl (Con información de ligado) Conservancia Frec. proteína Posición Secuencia Hebra A-0110 95 19 POL 521 AICSWRRAF XLXXXXXXXF 95 19 NUC 54 ALRQAILCW XLXXXXXXW 80 16 E V 108 TAMQWNSriTF XMXXXXXF 100 20 POL 166 ASFCGSPY XSXXXXXY 100 20 POL 166 ASFCGSPYSW xsxxxxxxw 90 18 NUC 19 ASKLCLGW xsxxxxxw 85 17 NUC 19 AS CLGWLW sxxxxxxw 80 16 POL 822 ASPLHVAW xsxxxxxw 100 20 ENV 312 CIPIPSSW IXXXXXW 100 20 ENV 312 CIPIPSSWAF XIXXXXXXXF 95 19 ENV 253 CLIFLLVLLDY XLXXXXXXXXY 95 19 ENV 239 CLRRFIIF XLXXXXXF 75 15 ENV 239 CLRRFIFLF XLXXXXXXXF 95 19 POL 523 CSWRRAF XSXXXXXF 100 20 ENV 310 CTCIPIPSSW XTXXXXXXXW 90 18 NUC 31 DIDPYKEF XIXXXXXF 85 17 NUC 29 DIJLDTASALY XLXXXXXXXY 11.1000 95 19 ENV 196 DSWWTSLNF XSXXXXXXF 95 19 NUC 43 ELLSLPSDF XLXXXXXXXF 95 19 NUC 43 ETITIRFLPSDFF XLXXXXXXXXF 95 19 POL 374 ESPLWDF XSXXXXXF 95 19 POL 374 ES LWDFSOF XSXXXXXXXXF 80 16 ENV 248 FILLLCLIF XIXXXXXXF 80 16 ENV 246 FLFILLLCLIF XLXXXXXXXXF 95 19 ENV 256 FIiLVLLDY XLXXXXXY 95 19 POL 658 FSPTYKAF XSXXXXXF 90 18 X 63 FSSAGPCALRF XSXXXXXXXXF 100 20 ENV 333 FSWLSLLVPF xsxxxxxxx 95 19 POL 656 FTFSPTYKAF XTXXXXXXXF 95 19 ENV 346 FVGLSPTVW xvxxxxxxw 95 19 POL 627 GLLGFAAPF XLXXXXXXF 95 19 POL 509 GLSPFLIACF XLXXXXXXXF 85 17 NUC 29 GMDIDPYKEF XMXXXXXXXF 95 19 NUC 123 G IRTPPAY XVXXXXXXXY 0.0017 75 15 POL 569 HUNPNKTKR XLXXXXXXXW 80 16 POL 491 HLYSHPILGF XLXXXXXXXXF 85 17 POL 715 H AELLAA.CF XTXXXXXXXF 95 19 NUC 52 HIALRQAILCW XTXXXXXXXXW 100 20 POL 149 HTLWKAGILY XTXXXXXXXY 0.0300 100 20 ENV 249 ILLCLIF XLXXXXXF 80 16 POL 760 ILRGTSFVY XLXXXXXXY 0.0017 90 18 ENV 188 ILTIPQSLDSW XLXXXXXXXXW 90 18 POL 625 IVGLLGFAAPF XVXXXXXXXXF 80 16 POL 503 KIPM3VGLSPF XLXXXXXXXXF 85 17 NUC 21 KLCLGWLW XLXXXXXW 75 15 POL 108 KLMPARF XLXXXXXF 75 15 POL 108 KLMPARFY XLXXXXXXY 0.0017 80 16 POL 610 IKPVNRPIDW XLXXXXXXXW 85 17 POL 574 KTKRWGYSLNF TXXXXXXXXF 95 19 POL 55 KVGNFTCLY XVXXXXXXY 0.0680 95 19 ENV 254 LIFLLVLLDY XIXXXXXXXY 0.0084 100 20 POL 109 LIMPARFY ???????? 85 17 NUC 30 LLDTASALY XLXXXXXXY 25.0000 80 16 POL 752 LLGCAANW XLXXXXXW 95 19 POL 628 LLGEAAPF XLXXXXXF 100 20 ENV 378 LLPIFFCLW XLXXXXXXW 100 20 ENV 378 LLPIFFCLWVY XLXXXXXXXXY 95 19 NUC 44 LLSFLPSDF XLXXXXXXF 95 19 NUC 44 LLSFLPSDFF XLXXXXXXXF 90 18 POOL 407 LLSSNLSW XLXXXXXW 95 19 ENV 175 IJLVLQAGF XLXXXXXF 95 19 ENV 175 LLVLQAGFF XLXXXXXXF 100 20 ENV 338 LLVPFVQW XLXXXXXW 100 20 ENV 338 LLVPFVQWF XLXXXXXXF 85 17 NUC 100 LLWFHISCLTF XLXXXXXXXXF 95 19 NUC 45 LSFLPSDF XSXXXXXF 95 19 NUC 45 LSFLPSDFF XSXXXXXXF 95 19 POL 415 LSLDVSAAF XSXXXXXXF 95 19 POL 415 LSLDVSAAFY SXXXXXXXY 4.2000 100 20 ENV 336 LSLLVPFVQ SXXXXXXXW 100 20 ENV 336 LSNNVPFVQWF SXXXXXXXXF 95 19 X 53 LSLRGLPVCAF XSXXXXXXXXF 95 19 POL 510 LSPFLLAQF XSXXXXXXF 75 15 ENV 349 LSPTVWLSV XSXXXXXXXXW 85 17 POL 742 LSRKYSF XSXXXXXF 85 17 POL 742 LSRKYTSFFW SXXXXXXXW 75 15 ENV 16 LSVPNPLGF XSXXXXXXF 75 15 UC 137 LTFQ¾ETVLEY XTXXXXXXXXY 90 18 ENV 189 LTIPOSLDSW XTXXXXXXW 90 18 ENV 189 LTPQSLDSWW XTXXXXXXXXW 90 18 POL 404 LTNLLSSNLS XTXXXXXXXXW 95 19 ENV 176 LVLQAGFF XVXXXXXF 100 20 ENV 339 LVPFVOWF XVXXXXXF 100 20 POL 377 LWDFSQF XVXXXXXF 85 17 ENV 360 MMWYWGPSLY XMXXXXXXXY 0.0810 75 15 X 103 MSTTDKEAY XSXXXXXXY 0.8500 75 15 X 103 MSTTDLEA.YF XSXXXXXXXF 95 19 POL 42 NLGNLNVSIPW XLXXXXXXXXW 90 18 POL 406 NLLSSNLSW XLXXXXXX 95 15 POL 45 NLNVS1PW XLXXXXXW 75 15 ENV 15 NLSVPNPLGF XLXXXXXXXF 90 18 POL 738 NSWLSRKY XSXXXXXXY 0.0005 100 20 ENV 380 PIFFCLVY XIXXXXXXY 0.0078 100 20 ENV 314 PIPSSWAF XIXXXXXF 100 20 POL 124 PLDGIKPY XLXXXXXXY 0.0190 100 20 POL 124 PLDKGIKPYY XLXXXXXXXY 0.1600 100 20 ENV 377 PLLPIFFCLW XLXXXXXXXW 95 19 ENV 174 PLLVLQAGF XLXXXXXXF 95 19 ENV 174 PLLVLQAGFF XLXXXXXXXF 80 16 POL 505 PMGVGLSPF XMXXXXXXF 85 17 POL 797 PTTGRTSLY XXXXXXXY 0.7700 75 15 ENV 351 PTVWLSVW XTXXXXXXW 85 17 POL 612 PVNRPIEW VXXXXXW 95 19 POL 685 QVFÍ VTPTG XVXXXXXXXXW 90 18 POL 624 RVGLLGF XIXXXXXF 75 15 POL 106 RLKLIMEARF XLXXXXXXXF 75 15 POL 106 RLLIMPARFY XLXXXXXXXXY 95 19 POL 376 RLWDFSQF XLXXXXXXF 90 18 POL 353 RTPARVTOGVF XTXXXXXXXXF 100 20 POL 49 SIPWTHVGNF XIXXXXXXXXF 95 19 ENV 194 SLDSWWTSLNF XLXXXXXXXXF 95 19 POL 416 SLDVSAAF XLXXXXXF 95 19 POL 416 SLDVSAAFY XLXXXXXXY 17.2000 100 20 ENV 337 SLLVPFVQW XLXXXXXXW 100 20 ENV 337 SLLVPFVOF XLXXXXXXXF 95 19 X 54 SLRGLPVCAF XLXXXXXXXF 90 18 X 64 SSAGPCALRF XSXXXXXXXF 75 15 X 104 STTDLEAY XTXXXXXY 75 15 X 104 STTDLEAYF XTXXXXXXF 75 15 ENV 17 SVPNPLGF XVXXXXXF 90 18 POL 739 SWLSRY XVXXXXXY 85 17 POL 739 SWLSRKYTSF XVXXXXXXXXF 90 18 ENV 190 TI QSLDSW XIXXXXXXW 90 18 ENV 190 TIPQSLDSWW IXXXXXXXW 100 20 POL 150 TLWKAGILY XLXXXXXXY 0.0017 75 15 X 105 T DLFAYF XTXXXXXF 85 17 POL 798 TTGRTSLY XTXXXXXY 80 16 UC 16 WQASKLCLGW XVXXXXXXXXW 75 15 E V 352 TVWLSV XVXXXXXW 85 17 POL 741 VLSRKYTSF XLXXXXXXF 85 17 POL 741 VLSRKYTSFPW LXXXXXXXXW 85 17 POL 740 WLSRKYTSF XVXXXXXXXF 80 16 POL 759 WIL CTSF XIXXXXXF 80 16 POL 759 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534 LAFSYMDDW 10 0.0003 90 18 POL 534 LAFSYMDDWL 11 95 19 POL 515 LAQF SAI 8 95 19 POL 515 LAQFTSAICSV 11 100 20 ENV 254 LIFLLVLL 6 0.0025 95 19 POL 514 LLAQFTSA 8 95 19 POL 514 LLAQFTSAI 9 0.1000 0.2700 3.7000 0.2600 0.7900 100 20 ENV 251 LLCLIFLL 8 0.0004 100 20 ENV 251 LLCLIFLLV 9 0.0048 100 20 ENV 251 LLCLIFLLVL 10 0.0075 100 20 ENV 251 LLCLIFLLVLL 11 0.0013 85 17 UC 30 LLD ASAL 8 95 19 ENV 260 LLDYQGML 8 0.0004 90 18 ENV 260 t,t,???p?G??? 10 0.980 0.0001 0.0200 0.6700 0.0009 80 16 POL 752 LLGCAANWI 9 0.0011 80 16 POL 752 LLGCAANWIL 10 0.0140 95 19 POL 628 LLGFAAPFT 9 0.0008 85 17 ENV 63 LLGWSPOA 8 75 15 ENV 63 LLGWSPQAQGI 11 100 20 ENV 250 LLLCLIFL 8 0.0006 100 20 ENV 250 LLLCLIELL 9 0.0065 100 20 ENV 250 ?.?,?G?,???.?,? 10 0.0036 100 20 ENV 250 LLLCLIFLLVL 11 0.0005 100 20 ENV 378 LLPIFFCL 8 0.0055 100 20 ENV 378 LLPIFFCLWV 10 0.0320 0.0008 0.0150 0.8000 0.0005 95 19 POL 563 LLSLGIHL 8 90 18 POL 407 LLSSNLSWL 9 0.0110 0.0780 3.9000 0.2700 O.0100 90 18 POL 407 LLSSNLSWLSL 11 80 16 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MMWYWGPSL 9 0.6400 75 15 UC 1 MQLEHCL 8 100 20 NUC 136 NAPILSTL 8 100 20 NUC 136 NAPILSTLPET 11 95 19 POL 42 NLOtfLNVSI 9 0.0047 90 18 POL 406 NLLSSNLSWL 10 0.0016 95 19 POL 45 NLNVSIPWT 9 0.0005 100 20 POL 400 NLQSLTNL 8 100 20 POL 400 NLQSL Iii 9 0.0047 75 15 ENV 15 NLSVP PL 8 90 18 POL 411 NLSWLALDV 9 0.650 0.0051 0.6400 0.1600 0.0990 90 18 POL 411 NLSWLSLDVSA 11 100 20 POL 47 NVSIPWTHKV 10 0.0001 100 20 POL 430 PAAMPHLL 8 85 17 POL 430 PAAMPHLLV 9 90 18 POL 775 PADDPSRGRL 10 90 18 ENV 131 EAGGSSSGT 9 90 18 ENV 131 PAGGSSSGTV 10 95 19 POL 641 PALMPLYA 8 95 19 POL 641 PAUYIPLYACI 10 0.0001 75 15 X 145 PAPCFFT 8 75 15 X 145 PAPCNFFTSA 10 80 16 X 11 PADVLCL 8 75 15 X 11 PAPXJVLCLRPV 11 90 18 POL 355 PARVTGGV 8 90 18 POL 355 PARVTCGVFL 10 90 18 POL 355 PARV QGVFLV 11 95 19 NUC 130 PAYRPPNA 8 95 19 UC 130 PAYRPP API 10 0.0001 95 19 MUC 130 PAYRPP¾PL 11 85 17 POL 616 PIEWKV02RI 10 0.0001 85 17 POL 616 PIDWVOQRIV 11 100 20 ENV 380 PIFFCL 8 100 20 EV 380 PIFFCLWVYI 10 0.0004 85 17 POL 713 PIHTAELL 8 85 17 POL 713 PIHIAELLA 9 85 17 POL 713 ???G???,??? 10 80 16 POL 496 PILH3FRKI 9 0.0001 80 16 POL 496 PILD3FRKIPM 11 100 20 UC 138 PILSTLPET 9 0.0001 100 20 NUC 138 PILSTLPETT 10 0.0001 100 20 UC 138 PILSTLPETIV 11 0.0001 80 16 ENV 314 PIPSSWAFA 9 95 19 POL 20 PLEEELPRL 9 0.0003 90 18 POL 20 PLEEELPR1A 10 0.0001 95 19 ENV 10 PL3FFPDHQL 10 0.0002 100 20 POL 427 PLHPAAMPHL 10 0.0001 100 20 POL 427 PLHPAAMPHLL 11 100 20 ENV 377 PLLPIFFCL 9 0.0650 0.0001 0.0018 0.1100 0.0047 100 20 E V 377 PLLPIFFCLWV 11 90 18 EV 174 PLLVLQAGFTL 11 0.0008 80 16 POL 711 PLPIH AEL 9 0.0004 80 16 POL 711 PLPIHTAELL 10 0.0001 80 16 FOL 711 PLPIHTAELLA 11 75 15 POL 2 PLSYQHFRKL 10 0.0001 75 15 POL 2 PLSYQHFR LL 11 85 17 POL 98 PLTVNEKRRL 10 0.0001 80 16 POL 505 PMGVGLSPFL 10 0.0001 80 16 POL 505 PM3VGLSPFLL 11 95 19 ENV 106 PQAMQWNST 9 80 16 ENV 106 PQAMQWNSTT 10 90 18 ENV 192 PQSLDSWWT 9 90 18 ENV 192 PQSLDSWWTSL 11 75 15 POL 692 PTCW3LAI 8 80 16 ENV 219 PTSHSFT 8 85 17 POL 797 PTTGRTSL 8 85 17 POL 797 PTTGRTSLYA 10 80 16 UC 15 PTVQASKL 8 80 16 NUC 15 PTVQASKLCL 10 75 15 ENV 351 PTVWLSVI 8 75 15 EV 351 PTVWLSVIWM 10 95 15 X 59 PVCAFSSA 8 85 17 POL 612 PVNRPIDWKV 10 0.0002 95 19 POL 654 QAFTFSPT 8 95 19 POL 654 QAFTSPTYA 11 95 19 EV 179 QAGFFLLT 8 80 16 ENV 179 QAGFFLLTRI 10 80 16 ENV 179 QAGFFLLRIL 11 90 18 NUC 57 QAILCWGEL 9 90 18 NUC 57 QAILCWGEL 10 95 19 ENV 107 QAMCWNST 8 80 16 ENV 107 QAMCWNSTT 9 80 16 NUC 18 10 80 16 X 8 QLDPARDV 8 0.0001 80 16 X 8 QIDPARDVL 9 0.0001 80 16 X 8 QLDPARDVLCL 11 0.0001 90 18 UC 99 QLLWFHISCL 10 0.0060 85 17 UC 99 QLL FHISCLT 11 95 19 POL 685 QVFADATPT 9 0.0001 95 19 POL 528 RAFPHCLA 8 80 16 ENV 187 RILTIPQSL 9 0.0010 90 18 POL 624 RIVGLLGFA 9 90 18 POL 624 RIVGLLGFAA 10 75 15 POL 106 RL LIMPA 8 90 18 UC 56 RQAILCWGEL 10 90 18 UC 56 RQAILCWGELM 11 90 18 UC 98 RQLLWFHI 8 90 18 UC 98 RQLLWFHISCL 11 85 17 ENV 88 ROSGRQPT 8 90 18 POL 353 RTPARVTGGV 10 95 19 UC 127 RTPPAYRPPNA 11 95 19 POL 36 RVAEDLNL 8 90 18 POL 36 RVAEDIMJGNL 11 80 16 POL 818 RVHFASPL 8 75 15 POL 818 RVHFASPLHV 10 0.0001 75 15 POL 818 RVHFASPLHVA 11 100 20 POL 357 RVTQGVFL 8 100 20 POL 357 RVT3GVFLV 9 0.0041 90 18 X 65 SAGPCALRFT 10 95 19 POL 520 SAICSWRRA 10 0.0001 90 18 NUC 35 SALYREAL 8 100 20 POL 49 SIPWTH V 8 95 19 ENV 194 SLDSWWTSL 9 75 15 POL 565 SLGIHLNPNK 11 95 19 ENV 337 SLLVPFVO FV 11 75 15 POL 581 SLMFMGYV 8 75 15 POL 581 SLNFMGYVI 9 0.0038 95 19 X 54 SLRGLPVCA 9 0.0007 90 18 POL 403 SLTNLLSSNL 10 0.0014 75 15 ENV 216 SQSPTSNHSPT 11 75 15 ENV 280 S GPC TCT 9 100 20 NUC 141 STLPETIV 8 100 20 NUC 141 STLPETTW 9 0.0019 80 16 ENV 85 STNRQSGRQPT 11 85 17 POL 548 SVQHLESL 8 80 16 ENV 330 SVRFSWLSL 9 0.0001 80 16 ENV 330 SVRFSWLSLL 10 0.0004 80 16 ENV 330 SVRFSWLSLLV 11 90 18 POL 739 SWLSRKZT 9 95 19 POL 524 SWRRAFPHCL 11 85 17 POL 716 TAELLAACFA 10 95 19 NUC 53 TALRQAIL 8 80 16 NUC 33 TASALYREA 9 80 16 NUC 33 TASALYREAL 10 90 18 ENV 190 TIPQSLDSWWT 11 100 20 NUC 142 TLPETTW 8 100 20 POL 150 TLWKAGIL 8 95 19 POL 636 TQCGYPAL 8 95 19 POL 636 TQCGYPALM 9 95 19 POL 636 TQCGYPAIMPL 11 85 17 POL 798 TTGRTSLYA 9 75 15 ENV 278 TTST3PCK 9 75 15 E V 278 TTSTGPCKTCT 11 85 17 POL 100 TVNEKRRL 8 80 16 NUC 16 TVQASKLCL 9 0.0002 75 15 ENV 352 TVWLSVIWM 9 0.0002 95 19 POL 37 VAEDL LGNL 10 0.0001 95 19 X 15 VLCLRPVGA 9 0.0014 85 17 POL 543 VU3AKSVQHL 10 0.0001 90 18 X 133 VLGGCRHKL 9 0.0009 90 18 X 133 VLCÜCRHKLV 10 0.0001 85 17 X 92 VL KRTLGL 9 0.0012 95 19 ENV 259 VLLDYQGM 8 95 19 E V 259 VLLDYQGML 9 0.0440 0.0001 0.0210 0.9000 0.0002 90 18 E V 259 VLLDYQGMLPV 11 0.5800 0.2200 4.9000 0.3400 0.0170 95 19 E V 177 VLQAGFFL 8 0.0019 95 19 ENV 177 VLQAGFFLL 9 0.0660 95 19 ENV 177 VLQftGFFLLT 10 0.0011 80 16 NUC 17 VQASKLCL 8 80 16 UC 17 V<^KLCI-GWL 11 95 19 ENV 343 VQWFVGLSFT 10 95 19 EV 343 VQWFVGLSPTV 11 100 20 POL 358 VGGVFLV 8 90 18 POL 542 WI-GAKSV 8 80 16 POL 542 WI_GAKSVQHL 11 90 18 POL 740 WLSR YT 8 95 19 POL 525 WRRAFPHCL 10 0.0003 95 19 POL 525 WRAFPHCL 11 80 16 POL 759 WILRCTSFV 9 0.0270 80 16 POL 759 WILRGTSFVYV 11 80 16 POL 751 WLDGCAANWI 10 0.0053 80 16 POL 751 LLGCAANWIL 11 100 20 POL 414 WLSLDVSA 8 95 19 POL 414 WLSLDVSAA 9 0.0059 100 20 ENV 335 LSLLVPFV 9 1.1000 0.0380 7.2000 0.3600 0.0310 95 19 ENV 237 WMCLRRFI 8 95 19 ENV 237 WMCLRRFI 9 0.0005 95 19 ENV 237 CLR FIIFL 11 0.0019 85 17 ENV 359 WMMWYWGPSL 10 0.0009 100 20 POL 52 WmKGNFT 9 0.0001 95 19 POL 52 WIKKVGNFTGL 11 100 20 POL 147 YLHTLWKA 8 100 20 POL 147 YLHTLWKAGI 10 0.0160 0.0005 0.5600 0.1000 0.0320 100 20 POL 147 YLH LKAGIL 11 100 20 POL 122 YLPLDKGI 8 90 18 NUC 118 YLVSFGVWI 9 0.3800 90 18 UC 118 YLVSFGVWIRT 11 90 18 POL 538 Y DDWL3A 9 0.0250 0.0001 0.0024 0.1000 0.0002 90 18 ENV 263 YQCMLFVCPL 10 75 15 POL 5 YQHFRKLL 8 75 15 POL 5 YQHFRKLLL 9 75 15 POL 5 YQHFRKTI????, 10 85 17 POL 746 YTSFFWLL 8 75 15 POL 746 YSFPWDLGCA 11 90 18 POL 768 YVPSALNPA 9 0.0039 TABLA IX SUPERPORCIOM HBV A03 (Con información de ligado) Con fr pro pos secuencia P2 Te AA A*0301 A*1101 A*3101 A*3301 A*6801 ser ec teí ici rm van ue na ón in cía nc al ia C 85 17 POL 721 AACFARSR A R 8 0.0004 0.0003 0.0056 0.0035 0.0014 95 19 POL 521 AICSWR I R 8 -0.0002 0.0003 0.0014 0.0006 0.0009 90 18 POL 772 ALNPADDPSR L R 10 0.0003 0.0001 85 17 X 70 ALRFTSAR L R 8 0.0047 0.0009 0.0450 0.0230 0.0004 80 16 POL 822 ASPLHVAWIR S R 9 75 15 ENV 84 ASTNRQSGR s R 9 0.0009 0.0002 0.0088 0.0008 0.0001 80 16 POL 75S CA7AN ILR A R 8 85 17 X 69 CALRFTSAR A R 9 0.0034 0.0230 1.5000 8.0000 0.7300 90 18 X 17 CLRPVGAESR L R 10 0.0011 0.0001 100 20 UC 48 CSPHH ALR S R 9 0.0029 0.0001 0.0520 0.0250 0.0440 85 17 NUC 29 DLLDIASALY R 11 0.0042 3.7000 0.0410 0.0003 0.0012 85 17 NUC 32 DIASALYR T R 8 0.0004 0.0018 0.0009 0.0002 0.0009 95 19 POL 17 KAG LiKhlKÍ.PR A R 11 -0.0009 0.0015 0.0110 0.0003 0.0012 90 18 POL 718 ELLAACFAR L R 9 0.0002 0.0004 85 17 POL 718 ELLAA.CEARSR L R 11 0.0062 0.0016 0.0200 0.2000 0.1600 95 19 NUC 174 ETTWRRR T R 8 0.0003 0.1400 0.0027 0.0002 0.0009 80 16 NUC 174 ETTVV RRGR T R 10 0.0003 0.0001 80 1G POL 821 FASPLHVAWR A R 10 90 18 X 63 FSSAGPCALR S R 10 95 19 POL 656 F SPTYK T K 8 0.0100 0.0100 0.0023 0.2100 0.0590 95 19 POL 518 FTSAICSWR T R 10 0.0003 0.0003 95 19 POL 518 FTSAICSWRR T R 11 0.0065 0.0092 0.0170 0.0350 1.5000 90 18 X 132 FVL£GCHK V K 9 0.0430 0.0090 75 15 POL 567 GIHL PNK I K 8 75 15 POL 567 GIHmENKTK I K 10 0.0025 0.0011 0.0009 0.0009 0.0003 75 15 POL 567 GIHLNPNKTKR I R 11 85 17 NUC 29 GMDIDPYK M 8 0.0006 0.0004 0.0001 0.0009 0.0009 90 18 POL 735 GTDNSWLSR T R 10 0.0010 0.0420 0.0030 0.0019 0.0008 90 18 POL 735 GTDNSWLSRK T K 11 0.0140 0.5600 0.0001 0.0002 0.0006 95 19 NUC 123 GVWIRTPPAYR V R 11 0.1900 0.1700 6.8000 0.7300 0.6600 90 18 NUC 104 HISCLTFGR I R 9 0.0160 0.0065 75 15 POL 569 HIKP KTK L K 8 75 15 POL 569 HUJPNK R L R 9 0.0025 0.0001 100 20 POL 149 HTLKAGILYK T K 11 0.5400 0.4400 0.0370 0.0720 0.1900 90 18 NUC 105 ISCLTPGR s R 8 0.0004 0.0002 0.0017 0.0017 0.0009 100 20 POL 153 KAGILYK A R 8 0.0002 0.0015 0.0001 0.0002 0.0009 80 16 POL 610 KLPVNRPIDWK L K 11 75 15 X 130 KVFVLQGCR V R 9 0.0420 0.0820 0.6000 0.0710 0.0030 85 17 POL 720 LAACFARSR A R 9 0.0058 0.0065 90 18 POL 719 IIAACFAR L R 8 0.0024 0.0003 0.0015 0.0029 0.0064 85 17 POL 719 LLAA FARS L R 10 85 17 UC 30 LLDIASALYR L R 10 0.0050 0.0002 80 16 POL 752 LL3CAANWILR L R 11 75 15 POL 564 LSLGIHLPNK S K 11 95 19 NUC 169 LSTLPEITWR ? R 11 -0.0009 0.0008 0.0078 0.0012 0.0023 0 75 15 POL 3 LSYQHFRK S K 8 85 17 POL 99 LTVNE RR T R 8 -0.0002 0.0001 0.0002 0.0009 0.0009 90 18 UC 119 LVSFGVWIR V R 9 0.0028 0.0120 100 20 POL 377 LWDFSQFSR V R 10 0.0016 0.3600 0.0260 0.2300 0.4900 75 15 X 103 MSTTDLEAYFK s K 11 90 18 NUC 75 LEDPASR L R 8 -0.0002 0.0001 0.0002 0.0009 0.0009 95 19 POL 45 NLNVSIPWTHK L K 11 -0.0009 0.0005 0.0019 0.0012 0.0023 90 18 POL 738 NSWLSRK S K 8 0.0006 0.0010 0.0007 0.0009 0.0009 100 20 POL 47 VSIPWTHK V K 9 0.0820 0.570 0.0002 0.0100 0.0320 90 18 POL 775 PADDPSRGR A R 9 0.0008 0.0002 0.0004 0.0015 0.0002 80 16 X 11 PARDVLCLR A R 9 0.0002 0.0002 0.0100 0.0180 0.0002 75 15 E V 83 PASTNRQSGR A R 10 90 18 POL 616 PIDW VCQR I R 9 0.0002 0.0005 80 16 POL 496 PIILGFR I K 8 95 19 POL 20 PLEEELPR L R 8 0.0002 0.0001 0.0002 0.0009 0.0009 100 20 POL 2 PLSYOHFR L R 8 -0.0002 0.0001 0.0002 0.0009 0.0009 75 15 POL 2 PLSYQHFRK L 9 0.001 0.0031 0.0006 0.0008 0.0002 85 17 POL 98 PLTVNEKR L R 8 0.0002 0.0001 0.0002 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A R 9 0.0058 0.2100 0.1500 0.650 0.3800 90 18 POL 771 SALNPADDPSR A R 11 -0.0004 0.0003 0.0003 0.0012 0.0023 75 15 POL 565 SLGIHLNP K L K 10 90 18 X 64 SSAGPCALR S R 9 0.0080 0.1400 0.3300 0.1600 0.7500 95 19 UC 170 STLPETTW T R 10 0.0007 0.0600 0.0080 0.0240 0.0250 95 19 NUC 170 £^[LPETTVV T R 11 0.0150 1.4000 0.1000 0.1600 0.3100 80 16 E V 85 STNRQSG T R 8 75 15 X 104 STTOLEAYFK T K 10 0.0066 2.7000 85 17 POL 716 TAELTAACFAR A R 11 0.0006 0.0023 0.0066 0.1600 0.0590 95 19 UC 171 TLPEITWR L R 9 0.0008 0.0002 0.0009 0.0024 0.0180 95 19 UC 171 TLPETTWRR L R 10 0.0007 0.0230 0.0006 0.0120 0.0440 95 19 UC 171 TLPETTWRRR L R 11 0.0005 0.0160 0.0061 0.0710 0.6400 100 20 POL 150 TLWKAGILYK L K 10 5.3000 0.3600 0.0051 0.0010 0.0130 100 20 POL 150 TTW 7AGILYKR L R 11 0.0082 0.0095 0.1000 0.1100 0.0640 95 19 POL 519 TSAICSWR S R 9 0.0005 0.0008 0.0600 0.0200 0.0820 95 19 POL 519 TSAICSWRR S R 10 0.0018 0.0006 0.0030 0.0066 0.0048 75 15 X 105 TTDLEAYF T K 9 0.0006 0.9200 0.0006 0.0012 0.0170 75 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3 K 11 TABLA X SUPERPORCIÓN A24 HBV (Con información de ligado) Conser frecu prote porción Secuencia hebra A*2401 vancia encia ína 95 19 POL 529 AFPHCIAF XFXXXXXF 95 19 POL 529 AFPHCIAPSY XFXXXXXXXY 95 19 POL 529 AFPHCIAFSYM XFXXXXXXXXM 95 19 X 62 AFSSAGPCAL XXXXXXXXL 0.0012 90 18 POL 535 AFSYMDDWL XFXXXXXXXL 0.0009 95 19 POL 655 AFTFSPTY XFXXXXXY 95 19 POL S5S AFTFSPTYKAF XEXXXXXXXXF 95 19 POL 521 AICSWRRAF XIXXXXXXXF 90 18 NUC 58 AILCWGEL XIXXXXXL 90 18 NUC 58 AILCW3EL XIXXXXXXM 95 19 POL 642 ALMPLYACI XLXXXXXXI 95 19 NOC 54 ALROAILCW XLXXXXXXW 80 16 EV 108 ¿MCWNSTTF XMXXXXXXF 95 19 POL 690 ATPTGWGL XTXXXXXL 75 15 POL 690 ATPGWGLAI X XXXXXXXI 95 19 POL 397 AVPNLQSL XVXXXXXL 95 19 POL 397 AVENLQSLTNL XVXXXXXXXXL 100 20 NUC 131 AYRPPNAPI XYXXXXXXI 0.0260 100 20 NUC 131 AYRPPNAPIL XYXXXXXXXL 0.0220 75 15 POL 607 CPKLPVNRPI XFXXXXXXXX1 100 20 ENV 312 CIPIPSSW XIXXXXXW 100 20 ENV 312 CIPIPSSWAF XIXXXXXXF 85 17 NUC 23 XLXXXXXM 85 17 NUC 23 CLGWLWGMDI XLXXXXXXXI 100 20 ENV 253 CLIFLLVL XLXXXXXL 100 20 EV 253 CLIFLLVLL XLXXXXXXL 95 19 ENV 253 CLIFLLVLLDY XLXXXXXXXXY 95 19 ENV 239 CLR FIIF XLXXXXXF 95 19 ENV 239 CLRRFIIFL XLXXXXXXL 75 15 ENV 239 CLRRFIIFLF XLXXXXXXXF 75 15 ENV 239 CLR FIIFLFI XLXXXXXXXXI 100 20 ENV 310 CTCIPIPSSW XTXXXXXXXW 90 1S NUC 31 DIDPYEF IXXXXXF 85 17 NUC 29 DliOTASAL XLXXXXXXL 85 17 NUC 29 DLLDIASALY XLXXXXXXXY 95 19 POL 40 DLNI ^LNVSI XLXXXXXXXXI 80 16 NUC 32 DIASALYREAL X XXXXXXXXL 85 17 POL 618 DW VCQRI XWXXXXXI 85 17 POL 618 DWKVCQRIVGL XWXXXXXXXXL 90 18 ENV 262 DYOCmPVCPL XYXXXXXXXXL 0.0002 80 16 X 122 ELGEEIRL XLXXXXXL 95 19 NUC 43 ET.TñFLPSDF XLXXXXXXF 95 19 NUC 43 ELLSFLPSDFF XLXXXXXXXXF 90 18 NUC 117 EYLVSFGVW YXXXXXXW 90 18 NUC 117 EYLVSFGVWI XYXXXXXXX1 0.0340 100 20 ENV 3B2 FFCLWVYI XFXXXXXI 80 16 ENV 182 FFLLTRIL XFXXXXXL 80 16 ENV 182 FFLLT ILTI XFXXXXXXXI 85 17 ENV 13 FFPDHQLDPAF XFXXXXXXXXF 80 16 E V 243 FIIFLFIL XIXXXXXL 80 16 E V 243 FIIFLFILL XIXXXXXL 80 16 ENV 243 FIIFLFILLL XIXXXXXXXL 80 16 ENV 248 FILLLCLI IXXXXXI 80 16 ENV 248 FILLLCLIF XIXXXXXXF 80 16 ENV 248 FILLLCLIFL XIXXXXXXXL 80 16 ENV 248 FILiLCLIFLL X1XXXXXXXXL 80 16 ENV 246 FLFILLLCL XLXXXXXXL 80 16 ENV 246 FLFILLLCLI XLXXXXXXXI 80 16 ENV 246 FLF1LLLCLIF XLXXXXXXXXF 75 15 ENV 171 FLGPLLVL XLXXXXXL 95 19 POL 513 FLLAQFTSAI XLXXXXXXXI 95 19 POL 562 FLLSLGIHL XLXXXXXXL 80 16 ENV 183 FLLTRILTI XLXXXXXXI 95 19 ENV 256 FIIJVLLDY XLXXXXXY 95 19 ENV 256 FIILVLLDYQC3¾ XLXXXXXXXXM 95 19 POL 656 FTFSPTYKAF XTXXXXXXXF 95 19 POL 656 FTFSPTY AFL XTXXXXXXXXL 95 19 POL 635 FTQCGYPAL X XXXXXXL 95 19 POL 635 FTOCGYPALM XTXXXXXXM 95 19 NEV 346 FVGLSPTVW xvxxxxxxw 95 19 ENV 346 FVGLSPTVWL XVXXXXXXXL 90 18 X 132 FVLGGCRH L XVXXXXXXXL 95 19 ENV 342 FVOWFVGL XVXXXXXL 90 18 POL 766 FVYVPSAL XVXXXXXL 95 19 POL 630 GFAAPFTQOGY FXXXXXXXXY 80 16 ENV 181 GFFLLTRI XFXXXXXI 80 16 EV 181 GFFLLTRIL XFXXXXXXL 80 16 ENV 181 GFFLL RILTI FXXXXXXXXI 95 19 ENV 12 GFFPDHCL XFXXXXXL 75 15 ENV 170 GFLGPLLVL XFXXXXXXL 80 15 POL 500 GFR IPM3VGL XFXXXXXXXXL 95 19 POL 627 GLLGFAAPF 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85 17 POL 543 VL3AKSVQHL XLXXXXXXXL 90 18 X 133 VLOGCRHKL XLXXXXXXL 85 17 X 92 VLHKRTLGL XLXXXXXXL 95 19 EV 259 Vl-LOYOCM XLXXXXXM 95 19 E V 259 VLLDYQGML XLXXXXXXL 95 19 E V 177 VJJJAGFFL XLXXXXXL 95 19 E V 177 VLQAGFFLL XLXXXXXXL 85 17 POL 741 VLSRYTSF XLXXXXXXF 85 17 POL 741 VLS KYTSFPW XLXXXXXXXX 80 16 POL 542 WLGAKSVQHL XVXXXXXXXXL 85 17 POL 740 VVLSRKYTSF XVXXXXXXXF 95 19 POL 525 VVRRAFPHCL XVXXXXXXXL 95 19 NUC 124 VWIRTPPAY XWXXXXXXY 75 15 ENV 353 VWLSVIWM XWXXXXXM 90 18 NUC 102 WFHISCLTF XFXXXXXF 0.0300 95 19 ENV 345 WFVGLSPTVW XFXXXXXXXW 0.0120 95 19 ENV 345 WFVGLSPTVWL XFXXXXXXXXL 80 16 POL 759 WILRCTSF XIXXXXXF 80 16 POL 759 WILRG SFVY XIXXXXXXXY 95 16 NUC 125 IRTPPAY XIXXXXXY 80 16 POL 751 WIJJGCAA W XLXXXXXXW 80 16 POL 751 LLGCAñWI XLXXXXXXXI 80 16 POL 751 LLGCAANWIL XLXXXXXXXXL 95 19 POL 414 WLSLDVSAAF XLXXXXXXXF 95 19 POL 414 WLSLDVSAAFY XLXXXXXXXXY 100 20 ENV 335 WLSLLVPF XLXXXXXF 100 20 E V 335 WLSLLVPEVQW XLXXXXXXXXW 85 17 MJC 26 WLWGMDIDPY XLXXXXXXXY 95 19 ENV 237 WMCLRRFI XMXXXXXI 95 19 ENV 237 WMCLRRFII XMXXXXXXI 0.0230 95 19 EV 237 W CLRRFIIF XMXXXXXXXF 0.0013 95 19 ENV 237 WMCLRRFIIFL X XXXXXXXXL 65 17 EMV 359 WMWYWGPSL XXXXXXXXL 0.0005 85 17 E V 359 WMMWYWGPSL XMXXXXXXXXY 100 20 POL 52 WIHK\ 0F X XXXXXF 95 19 POL 52 XTXXXXXXXL 95 19 EV 198 WWTSLNFL XWXXXXXL 85 17 EV 362 WYWGPSLY YXXXXXY 0.0001 100 20 POL 147 YLHTLWKAGI XLXXXXXXI 100 20 POL 147 YLHTLWKAGIL XLXXXXXXXXL 100 20 POL 122 YLPLDGI XLXXXXXI 100 20 POL 122 YLPLDKGIKPY XLXXXXXXXXY 90 18 NUC 118 YLVSFGVW XLXXXXW 90 18 UC 118 YLVSFGVWI XLXXXXXXI 85 17 POL 746 YTSFPWLL X XXXXXL TABLA XI. SUPERPORCIÓN HBV B07 (Con información de ligado) Con fr pro posic Secuencia P2 Te AA B*0702 B*3501 B*5101 B*5301 B*5401 ser ec teí ión rm van ue na in cía nc al ia C 75 15 X 146 APCNFFTSA P A 9 95 19 POL 633 APFTQCGY P Y 8 0.0001 0 , 0012 0.0019 0.0002 0.0002 95 19 POL 633 APFQCGYPA P A 10 0 ,0029 0.0001 0.0002 1.4000 95 19 POL 633 APFTQCGYPAL P L 11 0.2300 0.0010 0.0004 -0.0003 0.0093 100 20 ENV 232 CPGYRWMCL P L 9 80 16 NUC 14 CPTVQASKL P L 9 80 16 ÜC 14 CPTVQASKLCL P L 11 80 16 X 10 DPADVLCL P L 9 80 16 ENV 122 DPRVRGLY P Y 8 90 18 POL 776 DPSRGRL P L 9 0,0120 O.OOOl 0.0001 0.0001 0.0001 90 18 NUC 33 DPYKEFGA P A 8 0.0001 0.0001 0.0019 0.0002 0.0019 75 15 ENV 130 FPAGGSSSGTV P V 11 90 18 ENV 14 FPDHQLDPA P A 9 85 17 ENV 14 FEDHQLDPAF P F 10 0.0002 0.0016 0.0003 0.0011 0.0021 95 19 POL 530 FPHCLAFSY P Y 9 0.0001 0.5250 0.0655 0.5400 0.0199 95 19 POL 530 FPHCLAFSYM P M 10 0.0990 0.2200 0.0900 0.0790 0.0480 75 15 POL 749 FFWLLGCA P A 8 75 15 POL 749 FPWLLGCAA P A 9 75 15 POL 749 FFWLLGCAANW P W 11 90 18 X 67 GPCALRFTSA P A 10 0.0900 0.0001 0.0001 0.0002 0.0035 95 19 POL 19 GPLEEELPRL P L 10 0.0001 0.0001 0.0002 0.0001 0.0002 90 18 j POL 19 (ÍPI.WWkl.PWI A P A 11 -0.0002 0.0001 0.0001 -0.0003 0.0001 95 18 ENV 173 GPLLVLQA P A 8 0.0003 0.0001 0.0110 0.0002 0.0065 95 19 E V 173 GPLLVLQAGF P F 10 0.0001 0.0001 0.0002 0.0001 0.0002 95 19 ENV 173 GPLLVLQAGFF P F 11 0.0011 0.0001 0, 0001 0.0008 0.0009 85 17 POL 97 GPLTVNEKRRL P L 11 0.0031 0.0001 0.0001 -0.0003 0.0001 100 20 POL 429 HPAAMPHL P L 8 0.0650 0.0004 0.3100 0.0037 0.0160 100 20 POL 429 HPAAMPHLL P L 9 0.0980 0.0270 0.0110 0.0500 0.0120 85 17 POL 429 HPAAMPHLLV P V 10 0.0160 0.0020 0.007B 0.0140 0.0170 80 16 POL 495 HPIILGFRKI P I 10 100 20 ENV 313 IPIPSSWA P A 8 0.0004 0.0004 0.0019 0.0002 0.0600 100 20 ENV 313 IPIPSSWAF P F 9 0.1300 2,7679 2.3500 0.7450 0.0034 80 16 ENV 313 IPIPSSWAFA P A 10 0.0013 0.0024 0.0014 0.4500 80 16 POL 504 IPMGVGLSPF P F 10 80 16 POL 504 IPM3VGLSPFL P L 11 90 18 ENV 191 IPQSLDSW P W 8 90 18 ENV 191 IPQSLDS W P W 9 80 16 ENV 315 IPSSWAFA P A 8 100 20 POL 50 IPW1HKVGNF P F 10 0.0013 0.0001 0.0007 0.0001 0.0002 100 20 ENV 379 LPIFFCLW P W 8 0.0001 0.0001 0.0360 0.1400 0.0035 100 20 ENV 379 LPIIFFCLWV P V 9 100 20 ENV 379 LPIFFCL VY P y 10 0.0002 0.0079 0.0002 0.0006 0.0002 100 20 ENV 379 LPIFFCLWYI P I 11 0.0002 0.0001 0.0043 0.0139 0.0021 85 17 POL 712 LPIH AEL P L 8 85 17 POL 712 LPIHTAKTiT, P L 9 0.0040 0.0630 0.0052 0.3100 0.0005 85 17 POL 712 LPIHTAELIA P A 10 0.0018 0.0011 0.0016 0.3300 85 17 POL 712 LPIHTAFTiTAA P A 11 0.0090 0.0027 -0.0003 0.0120 2.7500 80 16 X 89 LPKVLHKRTL P L 10 100 20 POL 123 LPLDKGIKPY P Y 10 0.0001 0.0290 0.0002 0.0003 0.0002 100 20 POL 123 LPLDKGIKPYY P Y 11 -0.0002 0.0009 0.0001 0.0007 0.0001 95 19 X 58 LPVCAFSSA. P A 9 0.0480 0.0710 0,0110 0.0009 19.0000 80 16 POL 611 LPVNRPIDW P w 9 80 16 POL 611 LPVNRPIEWKV P V 11 80 16 POL 433 MPHLLVGSSGL P L 11 100 20 POL 1 MPLSYQHF P F 8 0.0001 0.0097 0.0120 0.0370 0.0190 75 15 POL 1 MPLSYQHFE¾ L P L 11 90 18 POL 774 NPADDPSRGRL P L 11 0.0120 0.0001 0.0001 -0.0003 0.0001 95 19 ENV 9 NPLGFFPDHQL P L 11 0.0012 0.0021 0.0001 0.0028 0.0001 75 15 POL 571 NPNKTKR P W 8 75 15 POL 571 NPNK KRWGY P Y 10 95 19 UC 129 PPAY PPNA P A 9 0.0001 0.0001 0.0001 0.0002 0.0003 95 19 NUC 129 PPAYRPPNAPI P I 11 0.0003 0.0001 0.0001 -0.0003 0.0001 85 17 ENV 58 PPHGGLLGW P W 9 0.0001 0.0002 0.0001 0.0003 0.0002 100 20 NUC 134 PPNAPILSTL P L 10 0.0001 0.0001 0.0035 0.0001 0.0002 80 16 POL 615 RPIDWKVCQR1 P I 11 100 20 NUC 133 RPPNAPIL P L 8 0.0076 0.0001 0.0280 0.0002 0.0002 100 20 NUC 133 RPPNAPILSTL P L 11 0.1300 0.0001 0.0018 -0.0003 0.0001 100 20 NUC 44 SPEHCSPHHTA P A 11 -0.0002 0.0001 0.0001 -0.0003 0.0011 95 19 POL 511 SPFLIAQF P F 8 0.5500 0.0009 0.0180 0.0009 0.0093 95 19 POL 511 SPFLLAQFTSA P A 11 0.0820 0-0001 0.0001 -0.0003 12.0500 100 20 NUC 49 SPHHTALRQA P A 10 0.0012 0.0001 0.0002 0.0035 100 20 NUC 49 SPHHTALRQAI P I 11 0.5800 0.0001 0.0004 0.0005 0.0002 85 17 ENV 67 SPOAQGIL P L 8 85 17 POL 808 SPSVPSHL P L 8 75 15 ENV 350 SPTVWLSV P V 8 75 15 E V 350 SPTVWLSVI P I 9 75 15 ENV 350 SFTVWLSVIW P w 10 75 15 ENV 350 SFTVWLSVIWM P w 11 95 19 POL 659 SPTY AFL P L 8 0.3900 0.0001 0.0019 0.0002 0.0002 90 18 POL 354 TPARVTGGV P V 9 0.0078 0.0001 0.0013 0.0001 0.0015 90 18 POL 354 TPARVTGGVF P F 10 0.3200 0.1000 0.0001 0.0099 0.0006 90 18 POL 354 TPA VTCGVFL P L 11 0.0950 0.0001 0.0001 0.0005 0.0005 95 19 JC 128 TPPAYRPPNA P A 10 0.0001 0.0001 0.0002 0.0100 75 15 ENV 57 TPPHOGLL P L 8 75 15 ENV 57 TPPHGGLIJ3W P W 10 80 16 POL 691 TFIOWGLA P A 8 75 15 POL 691 TPTGWGIAI P I 9 95 19 E V 340 VPFVQWFV P V 8 0.0010 0.0001 19,0000 0.0002 0.1100 95 19 ENV 340 VPEVQWFVGL P L 10 0.0011 0.0001 0.0100 0.0001 0.0025 95 19 POL 398 VPNLQSLTL P L 10 0.0006 0.0001 0.0004 0.0001 0.0002 95 19 POL 398 VTMJQSL LL P L 11 0.0004 0.0001 0.0001 -0.0003 0.0002 90 18 POL 769 VPSALNPA P A 8 0.0011 0.0001 0.0070 0.0002 1.0000 95 19 POL 393 WPKFAVENL P L 9 0.0054 0.0002 0.0015 0.0001 0.0015 95 19 POL 640 YPALMPLY P Y 8 0.0004 0.2600 0.4100 0.0450 0.0056 95 19 POL 640 YPALMPLYA P A 9 0.0180 0.0480 0.0340 0.0140 16.0000 95 19 POL 640 YPALMPLYACI P I 11 0.0040 0.0001 0.0470 0.0320 0.0700 TABLA XII Superporción HBV B27 (Sin datos de ligado disponibles) proteína Secuencia Posición en No. de Frecuencia Conservancia HBV aminoáci de (%) dos Secuencia AYW AHLSLRGL 51 8 19 95 AY ARVTQGVF 356 8 18 90 AYW DHGAHLSL 48 8 19 95 AYW DHQLDPAF 16 8 18 90 AYW DKGIKPYY 126 8 20 100 AYW FHISCLTF 103 8 18 90 AYW FR IPM3V 501 8 16 80 AYR GR TVLEY 140 8 15 75 AYW HHTALQA 51 8 20 100 AYW IHAELIA 714 8 17 85 AYW LHKRTDGL 93 8 18 90 AYW LHLYSHPI 490 8 19 95 AYW LRGLPVCA 55 8 19 95 AYW LRGTSFVY 761 8 16 80 AYW LRQAILCW 55 8 19 95 AYW LRRFIIFL 240 8 19 95 AYW NK WGY 573 8 15 75 AYW NRPIDWRK 614 8 18 90 AYW RRVAEDL 34 8 17 85 AYW PHCLAFSY 531 8 19 95 AYW PHGGUJGW 59 8 17 85 AY PKFAVENL 394 8 19 95 AYR CHFRKLLL 6 8 15 75 AYW RHYLHTLW 145 8 20 100 AYW RKYTSFPW 744 3 17 85 AYW RRAFPHCL 527 8 19 95 AYW RRFIIFLF 241 8 15 75 AYW SHPIIL3F 494 8 16 80 AYW SKLCLGWL 20 8 18 90 AYW SRLYVSL 472 8 16 80 AYW KRWGYSL 575 8 19 95 AYW TRHYLHTL 144 8 20 100 AYW VRFSWLSL 331 8 16 80 AYW WKVGQRIV 619 8 17 85 AYW YRPPNAPI 132 8 20 100 AYW ARVTGGVFL 356 9 18 90 AYW EHCSPHHTA 46 9 20 100 AYR GRETVLEYL 140 9 15 75 AYW HHTALRQA1 51 9 20 100 AYW HKVGNF GL 54 9 19 95 AYW IHTAELLAA 714 9 17 85 AYW KRWGYSLNF 576 9 17 85 AYW LHLYSHPII 490 9 16 80 AYW LHPAAPHL 428 9 20 100 AYW LHTLWKAGI 148 9 20 100 AYR LKLIMPARF 107 9 15 75 AYW LRGLPVCAF 55 9 19 95 AYW LRCTSFVYV 761 9 16 80 AYW LRRFIIFLF 240 9 15 75 AYW PHCLAFSYM 531 9 19 95 AYW PHHIALRQA 50 9 20 100 AYW PVLHKRTL 90 9 17 85 AYR QHFR TIT IT IT I 6 9 15 75 AYW QRIVGLLGF 623 9 18 90 AYW RKIPMGGL 502 9 16 80 AYW RKLPVNRPI 609 9 16 80 AYW RKYTSFPWL 744 9 17 85 AYW RRAFPHCLA 527 9 19 95 AYW RRFIIFLFI 241 9 15 75 AYR RRLKLIMPA 105 9 15 75 AYW RRVAEDLNL 35 9 18 90 AYW SKLCLGWLW 20 9 17 85 AYW SRKYTSFPW 743 9 17 85 AYW TRHYLH LW 144 9 20 100 AYW VHFASPIiHV 819 9 16 80 AYW VRFSWLSLL 331 9 16 80 AYW VRRAFPHCL 526 9 19 95 AYW YRPPNAPIL 132 9 20 100 AYW YRWMCLRRF 235 9 19 95 AYW AHLSLRGLPV 51 10 18 90 AYW AKSVQHLESL 546 10 17 85 AYW ARD\^CLRPV 12 10 15 75 AYW ARVTGGVFLV 356 10 18 90 AYW TRILTIPQSL 186 10 16 80 AYW VHFASPLHVA 819 10 16 80 AYW VRFSWLSIiV 331 10 16 80 AYW VRRAFPHCLA 526 10 19 95 AYW WKVCQRIVGL 619 10 17 85 AYW YRWM IJRRFI 235 10 19 95 AYW DHGAHLSLRGL 48 11 19 95 AYW IHLNPKTKRW 568 11 15 75 AYW IHTAELLAACF 714 11 17 85 AYW LHPAAMEHLLV 428 11 17 85 AYW LH LWKAGILY 148 11 20 100 AYW LRQAILCWGEL 55 11 18 90 AYW LRRFIIFLFIL 240 11 15 75 AYW PHHTALRQAIL 50 11 19 95 AYW PKFAVP LQSL 394 11 19 95 AYW PKVI-HKRILGL 90 11 17 85 AYW PRTPARVTQGV 352 11 18 90 AYW QRIVGL 3FAA 623 11 18 90 AYW RKLPVNRPID 609 11 16 80 AYW RRFIIFLFILL 241 11 15 75 AYR RRLKLIMPARF 105 11 15 75 AYW SHPIILGFRKI 494 11 16 80 AYW 20 11 17 85 AYW SRKYTSFPWLL 743 11 17 85 AYW TH3WGNFTGLY 53 11 19 95 AYW TKRWGYSLMFM 575 11 17 85 AYW TRHYLHTLWKA 144 11 20 100 AYW VHFASPLHVAW 819 11 16 80 AYW VRRAFPHCLAF 526 11 19 95 AYW WKVQQRIVGLL 619 11 17 85 AYW YRWMCLRRFII 235 11 19 95 TABLA XIII Superporción HBV B58 Proteína Secuencia posición No. de Frecuencia Conservancia aminoácidos de Secuencia (%) POL AAPHLLV 431 8 17 85 NUC ASALYEA 34 8 17 85 POL ASFCGSPY 166 8 20 100 NUC ASKLCLG 19 8 IB 90 POL ASOKHVAW 822 8 16 80 ENV ASVFSWL 329 8 16 80 POL ATFIGWGL 690 8 19 95 X CALRFTSA 69 8 19 90 NUC CSPHHTAL 48 8 20 100 POL CSWRRAF 523 8 19 95 POL ESLWDF 374 8 19 95 NUC ETVLEYLV 142 8 15 75 POL FARSRGA 724 8 17 85 POL FASPLHVA 821 8 16 80 POL FSPTYKAF 658 8 19 95 X FSSAGPCA 63 8 19 95 ENV FSLSLLV 333 8 20 100 POL FSYDDW 536 8 18 90 POL FTQCGYPA j 635 8 19 95 POL FTSAICSV 518 8 19 95 POL GAKSVQHL 545 8 17 85 POL CTDNSWL 735 8 18 90 POL HAELLAA 715 8 17 85 MJC HTALRQAI 52 8 20 100 POL HTLWKAGI 149 8 20 100 POL LAQFTSAI 515 8 19 95 UC LSFLPSDF 45 8 19 95 POL LSLDVSAA 415 8 19 95 ENV LSLLVPFV 336 8 20 100 X LSLRGLPV 53 8 19 95 POL LSRKYTSF 742 8 17 85 POL LSSLSWL 408 8 18 90 POL LSWLSLDV 412 8 20 100 UC LTFGRETV 108 8 19 95 X MSTTDLEA. 103 8 16 80 UC NAPILSTL 136 8 20 100 POL PÁAMPHLL 430 8 20 100 POL PALPLYA. 641 8 19 95 X PADVLCL 11 8 16 80 POL PARVGGV 355 8 1B 90 NUC PAYRPPNA 130 8 19 95 POL PSRGRLGL 779 8 18 90 .POL PTGWGLAI 692 8 15 75 POL PTTGRTSL 797 8 17 85 UC PTVQASKL 15 8 16 80 ENV PTVWLSVl 351 8 15 75 POL RAFPHCLA 528 8 19 95 X RTLGLSAM 96 8 24 120 NUC SALVREAL 35 8 18 90 X SSAGPCAL 64 8 19 95 E V SSGTVNPV 136 8 15 75 ENV SS PRQGM 5 8 18 90 NUC STLPETIV 141 8 20 100 X STTDLEAY 104 8 15 75 UC TALRQAIL 53 8 19 95 POL TSAICSW 519 8 19 95 ENV TSGFLGPL 166 8 16 80 X T DLEAYF 105 8 15 75 POL T 3RTSLY 798 8 17 85 POL VSWPKFAV 391 8 19 95 NUC VSYV VNM 115 8 20 100 POL VTGGVFVL 358 8 20 100 ENV WSPQAQGI 66 8 17 85 POL WTHKVQs!F 52 8 20 100 POL YSLNFMGY 580 8 17 85 POL YTSFPWLL 746 8 17 85 POL AAPFTQCGY 632 9 19 95 NUC ASALYREAL 34 9 17 85 UC ASKLCLGWL 19 9 18 90 POL ATPTGWGIA 690 9 16 80 POL CSRNLYSL 471 9 16 80 POL DATP 3WGL 689 9 19 95 E V DSWWTSL F 196 9 19 95 POL ARPT.KRFIT . 17 9 20 100 POL FADATP GW 687 9 19 95 POL FASPLHVAW 821 9 16 80 POL FAVPNLOSL 396 9 19 85 POL FSPTYKAFL 658 9 19 95 X FSSAGPCAL 63 9 19 95 POL FSYTODWL 536 9 18 90 POL FTFSPTYKA 656 9 19 95 POL FTGLYSSTV 59 9 18 90 POL FTQCGYPL 635 9 19 95 POL FTSAICSW 518 9 19 95 X GAHLSLRGL 50 9 19 95 UC HTALRQAIL 52 9 19 95 POL HTLWKAGIL 149 9 20 100 POL KSVQHLESL 547 9 17 85 POL KTKRWGYSL 574 9 19 95 POL LAFSYMDDV 534 9 18 90 NUC LSFLPSDFF 45 9 19 95 POL LSLDVSAAF 415 9 19 95 POL LSPFLLAQF 510 9 19 95 ENV LSPTVWLSV 349 9 15 75 NUC LSTLPEITV 140 9 20 100 ENV LSVPNPLGF 16 9 15 75 POL LSYQHFRKL 3 9 15 75 NUC LTFGRETVL 137 9 15 75 POL LTNLLSSNL 404 9 18 90 POL LTVNEKRRL 99 9 17 85 X MSTTDLEAY 103 8 15 75 POL NSWLSRKY 738 9 18 90 POL EAAMPHLLV 430 9 17 85 POL PARVTGGVF 355 9 18 90 POL PTTGRTSLY 797 9 17 85 E V PTV LSVIW 351 9 15 75 POL QAFTFSPTY 654 9 19 95 NUC 57 9 18 90 NUC QAS LCLGQ 18 9 16 80 POL RAFPHCLAF 528 9 19 95 ENV RTGDPAPNM 167 9 16 80 X SAGPCALRF 65 9 18 90 POL SASFCGSPY 165 9 20 100 POL SSNLS LSL 409 9 18 90 ENV SSSGTVNPV 135 9 15 75 NUC STLPETTW 141 9 20 100 X STTDLEAYF 104 9 15 75 POL TAFTITIAACF 716 9 17 85 NUC TASALYREA 33 9 16 80 POL TSFVYVPSA 764 9 16 80 ENV TSGFLGPLL 168 9 15 75 POL 1TCRTSLYA 798 9 17 85 POL VSIPWTHKV 48 9 20 100 ENV WSPOAQGIL 66 9 17 85 ENV WSSKPRQCM 4 9 18 90 POL YSHPIILGF 493 9 16 80 POL YSLNFMJYV 580 9 15 75 POL ASF03SPYWS 1S6 10 20 100 NUC ASFLOJSWIJW 19 10 17 85 ENV AS FSWLSL 329 10 16 80 POL ATP GW3LAI 690 10 15 75 X CAFSSAGPCA 61 10 19 95 ENV CTCIPIPSSW 310 10 20 100 ENV CTIPAQGTSM 298 10 16 80 POL DATP G GLA 689 10 16 80 ENV DÍ3VWTSI- FL 196 10 18 90 NUC ETEASALYREA 32 10 16 80 POL FAAPFTQCGY 631 10 19 95 ENV FSWLSLLVFF 333 10 20 100 POL FTFSPTYKAF 656 10 19 95 POL FTQCGYPALM 635 10 38 190 ENV GSSSGTVMPV 134 10 15 75 ENV GTNLSVPNPL 13 10 15 75 POL GTSFVYVPSA 763 10 16 80 POL HIAELLAACF 715 10 17 85 POL HTL KAGILY 149 10 20 100 POL IAFSY DDW 534 10 18 90 POL LSLDVSAAFY 415 10 19 95 E V LSLLVPFVQ 336 10 20 100 X LSLRGLPVCA 53 10 19 95 ENV LSPTVWLSVI 349 10 15 75 POL LSRKYTSFP 742 10 17 85 POL LSS LSWLSL 408 10 18 90 UC ILSTLPEriTVV 140 10 20 100 POL LSWLSLDVSA 412 10 20 100 POL LSYQHFRKLL 3 10 15 75 ENV LTIPQSLDSW 189 10 18 90 X MSTTDLEAYF 103 10 15 75 POL PADDPS GRL 775 10 18 90 ENV PAGGSSSGTV 131 10 18 90 POL PALMPLyA I 641 10 19 95 X PAPCNFFTSA 145 10 15 75 POL PARV 3GVFL 355 10 18 90 UC PAYRPPNAPI 130 10 19 95 POL PTTGTSLYA 797 10 17 85 NUC FTVQASKLCL 15 10 16 80 ENV PTVLSVIWM 351 10 30 150 ENV QAGFFLLTRI 179 io 16 80 NUC QAILCWGEL 57 10 36 180 ENV QAMQW STTF 107 10 16 80 UC QAS LCLGWL 18 10 16 80 E V QSIDSWWTSL 193 10 18 90 POL RTPARVTOGV 353 10 18 90 POL SAICSWRRA 520 10 19 95 X SSAGPCALRF 64 10 18 90 POL TAKTITIAA FA 716 10 17 85 NUC TALRQAILCW 53 10 19 95 NUC T/ASALYREAL 33 10 16 80 POL TSFPWLLGCA 747 10 15 75 POL TSAICSWRRA 519 11 19 95 POL TSFFWLD3CAA 747 11 15 75 ENV TSGFLGPLLVL 168 11 15 75 POL VS PKFAVP L 391 11 19 95 POL WTHKVGNF JL 52 11 19 95 POL YTSFEWLLGCA 746 11 15 75 Tabla XIV Superporcion HBV B62 Proteína Secuencia Posición No. De Frecuencia Conservancia aminoácidos de secuencia (%) NUC AILCW3EL 58 8 18 90 POL APFTQCGY 633 8 19 95 POL AVPNLQSL 397 8 19 95 E V CIPIPSSW 312 8 20 100 NUC CLGWLWGM 23 8 17 85 ENV CLIFLLVL 253 8 20 100 ENV CLRRFIIF 239 8 19 95 POL CQRIVGLL 622 8 17 85 NUC DIDPYKEF 31 8 18 90 NUC DLLDTASA 29 8 17 85 ENV DPRVRGLY 122 8 16 80 NUC DPYKEFGA 33 8 18 90 X DVLCLRPV 14 8 19 95 X ELGEEIRL 122 8 16 80 POL ELLAACFA 718 8 18 90 ENV FIIFLFIL 243 8 16 80 ENV FILLLCLI 248 8 16 80 ENV FLGPLLVL 171 8 15 75 ENV FLLVLLDY 256 8 19 95 POL FPWLLGCA 749 8 15 75 ENV FVGLSPTV 346 8 19 95 ENV FVQWFVGL 342 8 19 95 POL FVYVPSAL 766 8 18 90 POL GLSPFLIiA 509 8 19 95 ENV GLSPTVWL 348 8 20 100 E V GMLPVCPL 265 8 18 90 E V GPLLVLQA 173 8 19 95 POL GVGLSPFL 507 8 16 80 POL HLYSHPII 491 8 16 80 POL HPAAMPHL 429 8 20 100 ENV IIFLFILL 244 8 16 80 POL IILGFRKI 497 8 16 80 UC ILCWGELM 59 8 18 90 E V ILLLCLIF 249 8 20 100 POL ILRGTSFV 760 8 16 80 ENV ILTIPQSL 188 8 19 95 E V IPIPSSWA 313 8 20 100 E V IPQSLDSW 191 8 18 90 E V IPSSWAFA 315 8 16 60 POL IVGLLGFA 625 8 18 90 POL KIP GVGL 503 8 16 80 NUC KLCLGWL 21 8 17 85 POL KLIMPARF 108 8 15 75 POL KLPVNRPI 610 8 16 80 POL KVGNFTGL 55 8 19 95 X KVLHKRTL 91 8 17 85 E V LIFLLVLL 254 8 20 100 POL LIMPARFY 109 8 20 100 POL LLAQFTSA 514 8 19 95 ENV LLCLIFLL 251 8 20 100 NUC LLDTASAL 30 8 17 85 ENV LLDTQGML 260 8 19 95 POL LLGCAANW 752 8 16 80 POL LLGFAAPF 623 8 19 95 ENV LLGWSPQA 63 8 17 85 ENV LLLCLIFL 250 8 20 100 ENV LLPIFFCL 378 8 20 100 POL LLSLGIHL 563 8 19 95 POL LLSSNLSW 407 8 18 90 ENV LLTRILTI 184 8 16 80 POL LLVGSSGL 436 8 16 80 ENV LLVLQAGF 175 8 19 95 ENV LLVPFVQ 338 8 20 100 POL LMPLYACI 643 8 19 95 E V LPIFFCLW 379 8 20 100 POL LPIHTAEL 712 8 17 85 ENV LQAGFFLL 178 8 19 95 POL LQSLTNLL 401 B 20 100 ENV LVLQAGFF 176 B 19 95 ENV LVPFVQWF 339 T 20 100 NUC LVSFGVWI 119 B 18 90 POL LWDFSQF 377 8 20 100 POL MPLSYQHF 1 8 20 100 NUC MQLFHLCL 1 8 15 75 ENV MQWNSTTF 109 8 16 80 POL NL VSIPW 45 8 19 95 POL NLQSLTNL 400 8 20 100 ENV NLSVPNPL 15 8 15 75 POL NPNKTKRW 571 8 15 75 ENV PIFFCLWV 380 8 20 100 POL PIHTAELL 713 8 17 85 ENV PIPSS AF 314 8 20 100 E V PQSLDSWW 192 8 18 90 X PVCAFSSA 59 8 19 95 POL PVNRPID 612 8 17 85 X QLDPARDV 8 8 16 80 POL RIVGLLGF 624 8 18 90 POL RLKLIMPA 106 8 15 75 MUC RPPNAPIL 133 8 20 100 NUC RQLLWFHI 98 8 18 90 POL RVAEDLNL 36 8 19 95 POL RVHFASPL 818 B 16 80 POL RVTGGVFL 357 8 20 100 POL SI WTHKV 49 8 20 100 POL SLDVSAAF 416 8 19 95 POL SLNFMGYV 581 8 15 75 POL SPFLLAQF 511 8 19 95 E V SPQAQGIL 67 8 17 85 POL SPSVPSHL 808 8 17 85 ENV SPTVWLSV 350 8 15 75 POL SPTYKAFL 659 8 19 95 ENV SVPNPLGF 17 8 15 75 POL SVQHLESL 548 8 17 85 POL SWLSRKY 739 8 18 90 UC TLPETTW 142 8 20 100 POL TLWKAGIL 150 8 20 100 ENV TPPHGGLL 57 8 15 75 POL TPTG GLA 691 8 16 80 POL TQCGYPAL 636 8 19 95 POL TV EKRRL 100 8 17 85 ENV TVWLSVI 352 8 15 75 ENV VLLDYQG 259 8 19 95 ENV VLQAGFFL 177 8 19 95 E V VPFVQWFV 340 8 19 95 POL VPSALNPA 769 8 18 90 NUC VQASKLCL 17 8 16 80 POL WLGAKSV 542 8 18 90 POL WILRGTSF 759 8 16 80 NUC WIRTPPAY 125 8 19 95 POL WLSLDVSA 414 8 20 100 ENV WLSLLVPF 335 8 20 100 EMV W CLRRFI 237 8 19 95 POL YLHTLWKA 147 8 20 100 POL YLPLDKGI 122 8 20 100 NUC YLVSFGVW 118 8 18 90 POL YPALMPLY 640 8 19 95 POL YQHFRKLL 5 8 15 75 POL AICSWRRA 521 9 19 95 NUC AILCWGELM 58 9 18 90 POL ALMPLYACI 642 9 19 95 NUC ALRQAILCW 54 9 19 95 ENV AMQWNSTTF 108 9 16 80 X AMSTTDLEA 102 9 15 75 X APCNFFTSA 146 9 15 75 ENV CIPIPSSWA 312 9 20 100 ENV CLIFLLVLL 253 9 20 100 ENV CLRRFIIFL 239 9 19 95 NUC CLTFGRETV 107 9 18 90 ENV CPGYRWMCL 232 9 20 100 NUC CPTVQASKL 14 9 16 80 X CQLDPARDV 7 9 16 80 NUC DLLDTASAL 29 9 17 85 POL DLNLGNLNV 40 9 19 95 X DPARDVLCL 10 9 16 80 POL DPSRGRLGL 778 9 18 90 POL DWLGAKSV 541 9 18 90 ENV FIIFLFILL 243 9 16 80 ENV FILLLCLIF 248 9 16 80 ENV FLFILLLCL 246 9 16 80 POL FLLAQFTSA 513 9 19 95 POL FLLSLGIHL 562 9 19 95 ENV FLLTRILTI 183 9 16 80 ENV FPDHQLDPA 14 9 18 90 POL FPHCLLAFSY 530 9 19 95 POL FPWLLGCAA 749 9 15 75 ENV FVGLSPTVW 346 9 19 95 POL GLCQVFADA 682 9 17 85 POL GLLGFAAPF 627 9 19 95 ENV GLLGWSPQA 62 9 17 85 POL GVGLSPFLL 507 9 16 80 UC GVWIRTPPA 123 9 19 95 POL HLLVGSSGL 435 9 16 80 X HLSLRGLPV 52 9 18 90 POL HLYSHPIIL 491 9 16 80 POL HPAAMPHLL 429 9 20 100 ENV IIFLFILLL 244 9 16 80 POL ILGFR IP 498 9 16 80 E V ILLLCLIFL 249 9 20 100 POL ILRGTSFVY 760 9 16 80 ENV IPIPSSWAF 313 9 20 100 ENV IPQSLDS W 191 9 18 90 POL IVGLLGFAA 625 9 18 90 POL KLHLYSHPI 489 9 19 95 POL KLIMPARFY 108 9 15 75 POL KVCQRIVGL 620 9 17 85 POL KVGNFTGLY 55 9 19 95 POL LLAQFTSAI 514 9 19 95 ENV LLCLIFLLV 251 9 20 100 UC LLDTASALY 30 9 17 85 POL LLGCAA WI 752 9 16 180 ENV LLLCLIFLL 250 9 20 100 ENV LLPIFFCLW 378 9 20 100 NUC LLSFLPSDF 44 9 19 95 POL LLSSNLSWL 407 9 18 90 E V LLVLQAGFF 175 9 19 95 ENV LLVPFVQWF 333 9 20 100 NUC LLWFHISCL 100 9 18 90 ENV LPIFFCLWV 379 9 20 100 POL LPIHTAELL 712 9 17 85 X LPVCAFSSA 58 9 19 95 POL LPV RPIDW 611 9 16 80 ENV LVLLDYQG 258 9 19 95 ENV LVLQAGFFL 176 9 18 90 ENV LVPFVQWFV 339 9 19 95 ENV MMWYWGPSL 360 9 17 85 POL NLGNL VSI 42 9 19 95 POL NLLSSNLSW 406 9 18 90 POL NLQSLTNLL 400 9 20 100 POL NLSWLSLDV 411 9 18 90 ENV PIFFCLWVY 380 9 20 100 POL PIHTAELLA 713 9 17 85 POL PIILGFRKI 496 9 16 80 ENV PIPSSWAFA 314 9 16 80 POL PLDKGIK Y 124 9 20 100 POL PLEEELPRL 20 9 19 95 E V PLLPIFFCL 377 9 20 100 ENV PLLVLQAGF 174 9 19 95 POL PLPIHTAEL 711 9 16 80 POL PMGVGLSPF 505 9 16 80 NUC PPAYRPPNA 129 9 19 95 ENV PPHGGLLGW 58 9 17 85 X QLDPARDVL 8 9 16 80 ENV RILTIPQSL 187 9 16 80 POL RIVGLLGFA 624 9 18 90 POL RLWDFSQF 37£ 9 19 95 POL RVTGGVFLV 357 9 20 100 ENV SLDSWWTSL 194 9 19 95 POL SLDVSAAFY 416 9 19 95 ENV SLLVPFVQW 337 9 20 100 POL SLNFMGYVI 581 9 15 75 X SLRGLPVCA 54 9 19 95 ENV SPTVWLSVI 350 9 15 75 ENV SVRFSWLSL 330 9 16 80 ENV TIPQSLDSW 190 9 18 90 POL TLWKAGILY 150 9 20 100 POL TPARVTGGV 354 9 18 90 POL TPTGWGLAI 691 9 15 75 POL TQCGYPALM 636 9 19 95 UC TVQAS LCL 16 9 16 80 E V TWLSVIWM 352 9 15 75 X VLCLRPVGA 15 9 19 95 X VLGGCRHKL 133 9 18 90 X VLHKRTLGL 92 9 17 85 ENV VLLDYQGML 259 9 19 95 ENV VLQAGFFLL 177 9 19 95 POL VLSRKYTSF 741 9 17 85 POL WILRGTSFV 759 9 16 80 POL WLLGCAANW 751 9 16 80 POL WLSLDVSAA 414 9 19 95 E V LSLLVPFV 335 9 20 100 ENV WMCLRRFI I 237 9 19 95 POL WPKFAVPNL 393 9 19 95 NUC YLVSFGVWI 118 9 18 90 POL YMDDWLGA 538 9 18 90 POL YPALMPLYA 640 9 19 95 POL YQHFRKLLL 5 9 15 75 POL YVPSALNPA 768 9 18 90 POL AICSWRRAF 521 10 19 95 POL APFTQCGYPA 633 10 19 95 POL AQFTSAICSV 516 10 19 95 E V CIPIPSSWAF 312 10 20 100 POL CLAFSYMDDV 533 10 18 90 NUC CLGWL GMDI 23 10 17 85 ENV CLRRFIIFLF 239 10 15 75 X CQLDPARDVL 7 10 16 80 POL CQRIVGLLGF 622 10 17 85 NUC DIDPYKEFGA 31 10 18 90 NUC DLLDTASALY 29 10 17 85 X DVLCLRPVGA 14 10 19 95 NUC ELLSFLPSDF 43 10 19 95 ENV FIIFLFILLL 243 10 16 80 ENV FILLLCLIFL 248 10 16 80 ENV FLFILLLCLI 246 10 16 80 ENV FLFPLLVLQA 171 10 15 75 POL FLLAQFTSAI 513 10 19 95 ENV FPDHQLDPAF 14 10 17 85 POL FPHCLAFSYM 530 10 19 95 ENV FVGLSPTVWL 346 10 19 95 X FVLGGCRHKL 132 10 18 90 X GLPVCAFSSA 57 10 19 95 POL GLSPFLLAQF 509 10 119 95 ENV GLSPTVWLSV 348 10 15 75 NUC GMDIDPYKEF 29 10 17 85 X GPCALRFTSA 67 10 18 90 POL GPLEEELPRL 19 10 19 95 ENV GPLLVLQAGF 173 10 19 95 POL GVGLSPFLLA 507 10 16 80 NUC GVWI TPPAY 123 10 19 95 POL HLNPNKTKRW 569 10 15 75 POL HPAAMPHLLV 429 10 17 85 POL HPIILGFR I 495 10 16 80 POL I ILGFRKIPM 497 10 16 80 ENV ILLLCLIFLL 249 10 20 100 POL ILRGTSFVYV 760 10 16 80 UC ILSTLPETTV 139 10 20 100 ENV IPIPSSWAFA 313 10 16 80 POL IPMGVGLSPF 504 10 16 80 POL IPWTHKVGNF 50 10 20 100 NUC LCLGWLWGM 21 10 17 85 POL KLHLYSHPII 489 10 16 80 POL LPVNRPIDW 610 10 16 80 POL KQAFTFSPTY 653 10 19 85 POL VCQRIVGLL 620 10 17 85 X KVLHKRTLGL 91 10 17 85 ENV LIFLLVLLDY 254 10 19 95 ENV LLCLIFLLVL 251 10 20 100 ENV LLDYQGMLPV 260 10 18 90 POL LLGCAANWIL 752 10 16 80 ENV LLLCLIFLLV 250 10 20 100 E V LLPIFFCLWV 378 10 20 100 NUC LLSFLPSDFF 44 10 19 95 ENV LLVLLDYQGM 257 10 19 95 ENV LLVLQAGFFL 175 10 18 90 ENV LLVPFVQWFV 338 10 19 95 E V LPIFFCLWVY 379 10 20 100 POL LPIHTAELLA 712 10 17 85 X LP VLH RTL 89 10 16 80 POL LPLDKGIKPY 123 10 20 100 ENV LVLLDYQGML 258 10 19 95 ENV LVLQAGFFLL 176 10 18 90 ENV MMWYWGPSLY 360 10 17 85 POL NLLSSNLSWL 406 10 18 90 E V NLSVPNPLGF 15 10 15 75 POL NPNKTKRWGY 571 10 15 75 POL NVSIPWTHKV 47 10 20 100 POL PIDWKVCQRI 616 10 17 85 ENV PIFFCLWVYI 380 10 20 100 POL PIHTAELLAA 713 10 17 85 POL PLDKGIKPYY 124 10 20 100 POL PLEEELPRLA 20 10 18 90 E V PLGFFPDHQL 10 10 19 95 POL PLHPAAMPHL 427 10 20 100 E V PLLPIFFCLW 377 10 20 100 E V PLLVLQAGFF 174 10 19 95 POL PLPIHTAELL 711 10 16 80 POL PLSYQHFRKL 2 10 15 75 POL PLTVNEKRRL 98 10 17 85 POL PMGVGLSPFL S05 10 16 80 NUC PPNAPILSTL 134 10 20 100 POL PVNRPIDWKV 612 10 17 85 UC QLLWFHISCL 99 10 18 90 POL RIVGLLGFAA 624 10 18 90 POL RLKLI PARF 106 10 15 75 NUC RQAILCWGEL 56 10 18 90 POL RVHFASPLHV 818 10 15 75 ENV SLLVPFVQWF 337 10 20 100 X SLRGLPVCAF 54 10 19 95 POL SLTNLLSSNL 403 10 18 90 NUC SPHHTALRQA 49 10 20 100 ENV SPTVWLSVIW 350 10 15 75 ENV SVRFSWLSLL 330 10 16 80 E V TIPQSLDSWW 190 10 18 90 POL TPARVTGGVF 354 10 18 90 NUC TPPAYRPPNA 128 10 19 95 ENV TPPHGGLLGW 57 10 15 75 POL VLGAKSVQHL 543 10 17 85 X VLGGCRHKLV 133 10 18 90 ENV VPFVQ FVGL 340 10 19 95 POL VPNLQSLTNL 398 io 19 95 UC VQASKLCLGW 17 10 16 80 POL WLSRKYTSF 740 10 17 85 POL WRRAFPHCL 525 10 19 95 POL WILRGTSFVY 759 10 16 80 POL WLLGCAA WI 751 10 16 80 POL WLSLDVSAAF 414 10 19 95 NUC WLWG DIDPY 26 10 17 85 ENV WMCLRRFIIF 237 10 19 95 ENV WMMWYWGPSL 359 10 17 85 POL YLHTLWKAGI 147 10 20 100 ENV YQGMLPVCPL 263 10 18 90 POL YQHFRKLLLL 5 10 15 75 POL APFTOCGYPAL 633 11 19 95 POL AQFTSAICSW 516 11 19 95 POL AVPNLQSLTNL 397 11 19 95 ENV CIPIPSS AFA 312 11 16 80 POL CLAFSYMDDW 533 11 18 90 ENV CLIFLLVLLDY 253 11 19 95 ENV CLRRFIIFLFI 239 11 15 75 NUC CPTVQASKLCL 14 11 16 80 POL CQRIVGLLGFA 622 11 17 85 POL DLNLGNLNVS I 40 11 19 95 NUC ELLSFLPSDFF 43 11 19 95 ENV FILLLCLIFLL 248 11 16 80 ENV FLFILLLCLIF 246 11 16 80 ENV FLLVLLDYQGM 256 11 19 95 ENV FPAGGSSSGTV 130 11 15 75 POL FPWLLGCAANW 749 11 15 75 X FVLGGCRHKLV 132 11 18 90 POL FVYVPSALNPA 766 11 18 90 ENV GLSPTVWLSVI 348 11 15 75 POL GPLEEELPRLA 19 11 18 90 ENV GPLLVLQAGFF 173 11 19 95 POL GPLTVNEKRRL 97 11 17 85 X HLSLRGLPVCA 52 11 18 90 POL HLYSHPIILGF 491 11 16 80 ENV IIFLFILLLCL 244 11 16 80 ENV ILLLCLIFLLV 249 11 20 100 NUC ILSTLPETTW 139 11 20 100 E V ILTIPQSLDSW 188 11 18 90 POL IPMGVGLSPFL 504 11 16 80 POL IVGLLGFAAPF 625 11 18 90 POL KIPMGVGLSPF 503 11 16 80 POL KLHLYSHPIIL 489 11 16 80 E V LLCLIFLLVLL 251 11 20 100 ENV LLGWSPQAQGI 63 11 15 75 E V LLLCLIFLLVL 250 11 20 100 E V LLPIFFCLWVY 378 11 20 100 POL LLSSNLSWLSL 407 11 18 90 E V LLVLLDYQGML 257 11 19 95 ENV i LLVLQAGFFLL 175 11 18 90 NUC LLWFHISCLTF 100 11 17 85 ENV LPIFFCLWVYI 379 11 20 100 POL LPÍHTAELLAA 712 11 17 85 POL LPLDKGIKPYY 123 11 20 100 POL LP RPIDW V 611 11 16 80 E V LQAGFFLLTRI 178 11 16 80 E V LVPFVQ FVGL 339 11 19 95 POL MPHLLVGSSGL 433 11 16 80 POL MPLSYQHFRKL 1 11 15 75 POL NLGNLNVSIP 42 11 19 95 POL NLSWLSLDVSA 411 11 18 90 POL NPADDPSRGRL 774 11 18 90 ENV NPLGFFPDHQL 9 11 19 95 POL PID KVCQRIV 616 11 17 85 POL PIILGFRKIPM 496 11 16 80 NUC PILSTLPETTV 138 11 20 100 POL PLHPAAMPHLL 427 11 20 100 E V PLLPIFFCL V 377 11 20 100 ENV PLLVLQAGFFL 174 11 18 90 POL PLPIHTAELLA 711 11 16 80 POL PLSYQHFRKLL 2 11 15 75 POL PMGVGLSPFLL 505 11 16 80 UC PPAYRPPNAPI 129 11 19 95 E V PQA QWNSTTF 106 11 16 80 E V PQSLDSWWTSL 192 11 18 90 X QLDPARDVLCL 8 11 16 80 POL QVFADATPTGW 685 11 19 95 POL RLKLIMPARFY 106 11 15 75 POL RPIDW VCQRI 615 11 16 80 NUC RPPNAPILSTL 133 11 20 100 NUC RQAILCWGELM 56 11 18 90 NUC RQLLWGHISCL 98 11 18 90 POL RVAEDLNLGNL 36 11 18 90 POL RVHFASPLHVA 818 11 15 75 POL SIPWTHKVGNF 49 11 20 100 E V SLDSWWTSLNF 194 11 19 95 ENV SLLVPFVQWFV 337 11 19 95 NUC SPEHCSPHHTA 44 11 20 100 POL SPFLLAQFTSA 511 11 19 95 NUC SPHHTALRQAI 49 11 20 100 E V SPTV LSVI M 350 11 15 75 E V SVRFSWLSLLV 330 111 16 80 POL SWLSRKYTSF 739 11 17 85 POL SWRRAFPHCL 524 11 19 95 POL TPARVTGGVFL 354 11 18 90 POL TQCGYPALMPL 636 11 19 95 UC TVQASKLCLGW 16 11 16 80 ENV VLLDYQGMLPV 259 11 18 90 POL VLSR YTSFPW 741 11 17 85 POL VPNLQSLTNLL 398 11 19 95 NUC VQASKLCLGWL 17 11 16 80 ENV VQWFVGLSPTV 343 11 19 95 POL WLGAKSVQHL 542 11 16 80 POL WRRAFPHCLA 525 11 19 95 POL WILRGTSFVYV 759 11 16 80 POL WLLGCAANWIL 751 11 16 80 POL WLSLDVSAAFY 414 11 19 95 E V WLSLLVPFVQW 335 11 20 100 E V WMCLRRFIIFL 237 11 19 95 E V WMMWYWGPSLY 359 11 17 85 POL YLHTLWKAGIL 147 11 20 100 POL YLPLD GIKPY 122 11 20 100 POL YPALMPLYACI 640 11 19 95 Tabla XV Porción HBV AOl con información de ligado Conservanc Frec . Proteína Posici Secuencia AA A*0101 ia ón 100 20 POL 166 ASFCGSPY 8 90 18 POL 737 DNSWLSRKY 10 0.0001 95 19 POL 631 FAAPFTQCGY 10 0.0680 95 19 POL 630 GFAAPFTQCGY 11 75 15 NUC 140 GRETVLEY 8 85 17 POL 579 GYSLNF GY 9 100 20 POL 149 HTLWKAGILY 10 0.1100 95 19 POL 653 KQAFTFSPTY 10 0.0001 85 17 NUC 30 LLDTASALY 9 12.0000 95 19 POL 415 LSLDVSAAFY 10 0.0150 75 15 NUC 137 LTFGRETVLEY 11 85 17 ENV 360 MMWYWGPSLY 10 0.0810 75 15 X 103 MSTTDLEAY 9 0.8500 90 18 POL 738 NSWLSRKY 9 0.0005 100 20 POL 124 PLDKGIK Y 9 100 20 POL 124 PLD GIKPYY 10 0.1700 85 17 POL 797 PTTGRTSLY 9 0.2100 100 20 POL 165 SASFCGSPY 9 95 19 POL 416 SLDVSAAFY 9 5.2000 75 15 X 104 STTDLEAY 8 85 17 POL 798 TTGRTSLY 8 95 19 POL 414 WLSLDVSAAFY 11 85 17 ENV 359 WMMWYWGPSLY 11 0.3200 95 19 POL 640 YPALMPLY 8 85 17 POL 580 YSLNFMGY 8 Tabla XVI Porción HBV A03 con ligado Conservanc Frec . Proteína Posici Secuencia AA A*0301 ia 6n 85 17 POL 721 AACFARSR 8 0.0004 85 17 POL 721 AACFARSRSGA 11 95 19 POL 632 AAPFTQCGY 9 95 19 POL 632 AAPFTQCGYPA 11 85 17 POL 722 ACFARSRSGA 10 80 16 POL 688 ADATPTGWGLA 11 90 18 POL 776 ADDPSRGR 8 95 19 POL 529 AFPHCLAF 8 95 19 POL 529 AFPHCLAFSY 10 95 19 X 62 AFSSAGPCA 9 90 18 X 62 AFSSAGPCALR 11 95 19 POL 655 AFTFSPTY 8 95 19 POL 655 AFTFSPTYK 9 0.2600 95 19 POL 655 AFTFSPTYKA 10 95 19 POL 655 AFTFSPTYKAF 11 80 16 E V 180 AGFFLLTR 8 90 18 X 66 AGPCALRF 8 90 18 X 66 AGPCALRFTSA 11 95 19 POL 18 AGPLEEELPR 10 0.0004 95 19 POL 521 AICSWRR 8 -0.0002 95 19 POL 521 AICSWRRA 9 95 19 POL 521 AICSWRRAF 10 95 19 UC 41 ALESPEHCSPH 11 90 18 POL 772 ALNPADDPSR 10 0.0003 85 17 X 70 ALRFTSAR 8 0.0047 80 16 ENV 108 AMQW STTF 9 80 16 ENV 108 A QWNSTTFH 10 75 15 X 102 AMS1TDLEA 9 85 17 NUC 34 ASALYREA 8 100 20 POL 166 ASFCGSPY 8 0.0460 80 16 POL 822 ASPLHVAWR 9 75 15 E V 84 ASTNRQSGR 9 0.0009 80 16 POL 690 ATPTGWGLA 9 80 16 POL 755 CAAN ILR 8 95 19 X 61 CAFSSAGPCA 10 90 18 X 69 CALRFTSA 8 85 17 X 69 CALRFTSAR 9 0.0034 80 16 X 6 CCQLDPAR 8 85 17 POL 723 CFARSRSGA 9 75 15 POL 607 CFR LPVNR 9 95 19 POL 638 CGYPALMPLY 10 95 19 POL 638 CGYPALMPLYA 11 100 20 ENV 312 CIPIPSSWA 9 100 20 ENV 312 CIPIPSS AF 10 80 16 EVN 312 CIPIPSSWAFA 11 95 19 E V 253 CLIFLLVLLDY 11 0.0083 90 18 X 17 CLRPVGAESR 10 0.0011 95 19 ENV 239 CLRRFIIF 8 75 15 ENV 239 CLRRFIIFLF 10 100 20 NUC 48 CSPHHTALR 9 0.0029 100 20 NUC 48 CSPHHTALRQA 11 95 19 POL 523 CSWRRAF 8 95 19 POL 523 CSWRRAFPH 10 100 20 ENV 310 CTCIPIPSSWA 11 80 16 POL 689 DATPTGWGLA 10 90 18 POL 540 DDWLGAK 8 90 18 NUC 31 DIDPYKEF 8 90 18 NUC 31 DIDPYKEFGA 10 85 17 NUC 29 DLLDTASA 8 85 17 NUC 29 DLLDTASALY 10 0.0001 85 17 NUC 29 DLLDTASALYR 11 0.0042 95 19 ENV 196 DSWWTSLNF 9 0.0006 85 17 NUC 32 DTASALYR 8 0.0004 80 16 NUC 32 DTASALYREA 10 95 19 X 14 DVLCLRPVGA 10 95 19 POL 418 DVSAAFYH 8 90 18 POL 541 DWLGAKSVQH 11 95 19 POL 17 EAGPLEEELPR 11 -0.0009 90 18 NUC 40 EALESPEH 8 90 18 POL 718 ELLAACFA 8 90 18 POL 718 ELLAACFAR 9 0.0002 85 17 POL 718 ELLAACFARSR 11 0.0082 95 19 NUC 43 ELLSFLPSDF 10 95 19 UC 43 ELLSFLPSDFF 11 95 19 NUC 43 ESPEHCSPH 9 95 19 NUC 43 ESPEHCSPHH 10 95 19 POL 374 ESRLWDF 8 95 19 POL 374 ESRLWDFSQF 11 95 19 NUC 174 ETTWRRR 8 0.0003 80 16 UC 174 ETTWRRRGR 10 0.0003 95 19 POL 631 FAAPFTQCGY 10 85 17 POL 724 FARSRSGA 8 80 16 POL 821 FASPLHVA 8 80 16 POL 821 FASPLHVAWR 10 90 18 ENV 13 FFPDHQLDPA 10 85 17 E V 13 FFPDHQLDPAF 11 75 15 NUC 139 FGRETVLEY 9 75 15 POL 244 FGVEPSGSGH 10 95 19 NUC 122 FGW IRTPPA 10 95 19 NUC 122 FG IRTPPAY 11 80 16 ENV 248 FILLLCLIF 9 80 16 ENV 246 FLFILLLCLIF 11 75 15 ENV 171 FLGPLLVLQA 10 95 19 POL 513 FLLAQFTSA 9 0.0006 95 19 POL 562 FLLSLGIH 8 95 19 ENV 256 FLLVLLDY 8 0.0050 100 20 POL 363 FLVDKNPH 8 95 19 POL 658 FSPTYKAF 8 95 19 X 63 FSSAGPCA 8 90 18 X 63 FSSAGPCALR 10 90 18 X 63 FSSAGPCALRF 11 100 20 ENV 333 FSWLSLLVPF 10 0.0004 90 18 POL 536 FSYMDDWLGA 11 95 19 POL 656 FTFSPTYK 8 0.0100 95 19 POL 656 FTFSPTYKA 9 95 19 POL 656 FTFSPTYKAF 10 0.0004 95 19 POL 635 FTOCGYPA 8 95 19 POL 518 FTSAICSWR 10 0.0003 95 19 POL 518 FTSAICSWRR 11 0.0065 95 19 X 132 FVLGGCRH 8 90 18 X 132 FVLGGCRHK 9 0.0430 90 18 POL 766 FVYVPSALNPA 11 80 16 POL 754 GCAANWILR 9 95 19 POL 630 GFAAPFTOCGY 11 90 18 ENV 12 GFFPDHOLDPA 11 75 15 ENV 170 GFLGPLLVLOA 11 85 17 ENV 61 GGLLGWSPQA 10 100 20 POL 360 GGVFLVD 8 100 20 POL 360 GGVFLVDKNPH 11 75 15 POL 567 GIHLNPNK 8 75 15 POL 567 GIHLNPNKTK 10 0.0025 75 15 POL 567 GIHLNPNKTKR 11 85 17 POL 682 GLCQVFADA 9 0.0001 95 19 POL 627 GLLGFAAPF 9 0.0006 85 17 ENV 62 GLLGWSPOA 9 95 19 X 57 GLPVCAFSSA 10 95 19 POL 509 GLSPFLLA 8 95 19 POL 509 GLSPFLLAQF 10 85 17 UC 29 GMDIDPYK 8 0.0006 85 17 NUC 29 GMDIDPYKEF 10 -0.0003 90 18 POL 735 GTDNSWLSR 10 0.0010 90 18 POL 735 GTDNSWLSRK 11 0.0140 80 16 POL 763 GTSFVYVPSA 10 80 16 POL 245 GVEPSGSGH 9 100 20 POL 361 GVFLVDKNPH 10 80 16 POL 507 GVGLSPFLLA 10 95 19 UC 123 GVWIRTPPA 9 95 19 NUC 123 GVWIRTPPAY 10 0.0047 95 19 NUC 123 GVWIRTPPAYR 11 0.1900 100 20 NUC 47 HCSPHHTA 8 100 20 NUC 47 HCSPHHTALR 10 80 16 POL 820 HFASPLHVA 9 80 16 POL 820 HFASPLHVAWR 11 95 19 X 49 HGAHLSLR 8 85 17 ENV 60 HGGLLGWSPQA 11 90 18 NUC 104 HISCLTFGR 9 75 15 POL 569 HLNPNKTK 8 75 15 POL 569 HLNPNKTKR 9 90 18 X 52 HLSLRGLPVCA 11 80 16 POL 491 HLYSHPI ILGF 11 85 17 POL 715 HTAELLAA 8 85 17 POL 715 HTAELLAACF 10 85 17 POL 715 HTAELLAACFA 11 100 20 POL 149 HTLWKAGILY 10 0.0440 100 20 POL 149 HTLWKAGILYK 11 0.5400 95 19 POL 522 ICSWRRA 8 95 19 POL 522 ICSWRRAF 9 95 19 POL 522 ICSWRRAFPH 11 90 18 NUC 32 IDPYKEFGA 9 90 18 POL 617 IDW VCQR 8 100 20 ENV 381 IFFCLWVY 8 95 19 ENV 255 IFLLVLLDY 9 80 16 POL 734 IGTDNSWLSR 11 100 20 ENV 249 ILLLCLIF 8 j 80 16 POL 760 ILRGTSFVY 9 0.0440 90 18 NUC 105 ISCLTFGR 8 0.0004 90 18 POL 625 IVGLLGFA 8 90 18 POL 625 IVGLLGFAA 9 90 18 POL 625 IVGLLGFAAPF 11 100 20 POL 153 KAGILYKR 8 0.0002 80 16 POL 503 KIP GVGLSPF 11 75 15 POL 108 KLIMPARF 8 75 15 POL 108 KLIMPARFY 9 80 16 POL 610 LPVNRPID K 11 85 17 POL 574 KTKRWGYSLNF 11 75 15 X 130 KVFVLGGCR 9 0.0420 75 15 X 130 KVFVLGGCRH 10 95 19 POL 55 KVGNFTGLY 9 0.2100 85 17 POL 720 LAACFARSR 9 0.0058 95 19 X 16 LCLRPVGA 8 90 18 X 16 LCLRPVGAESR 11 95 19 POL 683 LCQVFADA 8 100 20 POL 125 LDKGIKPY 8 100 20 POL 125 LDKGIKPYY 9 80 16 X 9 LDPARDVLCLR 11 95 19 ENV 195 LDSWWTSLNF 10 85 17 NUC 31 LDTASALY 8 85 17 NUC 31 LDTASALYR 9 0.0004 80 16 NUC 31 LDTASALYREA 11 95 19 POL 417 LDVSAAFY 8 95 19 POL 417 LDVSAAFYH 9 80 16 E V 247 LFILLLCLIF 10 95 19 POL 544 LGAKSVQH 8 80 16 POL 753 LGCAA WILR 10 75 15 POL 566 LGIHLNPNK 9 75 15 POL 566 LGIHLNPNKTK 11 95 19 ENV 172 LGPLLVLQA 9 95 19 ENV 172 LGPLLVLQAGF 11 95 19 EMI 254 LIFLLVLLDY 10 0.0022 100 20 POL 109 LI PARFY 8 -0.0002 90 18 POL 719 LLAACFAR 8 0.0024 85 17 POL 719 LLAACFARSR 10 95 19 POL 514 LLAQFTSA 8 85 17 NUC 30 LLDTASALY 9 0.0013 85 17 NUC 30 LLDTASALYR 10 0.0050 80 16 POL 752 LLGCAA ILR 11 95 19 POL 628 LLGFAAPF 8 85 71 EMI 63 LLGWSPQA 8 100 20 ETV 378 LLPIFFCL VY 11 0.0230 95 19 NUC 44 LLSFLPSDF 9 95 19 NUC 44 LLSFLPSDFF 10 95 19 ENV 175 LLVLQAGF 8 95 19 ENV 175 LLVLQAGFF 9 0.0006 100 20 ENV 336 LLVPFVQWF 9 85 17 NUC 100 LL FHISCLTF 11 95 19 UC 45 LSFLPSDF 8 95 19 NUC 45 LSFLPSDFF 9 0.0006 95 19 POL 415 LSLDVSAA 8 95 19 POL 415 LSLDVSAAF 9 0.0004 95 19 POL 415 LSLDVSAAFY 10 95 19 POL 415 LSLDVSAAFYI I 11 75 15 POL 564 LSLGIHLNPNK 11 10 20 ENV 336 LSLLVPFVQWF 11 95 19 X 53 LSLRGLPVCA 10 95 19 X 53 LSLRGLPVCAF 11 95 19 POL 510 LSPFLLAQF 9 95 5 85 17 POL 742 LSRKYTSF 8 95 19 NUC 169 LSTLPETTWR 11 -0.0009 75 15 E V 16 LSVPNPLGF 9 100 20 POL 412 LSWLSLDVSA 10 0.0048 10 19 POL 412 LS LSLDVSAA 11 95 15 POL 3 LSYQIIFRK 8 75 15 NUC 137 LTFGRETVLEY 11 85 17 POL 99 LTVNEKRR 8 -0.0002 95 19 E V 176 LVLQAGFF 8 100 20 ENV 339 LVPFVQWF 8 0.0028 90 18 NUC 119 LVSFGVWIR 9 100 20 POL 377 LWDFSQF 8 0.0016 100 20 POL 377 LWDFSQFSR 10 95 19 ENV 238 MCLRRFIIF 9 75 15 ENV 238 MCLRRFI IFLF 11 90 18 POL 539 DDWLGA 8 90 18 POL 539 MDD LGAK 9 90 18 NUC 30 MDIDPYKEF 9 90 18 NUC 30 MDIDPYKEFGA 11 80 16 POL 506 MGVGLSPF 8 80 16 POL 506 GVGLSPFLLA 11 85 17 ENV 360 MMWY GPSLY 10 0.0500 80 16 X 103 MSTTDLEA 8 75 15 X 103 MSTTDLEAY 9 0.0008 75 15 X 103 MSTTDLEAYF 10 75 15 X 103 MSTTDLEAYFK 11 95 19 POL 561 NFLLSLGIH 9 90 18 NUC 75 NLEDPASR 8 -0.0002 95 19 POL 45 NL VSIPWTH 10 95 19 POL 45 NL VS IPWTHK 11 -0.0009 95 15 E V 15 NLSVPNPLGF 10 90 18 POL 411 NLSWLSLDVSA 11 75 15 ENV 215 NSQSPTSNH 9 90 18 POL 738 NSWLSRK 8 0.0006 90 18 POL 738 NSWLSR Y 9 0.0020 100 20 POL 47 NVSIP TH 8 100 20 POL 47 NVSIPWTHK 9 0.820 90 18 POL 775 PADDPSRGR 9 0.0008 95 19 POL 641 PAL PLYA 8 75 15 X 145 PAPCNFFTSA 10 80 16 X 11 PARDVLCLR 9 0.0002 90 18 POL 355 PARVTGGVF 9 75 15 ENV 83 PASTNRQSGR 10 95 19 NUC 130 PAYRPPNA 8 90 18 X 68 PCALRFTSA 9 85 17 X 68 PCALRFTSAR 10 75 15 X 147 PCNFFTSA 8 95 19 ENV 15 PDHQLDPA 8 90 18 ENV 15 PDHQLDPAF 9 95 19 POL 512 PFLLAQFTSA 10 95 19 POL 634 PFTQCGYPA 9 100 20 ENV 233 PGYRWMCLR 9 0.0008 95 19 ENV 233 PGYRWMCLRR 10 0.0048 95 19 ENV 233 PGYRWMCLRRF 11 90 18 POL 616 PIDW VCQR 9 0.0002 100 20 ENV 380 PIFFCLWVY 9 0.0011 85 17 POL 713 PIHTAELLA 9 85 17 POL 713 PIHTAELLAA 10 l 80 16 POL 496 PIILGFRK 8 100 20 ENV 314 PIPSSWAF 8 80 16 ENV 314 PIPSSWAFA 9 100 20 POL 124 PLD G1KPY 9 0.0001 100 20 POL 124 PLDKGIKPYY 10 0.0002 95 19 POL 20 PLEEELPR 8 0.0002 90 16 POL 20 PLEEELPRLA 10 90 19 ENV 10 PLGFFPDH 8 100 20 POL 427 PLHPAAMPH 9 0.0012 95 19 ENV 174 PLLVLQAGF 9 95 19 ENV 174 PLLVLQAGFF 10 80 16 PO:. 711 PLPIHTAELLA 11 100 20 POL 2 PLSYQHFR 8 -0.0002 75 15 POL 2 PLSYQHFRK 9 0.0011 85 17 POL 98 PLTVNEKR 8 0.0002 85 17 POL 98 PLTVNE RR 9 0.0008 80 16 POL 505 PMGVGLSPF 9 85 17 POL 797 PTTGRTSLY 9 0.0001 85 17 POL 797 PTTGRTSLYA 10 95 19 X 59 PVCAFSSA 8 90 IB X 20 PVGAESRGR 9 0.0002 85 17 POL 612 PVNRPIDWK 9 0.0310 95 19 POL 654 QAFTFSPTY 9 0.0030 95 19 POL 654 QAFTFSPTYK 10 0.0450 95 19 POL 654 QAFTFSPTYKA 11 80 16 ENV 179 QAGFFLLTR 9 80 16 ENV 107 QAMQWNSTTF 10 80 16 E V 107 QAMQWNSTTFH 11 95 19 POL 637 QCGYPALMPLY 11 95 19 POL 517 QFTSAICSWR 11 75 15 NUC 169 QSPRRRRSQSR 11 80 16 POL 189 QSSGILSR 8 95 19 POL 528 RAFPHCLA 8 95 19 POL 528 RAFPHCLAF 9 0.0015 95 19 POL 528 RAFPHCIAFSY 11 0.1200 85 17 NUC 28 RDLLDTASA 9 85 17 NUC 28 RDLLDTASALY 11 95 19 X 13 RDVLCLRPVGA 11 100 20 ENV 332 RFSWLSLLVPF 11 95 19 X 56 RGLPVCAF 8 95 19 X 56 RGLPVCAFSSA 11 100 20 NUC 152 RGRSPRRR 8 80 16 POL 762 RGTSFVYVPS 11 90 18 POL 624 RNGLLGF 8 90 18 POL 624 RIVGLLGFA 9 90 18 POL 624 RIVGLLGFAA 10 75 15 POL 106 RLKLIMPA 8 75 15 POL 106 RLKLIMPAR 9 0.0950 75 15 POL 106 RLKLIMPARF 10 75 15 POL 106 RLKLIMPARFY 11 75 15 X 128 RLKVFVLGGCR 11 95 19 POL 376 RLWDFSQF 9 0.0006 95 19 POL 376 RLWDFSQFSR 11 0.2800 95 19 NUC 163 RSPRRRTPSPR 11 -0.0007 75 15 NUC 167 RSQSPRRR 8 75 15 NUC 167 RSQSPRRRR 9 90 18 POL 353 RTPARVTGGVF 11 95 19 NUC 127 RTPPAYRPPNA 11 95 19 NUC 188 RTPSPRRR 8 -0.0002 95 19 NUC 188 RTPSPRRRR 9 0.0054 95 16 POL 818 RVHFASPLH 9 75 15 POL 818 RVHFASPLHVA 11 100 20 POL 357 RVTGGVFIVDK 11 0.0190 90 18 X 65 SAGPCALR 8 -0.0002 90 18 X 65 SAGPCALRF 9 -0.0003 95 19 POL 520 SAICSWR 8 -0.0002 95 19 POL 520 SAICSWRR 9 0.0058 95 19 POL 520 SAICSWRRA 10 95 19 POL 520 SAICS RRAF 11 95 18 POL 771 SALNPADDPSR 11 -0.0004 90 20 POI 165 SASFCGSPY 9 100 18 NUC 121 SFGVWIRTPPA 11 90 19 NUC 46 SFLPSDFF 8 95 15 POL 748 SFPWLIGCA 9 75 15 POL 740 SFPWLLGCAA 10 75 16 POL 765 SFVWPSA 8 80 20 POL 49 SIPWTHKVGNF 11 100 19 ENV 194 SLDSWWTSINF 11 95 19 POL 416 SLDVSAAF 8 95 19 POL 416 SIQVSAAFY 9 0.00016 95 19 POL 416 SLDVSAAFYH 10 75 15 POL 565 SIGIHLNPNK 10 100 20 ENV 337 SLLVPFVQWF 10 95 19 X 54 SLRGLPVCA 9 95 19 X 54 SLRGLPVCAF 10 0.0004 95 18 X 64 SSAGPCALR 9 0.0080 90 18 X 64 SSAGPCALRF 10 -0.0003 90 19 NUC 170 STIPETTWR 10 0.0007 95 19 NUC 170 STLPETTWRR 11 0.0150 95 16 ENV 85 STNRQSGR 8 80 15 X 104 STTDLEAY 8 75 15 X 104 STTDLEAYF 9 75 15 X 104 STTDLEAYFK 10 0.0066 75 15 ENV 17 SVPNPLGF 8 90 18 POL 739 SWLSRKY 8 -0.0002 85 17 POL 739 SWLSRKYTSF 11 95 19 POL 524 SWRRAFPH 9 0.1100 85 17 POL 716 TAELLAACF 9 85 17 POL 716 TAELL7AACFA 10 85 17 POL 716 TAELLAACFAR 11 0.0006 80 16 NUC 33 TASALYREA 9 100 20 E V 311 TCIPIPSSWA 10 100 20 E V 311 TCIPIPSSWAF 11 80 16 X 106 TDLEAYFK 8 90 18 POL 736 TDNSWLSR 9 90 18 POL 736 TDNSWLSRK 10 0.0006 90 18 POL 736 TDNSWLSRKY 11 75 15 NUC 138 TFGRETVLEY 10 95 19 POL 657 TFSPTYKA 8 95 19 POL 857 TFSPTYKAF 9 100 20 POL 359 TGGVFLVQK 9 0.0007 85 17 POL 799 TGRTSLYA 6 95 19 NUC 171 TLPETTWR 9 0.0008 95 19 NUC 171 TLPETTWRR 10 0.0007 95 19 NUC 171 TLPETTWRRR 11 0.0005 100 20 POL i 150 TL KAGILY 9 0.1300 100 20 POL 150 TLWKAGILYK 10 5.3000 100 20 POL 150 TL KAGILYKR 11 0.0082 95 19 POL 519 TSAICSWR 9 0.0005 95 19 POL 519 TSA1CSWRR 10 0.0018 95 19 POL 519 TSAICSWRRA 11 75 15 POL 747 TSFPWLLGCA 10 75 15 POL 747 TSFPWLLGCAA 11 80 16 POL 764 TSFVYVPSA 9 75 15 X 105 TTDLEAYF 8 75 15 X 105 TTDLEAYFK 9 0.0006 85 17 POL 798 TTGRTSLY 8 0.0004 85 17 POL 798 TTGRTSLYA 9 75 15 ENV 278 TTSTGPCK 8 80 16 UC 175 TTWRRRGR 9 0.0008 80 16 NTJC 176 TWRRRGR 8 0.0003 80 16 NUC 176 TWRRRGRSPR 11 95 19 X 60 VCAFSSAGPCA 11 85 17 POL 621 VCQRNGLLGF 11 100 20 POL 379 VDFSQFSR 8 100 20 POL 362 VFLVDKNPH 9 80 16 X 131 VFVLGGCR 8 80 16 X 131 VFVLGGCRH 9 75 15 X 131 VFVLGGCRHK 10 95 19 X 21 VGAESRGR 8 95 19 POL 626 VGLLGFAA 8 95 19 POL 626 VGLLGFAAPF 10 80 16 POL 508 VGLSPFLLA 9 80 16 POL 508 VGLSPFLLAQF 11 95 19 POL 56 VGNFTGLY 8 85 17 POL 96 VGPLTVNEK 9 0.0007 85 17 POL 96 VGPLTVNEKR 10 85 17 POL 96 VGPLTVNEKRR 11 95 19 X 15 VLCLRPVGA 9 95 19 POL 543 VLGAKSVQH 9 90 18 X 133 VLGGCRHK 8 0.0150 80 16 E V 177 VLQAGFFLLTR 11 85 17 POL 741 VLSRKYTSF 9 90 18 UC 120 VSFGV IR 8 0.0040 100 20 POL 48 VSIPWTHK 8 0.0130 100 20 POL 358 VTGGVFLVDK 10 0.0390 100 20 POL 378 WDFSQFSR 9 0.0015 90 18 POL 542 WLGAKSVQH 10 85 17 POL 740 WLSRKYTSF 10 0.0004 95 19 POL 525 WRRAFPH 8 95 19 POL 525 WRRAFPHCLA 11 80 16 NUC 177 WRRRGRSPR 10 0.0027 80 16 NUC 177 WRRRGRSPRR 11 90 18 NUC 102 WFHISCLTF 9 90 16 NUC 102 WFHISCLTFGR 11 85 17 NUC 28 GMDIDPY 8 85 17 NUC 28 WGMDIDPYK 9 -0.0003 85 17 NUC 28 WGMDIDPYKEF 11 85 17 POL 578 WGYSLNFMGY 10 80 16 POL 759 WILRGTSF 8 80 16 POL 759 WILRGTSFVY 10 0.0076 95 19 NUC 125 WIRTPPAY 8 -0.0002 95 19 NX 125 WIRTPPAYR 9 0.0008 90 18 POL 314 WLQFRNSK 8 -0.0002 100 20 POL 414 WLSLDVSA 8 95 19 POL 414 WLSLDVSAA 9 95 19 POL 414 LSLDVSAAF 10 95 19 POL 414 WLSLDVSAAFY 11 0.0034 100 20 EMV 335 WLSLLVPF 8 85 17 RUC 26 LWGMDIDPY 10 0.0002 85 17 NUC 26 WLWGMDIDPYK 11 0.0030 95 19 ENV 237 WMCLRRFIIF 10 0.0004 85 17 ENV 359 WMMWYWGPSLY 11 0.0009 100 20 POL 52 WTHKVGNF 8 100 20 POL 147 YLHTLW A 8 100 20 POL 122 YLPLDKGIK 9 0.0001 100 20 POL 122 YLPLDKGIKPY 11 -0.0004 90 18 NUC 118 YLVSFGVWIR 10 0.0005 90 18 POL 538 YMDDWLGA 9 0.0001 90 18 POL 538 YMDDWLGAK 10 0.0330 80 16 POL 493 YSHPIILGF 9 80 16 FOL 493 YSHPIILGFR 10 80 16 POL 493 YSHIPI ILGFRK 11 85 17 POL 580 YSLNFMGY 8 -0.0002 75 15 POL 746 YTSFPWLLGCA 11 90 18 POL 768 YVPSALNPA 9 Tabla XVII Porción All con información de ligado Conservanc Prec . Proteína Posici Secuencia AA A*1101 ia ón 85 17 POL 721 AACFARSR 8 95 19 POL 632 AAPFTQCGY 9 90 18 776 ADDPSRGR 8 95 19 POL 529 AFPHCLAFSY 10 90 19 X 62 AFSSAGPCALR 11 95 19 POL 655 AFTFSPTY 8 95 19 POL 655 AFTFSPTYK 9 80 16 ENV 180 AGFFLLTR 8 95 19 POL 18 AGPLEEELPR 10 95 19 POL 521 AICSWRR 8 95 19 NUC 41 ALESPEHCSPH 11 90 18 POL 772 ALNPADDPSR 10 85 17 X 70 ALRFTSAR 8 80 16 ENV 108 AMQWNSTTFH 10 80 8 POL 166 ASFCGSPY 8 80 16 POL 822 ASPLHVAWR 9 75 15 ENV 84 ASTNRQSGR 9 80 16 POL 755 CAAN ILR 8 85 17 X 69 CALRFTSAR 9 80 16 X 6 CCQLDPAR 8 75 15 POL 607 CFRKLPV R 9 95 19 POL 638 CGYPALMPLY 10 95 19 ENV 253 CL I FLLVLLDY 11 90 18 X 17 CLRPVGAESR 10 100 20 UC 48 CSPHHTALR 9 95 19 POL 523 CSWRRAFPH 10 90 18 POL 540 DDWLGAK 8 85 17 NUC 29 DLLDTASALY 10 85 17 NUC 29 DLLDTASALYR 11 90 18 POL 73 7 DNSWLSR 8 90 18 POL 73 7 DNSWLSRK 9 90 18 POL 737 DNSWLSRKY 10 85 17 NUC 32 DTASALYR 8 95 19 POL 418 DVSAAFYH 8 90 18 POL 54 1 DWLGAKSVQH 11 95 19 POL 17 EAGPLEEELPR 11 90 18 NUC 40 EALESPEH 8 90 18 POL 718 ELLAACFAR 9 85 17 POL 718 ELLAACFARSR 11 95 19 NUC 43 ESPEHCSPH 9 95 19 NUC 43 ESPEHCS PHH 10 95 19 UC 174 ETTWRRR 8 80 16 NUC 174 ETTWRRRGR 10 95 19 POL 631 FAAPFTQCGY 10 80 16 POL 821 FASPLHVA R 10 75 15 NUC 139 FGRETVLEY 9 75 15 POL 244 FGVEPSGSGH 10 95 19 NUC 122 FGVWIRTPPAY 11 95 19 POL 562 FLLSLGIH 8 95 19 ENV 256 FLLVLLDY 8 100 20 POL 363 FLVDKVPH 8 90 18 X 63 FSSAGPCALR 10 95 19 POL 656 FTFSPTYK 8 95 19 POL 518 FSAICSWR 10 95 19 POL 518 FTSAICSWRR 11 95 19 X 132 FVLGGCRH 8 90 18 X 132 FVLGGCRHK 9 80 16 POL 754 GCAANWILR 9 95 19 POL 630 GFAAPFTQCGY 11 100 20 POL 360 GGVFLVD 8 100 20 POL 360 GGVFLVDKNPH 11 75 15 POL 567 GIHLNPN 8 75 15 POL 567 GIHLNPNKTK 10 75 15 POL 567 GIHLNPNKTKR 11 85 17 NUC 29 G DIDPYK 8 95 19 POL 44 GNLNVSI PWTH 11 90 18 POL 735 GTDNSWLSR 10 90 18 POL 735 GTDNSWLSRK 11 80 16 POL 245 GVEPSGSGH 9 100 20 POL 361 GVFLVDKNPH 10 95 19 NUC 123 GVWIRTPPAY 10 95 19 NUC 123 GVWIRTPPAYR 11 100 20 NUC 47 HCSPHHTALR 10 80 16 POL 820 HFASPLHVAWR 11 95 19 X 49 HGAHLSLR 8 90 18 UC 104 HISCLTFGR 9 75 15 POL 569 HLNPNKTK 8 75 15 POL 569 HLNPNKT R 9 100 20 POL 149 HTLWKAGILY 10 100 20 POL 149 HTLWKAGILYK 11 95 19 POL 522 ICSWRRAFPH 11 90 18 POL 617 IDWKVCQR 8 100 20 ENV 381 IFFCLWVY 8 95 19 ENV 255 IFLLVLLDY 9 80 16 POL 734 IGTDNSWLSR 11 80 16 POL 760 ILRGTSFVY 9 90 18 MUC 105 ISCLTFGR 8 100 20 POL 153 KAGILY R 8 75 15 POL 108 KLIMPARFY 9 80 16 POL 610 KLPVNRPIDWK 11 75 15 X 130 KVFVLGGCR 9 75 15 X 130 KVFVLGGCRH 10 95 19 POL 55 KVGNFTGLY 9 85 17 POL 720 LAACFARSR 9 90 18 X 16 LCLRPVGAESR 11 100 20 POL 125 LDKGIKPY 8 100 20 POL 125 LDKGIKPYY 9 80 16 X 9 LDPARDVLCLR 11 85 17 UC 31 LDTASALY 8 85 17 NUC 31 LDTASALYR 9 95 19 POL 417 LDVSAAFY 8 95 19 POL 417 LDVSAAFYH 9 95 19 POL 544 LGAKSVQH 8 80 16 POL 753 LGCAANWILR 10 75 15 POL 566 LGIHLNPNK 9 75 15 POL 566 LGIHLNPNKTK 11 95 19 ENV 254 LIFLLVLLDY 10 100 20 POL 109 LIMPARFY 8 90 18 POL 719 LLAACFAR 8 85 17 POL 719 LLAACFARSR 10 85 17 NUC 30 LLDTASALY 9 85 17 NUC 30 LLDTASALYR 10 80 16 POL 752 LLGCAA ILR 11 100 20 ENV 378 LLPIFFCLWVY 11 90 18 POL 773 LNPADDPSR 9 90 18 POL 773 LNPADDPSRGR 11 75 15 POL 570 LNPNKTKR 8 75 15 POL 570 LNPNKTKRWGY 11 95 19 POL 46 LNVSIPWTH 11 95 19 POL 46 LNVSIPWTHK 10 95 19 POL 415 LSLDVSAAFY 10 95 19 POL 415 LSLDVSAAFYH 11 75 15 POL 564 LSLGIHLNPNK 11 95 19 NUC 169 LSTLPETTWR 11 75 15 POL 3 LSYQHFRK 8 75 15 UC 137 LTFGRETVLEY 11 85 17 POL 99 LTVNEKRR 8 90 18 NUC 119 LVSFGVWIR 9 100 20 POL 377 LWDFSQFSR 10 90 18 POL 539 MDDWLGA 9 85 17 E V 360 MMWYWGPSLY 10 75 15 X 103 MSTTDLEAY 9 75 15 X 103 MSTTDLEAYFK 11 95 19 POL 561 NFLLSLGIH 9 90 18 NUC 75 NLEDPASR 8 95 19 POL 45 NLNVSIP TH 10 95 19 POL 45 NLNVSIPWTHK 11 75 15 ENV 215 NSQSPTSNH 9 90 18 POL 738 NSWLSRK 8 90 18 POL 738 NSWLSRKY 9 100 20 POL 47 NVSIPWTH 8 100 20 POL 47 NVSIP THK 9 90 18 POL 775 PADDPSRGR 9 80 16 X 11 PARDVLCLR 9 75 15 ENV 83 PAS NRQSGR 10 85 17 X 68 PCALRFTSAR 10 100 20 ENV 233 PGYRWMCLR 9 95 19 ENV 233 PGYRWMCLRR 10 90 18 POL 616 PIDW VCQR 9 100 20 ENV 380 PIFFCL VY 9 80 16 POL 496 PIILGFRK 8 100 20 POL 124 PLDKGIKPY 9 100 20 POL 124 PLDKGIKPYY 10 95 19 POL 20 PLEEELPR 8 95 19 POL 10 PLGFFPDH 8 100 20 POL 427 PLHPAAMPH 9 100 20 POL 2 PLSYQHFR 8 75 15 POL 2 PLSYQHFRK 9 85 17 POL 98 PLTVNEKR 8 85 17 POL 98 PLTVNEKRR 9 75 15 POL 572 PNKTKRWGY 9 85 17 POL 797 PTTGRTSLY 9 90 18 X 20 PVGAESRGR 9 85 17 POL 612 PVNRPIDWK 9 95 19 POL 654 QAFTFSPTY 9 95 19 POL 654 QAFTFSPTY 10 B 0 16 ENV 179 QAGFFLLTR 9 80 16 E V 107 QAMQWNSTTFH 10 95 19 POL 63 7 QCGYPALMPLY 11 95 19 POL 517 QFTSAICSWR 11 75 15 NUC 169 QSPRRRRSQSR 11 80 16 POL 189 QSSGILSR 8 95 19 POL 528 RAFPHCLAFSY 11 85 17 NUC 2 8 RDLLDTASALY 11 100 2 0 NUC 152 RGRSPRRR 8 75 15 POL 106 RLKL IMPAR 9 75 15 POL 106 RLKLIMPARFY 11 75 15 X 12 8 RLKVFVLGGCR 11 95 19 POL 376 RLWDFSQFSR 11 95 19 NUC 183 RSPRRRTPS PR 11 75 15 UC 167 RSQSPRRR 8 75 15 NUC 167 RSQSPRRRR 9 95 19 NUC 188 RTPS PRRR 8 95 19 MUC 188 j RTPSPRRRR 9 8 0 16 POL 818 RVHFASPLH 9 100 2 0 POL 3 57 RVTGGVFLVDK 11 90 18 X 65 SAGPCALR 8 95 19 POL 520 SAICSWR 8 95 19 POL 520 SAICSWRR 9 90 18 POL 771 SALNPADDPSR 11 100 20 POL 165 SASFCGSPY 9 95 19 POL 416 SLDVSAAFY 9 95 19 POL 416 SLDVSAAFYH 10 75 15 POL 565 SLGIHLNPNK 10 90 18 X 64 SSAGPCALR 9 95 19 NUC 170 STLPETTWR 10 95 19 UC 170 STLPETTWRR 11 80 16 E V B5 STNRQSGR 8 75 15 X 104 STTDLEAY 8 75 15 X 104 STTDLEAYFK 10 90 18 POL 739 SWLSRKY 8 95 19 POL 524 SWRRAFPH 9 85 17 POL 716 TAELLAACFAR 11 80 1S X 106 TDLEAYFK 8 90 18 POL 736 TDNSWLSR 9 90 18 POL 736 TDNSWLSRK 10 90 18 POL 736 TDNSWLSRKY 11 75 15 NUC 138 TFGRETVLEY 10 100 20 POL 359 TGGVFLVDK 9 95 19 UC 171 TLPETTWR 9 95 19 NUC 171 TLPETTWRR 10 95 19 NUC 171 TLPETTWRRR 11 100 20 POL 150 TLWKAGILY 9 100 20 POL 150 TLW AGILYK 10 100 20 POL 150 TLWKAGILYKR 11 95 19 POL 560 TNFLLSLGIH 10 95 19 POL 519 TSAICSWR 9 95 19 POL 519 TSAICSWRR 10 75 15 X 105 TTDLEAYFK 9 85 17 POL 798 TTGRTSLY 8 75 15 E V 278 TTSTGPCK 8 80 16 NUC 175 TTWRRRGR 9 80 16 NUC 176 TWRRRGR 8 80 16 NUC 176 TWRRRGRSPR 11 100 20 POL 379 VÜFSQFSR 8 100 20 POL 362 VFLVDKNPH 9 80 16 X 131 VFVLGGCR 8 80 16 X 131 VFVLGGCRH 9 75 15 X 131 VFVLGGCRHK 10 95 19 X 21 VGAESRGR 8 95 19 POL 56 VGNFTGLY 8 85 17 POL 96 VGPLTVNEK 9 85 17 POL 96 VGPLTVNEKR 10 85 17 POL 96 VGPLTVNEKRR 11 95 19 POL 543 VLGAKSVQH 9 90 18 X 133 VLGGCRHK 8 80 16 ENV 177 VLQAGFFLLTR 11 85 17 POL 613 VNRPIDWK 8 90 18 NUC 120 VSFGVWIR 8 100 20 POL 48 VSIPWTHK 8 100 20 POL 358 VTGGVFLVDK 10 100 20 POL 378 WDFSQFSR 9 90 18 POL 542 WLGAKSVQH 10 95 19 POL 525 WRRAFPH 8 80 16 NUC 177 WRRRGRSPR 10 80 16 NUC 177 WRRRGRSPRR 11 90 18 NUC 102 WFHISCLTFGR 11 85 17 NUC 28 WGMDIDPY 8 85 17 UC 28 WGMDIDPYK 9 85 17 POL 578 WGYSLNFMGY 10 80 16 POL 759 ILRGTSFVY 10 95 19 NUC 125 WIRTPPAY 8 95 19 NUC 125 WIRTPPAYR 9 90 18 POL 314 WLQFR SK 8 95 19 POL 414 LSLDVSAAFY 11 85 17 NUC 26 WLWGMDIDPY 10 85 17 NUC 26 WLWGMDIDPYK 11 85 17 ENV 359 WMMWYWGPSLY 11 100 20 POL 122 YLPLDKGIK 9 100 20 POL 122 YLPLDKGIKPY 11 90 18 NUC 118 YLVSFGVWIR 10 90 18 POL 538 YMDDWLGAK 10 80 16 POL 493 YSHPI ILGFR 10 80 16 POL 493 YSHPI ILGFRK 11 85 17 POL 580 YSLNFMGY 8 Tabla XVIII Porción HBV A24 con información de ligado Conservan Frec. Proteína Posicí Secuencia AA pres A*2401 cia ón enta da 95 19 POL 529 AFPHCLAF 8 95 19 X 62 AFSSAGPCAL 10 0.0012 90 18 POL 535 AFSYMDDWL 10 0.0009 95 19 POL 655 AFTFSPTYKAF 11 80 16 ENV 108 AMQWNSTTF 9 100 20 NUC 131 AYRPPNAPI 9 0.0310 100 20 NUC 131 AYRPPNAPIL 10 0.0042 75 15 POL 607 CFRKLPVNRPI 11 85 17 POL 618 DWKVCQRI 8 85 17 POL 618 DWKVCQRIVGL 11 90 18 ENV 262 DYQGMLPVCPL 11 0.0002 90 18 NUC 117 EYLVSFGVW 9 90 18 NUC 117 EYLVSFGVWI 10 100 20 ENV 382 FFCLWVYI 8 80 16 ENV 182 FFLLTRIL 8 80 16 ENV 182 FFLLTRILTI 10 85 17 ENV 13 FFPDHQLDPAF 11 80 16 ENV 181 GFFLLTRI 8 80 16 ENV 181 GFFLLTRIL 9 80 16 ENV 181 GFFLLTRILTI 11 95 19 ENV 12 GFFPDHQL 8 75 15 ENV 170 GFLGPLLVL 9 80 16 POL 500 GFR I PMGVGL 11 85 17 UC 29 GMDIDPYKEF 10 1 90 18 ENV 265 GMLPVCPL 8 85 17 UC 25 GWLWGMDI 8 85 17 ENV 65 GWSPQAQGI 9 0.0024 85 17 E V 65 GWSPQAQGIL 10 0.0003 95 19 POL 639 GYPAL PL 8 95 19 ENV 234 GYRWMCLRRF 10 0.0007 95 19 ENV 234 GYR MCLRRFI 11 75 15 POL 579 GYSLNFMGYVI 11 80 16 POL 820 HFASPLHVAW 10 75 15 POL 7 HFRKLLLL 8 100 20 POL 146 HYLHTLWKAGI 11 100 20 ENV 381 IFFCL VYI 9 0.0087 80 16 E V 245 IFLFILLL 8 80 16 ENV 245 IFLFILLLCL 10 80 16 ENV 245 IFLFILLLCLI 11 85 17 ENV 358 IWMM YWGPSL 11 0.0004 95 19 POL 395 KFAVPNLQSL 10 0.0020 100 20 POL 121 KYLPLDKGI 9 85 17 POL 745 KYTSFPWL 8 85 17 POL 745 KYTSFPWLL 9 * 5.3000 80 16 ENV 247 LFILLLCL 8 80 16 E V 247 LFILLLCLI 9 80 16 ENV 247 LFILLLCLIF 10 80 16 ENV 247 LFILLLCLIFL 11 95 19 POL 643 LMPLYACI 8 90 18 NUC 101 L FHISCL 8 85 17 NUC 101 LWFHISCLTF 10 80 16 POL 492 LYSHPIIL 8 80 16 POL 492 LYSHPI ILGF 10 * 1.1000 85 17 ENV 360 MMWYWGPSL 9 0.0060 85 17 ENV 361 M YWGPSL 8 0.0005 95 19 POL 561 NFLLSLGI 8 95 19 POL 561 NFLLSLGIHL 10 0.0099 80 16 POL 758 N ILRGTSF 9 95 19 POL 512 PFLLAQFTSAI 11 95 19 POL 634 PFTQCGYPAL 10 0.0002 95 19 E V 341 PFVQWFVGL 9 0.0003 80 16 POL 505 PMGVGLSPF 9 80 16 POL 505 PMGVGLSPFL 10 80 16 POL 505 PMGVGLSPFLL 11 80 16 POL 750 PWLLGCAANW 10 80 16 POL 750 P LLGCAA WI 11 100 20 POL 51 P THKVGNF 9 * 0.0290 95 19 E V 344 QWFVGLSPTVW 11 75 15 ENV 242 RFIIFLFI 8 75 15 ENV 242 RFIIFLFIL 9 75 15 ENV 242 RFIIFLFILLL 10 75 15 ENV 242 RFI IFLFILLL 11 100 20 ENV 332 RFSWLSLL 8 100 20 ENV 332 RFSWLSLLVPF 11 85 17 POL 577 RWGYSLNF 8 95 19 ENV 235 RWMCLRRF 8 95 19 ENV 236 RWMCLRRFI 9 * 0.0710 95 19 ENV 236 RWMCLRRFII 10 * 1.1000 95 19 ENV 236 RWMCLRRFI IF 11 100 20 POL 167 SFCGSPYSW 9 * 0.0710 95 19 NUC 46 SFLPSDFF 8 80 16 POL 765 SFVYVPSAL 9 95 19 POL 413 SWLSLDVSAAF 11 100 20 ENV 334 SWLSLLVPF 9 0.3900 95 19 POL 392 SWPKFAVPNL 10 * 5.6000 100 20 ENV 197 SWWTSLNF 8 95 19 ENV 197 SWWTSLNFL 9 * 0.3800 90 18 POL 537 SYMDDWL 8 75 15 POL 4 SYQHFRKL 8 75 15 POL 4 SYQHFRKLL 9 0.0051 75 15 POL 4 SYQHFRKLLL 10 * 0.0660 75 15 POL 14 SYQHFRKLLLL 11 75 15 UC 138 TFGRETVL 8 75 15 NUC 138 TPGRETVLEYL 11 95 19 POL 657 TFSPTYKAF 9 0.0060 95 19 POL 657 TFSPTYKAFL 10 0.0043 95 19 POL 686 VFADATPTGW 10 * 0.0180 75 15 X 131 VFVLGGCRHKL 11 90 18 NUC 102 WFHISCLTF 9 0.0300 95 19 ENV 345 WFVGLSPT 10 * 0.0120 95 19 ENV 345 WFVGLSPTVWL 11 95 19 ENV 237 WMCLRRFI 8 95 19 ENV 237 WMCLRRFII 9 * 95 19 ENV 237 W CLRRFIIF 10 0.0013 95 19 E V 237 WMCLRRFI IFL 11 85 17 ENV 359 WMMWYWGPSL 10 * 95 19 E V 198 WWTSLNFL 8 Tabla XlXa SUPERPORCION HBV DR Prot Secuencia Frec. conser Secuencia ejemplar Posición Frecue Conservan eína núcleo vancia en Poli- ncia cia de de proteína de Secuencia núcleo HBV Secuen ejemplar (%) cia (%) ejempl ar POL F PFD3CG 19 95 LIJ3FAAPFTQCGYPA 628 19 95 POL FADATPTGW 19 95 OQ ADATPGG1A 684 16 80 POL FAVPNLQSL 19 95 WPFAVPNLQSLTNL 393 19 95 NUC FGRETVLEY 15 75 CLTFGRETVLEYLVS 136 14 70 POL PGVEPSGSG 15 75 RRSFGVEPSGSGHID 252 6 30 NUC FHISCLFG 18 90 LLWFHISCLTFGRET 100 17 85 NUC FHLCLIISC 16 80 QLFHLCLIISCSCP 1 10 50 EV FILLLCLIF 16 80 IFI-FILI-LCLIFLLV 245 16 80 EV FLFILLLCL 16 80 FIIFLFIliLCLIFL 243 16 80 ENV FLGPLLVLQ 15 75 TSGFLGPLLVLQAGF 168 15 75 ENV FLLTRILTI 16 80 AGFFLLTRILTIPQS 180 16 80 ENV FLLVLLDYQ 19 95 CXIFIiVLLDYQGML 253 19 95 ENV FPAOGSSSG 15 75 GLYFPAGGSSSGTVN 127 11 55 ENV FPDHQLDPA 18 90 LGFFPDHQLDPAPGA 22 9 45 POL FPHCLAFSY 19 95 RRAFPHCLAFSYMDD 527 19 95 POL FRKIPMGVG 16 80 IlijFRKIPMGVGLSP 498 13 65 POL FRKLPVNRP 16 80 KQCFRKLPVNRPIDW 616 9 45 X FSSAGPCAL 19 95 VCAFSSAGPCALRFT 60 18 90 ENV FSLSLLVP 20 100 SVRFSLSLLVPFVQ 330 16 80 POL FTFSPTYKA 19 95 KQAFTFSPTYKAFLC 653 12 60 POL FTGLYSSTV IB 90 VGNFIX3LYSSTVPVF 56 11 55 POL FTSAICSW 19 95 LAQFTSAICSVVRRA 515 19 95 E V FVGLSFTV 19 95 O PVGI^PTVWLSV 343 14 70 X FVLGGCRHK 18 90 LKVFVLGGCRHKLVC 129 14 70 ENV FVQWFVGLS 19 95 LVPFVCWFVGLSPTV 339 19 95 POL FVYVPSALN 18 90 GTSFVYVPSALNPAD 763 16 80 POL IDWKVCQRI 17 85 RPIDW VCQRIVGL 614 16 80 ENV IFLFILLLC 16 80 RFIIPLF1LLLCLIF 242 15 75 ENV IFLLVLLDY 19 95 LCLIFLLVLLDYQCW 252 19 95 POL ICTDNSWL 16 80 AKLIGTDNSWLSRK 731 13 65 POL ??????,??? 17 85 PLPIHTAELLAACFA 711 16 80 ENV IIFLFILLL 16 80 RRFIIFLFILLLCLI 241 15 75 ENV ILLLCLIFL 20 100 246 16 80 POL ILGTSFVY 16 B0 ANWILRGTSFVYVPS 757 16 80 UC ILSUJPETT 20 100 NAPILS LPETTWR 165 19 95 ENV IPIPSSWAF 20 100 CTCIPIPSSWAFARF 321 8 40 NUC IRTPPAYRP 19 95 GVWIRTPPAYRPPNA 123 19 95 POL LAACFARSR 17 85 AELLAACFARSRSGA 717 16 80 POL LAFSYMDDV 18 90 PHCIAFSY DDVVLG 531 18 90 POL LAQF SAIC 19 95 PFLLAQFTEAICSW 512 19 95 NUC LCLGWLWGM 17 85 ASKLCLGWLWGMDID 19 17 85 ENV LCLIFLLVL 20 100 ILLLCLIFLLVLLDY 249 19 95 X IJCLRPVGAE 19 95 RDVLCLRPVGñESRG 13 18 90 POL IJCOVFADAT 19 95 RPGLCQVFADATPTG 680 11 55 ENV LDSWWTSLN 19 95 PQSLJDSWWTSLNFI-G 192 17 85 UC LSTASALYR 17 85 RDJLIJTrASALYREAL 28 16 80 POL LDVSAAFYH 19 95 WLSLDVSAAFYHIPL 425 11 55 ENV LDYQGMLPV 1B 90 LVUJ3YQG LPVCPL 258 18 90 POL 18 90 A< Pi,[.:nwi.Pki.Ai)kr 18 13 65 EV IJII LCLI 16 80 IIFIJILLLCLIFLL 244 16 80 POL LGA SVQHL 17 85 DW 3AKHVQHLESL 541 16 80 POL LGFAAPFTQ 19 95 VG-J-JGFAAPFTQCGY' 626 19 95 POL LGF KIPMG 19 95 PIIIJSFRKIPMGVGL 496 13 65 POL L£NLNVSIP 19 95 DILNL MI-NVSIPWrH 40 19 95 E V LGPLLVLQA 19 95 SGFTJ3PLLVLQAGFF 169 15 75 POL LHPAAMPHL 20 100 HLPLHPAAMPHLLVG 425 9 45 ENV LIFLLVLLD 19 95 IJXLIFIiVLLDYQG 251 19 95 POL LKLI PARF 15 75 KffixKLIMPARFYP 104 7 35 X UNFVLCGC 15 75 EIRUCVFVLGGCRHK 126 13 65 POL LLAQFTSAI 19 95 SPFLLAQFTSAICSV 511 19 95 UC LLDTASALY 17 85 II^LLCTASALYREA 56 9 45 POL IJ-GCAA WI 16 80 FPWI-IJ3CAA WII-RG 749 15 75 POL U-GFAAPFT 19 95 IVGLLGFAAPFTQCG 625 18 90 E V LLGWSPQAQ 17 85 HGGLLGWSPQAQGIL 60 15 75 ENV LLLCLIFLL 20 100 LFIl lTLIFLLVLL 247 16 80 NUC LLSFLPSDF 19 95 SVRT,T„FLPSDFFPS 41 11 55 POL LLSUJIHLN 19 95 TMFLLSl^IHLNP K 560 15 75 POL LLSSNLSWL 18 90 LTNI-LSSNLSWLSLD 404 18 90 E V LLTRILTIP 16 80 GFFLLT ILTIPQSL 181 16 80 ENV LLVLQAGFF 19 95 LGPIiVLQAGFFIaLT 172 18 90 ENV LLVPFVCWF 20 100 LS JLVPFVQWFVGL 335 19 95 NUC LLWFHISCL 18 90 IRQLLWFHISCLTFG 126 13 65 POL L PLYACIQ 19 95 YPALMPLYA.CIQSKQ 640 11 55 POL IÍJLGNLNVS 19 95 AFI)LNJJGNLNVSIPW 38 19 95 POL IJNPN T RW 15 75 GIHL·^JP^J?t?RWGirs 567 15 75 1 POL L RRVAEDL 17 85 DEGIL ¾RVAEDLNLG 30 12 60 POL LNVSIP TH 19 95 LaOWSIPWTHKVG 43 19 95 NUC LPETTWR 19 95 LSTLPE IWRRRGR 169 16 80 E V LPIFFCL V 20 100 LPLLPIFFCLWVYIZ 376 13 65 POL LPIHTAELL 17 85 VAPLPIHTAELT AAC 709 9 45 POL LPVNRPIDW 16 80 FRKLPVNRPIDW VC 608 15 75 POL LQFRNSKPC 18 90 CWWLQFRNSKPCSDY 312 10 50 X LRGLPVCAP 19 95 HLSLRGLPVCAFSSA 52 18 90 X LRPVGAESR 18 90 VLCIIÍPVGAESRGRP 15 18 90 NUC LRQAILCW3 18 90 HTALRQAILCWGELM 52 18 90 ENV LRRFIIFLF 15 75 WMCLRRFIIFLFILL 237 15 75 NUC LSFLPSDFF 19 95 VKT .T.SFLPSDFFPSI 42 10 50 POL LSLDVSAAF 19 95 LSWLSLDVSAAFYHI 423 11 55 ENV LSLLVPFVQ 20 100 FSWLSLLVPFVQWFV 333 19 95 X LSLRGLPVC 19 95 GAHLSLRGLPVCAFS 50 18 90 POL LSPFLLAQF 19 95 GVGLSPFLLAQFTSA 507 16 80 POL LSR YTSFP 17 85 SVVLSRKYTSFPWLL 739 17 85 POL I£SNLSWLS 18 90 mjLSSNLSWLSLDV 405 18 90 ENV LSVPNPLGF 15 75 GINLSVPNPLGFFPD 13 14 70 POL LS LSLDVS 20 100 SSNLSWLSLDVSAAF 409 17 85 ENV LTIPQSLDS 18 90 TRILTI PQSLDSWWr 186 15 75 POL LTNLLSSNL 18 90 D2SLTOLLSSNLSWL 401 18 90 E V LTRILTIPQ 16 80 FFÜTOILTIPQSLD 182 15 75 POL LVDKNPH T 20 100 GVFLVD NPH TTES 372 11 55 UC LVSFGVWIR 18 90 LE3YLVSPGVWIRTPP 145 14 70 POL LWDFSQFS 20 100 ESRLWDFSQFSRGN 374 9 45 NUC LWFHISCLT 17 85 RQLLWFHISCLTFGR 98 17 85 NUC LWGMDIDPY 17 85 IJSWLWGMDIDPYKEF 24 17 85 POL LWKAGILYK 20 100 LtíILWKAGILYKRET 148 18 90 NUC LYREALESP 17 85 ASALYREALESPEHC 34 17 85 POL LYSHPIILG 16 80 KLHLYSHPIILGFRK 489 16 80 POL MDDWLGAK 18 90 FSYMDDWLGA SVQ 536 18 90 POL MGVGLSPFL 16 80 KIP GVGLSPFLLAQ 503 16 80 POL MPHLLVGSS 17 85 PAAMPHLLVGSSGLS 430 8 40 E V MQWNST FH 16 80 PQAMi^i ST FHQTL 106 8 40 X STTDLFAY 15 75 LSAMSTTDLFAYF D 100 9 45 ENV MWYWGPSLY 17 85 IWM WYWGPSLYNIL 369 9 45 X VCAFSSAGP 19 95 GLPVCAFSSAGPCAL 57 18 90 POL VCQRIVGLL 17 85 DW VCQRIVGLLGEA. 618 17 85 POL VFADATP G 19 95 LCQVFADATPTGWGL 683 19 95 E V VGLSPTVWL 19 95 CHFVGLSFTVWLSVI 344 14 70 POL VGPLTV EK 17 85 QQYVGPLTVNEKRRL 93 8 40 POL VHFASPLHV 16 80 PDRVHFASPIHVAWR 816 12 60 X VLCLRPVGA 19 95 ARi jCLRP GAESR 12 14 70 POL VL3AKSVQH 19 95 DDWLGA SVQHLES 540 16 80 X VLHKRTLGL 17 85 LPKVI-HKRTLGLSA 89 11 55 POL VP LQSLTN 19 95 KFAVPNLQSLTNLLS 395 19 95 UC VQASKLCLG 16 80 CPTVQASKLCLGWLW 14 15 75 ENV VRFSWLSLL 16 80 WASVRPSWLSLLVPF 328 13 65 POL VRRAFPHCL 19 95 CSWRRAFPHCLAFS 523 19 95 POL VSIPWTH V 20 100 NLNVSIPWTHKV=NF 45 19 95 UC VWIRTPPAY 19 95 SFGVWIRTPPAYRPP 121 18 90 POL VYVPSALP 18 90 TSFVYVPSALNPADD 764 16 80 NUC WFHISCLTF 18 90 QLLWFHISCLTFGRE 99 17 85 ENV WFVGLSPTV 19 95 FVQWFVGLSPTVWLS 342 19 95 POL WIL G SFV 16 80 AANWILRCTSFVYVP 756 14 70 UC WIRTPPAYR 19 95 FGVWIRTPPAYRPP 122 19 95 POL WKAGILYKR 20 100 HTLWKAGILYKRETT 149 18 90 POL WLLGCAA W 16 80 SPFWLLGCAAN ILR 748 15 75 POL WLSLDVSAA 19 95 411 17 85 ENV WLSLLVPFV 20 100 RFSWLSLLVPFVQ F 332 20 100 POL WPKFAVPNL 19 95 RVSWPKFAVP LQSL 390 11 55 POL YMDDWLGA 18 90 AFSYTffiDVVLGASV 535 18 90 POL YPALMPLYA 19 95 Q03YPAL PLYACIQ 637 19 95 ENV YQCMLPVCP 18 90 T,T,T,nYQ(3yiLPVCPLIP 260 10 50 NUC YRPPNAPIL 20 100 PPAYRPP APILSTL 129 19 95 ENV YRWMCLRRF 19 95 CPGYRW CLRRFIIF 232 19 95 POL YSHPIII.GF 16 80 LHLYSHPIILGFRKI 490 16 80 POL YSLNFWGYV 15 75 RWGYSIJ FMGYVIGS 588 11 55 POL YVPSAL PA 18 90 SFVYVPSAL PADDP 765 16 80 ENV FFCLWVYIZ 20 382 ENV MCTNLÉSVPN 15 12 Tabla XIXB SUPERPORCION HBV DR con datos de ligado Secuencia Secuencia ER1 DR2 ¾il DP2w2|¾ DR3 DR<tw4 DR4wl5 DR5wll DR5 l2 DR6wl9 DR7 DR8 2 DR9 Drw53 núcleo ejenplar FSAPFigCG I_U37W>FTQCEYPA EAEftTETGW CQEACfiTPIGHaiA 0.2800 EAVPNIQSL 0.0007 0.0013 0.0023 0.0O02 0.0008 o.oieo P3¾EIVLEY CiaTOÍEWLEYL S PGVEPSGSG RRSEU/EPSGSGHID misccrn LLHEHLS CTFGREr FHICLIISC MQIFHICLI 13CSCP F ÜLCLIF 0.0005 0.0041 0.O018 FTÍIUU L FIIFIi LIJ-CLIFL ??£????¾} TSGFUS'LIMÍJBGF FLITRmn 4. 6O0O 0.0420 0.0190 0.0040 5.3O00 0.1500 3.6O0O 0.0700 0.3700 3.10O0 0.2600 1.3000 FLLVLU¾Q FEFGGSSSG GLYFE¾3SSSSGTVN FPCH3IDPA FPtCIAFSY RRAFCTELAFSB D 0.0O1O 0.0010 0.0010 0.0017 0. OOO9 IU3FRKIMAQ_SP ??? o Tabla XXa Porción HBV DR-3A Prot Secuencia Frec. conser Secuencia Posición FrecuenConservan eina núcleo núcleo vancia ejemplar en Poli- cia de cia de de proteína SecuenSecuencia núcleo cia e emplar (%) ejemplar (%) ENV FFPDHQLDP 19 95 PLGFFPDHQLDPAFG 10 9 95 UC FGRETVLEY 15 75 CLTFGRETVLEYLVS 136 14 75 POL FGVEPSGSG 15 75 RESFGVEPSGSGHID 241 6 75 POL FLVDNPHN 20 100 GGVFLVDNPHNTTE 360 11 100 POL IGTDNSWL 16 80 A LIGTDNSWLSRK 731 13 80 POL LEEELPRLA 18 90 AGPLEEELPRIADEG 18 13 90 POL LPLDKGIKP 20 100 TKYLPLDKGIKPYYP 120 20 100 POL LSLDVSAAF 19 95 LSWLSLDVSAAFYHI 412 11 95 POL LWDFSQFS 20 100 ESRLWDFSQFSRGN 374 9 100 NUC LYREALESP 17 85 ASALYREflLESPEHC 34 17 85 NUC MDIDPY EF 17 85 LWGMDIDPYKEFGAS 27 9 85 POL VAEDLNLGN 20 100 Nl^VAEDLNLGNLNV 34 17 100 POL VFADAIPTG 19 95 LOQVFADATPTGWGL 683 19 95 ENV VLLDYQGML 19 95 FLLVLLDYQGMLPVC 256 18 95 POL YMDDWLGA 18 90 AFSYMDDWLGñKSV 535 18 90 ?55 Tabla XXc Porción HBV DR-3B Prot Secuencia Frec. Conser Secuencia ejemplar Posición Frecue Secuencia eína núcleo núcleo vancia en Poli- ncia ejemplar núcleo proteina de (%) HBV Secuen cia ejempl ar X AHLSLRGLP 16 90 DHGAHLSLRGLPVCA 48 18 90.00 POL FSPTYKAFL 19 95 AFTFSPTYKAFLCKQ 655 11 55.00 POL IPWIHKV3J 20 100 VSIPWTHKVGNFIG 47 20 100.00 POL LTVEKRRL 17 85 VGPLTVNEKRRLKLI 96 12 60.00 X VGAESGRP 19 95 LRPVGAESRGRPVSG 18 7 35.00 POL WLSRKYTS 18 90 DNSWLSRKYTSFPW 737 17 85.00 Tabla XXd Porción HBV DR-3B con enlace de información 10 15 Tabla XXI. FRECUENCIA FENOTÍPICA SUPERTIPOS-HLA a. SupertipoE caucásico Negro Japonés Chino Hispano promedio Individual norteamericano ~A2 45.8 39.0 ~ 42.4 45.9 43.0 43.2 A3 37.5 42.1 45. T 52.7 43.1 44.2 B7 38.6 52.7 48.8 35.5 47.1 44.7 Al 47.1 16.1 21. T 14.7 26.3 25.2 A24 23.9 38.9 58.6 40.1 38.3 40.0 B44 43.0 21.2 42.9 39.1 39.0 37.0 B27 28.4 26.1 13.3 13.9 35.3 23.4 B62 12.6 4.8 36.5 25.4 11.1 18.1 B58 10.0 25.1 1.6 9.0 5.9 10.3 b, Supertipos Combinados A2, A3, B7 83.0 86.1 87.5 88.4 86.3 86.2 A2, A3, B7, 99.5 98.1 100.0 99.5 99.4 99.3 A24, B44, Al A2, A3, B7, 99.9 99.6 100.0 99.8 99.9 99.8 A24, B44, Al, B27, B62, ?5T Tabla XXII ANALOGOS HBV Secuencia crren. Por ión Superpo Superpo Porci Superpo 1° Análogo fija Al rcián rción 6n rción Anclaje A2 A3 A24 B7 fijo 10 CILLCLIFL N Y N N N No A 9 RMTGGVFLV VM2 ,V9 N Y N N N 1 A 9 LMPFVQWFV VM2.V9 N Y N N N 1 A 9 RLTGGVFLV VL2. V9 N Y N N N 1 A 9 GLCQVFADV L2. AV9 N Y N N N 1 A 9 WLLRGTSFV IL2. V9 N Y N N N 1 A 9 NLGNLiNVSV L . IV9 N Y N N N 1 A 9 YLPSALNPV VL2. AV9 N Y N N N 1 A 9 GLWIRTPPV VL2. AV9 N Y N N N 1 A 9 RLSWPKFAV VL2. V9 N Y N N N 1 A 9 ILGLLGFAV VL2. AV9 N Y N N N 1 A 9 RMLTIPQSV IM2. LV9 N Y N N N 1 A 9 SLDSWWTSV L2. LV9 N Y N N N 1 A 10 FMLLLCLIFL IM2. LIO N Y N Y N 1 A 10 LMLQAGFFLV VM2.LV N Y N N N 1 A 10 SMLSPFLPLV IM2. LV1 N Y N N N 1 A 10 LMLLDYQQMV VM2. LV N Y N N N 1 A 10 FLGLSPTV V VL2. LV1 N Y N N N 1 A 8 FPAAMPHL N N N N Y A 8 HPFAMPHL N N N N Y A 8 HPAAMPHI N N N N Y A T FMFSPTY N N Y N N A 8 FVFSPTYK N N Y N N A 9 FLLTRILTV L2. IV9 N Y N N N 1 A 9 ALMPLYACV L2. IV9 N Y N N 1 A LLAQFTSAV L2. IV9 N Y N N N 1 A LLPFVQWFV VL2. V9 N Y N N N 1 A FLLAQFTSV L2. AV9 N Y N N N 1 A KLHLYSHIPV L2. IV9 N Y N N N 1 A KLFLYSHPI N Y N N N No A LLSSNLSWV L2. LV9 N Y N N N 1 A FLLSLGIHV L2. LV9 N Y N N N 1 A MMWYWGPSV M2. LV N Y N N N 1 A VLQAGFFLV L2. LV9 N Y N N N 1 A PLLPIFFCV L2. LV9 N Y N N N 1 A FLLPIFFCL N Y N N N No A VLLDYQGMV L2. LV9 N Y N N N 1 A Y FDWLGA N Y N N N NO A GLLGWSPQV L2. AV9 N Y N N N 1 A FPAAMPHLL N N N N Y A HPFAMPHLL N N N N Y A HPAAMPHLI N N N N Y A FPVCAFSSA N N N N Y A LPFCAFSSA N N N N Y A LPVCAFSSI N N N N Y A FPALMPLYA N N N N Y A YPFLMPLYA N N N N Y A YPALMPLYI N N N N Y A FPSRGRLGL N N N N Y A DPFRGRLGL N N N N Y A DPSRGRLGI N N N N Y A SMICSWR N N Y N N A SVICSWRR N N Y N N A KVGNFTGLK N N Y N N A KVGNFTGLR N N Y N N A WFFSQFSR N N Y N N A SV RPIDW N N Y N N A TLWKAGILK N N Y N N A TLWKAGILR N N Y N N A T KAGILY Y N Y N N A T KAGILY N N Y N N A RMYLHTLW N N Y N N A RVYLHTLWK N N Y N N A AMTFSPTY N N Y N N A SWRRAFPR N N Y N N A SWRRAFP N N Y N N A SAIXSWRR N N Y N N A LPVXAFSSA N N N N Y 1 A FLLAQFTSAV L2. IV10 N Y N N N No A YLFTLWKAGI N Y N N N No A YLLTLW AGI N Y N N N No A LLFYQGMliPV N Y N N N No A LLLYQGMLPV N Y N N N 1 A LLVLQAGFFV L2. LV10 N Y N N N 1 A ILLLCLIFLV L2. LV10 N Y N N N A FPFCLAFSYM N N N N Y A FPHCLAFSYI N N N N Y A FPARVTGGVF N N N N Y A TPFRVTGGVF N N N N Y A TPARVTGGVI N N N N Y A FPCALRFTSA N N N N Y A GPFALRFTSA N N N N Y A GPCALRFTSI N N N N Y A 10 FPAAMPHLLV N N N N Y A 10 HPFAMPHLLV N N N N Y A 10 HPAAMPHLLI N N N N Y A 10 QMFTFSPTY N N Y N N A 10 QVFTFPTYK N N Y N N A 10 TMWKAGILYK N N Y N N A 10 TVWKAGILYK N M Y N N A 10 VMGGVFLVDK N N Y N N A 10 WGGVFLVDK N N Y N N A 10 SMLPETTWR N N Y N N A 10 SVLPETTWR N N Y N N A 10 TMPETTWRR N N Y N N A 10 TVPETTWRR N N Y N N A 10 HTL KAGILK N N Y N N A 10 HTLWKAGILR N N Y N N A 10 HMLWKAGILY Y N Y N N A 10 HVLWKAGILY N N Y N N A 10 GMDNSWLSR N N Y N N A 10 GVDNSWLSR N N Y N N A 10 GTFNSWLS N N Y N N A 10 YMFDWLGAK N N Y N N A 10 MMWYWGPSLK N N Y N N A 10 MMWYWGPSLR N N Y N N A 9 ILLLXLIFL N Y N N N A 9 LLLXLIFLL N Y N N N A 9 LLXLIFLLV N Y N N N A 9 PLLPIFFXL N Y N N N A 9 ALMPLYAXI N Y N N N A 9 GLXQVFADA N Y N N N A 9 HISXLTFGR N N Y N N A 9 FVLGGXRHK N N Y N N A 10 FILLLXLIFL N Y N N N A 10 ILLLXLIFLL N Y N N N A 10 LLLXLIFLLV N Y N N N A 10 LLPIFFXLWV N Y N N N A 10 QLLWFHISXL N Y N N N A 10 LLGXAANWIL N Y N N N A 10 TSftlXSWRR N N Y N N A 10 GYRWMXLRRF N N N Y N A 10 GPXALRFTSA N N N N Y A 10 FPHXLAFSYM N N N N Y A 11 H LWKAGILYK N N Y N N A 11 HVLWKAGILYK N N Y N N A 11 SMLPETTWRR N N Y N N A 11 SVLPETTWRR N N Y N N A '11 GMDNSWLSRK N N Y N N A 11 GVDNSWLSRK N N Y N N A 11 GTFNSWLSRK N N Y N N A 8 MPLSYQHI N N N N Y A 8 LPIFFCLI N N N N Y A 8 SPFLLAQI N N N N Y A 8 YPALMPLI N N N N Y A s VPSALNPI N N N N Y A 9 LPIFFCLWI N N N N Y A 9 LPIHTAELI N N N N Y A 10 VPFVQWFVGI N N N N Y A 11 NPLGFFPDHQI N N N N Y A 11 LPIHTAELLAI N N N N Y A FLPSYFPSA L2. FYB N Y N N N Rev3 A YLHTLWKAGV L2. IV10 N Y N N N 1 A STLPETYWRR N N Y N N A YMDDWLGV M2. AV9 N Y N N N 1 A FPIPSSWAF N N N N Y A IPITSSWAF N N N N Y A IPILSSWAF N N N N Y A FPVCLAFSY N N N N Y A FPHCLAFAY N N N N Y A FPHCLAFSL N N N N Y A IPIPMSWAF N N N N Y A FPHCLAFAL N N N N Y A FLPSZFFPSV N Y N N N No A FLPSZFFPSV N Y N N N No A IPFPSSWAF N N N N Y A IPIPSS AI N N N N Y A FPFCLAFSY N N N N Y A FPHCLAFSI N N N N Y A FPHCLAFSA N N N N Y A FQPSDYFPSV N Y N N N Rev A YLLTRILTI N Y N N N A FLYTRILTI N Y N N N A FLLTYILTI N Y N N N A FLLTRILYI N Y N N N A FLPSDFFPSVR N N Y N N A FLPDFFPS N N N N N A FLPSDFFP N N N N N A FLPSDFFPSI L2. VI10 N Y N N N Re A FLPSDYFPSV N Y N N N No A YSFLPSDFFPSV N N N N N A YNMGL FRQL N N N N N A NMGLKYRQL N Y N Y N A FLPS (X) YFPSV N N N N N No A FLPSD (X) FPSV N N N N N A FLPSDLLPSVR N N Y N N A FLPSDFFPSVRD N N N N N A LSFLPSDFFPSV N N N N N A SFLPSDFFPSV N N N N N A PSDFFPSV N N N N N A FLMSYFPSV N Y N N N A FLPSYFPSV L2. FY5 N Y N N N A FLMSDYFPSV N Y N N N NO A CILLLCLIFLL N Y N N N 3 A FLPNDFFPSA N Y N N N No A FLPDDFFPSA L2. SN4 N Y N N N No A FLPNDFFPSA L2. SD4 N Y N N N Rev A FLPNDFFPSV N Y N N N NO A FLPSDFFPSA L2. A10 N Y N N N Rev A FLPDDFFPSV N Y N N N NO A FLPADFFPSV N Y N N N Rev A FLPVDFFSV N Y N N N No A FLPADFPSI L2. SA4 N Y N N N No A FLPVDFFPSI L2. SV4 N Y N N N No A FLPSDAFPSV N Y N N N Rev A FLPSAFFPSV N Y N N N Rev A FLPSDFAPSV N Y N N N No A FLPSDFFASV N Y N N N No A FLPSDFFPAV N Y N N N No A FLASDFFPSV N Y N N N NO A FAPSDFFPSV LA2.V10 N Y N N N No A ALPSDFFPSV N Y N N N No A YLPSDFFPSV N Y N N N Rev A FMPSDFFPSV LM2.VI N Y N N N No A FLKSDFFPSV N Y N N N No A FLPSEFFFPSV N Y N N N 1 A FLPSDFYPSV N Y N N N No A FLPSDFFKSV N Y N N N No A FLPSDFFPKV N Y N N N No A FLPSDFFPSV(CO NH2) VLEYLVSFG ( H 2) ATVELLSFLPSDF FPSV- H2 TVELLSFLPSDFF PSV-NH2 VELLSFLPSDFFP SV-NH2 ELLSFLPSDFFPS V-NH2 LLSFLPSDFFPSV -NH2 LSFLPSDFFPSV- NH2 SFLPSDFFPSV- NH2 FLPSDFFPSV- Tabla XXIII: Inmunogenicidad de péptidoe derivados de HBV.

Inmunogenicidad Superpoc Péptido Secuencia Proteína XRN Priiraria Trans Paciente gener ión génic B al a Superpor 924.07 FLPSDFFPSV HBV núcleo 18 5 10/10 6/6 25/32' + ción A2 1069.06 LiVPFVQWFV HBV env 338 5 3/4 6/9 + 1147.13 FLLAQFTSAI HBV pol 513 5 0/3 des 1090.77 YMDDWLGV HBV pol 538 5 9/9 + 777.03 FLLTRILTI HBV env 183 4 14/23* + 927.15 ALÍ4PLYACI HBV pol 642 4 10/12 3/5 2/15* + 1013.01 WLSLLVPFV HBV env 335 4 2/6 5/9 23/29* + 1069.05 LLAQPTSAI HBV pol 504 4 0/4 0/5 des 1132.01 LVPFVt_jFV HBV env 339 4 0/3 0/4 des 1147.14 VLLDYCGMLfV HBV env 259 4 4/4 6/6 + 927.41 LLSSNLSWL HBV pol 992 3 0/4 0/3 des 92742 LS LSIXIV HBV pol 411 3 2/8 + 927.43 KLHLYSHPI HBV pol 489 3 0/4 4/6 + 1069.07 FLLAQFTSA HBV pol 503 3 1/2 0/3 + 1168.02 GLSRYVARL HBV pol 455 3 + 9/13* + Superpor 927.11 FlLSIfilHL HBVpol 5S2 2 15/22 12/13 9/15* + ción A2 927.47 HLYSHPIIL HBV pol 1076 2 10/14 + 1039.03 MMWYW3PSL HBV env 360 2 3/4 0/4 + 1069.12 YLHTLWKAGV HBV pol 147 2 2/4 + 1137.02 LLDYQGMLPV HBV env 260 2 1/2 0/4 + 1142.07 GLLGWSPQA HBV env 62 2 3/4 5/6 + 1.0573 ILRGTSFVYV HBV pol 773 1 3/7b + 1013.14 VLQAGFFLL HBV env 177 1 0/4 5/12 + 1069.10 LLPIFFCLW HBV env 378 1 3/3 0/4 2/5c + 1069.13 PLLPIFFCL HBV env 377 1 0/4 7/12 + 1090.06 LLVLQAGFFL HBV env 175 1 1/5 0/4 + 1090.12 YLVSFGVWI HBV nuc 118 1 9/9 + 1.0518 GLSPTVWLSV HBV env 33T 1 3/9" + 1090.14 Y 3DVVLGA. HBV pol 538 1 2/7 2/5 2/7b + Superpor 1147.16 HILWAGILYKS HBV POL 149 5 0/6 3/3 1/22 + ción A3 1083.01 TLPE TWRR HBV núcleo 141 4 3/5 6/6 8/32 + 1150.51 GSTHVSWPK HBV pol 398 4 3/6 des 1.0219 FVLGGCHK HBV adr "X" 3 0/4 + 1550 + 1069.16 VSIPWTHK HBV pol 47 3 0/8 0/3 1/21 + 1069.20 LWDFSOFSR HBV pol 388 3 0/4 6/6 1/22 + 1090.10 QAFFSPTYK HBV pol 665 3 3/6 0/3 3/21 + 1090.11 SAICSWRR HBV pol 531 3 1/4 2/22 + Superpor 1069.15 TLWAGILYK HBV pol 150 2 3/8 0/3 5/28 + ción A3 1142.05 KWaJFTCLY HBV adr POL 2 0/3 2/22 + 629 Superpor 1147.05 FPHCLAFSYM HBV POL 530 5 1/3 0/12 + ción B7 988.05 LPSDFFPSV HBV núcleo 19- 4 2/16 + 27 1145.04 IPIPSSWAF HBV ENV 313 4 0/4 1/12 + 1147.02 HPAAMPHLL HBV POL 429 4 0/5 0/12 des 1147.06 LPVCAFSSA HBV X 58 4 1/4 + 1147.08 YPALMPLYA HBV POL 60 4 0/12 des 1145.08 FPHCLAFSYM HBV POL 541 3 0/4 des Superpor 1147.04 TPARVTOGVF HBV POL 354 2 2/12 + ción B7 La evaluación de inmunogenicidad de cultivos primarios, pacientes agudos (a-Bertoni et al., J. Clin. Invest. 100:503, b-Rehermann et al., J. Clin. Invest 97:1655, c- Nayersina et al., J. Immunol . 150:4659) o ratones transgénicos . Una evaluación positiva (+) se asigna cuando se han notado respuestas en uno de estos sistemas. Des = desconocido.

Tabla XXIV. Ensayos de ligado MHC-péptido: líneas celulares y ligandos radioetiquetados A. Ensayos de ligado clase I Péptido Radioetiquetado Espe Antígeno xAlelo Línea celular Fuente Secuencia cies Huma Al A*0101 Steinlrn Hu.J cadena 102-110 YTAWPLVY no A2 A*0201 JY HBVC 18-27 F6->Y FLPSDYFPSV A2 A*0202 P815 (transfectado) HBVc 1T-27 F6->Y FLPSDYFPSV A2 A*0203 FU HBVc 18-27 F6->Y FLPSDYFPSV A2 A*0206 CLA HBVc 18-27 F6->Y FLPSDYFPSV A2 A+0207 721.221 (transfectado HBVc 1B-27 F6->Y FLPSDYFPSV A3 OO107 No natural (A3C0N1) KVFPYALINK All BVR No natural (A3O0N1) KVFPYALIN A24 A*2402 AS116 No natural (A24CON1) AYTDNYNKF A31 A*3101 SPAOÍ No natural (A3C0N1) KVFPYALINK A33 A*3301 LWAGS No natural (A3O0N1) KVFPYALINK A28/68 A*6801 CIR HBVc 141-151 T7->Y STLPETYWRR A28/68 A*6802 AMAI HBV pol 646-654 C4->A FTOAGYPAL B7 B*0702 GM3107 A2 sec. señal 5-1 (L7->Y) APTLVYLL B8 B*0801 Steinlin HIV gp58S-593 Y1->F,Q5->Y FLKDYQLL B27 B*270B LG2 R 60B FRYNGLIHR B35 B*3501 CIR,BVR No natural (B35Q0N2) FPFKYAAAF B35 B*3S02 ???? No natural (B35CON2) FPFKYAAAF B35 B*3503 EHM No natural (B35O0N2) FPFKYAAAF B44 B*4403 PITOUT EF-1 G6->Y AEMGKYSFY B51 AS116 No natural (b3500N2) FPFKYAAAF B53 B*5301 AMAI No natural (B35O0N2) FPFKYAAAF B54 B*5401 ?G3 No natural (B35CDN2) FPFKYAAAF CV4 CV*0401 CIR No natural (C400N1) QYDDAVYKL Cw6 Cw*0602 721.221 transfectado No natural (C6C0N1) YRKDQGNVL Cw7 CW0702 721.221 transfectado No natural (C6CCM) YRHDGGNVL Rató G> EL4 Adenovirus ElA P7->Y SGPSNTYPEI n Kf EL4 VSV NP 52-59 RGYVFQGL ?T15 K-V-IIIB ENV G4->Y RGPYRAFVTI P815 No natural (KdCCNl) KFNPMKTYI Ld P815 HBVs 28-39 IPQSLDSYWTSL B. Class II Péptido Radioetiquetado Espe Antígeno Alelo Línea celular Fuente Secuencia cíes Huma DR1 DRB1*0101 LG2 HA Y307-319 YPKYVKQNTI±KLAT no DR2 DRB1*1501 L466.1 MBP 88-102Y WHFFNTVTPRTPPY DR2 DRB1*1601 L242.5 No natural (760.16) Y7AAFAAAKTAAAFA DR3 DRB1*0301 MAT T 65kD Y3-13 YTIAFDEEARR DR4w4 DRB1*0401 Preisa No natural (717.01) Y7ARFQSQTTLKQKT DR4wlO DRB1*0402 YAR No natural (717.10) YARFQRGTTLKAAA DR4 l4 DRB1*0404 BUJ 40 No natural (717.01) YARFQSCTTLQKT DR4wl5 DRB1*0405 ?G3 No natural (717.01) YARPQSCTnLKQK DR7 DRB1*0701 Pitout Tcx. Tet. 830-843 QYIKANSKFIGITE DR8 DRB1*0802 OLL Tox. Tet. 830-843 QYIKANSKFIGITE DR8 DRB1+0803 LUY Tox. Tet. 830-843 QYIKANSKFIGITE DR9 DRB1*0901 HID Tox. Tet. 830-843 QYIKANSKFIGITE DR11 DRB1*1101 Swsig Tox. Tet. 830-843 QYIKANSKFIGITE DR12 DRB1*1201 Herluf Péptido eluido desc. EALIHQLKINPYVLS DR13 DRB1*1302 H0301 Tox. Tet. 830-843 S->A QYIKANAKFIGITE DR51 DRB5*0101 GM3107 ó L416.3 Tox. Tet. 830-843 QYIKANAFIGITE DR51 DRB5*0201 L255.1 HA 307-319 PKYVKQNTLKLAT DR52 DRB3*0101 MAT ?a?. Tet. 830-843 NGQI-NDPNRDIL DRS3 DRB4*0101 L257.6 No natural (717.01) YñRí^OTrLKQKT DQ3.1 QA1*0301/DQB PF No natural (ROIV) AHAAHAAHAAHAAHAA 1*03 Rató IAb DB27.4 No natural (ROIV) AHñAHASHAAHAAHAA n IAd A20 No natural (ROIV) AHAAHAAHAAHAAHAA IAk Oí-12 HEL 46-61 y TDGSTDYGILQlSR IAB LS102.9 No natural (ROIV) ??7????????????? IAU 91.7 No natural (ROIV) AHAAHAAHAAHAAHAA H? A20 Represor lambda 12-26 YLEDARRKAIYEKK IE CH-12 Represor lambda 12-26 YIiEDARRKKAIYE K Tabla XXV. Anticuerpos usados en purificación MHC.

Anticuerpos monoclonales Especi icidad W6/32 HLA-class I B123.2 HLA-B y C IVD12 HLA-DQ LB3.1 HLA-DR Ml/42 H-2 class I 28-14-8S H-2 Db Y Ld 34-5-8S H-2 Dd B8-24-3 H-2 Kb SF1-1.1.1 H-2 d Y-3 H-2 Kb 10.3.6 H-2 IAk 14.4.4 H-2 Ied, IEK MKD6 H-2 IAd Y3JP H-2 lab, las, Tabla XXVI: Ligado in vitro de peptidos derivados de HBV conservadores para alólos del supertipo HLA-A2 Capacidad de ligado del supertipo A2 (IC50 nM) Péptído AA Moléc lera Pos Secuencia Cons A*02 A*0202 A*020 A*0206 A*6802 Al ula v.1 01 3 el ?? li ga do S 924.07 10 ücle 18 FLPSDFFPSV 95 2.5 2.1 6.0 3.0 36 5 1069.06 10 OEENV 349 LLVPFVQ FV 95 7.5 11 5.9 13 286 5 1147.13 10 POL 524 FLIAQFTSAI 95 24 134 1.4 34 455 5 1013.0102 9 ENV 346 WLSLLVPFV 100 4.6 113 1.4 10 1290 4 ¦ J¾ 777.03 9 ENV 183 FLLT ILTI 80 9.8 100 1.3 19 4 927.15 9 POL 653 ALMPLYACI 95 10 126 3.0 160 851 4 1069.05 9 POL 525 LLAQFTSAI 95 50 16 3.0 1538 51 4 1132.01 9 ENV 350 LVPFVOWFV 95 119 287 2083 463 14 4 1147.14 11 ENV 259 VI-II3YQJ1LPV 90 8.6 20 2.0 13 2353 4 1090.77 9 POL 538(a) YMDDWLGV 90 5.1 90 6.7 71 1905 4 1069.071 9 POL 524 FLLAQFTSA 95 6.0 1654 9.1 39 870 3 927.46 9 POL 500 KLHLYSHPI 95 72 126 3.7 627 26667 3 927,42 9 POL 422 NLSWLSLDV 90 77 843 16 2313 404 3 1168.02 9 POL 455 GLSRYVARL 90 79 391 18 12333 - 3 927.41 9 POL 418 LLSSNLSWL 90 455 55 2.6 1370 4000 3 1039.031 9 ENV 360 MMWYWGPSL 85 5.6 5375 833 112 3636 2 927.11 9 POL 573 FLLSLGLHL 95 7.7 4300 1000 34 11429 2 1142.07 9 ENV 73 GLLGWSPQA 85 13 14333 286 1429 - 2 927.47 9 POL 502 HLYSHPIIL 80 23 14333 11 2176 755 2 1137.02 10 ENV 271 U_DY031LFV 90 51 - 500 552 2 1069.09 9 ENV 270 VLI_DYQ(_ML 95 114 - 476 4111 2 1069-14 10 JC 168 ILSTLPETTV 100 238 506 130 1194 5970 2 1069.11 10 POL 147 YLHTLWKAGI 100 313 8600 ie 4000 1250 2 1142.01 9 UC 129 LLWFlilSCL 90 385 21500 238 1194 4082 2 1090.12 9 UC 147 YLVSFGVWI 90 13 1 1,0518 10 ENV 359 GLSPTVWLSV 75 16 1 1013.1402 9 ENV 177 VLQAGFFLL 95 33 2389 3704 1974 6349 1 1069.13 9 ENV 386 PLLPIEFCL 100 77 5556 3364 8511 1 1069.10 10 ENV 389 LLPIFFCLWV 100 156 5375 667 5000 1 1090.06 10 ENV 175 IJJVLQAGFFL 90 161 1162 2222 2467 3636 1 1.0895 10 ENV 248 FILLLCLIFL 80 179 1 927.24 9 POL 770 WILRCTSFV 80 185 1 1090.14 9 POL 538 YMDDWLGA. 90 200 - 4167 - 1 3.0205 10 ENV 171 FLGPIi,VIi3A 75 263 1 1069.08 10 ENV 260 ILLLCLIFLL 100 263 - - 2846 26667 1 1.0573 10 POL 773 ILCTSFVYV 80 313 1 1. Frecuencia de secuencia completa entre revisados aislados 2. Número de ligados de alelos de supertipo. Péptidos que ligan 3 o más alelos se consideran degenerados. 3. Un guión (-) indica IC50.

Tabla XXVII: Ligado in vitro de péptidos derivados de HBV conservados para alelos del supertipo HLA-A3.

Capacidad de ligado del supertipo A3 Alel (1C50 nM) os Páptido AA Molécula lera Secuencia Cons A*03 A*ll A*3101 A*3301 A*6801 Enla Poa V.1 ce 26.0535 11 XNUCFUS 299 GVWI TPPAYR 95 58 35 3.0 40 12 5 114"' .16 11 Pol 149 HTLW AGILY 100 20 14 4T6 403 42 5 26.0539 11 POL 376 RLWDFSQFSR 95 39 2.0 7.0 24 1.0 5 26.0149 9 X 69 CALRFTSAR 85 3235 261 12 3-6 11 4 1.0993 9 X 130 VFVLGGCR 75 262 73 30 40B 2667 4 26.0153 9 X 64 SSAGPCALR 90 1375 43 55 1S1 11 4 1083.01 11 núcleo 141 STLPETTWRR 95 733 4.0 180 181 26 4 20 - 0130 9 Pol 655 AFTFSPTYK 95 42 150 3103 131B2 296 3 26.0008 8 POL 565 FTFSPTYK 95 193 136 1286 1000 73 3 1.0219 9 X 1550 FVLGGCRHK 80 169 316 1500 744 103 3 1069.20 10 POL 388 LWEFSQFSR íoo 6875 17 692 126 16 3 J 1069.16 9 POL 47 NVSIPWTHK 100 134 105 2900 250 3 1090.10 10 POL 665 QAFTFSPTY 95 244 11 1B000 5088 6.7 3 1090.11 9 POL 531 SAJCSWRR 95 1897 29 1200 446 21 3 20.0131 9 Pol 524 SWRRAFPH 95 100 10 621 500 3 26.0545 11 XNUCFUS 318 TLPETTWRRR 95 22000 375 2951 408 13 3 26.0023 s XNUCFUS 296 VSFGVWIR 90 2750 207 240 1074 222 3 1142.05 9 POL 55 KVGNFTGLY 95 52 353 2 1142.06 9 POL 623 PVNRPIDWK 85 355 43 - BB89 2 1.0975 9 POL 106 RLKLI PAR 75 116 5.8 592 2 1.0562 10 POL 576 SLGIHLNPNK 75 55 77 2 1069.21 10 NUC 170 STLPETTWR 95 15714 100 2250 1208 320 2 1069.22 10 NUC 171 TLPETTWRR 95 15714 261 2417 182 2 1069.15 10 POL 150 TLWKAGILYK 100 2.1 17 3529 29000 615 2 1.0215 9 X 105 TTDLEAYF 75 18333 6.5 24167 471 2 1069.17 10 POL 369 VTGGVFLVDK 100 2T2 65 3636 2 1069.19 9 POL 389 WDFSQF3R 100 7333 80 13346 1706 242 2 26.0026 B POL 163 ASFCGSPY 100 239 26 20000 2 26.0549 11 ENV 3T9 LLPIFFCLWVY 100 478 10000 2609 644 82 2 26.0S5O 11 POL 528 RAFPHCLAFSY 95 92 15 667 26364 2667 2 1090.04 10 POL. 746 GTDNSWLSR 90 11000 143 6000 15263 10000 1 1069.04 10 POL 149 HTLWKAGILY 100 250 7500 SS29 6667 1 1.0205 9 POL 771 ILRGTSFVY 80 250 1 1090. OS 9 NUC 148 LVSPGV IR 90 3929 500 1 1039.01 10 ENV 360 MMVrfWGPSLY 85 220 7500 26667 i - 1.0584 10 X 104 STTDLEAYF 75 1667 2.2 1 1147.17 11 Pol 735 GTDNSWLSRK 90 786 11 1 1147.18 11 Pol 357 RVTGQVFLVD 100 578 207 1 1099.03 s POL 150 TLW AGILY 100 85 7500 1 1090.15 10 POL 549 Y DDWLGA 90 333 1395 - - 1 26.0024 8 POL 50 VS1PWTHK 100 846 353 5806 22308 20000 1 1. Frecuencia de secuencia completa entre revisados aislados 2. Número de ligados de alelos de supertipo. Péptidos que ligan 3 o más alelos se consideran degenerados. 3. Un guión (-) indica IC50.

Tabla XXVIII : ligado in vitro de péptidoa derivados de HBV conservados para alelos del supertipo HLA-B7 Capacidad de ligado del supertipo B7 Lig (leso ) ado de Péptido 7??. Msléc lera Secuencia Cons B*0702 B*3501 B*5101 B*5301 B*5401 Ale nía Pos v 1 IOB 1147.05 10 POL 541 FPHCLAFSYM 95 56 33 61 118 208 5 1145.04 9 ENV 324 IPIPSSWAF 100 42 2.6 2.3 12 2941 4 1147.02 9 POL 440 HP7AAMPHLL 100 56 267 500 186 833 4 1147.06 9 X 58 LPVCAFSSA 95 115 101 500 10333 0.53 4 1147.08 9 POL 651 YPAIMPLYA. 95 306 150 162 664 0.63 4 988.05 9 NUCLEO 19 LPSDFFPSV 95 1774 343 90 120 4.B 4 1145.08 9 POL 541 FPHCLAFSY 95 14 83 17 503 3 19.0014 8 POL 640 YPALMPLY 190 13750 28 13 207 1786 3 26.0570 11 pol 640 YPALMPLY7ACI 95 1375 - 117 291 143 3 1147.04 10 POL 365 TPARVTGGVF 90 17 12 - 939 16667 2 15.0034 9 ENV 390 LPIFFCLWV 100 - - 57 2325 53 2 20.0140 9 POL 723 LPLHTAELL 85 1375 114 1058 30 20000 2 19.0006 8 ENV 340 VPFVOWFV 95 5500 - 0.29 - 91 2 19.0007 8 ENV 379 LPIFFCLW 100 - - 153 66 2857 2 19.0010 a POL 1 MPLSYQHF 100 - 742 458 251 526 2 19.0011 8 POL 429 HPAAMPHL 100 85 18000 18 2514 625 2 19.0012 8 POL 511 SPFLLAQF 95 10 8000 306 10333 1075 2 26.0566 11 Pol 511 SPFLLAQF SA 95 67 - - - 0.83 2 1147.01 9 POL 789 DPS GKLGL 90 458 - - - - 1 16 0182 10 X 67 GPCALRÍTSA 90 61 - - - 2857 1 20 0273 10 POL 440 HPAA PHLLV 85 344 3600 705 664 588 1 15 0030 9 ENV 191 IPQSLDSWW 90 - - 27500 62 1 15 0210 10 POL 123 LPLDGIKPY 100 - 248 27500 - 1 16 0006 9 EV 25 FPDHQLDPA 90 - 8000 - 12 1 16 0177 10 ENV 324 IPIPSSWAFA 80 4231 3000 6643 22 1 16 0180 10 POL 644 APFTQCGYPA 95 1897 - - 7.1 1 16 0181 10 POL 723 LPIHIAKIJA 85 3056 6545 5813 30 1 19 0003 ? ENV 173 GPLLVLQA. 95 18333 - 500 1538 1 19 0005 8 ENV 313 IPIPSSWA 100 13750 18000 2895 - 167 1 19 0009 ? UC 133 RPPNAPIL 100 724 - 196 - - 1 19 0015 8 POL 659 SPTYKAFL 95 14 - 2895 - - 1 19 0016 8 POL 769 VFSALNPA 90 5000 - 786 - 10 1 26 0554 11 Pol 633 APFIQ03YPAL 95 24 7200 13750 - 1075 1 26 0559 11 POl 712 LPfflTAELLAA 85 611 2667 - 775 3.6 1 26 0561 11 Pol 774 PADDPSRGRL 90 458 - - - - 1 26 0564 11 Kücle 133 PPUAPILSTL 100 42 - 3056 - 1 26 0567 11 o 49 SPHHIALRQAI 100 9.5 - 13750 18600 - 1 26 0568 11 Núcle 354 TPARVTOGVFL 90 58 - - 18600 20000 1 o pol 1. Frecuencia de secuencia completa entre revisados aislados 2. Número de ligados de alelos de supertipo. Péptidos que ligan 3 o más alelos se consideran degenerados. 3. Un guión (-) indica IC50.

Tabla XXIX; péptidoa que contiene la porción Al y A24 derivada de HBV a. péptidos de porción Al El guión indica IC50 nM b. péptidos de porción A24 Péptido Molécula Posición Secuencia Conserv. Ligado HLA-A*2 02 (IC50 nM) 20.0271 POL 392 SWPKFAVPNL 95 2.1 1069.23 POL 745 KYTSFPWLL 85 2.3 2.0181 POL 492 LYSHPII1GF 80 11 20.0269 ENV 236 RWMCLRRFII 95 11 20.0136 ENV 334 SWLSLLVPF 100 31 20.0137 ENV 197 SWWI5LNFL 95 32 20.0135 ENV 236 RW CLRRFI 95 169 20.0139 POL 167 SPCGSPYSW 100 169 2.0173 POL 4 75 182 2.0060 1224 QYPALMPLY 95 245 13.0129 NUC 117 EYLVSPGVWI 90 353 1090.02 Núcleo 131 AYRPEMAPI 90 387 13.0073 NUC 102 WKHISCLTF 80 400 20.0138 POL 51 PWIHKVCHF 100 414 guión indica IC50 nM Tabla XXX : Inmunogenicidad de péptidoa de reacción cruzada de superporción A2 derivada de HBV Evaluación de inmunogenicidad derivada de cultivos primarios, pacientes agudos (a-Bertoni et al., J. Clin. Invest . 100:503, b-Rehermann et al., J. Clin. Invest 97:1655, c-Nayersina et al., J. Immunol 150:4659) o ratones transgénicos . Una evaluación positiva (+) se asigna cuando se ha notado respuestas en uno de estos sistemas.

Tabla XXXb: Inmunogenicidad de péptidos de superporción A2 HBV de reacción no cruzada Evaluación de inmunogenicidad derivada de cultivos primarios, pacientes agudos (a-Bertoni et al., J. Clin. Invest . 100:503, b-Rehermann et al., J. Clin. Invest 97:1655, c-Nayersina et al., J. Immunol 150:4659) o ratones transgénicos . Una evaluación positiva (+) se asigna cuando se ha notado respuestas en uno de estos sistemas.

Tabla XXXc : Reconocimientos cruzado de HBV pol 538 y una variante pol 538 inducida por Lamiduvina para inducir CTK con un análogo pol 538*. a. Se inducen las CTL usando el análogo 1090.77 de HBV pol 538 (péptido 1090.14) . El 1090.77 se codificó en el minigen pEP2. AOS de ADN. b. Los valores mostrados representan el medio geométrico de ALU de 2 cultivos independientes. Los péptidos cargados en células objetivos fueron 1090.14 (HBV pol 538) o 1353.02 (un mutante inducido por Lamivudina de pol 538) .

Tabla XXXIa: Inmunogenicidad de péptidos de reacción cruzada de euperporción A3 derivados de HBV 1. Evaluación de inmunogenicidad derivada de cultivos primarios, Bertoni et al., J. Clin. Invest. 100:503 o ratones transgénicos . Una evaluación positiva (+) se asigna cuando se ha notado respuestas en uno de estos sistemas. Una evaluación negativa (-) indica que no hay respuestas cuando se examina.

Tabla XXXItu Inmunogenicidad de peptidos de superporción A3 HBV de reacción no cruzada 1. Evaluación de inmunogenicidad derivada de cultivos primarios, Bertoni et al., J. Clin. Invest. 100:503 o ratones transgénicos . Una evaluación positiva (+) se asigna cuando se ha notado respuestas en uno de estos sistemas. Una evaluación negativa (-) indica que no hay respuestas cuando se examina.

Tabla XXXIla: Inmunogexiicidad da péptidos de reacción cruzada de superporción B7 HBV 1. Evaluación de inmunogenicidad derivada de cultivos primarios, Bertoni et al., J. Clin. Inves . 100:503 o ratones transgénicos . Una evaluación positiva (+) se asigna cuando se ha notado respuestas en uno de estos sistemas. Una evaluación negativa (-) indica que no hay respuestas cuando se examina Tabla XXXIIb: Inmunogenicidad de péptidos de euperporción B7 HBV de reacción no cruzada primarios, Bertoni et al., J. Clin. Invest . 100:503 o ratones transgénicos . Una evaluación positiva (+) se asigna cuando se ha notado respuestas en uno de estos sistemas. Una evaluación negativa (-) indica que no hay respuestas cuando se examina.

Tabla XXXIII. Epítopes HTL derivados de HBV candidatos Consexvancia Criterio de Péptido Mol la Pos Núcleo Total Secuencia Selección Superporción F107.01 E V 249 100 95 IIiiCLIFIiVLLDY DR F107.02 E V 252 95 95 ILOJIFLLVIJLDYQGW 1280.17 ENV 258 90 90 LVLLDYQCMLPVCPL 1186.22 ENV 332 100 100 RFSWLSLLVPFVQWF 1186.15 ENV 339 95 95 LVPF7QWFVGLSPTV 1186-06 ENV 342 95 95 FVQWFVGLSTVWLS 1186.03 NUC 19 85 85 ASKLCTJOWLV DID 1186.12 UC 24 85 85 LGWLWGWDIDPY EF 857.02 NUC 50 90 PffiHALROAII niMIlA 1186.23 NUC 98 85 85 RQLLWFHISCLTPGR 27.0279 NUC 117 90 EYLVSFGVWIRTPPA 27.0280 NUC 123 95 95 GVWIRTPPAYRPPNA 1186.20 NUC 129 100 95 PPAYRPPNAPILSTL 1186.16 NUC 136 100 95 NAPILST PETTWR 1186.01 POL 38 95 95 AED1 JLNVSIPW 1186.17 POL 45 100 95 NLNVSIFWTHKVGNF 27.0281 FOL 145 100 100 RHYIiTrLWKñGILYK 1280.13 POL 406 95 95 KFAVPNLQSLTNLLS 27.0283 POL 409 85 VP LQSLTNLLSSNL F107.03 POL 412 90 90 LQSLTNIJLSSNLSWL 1186.28 POL 416 90 90 TOLI^SNLSWLSLDV 1186.27 POL 420 100 85 SSNLSWLSLDVSAAF F107.04 POL 523 95 95 PFLLAQFTSAICSW 1186.10 POL 526 95 95 LAQFTSAICSW RA 1186.04 POL 534 95 95 CSWRRAFPHCLAFS F107.05 POL 538 95 95 RRAFPHCLAFSYMDD 1186.02 POL 546 90 90 AFSYMDDWLGA SV 1186.05 POL 629 85 85 DWKVCQRIVGLLGFA 1280.21 POL 637 95 95 VGIIjSFAAPFlOCGY 27.0278 POL 643 95 AAPFTQ03YPALMPL 1186-21 POL 648 95 95 QCGYPAIJvlPLYACIQ. 1280.14 POL 694 95 95 LCOVFAmTPTCNGL 27.0282 POL 750 85 85 SVVLSRKYTSFPWLL X 13 95 90 RDVLCLRPVGAESRG 1186.07 X 50 95 90 GAHLSLRGLPVCAFS 1186.29 X 60 95 90 V AFSSAGPCAL FT Algoritmo 1280.20 ENV 330 100 80 SVRFSWLSLLVPFVQ 1280.19 UC 28 85 80 RDIjI-DrASALYREAL 1298.02 POL 56 90 55 VGNFIGLYSSTVPVF 1298.03 POL 571 95 75 TNFIiSLGIHLNPNK 1298.05 POL 651 95 55 YPALMPLYACIQS Q 1298.06 POL 664 95 60 QAF FSPTY AFLC 1260.181 POL 722 85 80 PLPIH AELLAACFA 1280.09 POL 774 90 80 CTSFVYVPSALNPAD Porción DR3 795.05 ENV 10 95 PLGFFPDHQLDP 35.0090 ENV 312 95 90 FliVLLDYOa^ILPVC CF-03 NUC 28 85 80 FJXLD ASALYRE-AIJESPEH 35.0091 POL 18 90 65 AGPLEEELPRLADEG 35.0092 POL 34 100 85 35.0093 POL 96 85 60 VGPLTVNEKRLKLI 35.0094 POL 120 100 100 TKYLPLDKGI PYYP 35.0095 POL 371 100 55 QGVFLVDNFH ITE 35.0096 POL 385 100 45 ESRLVVDFSQFSRGN 1186.18 POL 422 95 85 NLSWLSLDVSAAFYH 35.0099 POL 66 95 55 AETFSPTYKAFLCKQ 35.0101 X 18 95 35 LRPVGAES GRPVSG Coriservancia 799.01 ENV 11 80 75 PI JVLQAGFFLL RILTIPQ reducida o 799.02 ENV 31 95 SIJDSWWTSLNFL33riVCLG variada 799.04 ENV 71 95 75 GYRWMCLRRFIIFLFILLLC 1298.01 ENV 117 80 40 POJWQWNbYl^HOTL 1280.06 ENV 180 80 80 AGFFLLTRILTIPOS 1280.11 ENV 245 80 80 IFIJILLLCLIFLLV CF-08 UC 120 90 VSFGVWIRTPPAYRPPNAPI 1186.25 NUC 121 95 90 SFGVWIRTPPAYRPP 1280.15 POL 501 80 80 LHLYSHPIILGFR I 1298.04 POL 618 80 45 KQCFRKLPV RPIDW 1298.07 POL 767 80 70 AANWILRGTSFVYVP 1298.08 POL 827 80 60 PDRVHFASPLHVAWR Tabla XXXIV. Paneles de revisión HLA-DR Ensayo representativo Frecuencia fenotipica Panel de AntigeAlelos Alelo Alias Cauc Neg. Jpn. Chn. Hisp Prm. revisión no Primario DEL DRB1*0101-03 DRB1*0101 (DR1) 18.5 8.4 10.7 4.5 10.1 10.4 DR4 DRB1*0401-12 DRB1*0401 (DR4w4) 23.6 6.1 40.4 21.9 29.8 24.4 DR7 DRB1*0701-02 DRB1*0701 (DR7) 26.2 11.1 1.0 15.0 16.6 14.0 Panel 59.6 24.5 49.3 38.7 51.1 44.6 Total SecundaDR2 DRB1*1501-03 DRB1*1501 (DR22 i) 19.9 14.8 30.9 22.0 15.0 20.5 rio DR2 DRB5*0101 DRB5*0101 (DR2w2|}2) - - - - - - DR9 DRB1*09011, 09012 DRB1÷0901 3.6 4.7 24.5 19.9 6.7 11.9 (DR9) DR13 DRBl*1301-06 DRB1÷1302 21.7 16.5 14.6 12.2 10.5 15.1 (DR6wl9) Panel 42.0 33.9 61.0 48.9 30.5 43.2 Total TerciaDR4 DRB1*0405 DRB1*0 05 (DR4W15) 23.3 15.1 rio D 8 DRBl*0801-5 DRB1*0802 (DR8w2) 5.5 10.9 25.0 10.7 18.1 15.5 DR11 DRBl*1101-05 DRB1+1101 (DRSwll) 17.0 18.0 4.9 19.4 Panel 22.0 27.8 29.2 29.0 39.0 29.4 total CuaterDR3 DRBl*0301-2 DRB1*0301 (DR3wl7) 17.7 19.5 0.4 7.3 14.4 11.9 nario DR12 DRB1*1201.02 DRB1*1201 (DR5wl2) 2.T 5.5 13.1 17.6 5.7 8.9 Panel 20.2 24.4 13.5 24.2 19.7 20.4 total Tabla XXXV. Péptidos de ligado HLA-DR de reacción cruzada derivados de HBV 1 Tabla XXXVI. Peptidos de ligado DR3 derivados de HBV * probado como péptido 35,0100 Tabla XXXVIIai epítopes CTL preferidos de HBV Péptido Secuencia Proteína HLA 924.07 FLPSDFFPSV Núcleo 18 A2 777.03 FLLTRILTI Env 183 A2 927.15 AL PLYACI Pol 642 A2 1013.01 WLSLLVPFV Env 335 A2 1090.77 YMDDWLGV Pol 538 A2/A1 1168.02 GLSRYVARL Pol 455 A2 927.11 FLLSLGIHL Pol 562 A2 1069.10 LLPIFFCLWV Env 378 A2 1069.06 LLVPFVQWFV Env 338 A2 1147.16 HTLWKAGILY Pol 149 A3/A1 1083.01 STLPETTWRR Núcleo 141 A3 1069.16 NVSIPWTH Pol 47 A3 1069.20 LWDFSQFSR Pol 388 A3 1090.10 QAFTFSPTYK Pol 665 A3 1090.11 SAICSWRR Pol 531 A3 1142.05 KVGNFTGLY Pol 629 A3/A1 1147.05 FPHCLAFSYM Pol 530 B7 988.05 LPSDFFPSV Núcleo 19 B7 1145.04 IPIPSSWAF Env 313 B7 1147.02 HPAAMPHLL Pol 429 B7 26.0570 YPALMPLYACI Pol 640 B7 1147.04 TPARVTGGVF Pol 354 B7 1.0519 DLLDTASALY Núcleo 419 Al 2.0239 LSLDVSAAFY Pol 1000 Al 1039.06 WMM YWGPSLY Env 359 Al 20.0269 RWMCLRRFII Env 236 A24 20.0136 SWLSLLVPF Env 334 A24 20.0137 SWWTSLNFL Env 197 A24 13.0129 EYLVSFGVWI Núcleo 117 A24 1090.02 AYRPPNAPI Núcleo 131 A2 13.0073 WFHISCLTF Núcleo 102 A2 20.0271 SWPKFAVPNL Pol 392 A2 1069.23 KYTSFPWLL Pol 745 A24 2.0181 LYSHPIILGF Pol 492 A24 Tabla XXXVI Ib: epítopes HTL preferidos de HBV Criterio Conservancia de Péptido Mol la POB Núcl Total Secuencia selección eo Superporci F107.03 POL 412 90 90 LQSLTNLLSSNLSWL ón DR 1298.06 POL 664 95 60 KQAFTFSPTYKAFLC 1280.06 ENV 180 80 80 AGFFLLTRILTIPQS 1280.09 POL 774 90 80 GTSFVYVPSALNPAD CF-08 NÚCLEO 120 90 VSFGWIRTPPAYRPPNAPI 27.0281 POL 145 100 100 RHYLHTLWKAGILYK 1186.15 ENV 339 95 95 LVPFVQWFVGLSPTV 1280.15 POL 501 80 80 LHLYSHPIILGFRKI F107.04 POL 523 95 95 PFLLAQFTSAICSW 1298.04 POL 618 80 45 KQCFRKLPVNRPIDW 1298.07 POL 767 80 70 AANWILRGTSFVYVP 857.02 NÚCLEO 50 90 PHHTALRQAILCWGELMTLA Porción 1280.14 POL 694 95 95 LCQVFADATPTGWGL DR3 35.0096 POL 385 100 45 ESRLWDFSQFSRGN 35.0093 POL 96 85 60 VGPLTVNEKRRLKLI 1186.27 POL 420 100 85 SSNLSWLSLDVSAAF Tabla XXXVIII. Cobertura de población estimada por un panel de epítopes HTL derivados de HBV 1. La cobertura de población total se ajustó para contar la presencia de DRX en muchas poblaciones étnicas. Se asume que el rango de especificidades representado por los alelos DRX apreciará aquellos alelos HLA-DR caracterizados previamente. La porción de DRX incorporado bajo cada porción es representativa de la frecuencia de la porción en el resto de la población. La cobertura total no ee ajusta para contar tipos de genes desconocidos. 2. El número de epítopes que representan un estimado mínimo, solo considera los epítopes mostrados en la Tabla 12. Alelos adicionales posiblemente se ligan por epítopes alojados que no se cuentan.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones .

1. Una composición caracterizada porque comprende al menos un péptido del virus de hepatitis B (VHB) , el péptido comprende un epitope preparado, aislado que consiste de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: ALMPLYACI, WLSLLVPFV, YMDDWLGA, LLPIFFCLWV, HTLWKAGILYK, NVSIPWTHK, LWDFSQFSR, QAFTFSPTYK, SAICSWRR, KVGNFTGLY, FPHCLAFSYM, IPIPSSWAF, HPAAMPHLL, YPALMPLYACI, TPARVTGGVF, DLLDTASALY, LSLDVSAAFY, W MWY GPSLY, R MCLRRFI I , SWLSLLVPF, S WTSLNFL, EYLVSFGVWI, AYRPPNAPI, WFHISCLTF, SWPKFAVPNL, KYTSFPWLL, LQSLTNLLSSNLSWL, KQAFTFSPTYKAFLC, AGFFLLTRILTIPQS , GTSFVYVPSALNPAD, VSFGV IRTPPAYRPPNAPI , RHYLHTLWKAGILYK, LVPFVQWFVGLSPTV, LHLYSHPI ILGFRKI , PFLLAQFTSAICSW, KQCFRKLPVNRPIDW, AANWILRGTSFVYVP, PHHTALRQAILCWGELMTLA, LCQVFADATPTGWGL, ESRLWDFSQFSRGN, VGPLTVNEKRRLKLI , y SSNLSWLSLDVSAAF.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además un epitope seleccionado del grupo que consiste de FLLSLGIHL, FLPSDFFPSV, LPSDFFPSV, FLLTRILTI, LLVPFVQWFV, LYSHPIILGF, STLPETTWRR, y GLSRYVARL.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el epltope se une a un enlazador aminoácido.

4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el epltope se mezcla o une a un epltope CTL.

5. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el epltope se mezcla o une a un epitope HTL.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el epitope HTL es una molécula ligada a pan-DR.

7. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además una liposoma, en donde el epitope está sobre o dentro del liposoma.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el epitope se une a un lípido.

9. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el epitope es un heteropolímero.

10. La composición de conformidad con la reivindicación 1, .caracterizado porque el epitope es un homopolimero .

11. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracteri ada porque el epitope está enlazado a una HLA de cadena pesada, p2-microglobulina, y complejo de estreptavidina, por lo que se forma un tetrámero.

12. La composición de conformidad con la reivindicación 1 caracterizada porque comprende además una célula que presenta un antigeno, en donde el epitope está en o dentro de la célula que presenta el antígeno.

13. La composición de conformidad con la reivindicación 12/ caracterizada porque el epitope se enlaza a una molécula HLA en la célula que presenta el antígeno, por lo cual cuando se presenta un linfocito T citotóxico (CTL) que se restringe a la molécula HLA, un receptor del CTL se liga a un complejo de la molécula HLA y el epitope.

14. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la célula que presenta el antígeno es una célula dendrítica.

15. Una composición, que comprende uno o más péptidos, y además, comprende al menos dos epítopes, caracterizada porque uno de los epítopes se selecciona del grupo que consiste de: ALMPLYACI, WLSLLVPFV, YMDDWLGA, LLPIFFCLWV, HTLWKAGILYK, VSIPWTHK, LWDFSQFSR, QAFTFSPTYK, SAICSWRR, KVGNFTGLY, FPHCLAFSYM, IPIPSSWAF, HPAAMPHLL, YPALMPLYACI , TPARVTGGVF, DLLDTASALY, LSLDVSAAFY, WMMWYWGPSLY, RWMCLRRFI I , SWSLLVPF, SWWTSLNFL, EYLVSFGVWI, AYRPPNAPI, WFHISCLTF, SWPKFAVPNL, KYTSFPWLL, LQSLTNLLSSNLSWL, KQAFTFSPTYKAFLC, AGFFLLTRILTIPQS, GTSFVYVPSALNPAD, VSFGV IRTPPAYRPPNAPI , RHYLHTL KAGILYK, LVPFVQWFVGLSPTV, LHLYSHPI ILGFRKI , PFLLAQFTSAICSW, KQCFRKLPVNRPIDW, AANWILRGTSFVTVP, PHHTALRQAILCWGELMTLA, LCQVFADATPTGWGL, ESRLWDFSQFSRGN, VGPLTVNEKRRLKLI , y SSNLSWLSLDVSAAF y en donde cada uno de uno o más péptidos comprende menos de 50 aminoácidos contiguos que tienen el 100% de identidad con una secuencia de péptido nativo del virus de hepatitis B (VHB) .

16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque comprende además un epítope seleccionado del grupo que consiste de FLLSLGIHL, FLPSDFFPSV, LPSDFFPSV, FLLTRILTI, LLVPFVQWFV, LYSHPI ILGF, STLPETTWRR, y GLSRYVARL .

17. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque un péptido comprende al menos dos epitopes .

18. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque al menos uno del uno o más péptidos es un heteropolimero .

19. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el epítope que se selecciona del grupo colocado en la reivindicación 15 se une a un epítope de linfocito T citotóxico (CTL) .

20. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el epítope seleccionado del grupo colocado en la reivindicación 15 se une a un epítope de linfocito T auxiliar (HTL) .

21. La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el epitope HTL es una molécula enlazada a pan-DR.

22. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque comprende además una liposoma, en donde el epitope está en o dentro de la liposoma.

23. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el epitope que se selecciona del grupo colocado en la reivindicación 15 se une a un lipido.

24. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el epitope que se selecciona del grupo colocado en la reivindicación 15 está en o dentro de la célula que presenta el antigeno.

25. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el epitope se enlaza a una molécula HLA en la célula que presenta el antigeno, por ello cuando se presenta un linfocito citotóxico (CTL) que se restringe a la molécula HLA, el receptor de la CTL se liga a un complejo de la molécula HLA y al epitope.

26. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la célula que presenta el antigeno es una célula dendritica.

27. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque comprende además una péptido adicional mezclado con uno o más péptidos.

28. La composición de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque el péptido adicional comprende un epitope CTL o HTL.

29. Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende : una dosis unitaria de un péptido que comprende menos de 50 aminoácidos contiguos que tienen el 100% de identidad con una secuencia de péptido nativo del virus de hepatitis B, el péptido comprende un epitope seleccionado del grupo que consiste de: ALMPLYACI, WLSLLVPFV, YMDDWLGA, LLPIFFCLWV, HTLWKAGILYK, NVSIPWTHK, LWDFSQFSR, QAFTFSPTYK, SAICSWRR, KVGNFTGLY, FPHCLAFSYM, IPIPSS AF, HPAAMPHLL, YPALMPLYACI, TPARVTGGVF, DLLDTASALY, LSLDVSAAFY, WMMWYWGPSLY, RWMCLRRFI I , SWSLLVPF, SWWTSLNFL, EYLVSFGVWI, AYRPPNAPI, WFHISCLTF, SWPKFAVPNL, KYTSFPWLL, LQSLTNLLSSNLSWL, KQAFTFSP YKAFLC, AGFFLLTRILTIPQS, GTSFVYVPSALNPAD, VSFGVWIRTPPAYRPPNAPI , RHYLHTLWKAGILYK, LVPFVQWFVGLSPTV, LHLYSHPI ILGFRKI , PFLLAQFTSAICSW, KQCFRKLPVNRPIDW, AA WILRGTSFVYVP, PHHTALRQAILCWGELMTLA, LCQVFADATPTGWGL, ESRLWDFSQFSRGN, VGPLTVNEKRRLKLI , y SSNLSWLSLDVSAAF; y un excipiente farmacéutico.

30. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque comprende además un epítope adicional.

31. La composición de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque el epítope adicional se selecciona del grupo que consiste de FLLSLGIHL, FLPSDFFPSV, LPSDFFPSV, FLLTRILTI, LLVPFVQWFV, LYSHPI ILGF, STLPETTWRR, y GLSRYVARL .

32. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque el epítope adicional es una molécula de enlace PanDR.

33. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el excipiente farmacéutico comprende un adyuvante.

34. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque comprende una célula que presenta un antígeno.

35. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque el epítope se enlaza a una molécula HLA en la célula que presenta el antígeno, por lo cual un linfocito T citotóxico (CTL) que se restringe a la molécula HLA se presenta, el receptor del CTL ligando a un complejo de la molécula HLA y el epítope.

36. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque la célula que presenta el antígeno es una célula dendrítica.

37. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque comprende además una liposoma, en donde al menos un epítope está en o dentro de la liposoma .

38. La composición de vacuna para el virus de hepatitis B caracterizada porque comprende uno o más péptidos del virus de hepatitis B comprendidos en cualquiera de las tablas VII-XVIII, XIXa-b, XXa-d, XXII-XXIII, XXVI-XXIX, XXXa-c, XXXIa-b, XXXIIa-b, XXXIII-XXXVI, Y XXXVIIa-b.

39. La composición de vacuna para el virus de hepatitis B que comprende 6 o más péptidos de 8-11 aminoácidos de longitud del antígeno del virus de hepatitis B caracterizada porque uno o más de los péptidos comprenden una porción del HLA-A2, uno más de los péptidos comprenden una porción del HLA-A3, uno más de los péptidos comprenden una porción del HLA-A7, uno más de los péptidos comprenden una porción del HLA-A1, uno más de los péptidos comprenden una porción del HLA-A24, y uno más de los péptidos comprenden una porción del HLA-A .