KR20030055261A - 펩티드 및 핵산 조성물을 이용한 ｂ형 간염 바이러스에대한 세포 면역 반응의 유도 - Google Patents

펩티드 및 핵산 조성물을 이용한 ｂ형 간염 바이러스에대한 세포 면역 반응의 유도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 HBV에 대한 에피토프-계 백신을 개발하기 위하여 T 세포에 의한 항원 인지 기작에 관한 우리의 지식을 이용하는 것이다. 더욱 구체적으로, 본 출원은 약학 조성물 및 HBV 감염의 예방 및 치료에 사용하는 방법에 대한 우리의 발견에 관한 것이다.

Description

펩티드 및 핵산 조성물을 이용한 Ｂ형 간염 바이러스에 대한 세포 면역 반응의 유도{INDUCING CELLULAR IMMUNE RESPONSES TO HEPATITIS B VIRUS USING PEPTIDE AND NUCLEIC ACID COMPOSITIONS}
Ⅰ. 발명의 배경 기술
B형 간염 바이러스(HBV)에 의한 만성 감염은 적어도 5% 이상의 세계 인구에 영향을 미치고, 경변 및 간세포 암종의 주요 원인이다(Hoofnagle, J., N. Engl. J. Med. 323:337, 1990; Fields, B. 및 Knipe, D. In: Fields Virology 2:2137, 1990). 세계 보건 기구는 B형 간염을 전세계적인 사망의 주요 원인으로 열거하는데, 상기 B형 간염은 사망 원인 제1위인 만성 폐 질환에 거의 근접하고, AIDS보다훨씬 높은 사망 원인이다. 만성 HBV 감염은 무증상의 보균자 상태로부터 연속적인 간세포의 괴사 및 염증에 이르까지 광범위한 증상을 나타내고, 간세포 암종을 일으킬 수 있다.
HBV에 대한 면역 반응은 B형 간염의 감염을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 뉴클레오캡시드 코어(nucleocapside core), 폴리머라아제 및 표면 항원을 비롯한 HBV의 상이한 영역에 대한 각종 체액성 및 세포성 반응을 동정하였다. T세포 매개 면역성[특히, 클래스 I 인간 백혈구 항원-제한 세포독성 T 림프구(CTL)에 관련됨]은 확정된 HBV 감염과 싸우는데 중요하다고 여겨진다.
클래스 I 인간 백혈구 항원(HLA) 분자는 거의 모든 유핵 세포의 표면 상에서 발현된다. CTL은 각종 항원의 세포내 처리로부터 유래한 펩티드 단편을 클래스 I HLA 분자와의 복합체의 형태로 인식한다. 그 후, 이러한 인식은 HLA-펩티드 복합체를 보유한 세포의 파괴를 직접 야기시키거나 또는 비파괴 메카니즘(예컨대, 바이러스 복제를 저해하는 인터페론의 생산)의 활성화를 야기시킨다.
몇몇 연구는 자기 한정적(self-limiting) 급성 간염과 다중 특이성 CTL 반응사이의 연관성을 강조한다(Penna, A 등, J. Exp. Med. 174:1565, 1991; Nayersina, R 등, J. Immunol. 150:4659, 1993). 또한, 만성 HBV 감염의 자발적 제거 및 인터페론 관련 제거는 격렬한 CTL 반응의 부활과 연관되어 있다(Guidotti, L. G. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3764, 1994). 상기 모든 경우에, CTL 반응은 다클론성이고, HBV 엔벨로프(envelope), 코어 및 폴리머라아제 항원을 비롯한 다중 바이러스 단백질에 대한 특이성이 있다. 이와 대조적으로, 만성 간염이 있는 환자에있어서, CTL 활성은 통상적으로 없거나 약하며, 항원적으로 제한된다.
HBV 감염 문제의 해결에 있어서의 CTL의 중요한 역할은 HBV 트랜스제닉 마우스를 사용하는 연구에 의해 추가로 강조되었다. HBV 특이성 CTL의 HBV 게놈용 트랜스제닉 마우스로의 입양 전이(adoptive transfer)는 바이러스 복제의 억제를 야기시켰다. 이러한 효과는 림포카인에 기초한 비용균성 메카니즘에 의해 주로 매개된다(Guidotti, L. G. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3764, 1994; Guidotti, L. G., Guilhot, S. 및 Chisari, F. V., J. Virol. 68:1265, 1994; Guidotti, L. G. 등, J. Virol. 69:6158, 1995; Gilles, P. N., Fey, G. 및 Chisari, F. V., J. Virol. 66:3955, 1992).
클래스 I 제한 반응의 경우에서와 마찬가지로, HLA 클래스 II 제한 T-세포 반응은 통상 급성 간염이 있는 환자에서 검출되고, 만성 감염이 있는 환자에서는 없거나 약하다(Chisari, F. V. 및 Ferrari, C., Annu. Rev. Immunol. 13:29, 1995). HLA 클래스 II 반응은 헬퍼 T 세포들(HTLs) 활성화와 관련되어 있다. 클래스 II HLA 분자를 인식하는 헬퍼 T 림프구는 바이러스 복제를 억제하는 사이토카인의 분비를 통해 HBV 감염의 제거에 직접 기여할 수 있다(Franco, A 등, J. Immunol. 159:2001, 1997). 그러나, 질병 문제의 해결에 있어서의 상기 헬퍼 T 림프구의 주된 역할은 바이러스 특이성 CTL 및 B 세포의 활성화 및 확장을 유도함으로써 매개되는 것이라고 여겨진다.
HBV 감염과 함께 관찰되는 이종 면역 반응의 관점에서, 다중 에피토프에 대하여 동시에 지향되는 다중 특이성 세포 면역 반응의 유도는 HBV에 대해 효능이 있는 백신의 개발에 중요한 것처럼 보인다. 환자에 나타나는 반응에 대응하는 면역 반응을 유도하고, HBV 감염을 제거하는 백신 실시태양을 수립할 필요성이 있다. 에피토프계 백신이 유용한 것으로 보인다.
적당한 기법의 개발시, 에피토프계 백신의 사용은 종래의 백신을 사용하는 경우에 비하여 보다 유리한 몇 가지 장점을 갖는다. 이러한 백신 내에의 봉입용 에피토프는 도피 돌연변이의 가능성을 감소시키기 위해, 바이러스 또는 종양 관련 항원의 보존 영역으로부터 선택될 수 있다. 전(全) 항원을 사용하는 경우에 비하여 유리한 에피토프계 기법의 장점은 전 항원에 대한 면역 반응이 대부분 항원의 가변 영역을 지향하고, 돌연변이 때문에 면역 도피를 허용한다는 것이 명백하다는 것이다. 더욱이, 에피토프계 백신의 사용으로, 전 항원 내에 존재할 수 있는 면역억제성 에피토프를 피할 수 있다.
또한, 에피토프계 백신 방법의 사용으로, 선택된 에피토프(CTL 및 HTL)를 결합시킬 수 있고, 추가로 예컨대 향상된 면역원성을 달성하도록 에피토프 조성물을 개량할 수 있다. 따라서, 적당한 경우, 표적 질병에 대한 면역 반응을 조절할 수 있다. 종래의 방법으로는 반응의 유사한 조작이 불가능하다.
에피토프계 면역 자극 백신의 다른 주요 장점은 안전성이다. 고유한 생물학적 활성을 보유할 수 있는 감염성 제제 또는 전(全) 단백질 항원에 의해 유발될 가능성이 있는 병리학적 부작용을 제거한다.
또한, 에피토프계 백신은 동일한 병원체로부터 유래한 다중 선택 항원에 대한 면역 반응을 조정 및 집중할 수 있는 성능을 제공한다. 따라서, 특정 병원체에대한 면역 반응에 있어서의 환자별 다양성은 성기 병원체로부터 유래한 다중 항원으로부터 유래한 에피토프를 백신 조성물에 포함시킴으로써 경감될 수 있다. "병원체(pathogen)"는 감염성 제제 또는 종양 관련 분자일 수 있다.
그러나, 광범위한 효능이 있는 에피토프계 면역치료제의 개발에 대한 가장 가공할 만한 장해 중 하나는 HLA 분자의 극도의 다형성(polymorphism)이었다. 지금까지, 유전적으로 편향되지 않은 다수의 집단에 걸쳐 효과적인 면역치료제의 개발은 상당히 복잡한 업무이었고; 이를 위해서는 사용되는 에피토프가 각 개별 HLA 대립유전자에 대응하는 HLA 분자에 대해 특이적일 필요가 있고, 따라서 인종적으로 다양한 집단에 걸쳐 효과적인 면역치료제의 개발을 위해서는 비현실적으로 많은 수의 에피토프를 사용하여야 했다. 에피토프계 백신에 사용하기 위한, 다중 HLA 항원 분자에 의해 결합되는 펩티드 에피토프를 개발할 필요성이 있다. 보다 많은 수의 HLA 항원 분자가 결합될수록, 백신은 보다 광범위한 집단에 대하여 효능이 있다.
더욱이, 본 명세서에 보다 자세히 기술되어 있듯이, 펩티드 결합 특성을 조절할 필요성이 있는데, 이는 예컨대, 다중 HLA 항원에 결합할 수 있는 펩티드가 면역 반응을 자극할 수 있는 친화성으로, 상기 다중 HLA 항원에 결합되도록 하기 위함이다. 면역원성과 상관관계가 있는 친화성에서 1개 이상의 HLA 대립유전자에 의해 제한되는 에피토프의 동정은 전범위의 집단에 걸쳐 효능이 있도록 하고, 반응의 유도가 충분히 격렬하게 일어나도록 함으로써, 자기 한정적 급성 간염에서 나타나는 천연 면역 반응 또는 만성 HBV 감염의 자발적인 제거 반응이 다양한 부류의 집단에 유도되도록 한다. 또한, 상기 반응은 광범위한 배열의 에피토프를 표적화할수 있다. 본 명세서에 기술되어 있는 기법은 상기 유리한 면역 반응을 제공한다.
이 섹션에 제공되는 정보는 본 출원의 출원일 당시의 배경 기술을 기술하려는 의도이다. 본 출원의 우선일 이후에 생성된 정보는 이 섹션에 포함된다. 따라서, 이 섹션에서의 배경 기술은 본 출원의 우선일을 기술하려는 의도는 아니다.
연방 후원에 의한 연구 개발
본 발명은 부분적으로는 미국 국립 보건원의 승인 하의 미국 연방 정부의 자금 후원에 의해 완성된 것이다. 미국 연방 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 보유한다.
본 발명은 펩티드 및 핵산 조성물을 이용하여 B형 간염 바이러스에 대한 세포 면역 반응을 유도하는 것에 관한 것이다. 이하, 본 명세서에 기술될 사항의 개요를 나타내면 다음과 같다.
색인
I. 발명의 배경 기술
II. 발명의 개요
III. 도면의 간단한 설명
IV. 발명의 상세한 설명
A. 정의
B. HBV에 대한 CTL 및 HTL 반응의 자극
C. HLA 분자에 대한 펩티드 에피토프의 결합 친화성
D. 펩티드 에피토프 결합 모티프(motif) 및 슈퍼모티프(supermotif)
1. HLA-A1 슈퍼모티프
2. HLA-A2 슈퍼모티프
3. HLA-A3 슈퍼모티프
4. HLA-A24 슈퍼모티프
5. HLA-B7 슈퍼모티프
6. HLA-B27 슈퍼모티프
7. HLA-B44 슈퍼모티프
8. HLA-B58 슈퍼모티프
9. HLA-B62 슈퍼모티프
10. HLA-A1 모티프
11. HLA-A2.1 모티프
12. HLA-A3 모티프
13. HLA-A11 모티프
14. HLA-A24 모티프
15. HLA-DR-1-4-7 슈퍼모티프
16. HLA-DR3 모티프
E. 백신이 효능이 있는 집단 적용 범위의 확대
F. 면역 반응 자극 펩티드 유사체
G. 슈퍼모티프 또는 모티프 함유 펩티드에 대한 질병 관련 항원으로부터 유래한 단백질 서열의 컴퓨터 스크리닝
H. 펩티드 에피토프의 제조
I. T-세포 반응을 검출하는 분석법
J. 면역 반응의 평가를 위한 펩티드 에피토프의 용도
K. 백신 조성물
1. 미니유전자(minigene) 백신
2. 헬퍼 펩티드와 CTL 펩티드의 배합
L. 치료 또는 예방 목적을 위한 백신의 투여
M. 키트
V. 실시예
VI. 특허청구범위
VII. 요약서
Ⅲ. 도면의 간단한 설명
도 1:도 1은 평균 집단에 있어서, HLA-A 및 HLA-B 분자에 의해 결합되는 HBV 후보 에피토프의 수의 함수로서 나타낸 유전자형의 총 빈도의 그래프를 제공한다.
이러한 도 1은 HBV 후보 에피토프에 대한 몬테 카를로 집단 적용범위 분석에 관한 것으로서, 전술한 바와 같이, 평균 집단에 있어서 HLA-A 및 B 대립유전자에 의하여 결합되는 HBV 후보 에피토프의 수의 함수로서 유전자형의 총 빈도를 나타내는 플롯을 도시한 것이다. 여기에서, 유전자형 값은 백인, 북미 흑인, 일본인, 중국인 및 라틴 아메리카인 집단에서 유전자 빈도를 평균하여 유도하였다. 또한, 유전자형의 누적 빈도를 나타내었다.
현재 이용할 수 있는 HLA 유형화 데이터를 이용하는 경우는, 평균 집단에 있어서, 유전자의 잔여 분획(약 15 %)을 명시하지 않았다. 유전자 100 % 계수에 도달하기 위하여, HLA 특이적 집단 내 클러스터의 상대 빈도에 비례하여 각 hlt 집단 클러스터에 대하여 잔여 분획을 첨가하였다.
도 2:도 2는 실험 모델의 미니유전자 작제물에 있어서의 펩티드 에피토프의 위치를 예시한 것이다.
Ⅱ. 발명의 개요
본 발명은 항원이 T 세포에 의해 인식되는 메카니즘에 대한 지식에 의해 예컨대 HBV를 지향하는 에피토프계 백신을 개발하는 것에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 출원은 특정 에피토프 약학 조성물 및 이를 HBV 감염의 예방 및 치료에 사용하는 방법에 관한 것이다.
적당한 기법의 개발시, 에피토프계 백신의 사용은 종래의 백신을 사용하는 경우에 비하여, 특히 백신 조성물에 전(全) 항원을 사용하는 경우에 비하여 보다 유리한 몇 가지 장점을 갖는다. 전 항원에 대한 면역 반응이 대부분 항원의 가변 영역을 지향하고, 돌연변이 반응 때문에 면역 도피를 허용한다는 것이 명백하다. 에피토프계 백신에의 봉입용 에피토프는 바이러스 또는 종양 관련 항원의 보존 영역으로부터 선택되고, 이로써 도피 돌연변이의 가능성을 감소시킨다. 더욱이, 에피토프계 백신의 사용으로, 전 항원 내에 존재할 수 있는 면역억제성 에피토프를 피할 수 있다.
에피토프계 백신 방법의 추가의 장점은 선택된 에피토프(CTL 및 HTL)를 결합시킬 수 있고, 추가로 예컨대 에피토프 조성물을 개량하여 향상된 면역원성을 달성할 수 있다는 것이다. 따라서, 적당한 경우, 표적 질병에 대한 면역 반응을 조절할 수 있다. 종래의 방법으로는 반응의 유사한 조작이 불가능하다.
에피토프계 면역 자극 백신의 다른 주요 장점은 안전성이다. 고유한 생물학적 활성을 보유할 수 있는 감염성 제제 또는 전(全) 단백질 항원에 의해 유발될 가능성이 있는 병리학적 부작용을 제거한다.
또한, 에피토프계 백신은 동일한 병원체로부터 유래한 다중 선택 항원에 대한 면역 반응을 조정 및 집중할 수 있는 성능을 제공한다. 따라서, 특정 병원체에 대한 면역 반응에 있어서의 환자별 다양성은 상기 병원체로부터 유래한 다중 항원으로부터 유래한 에피토프의 백신 조성물에의 봉입에 의해 경감될 수 있다. "병원체"는 감염성 제제 또는 종양 관련 분자일 수 있다.
그러나, 광범위한 효능이 있는 에피토프계 면역치료제의 개발에 대한 가장 가공할 만한 장해 중 하나는 HLA 분자의 극도의 다형성이었다. 지금까지, 유전적으로 편향되지 않은 다수의 집단에 걸쳐 효과적인 면역치료제의 개발은 상당히 복잡한 업무이었고; 이를 위해서는 사용되는 에피토프가 각 개별 HLA 대립유전자에 대응하는 HLA 분자에 대해 특이적일 필요가 있고, 따라서 인종적으로 다양한 집단에 걸쳐 효과적인 면역치료제의 개발을 위해서는 비현실적으로 많은 수의 에피토프를 사용하여야 했다. 따라서, 에피토프계 백신에 사용하기 위한, 다중 HLA 항원 분자에 의해 결합되는 펩티드 에피토프를 개발할 필요성이 있었다. 보다 많은 수의 HLA 항원 분자가 결합될수록, 백신은 보다 광범위한 집단에 대하여 효능이 있다.
더욱이, 본 명세서에 보다 자세히 기술되어 있듯이, 펩티드 결합 특성을 조절할 필요성이 있는데, 이는 예컨대, 다중 HLA 항원에 결합할 수 있는 펩티드가 면역 반응을 자극할 수 있는 친화성으로, 상기 다중 HLA 항원에 결합되도록 하기 위함이다. 면역원성과 상관관계가 있는 친화성에서 1개 이상의 HLA 대립유전자에 의해 제한되는 에피토프의 동정은 전범위의 집단에 걸쳐 효능이 있도록 하고, 반응의 유도가 충분히 격렬하게 일어나도록 함으로써, 다양한 부류의 집단 적용 범위에서 감염을 방지 또는 제거되도록 한다. 또한, 상기 반응은 광범위한 배열의 에피토프를 표적화할 수 있다. 본 명세서에 기술되어 있는 기법은 상기 유리한 면역 반응을 제공한다.
바람직한 구체예에 있어서, 공지의 항원의 단백질 서열이 모티프(motif) 또는 슈퍼모티프(supermotif) 함유 에피토프의 존재에 대해 평가되는 방법에 의해 본 발명의 백신 조성물에 포함시키기 위한 에피토프를 선택한다. 이어서, 모티프 또는 슈퍼모티프 함유 에피토프에 대응하는 펩티드를 합성하고, 선택된 모티프를 인식하는 HLA 분자에 대한 결합 성능을 시험한다. 중간 정도의 친화성 또는 고친화성[HLA 클래스 I 분자에 대하여는 500 nM 이하의 IC50(또는 KD값) 또는 HLA 클래스 II 분자에 대하여는 1000 nM 이하의 IC50(또는 KD값)]에서 결합하는 상기 펩티드는 CTL 또는 HTL 반응을 유도할 수 있는 성능에 대하여 추가로 평가한다. 백신 조성물에의 봉입용 면역원성 백신을 선택한다.
또한, 슈퍼모티프 함유 펩티드는 HLA 슈퍼타입 패밀리(supertype family) 내의 다중 대립유전자와 결합할 수 있는 성능에 대하여 시험한다. 또한, 펩티드 에피토프를 유사체화하여 HLA 슈퍼타입 내의 다중 대립유전자에 결합할 수 있는 성능 및/또는 결합 친화성을 개량할 수 있다.
또한, 본 발명은 공지의 HLA-타입을 보유하는 환자 내의 HBV에 대한 백신의 면역원성 활성을 조절하는 방법으로서, 상기 환자 내에 존재하는 1개 이상의 HLA 대립유전자의 생성물에 결합하는 아미노산 서열로서 표 VI 내지 표 XX 또는 표 XXII에 기재되어 있는 아미노산 서열을 필수 구성 성분으로 하는 HBV 에피토프를 포함하는 펩티드 조성물을 사용하여, 환자로부터 유래한 T 림프구 샘플을 항온배양하는 단계, 및 펩티드와 결합하는 T 림프구의 존재에 대해 검출하는 단계를 포함하는 방법을 포함하는 구체예를 포함한다. 바람직한 구체예에 있어서, 펩티드는 사합체성 복합체를 포함한다.
본 발명에 따른 펩티드를 정의하는 대안의 방법은 물리적 특성(예컨대, 길이), 1차 구조, 가능하게는 2차 구조 및/또는 3차 구조; 또는 특정 대립유전자 특이성 HLA 분자 또는 대립유전자 특이성 HLA 분자의 군에의 결합과 상관관계가 있는 전하에 의해 정의하는 것이다. 펩티드를 정의하는 또 다른 방법은 HLA 결합 영역(binding pocket)의 물리적 특성 또는 몇몇 대립유전자 특이성 HLA 결합 영역에 의해 공유되는 특성(예컨대, 영역의 배열 및 전하 분포)에 의해 정의하거나 또는 펩티드가 상기 영역 또는 영역들에 적응하거나 결합하는지 여부에 의해 정의하는 것이다.
후술하는 바에 의해 자명하듯이, 다른 방법 및 구체예도 또한 고안해 낼 수 있다. 또한, 본 명세서에 기술되어 있는 임의의 방법에 의해 생산되는 신규 합성펩티드도 또한 본 발명의 일부이다.
Ⅳ. 발명의 상세한 설명
본 발명의 펩티드 및 이에 대응하는 핵산 조성물은 CTL 또는 HTL 반응의 생성을 자극함으로써 HBV에 대한 면역 반응을 자극하는데 유용하다. 미변성의 천연 HBV 아미노산 서열로부터 직접적으로 또는 간접적으로 유래한 펩티드는 HLA 분자에 결합할 수 있고, HBV에 대한 면역 반응을 자극할 수 있다. HBV로부터 유래한 완전한 폴리단백질 서열 및 이의 변이체는 유전자 은행(Genbank)으로부터 얻을 수 있다. 또한, 펩티드는 후술하는 바에 의해 자명하듯이, 지금까지 공지되지 않은 HBV 변이체에 대하여 연속적으로 발견될 수 있는 서열 정보로부터 용이하게 결정될 수 있다.
후술하는 바와 같이, 여러 가지 방식으로 본 발명의 펩티드를 동정하였다. 또한, 유사 펩티드를 유도하고, 특정 아미노산 잔기를 변형시킴으로써 HLA 분자에 대한 결합 활성을 조절하여, 변경된 면역원성을 나타내는 펩티드 유사체를 창출하였다. 또한, 본 발명은 다중 HLA 항원과 상호작용할 수 있는 에피토프계 백신이 선행 기술의 백신보다 광범위한 집단에 걸쳐 효능이 있도록 할 수 있는 조성물 및 상기 조성물의 배합물을 제공한다.
Ⅳ.A. 정의
알파벳 순으로 열거된 하기 정의를 참조하면, 본 발명을 보다 잘 이해할 수 있다.
"컴퓨터" 또는 "컴퓨터 시스템"은 일반적으로 프로세서; 1개 이상의 정보 저장/회수 장치(예컨대, 하드 드라이브, 디스크 드라이브 또는 테이프 드라이브); 1개 이상의 입력 장치(예컨대, 키보드, 마우스, 터치 스크린 또는 마이크로폰); 및디스플레이 작제물을 포함한다. 또한, 컴퓨터는 네트워크 상에서 통신하는 통신 채널을 포함할 수 있다. 이러한 컴퓨터는 상기 열거되어 있는 것보다 더 많거나 더 적은 장치를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "작제물(construct)"은 일반적으로 자연적으로 발생하지 않는 조성물을 의미한다. 작제물은 합성 기법(예컨대, 재조합 DNA 제조 및 발현 기법 또는 핵산 또는 아미노산에 대한 화학적 합성 기법)에 의해 생산할 수 있다. 또한, 작제물은 하나의 물질에 다른 물질을 부가하거나 친화(affiliation)시킴으로써 생산할 수 있는데, 상기 작제물은 자연에서 그와 같은 형태로 발견되지 않는다.
"교차 반응성 결합"은 펩티드가 1개 이상의 HLA 분자에 의해 결합되는 것을 가리키며; 동의어는 변성(degenerate) 결합이다.
"잠재(cryptic) 에피토프"는 분리된 펩티드와의 면역화에 의해 반응을 유도하지만, 반응은 에피토프를 포함하는 천연 전(全) 단백질이 항원으로 사용되는 경우에 시험관 내에서 교차 반응성이 아니다.
"우성 에피토프"는 천연 전(全) 항원과의 면역화시 면역 반응을 유도하는 에피토프이다(예컨대, Sercarz 등의 문헌[Annu. Rev. Immunol. 11:729-766, 1993]을 참조하라). 상기 반응은 분리된 펩티드 에피토프와 시험관 내에서 교차 반응성이다.
특정 아미노산 서열의 경우, "에피토프"는 특정 면역글로불린에 의한 인식에 관련된 일련의 아미노산 잔기이며, T 세포와의 관계에 있어서는 상기 잔기는 T 세포 수용체(TCR) 단백질 및/또는 주요 조직적합성 복합체(MHC) 수용체에 의한 인식에 필요하다. 시험관내 또는 생체내에서의 면역 시스템의 설정에 있어서, 에피토프는 분자(예컨대, 1차, 2차 및 3차 펩티드 구조) 및 전하의 집합적 특징물인데, 상기 분자 및 전하는 함께 면역글로불린, TCR 또는 HLA 분자에 의해 인식되는 부위를 형성시킨다. 본 명세서 전반에 걸쳐 에피토프와 펩티드는 종종 호환적으로 사용된다.
본 발명의 에피토프 및 추가의 아미노산(들)을 포함하는 단백질 또는 펩티드 분자는 본 발명의 범주 내에 속한다는 것을 이해하여야 한다. 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 펩티드의 길이를 제한하는데, 그러하지 아니하면 작제물이 아니다. 길이가 제한된 일 구체예는, 본 발명의 에피토프를 포함하는 단백질/펩티드가 천연 서열과 100% 동일한 영역(즉, 인접하는 일련의 아미노산들)을 포함하는 경우에 발생한다. 해독[예컨대, 전(全) 천연 분자 상에서의 해독]으로부터의 에피토프의 정의를 회피하기 위해서는, 천연 펩티드 서열과 100% 동일한 임의의 영역의 길이에 대한 제한이 있다. 따라서, 본 발명의 에피토프, 및 천연 펩티드 서열과 100% 동일한 영역을 포함하는 펩티드의 경우(그러하지 아니하면, 작제물이 아님), 천연 서열과 100% 동일한 영역의 길이는 일반적으로 600개 이하의 아미노산이고, 종종 500 개 이하의 아미노산, 400개 이하의 아미노산, 250개 이하의 아미노산, 100개 이하의 아미노산, 85개 이하의 아미노산, 75개 이하의 아미노산, 65개 이하의 아미노산, 또는 50개 이하의 아미노산이다. 특정 구체예에 있어서, 본 발명의 "에피토프"는 천연 펩티드 서열과 100% 동일한 51개 미만의 아미노산을 갖는 영역을 보유하는펩티드에 의해 포함되는데, 최소 5개의 아미노산까지 임의의 수가 가능하다(49개, 48개, 47개, 46개, 45개, 44개, 43개, 42개, 41개, 40개, 39개, 38개, 37개, 36개, 35개, 34개, 33개, 32개, 31개, 30개, 29개, 28개, 27개, 26개, 25개, 24개, 23개, 22개, 21개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개 또는 5개의 아미노산).
따라서, 600개의 아미노산보다 긴 펩티드 또는 단백질 서열은, 그들이 천연 펩티드 서열과 100% 동일한 600개 이상의 임의의 인접 아미노산 서열을 포함하지 않는 한(그러하지 않으면, 작제물이 아님) 본 발명의 범주 내에 속한다. 천연 서열에 대응하는 5개 이하의 인접 잔기를 보유하는 임의의 펩티드의 경우, 본 발명의 범주에 속하기 위한 상기 펩티드의 최대 길이에 대한 제한이 없다. 천연 CTL 펩티드의 경우, 길이가 600개의 아미노산 잔기 이하이고, 최소 8개의 아미노산 잔기까지 임의의 수가 가능하다.
"인간 백혈구 항원" 또는 "HLA"는 인간 클래스 I 또는 클래스 II 주요 조직적합성 복합체(MHC) 단백질이다(예컨대, Stites 등의 문헌[IMMUNOLOGY, 제8판, 미국 캘리포니아주 로스앤젤레스 소재 Lange Publishing, (1984)]를 참조하라).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "HLA 슈퍼타입 또는 패밀리"는 공유되는 펩티드-결합 특이성을 기초로 분류되는 HLA 분자 세트를 의미한다. 특정 아미노산 모티프를 보유하는 펩티드에 대한 다소 유사한 결합 친화성을 공유하는 HLA 클래스 I 분자는 HLA 슈퍼타입으로 분류된다. HLA 슈퍼패밀리(superfamily), HLA 슈퍼타입 패밀리 및 HLA xx-유사 슈퍼타입 분자(여기서, xx는 특정 HLA 타입을 의미함)는 동의어이다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 결과는 "IC50"의 관점에서 표현된다. IC50은 대조 펩티드의 결합의 50% 저해가 관찰되는, 결합 분석에 있어서의 펩티드의 농도이다. 상기 분석이 수행되는 조건(즉, HLA 단백질 및 표지된 펩티드의 농도의 제한) 하에서, 상기 IC50값은 대략 KD값이다. 결합을 측정하는 분석법은 예컨대 PCT 국제공개공보 WO 94/20127 및 WO 94/03205에 상세하게 기재되어 있다. 상기 분석 조건이 변하는 경우, 사용되는 특정 시약(예컨대, HLA 제제 등)에 의존하여 IC50값이 종종 극적으로 변화할 수 있다는 것을 유념해야 한다. 예를 들어, HLA 분자의 과다한 농도는 소정의 리간드의 외관상 측정된 IC50을 증가시킬 수 있다.
대안으로, 결합은 대조 펩티드에 대하여 상대적으로 나타낸다. 특정 분석이 보다 더 민감하거나 또는 보다 덜 민감한 경우에는 시험되는 펩티드의 IC50이 다소 변할 수 있지만, 대조 펩티드에 대한 상대적인 결합은 유의적으로 변화하지 않는다. 예를 들어, 대조 펩티드의 IC50이 10배 증가할 정도의 조건 하에서 분석을 수행하는 경우, 시험 펩티드의 IC50값도 또한 대략 10배 이동할 것이다. 따라서, 모호성을 회피하기 위하여, 펩티드가 우수한 결합제, 중간 정도의 결합제, 약한 결합제 또는 네가티브(negative) 결합제인지 여부에 대한 평가는 일반적으로 표준 펩티드의 IC50에 대한 상대적인 IC50에 기초한다.
또한, 생세포를 사용하는 시스템(예컨대, Ceppellini 등의 문헌[Nature339:392, 1989]; Christnick 등의 문헌[Nature 352:67, 1991]; Busch 등의 문헌[Immunol. 2:443, 1990]; Hill 등의 문헌[J. Immunol. 147:189, 1991]; 및 del Guercio 등의 문헌[J. Immunol. 21:2069, 1991] 등 참조), 세정 용균물(detergent lysate)을 사용하는 무세포 시스템(예컨대, Cerundolo 등의 문헌[J. Immunol. 21:2069, 1991] 참조), 부동화 및 정제된 MHC를 사용하는 시스템(예컨대, Hill 등의 문헌[J. Immunol. 152, 2890] 및 Marshall 등의 문헌[J. Immunol. 152:4946, 1994] 참조), ELISA 시스템(예컨대, Reay 등의 문헌[EMBO J. 11:2829, 1992] 참조), 표면 플라스몬(plasmon) 공명을 사용하는 시스템(예컨대, Jhilko 등의 문헌[J. Biol. Chem. 268:15425, 1993], 고유량(high flux)의 가용성 상(相) 분석을 사용하는 시스템(예컨대, Hammer 등의 문헌[J. Exp. Med. 180:2353, 1994] 참조), 및 클래스 I MHC 안정화 또는 집합(assembly)의 측정을 사용하는 시스템(예컨대, Ljunggren 등의 문헌[Nature 346:476, 1990]; Schumacher 등의 문헌[Cell 62:563, 1990]; Townsend 등의 문헌[Cell 62:285, 1990] 및 Parker 등의 문헌[J. Immunol. 149:1896, 1992] 참조)를 비롯한 다른 분석 시스템을 사용하여, 결합을 측정할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, HLA 클래스 I 분자에 대한 "고친화성"은 50 nM 이하의 IC50값 또는 KD값에서의 결합을 의미하고; "중간 정도의 친화성"은 약 50 내지 약 500 nM의 IC50값 또는 KD값에서의 결합을 의미한다. HLA 클래스 II 분자에의 결합에 대한 "고친화성"은 100 nM 이하의 IC50값 또는 KD값에서의 결합을 의미하고; "중간 정도의 친화성"은 약 100 내지 약 1000 nM의 IC50값 또는 KD값에서의 결합을 의미한다.
2개 이상의 펩티드 서열과 관련하여, "동일한(identical)" 또는 "동일성(identity)" 백분율이란 서열 비교 알고리듬을 사용한 측정시 또는 수동 배열 및 육안 검사에 의한 측정시, 비교 윈도우(comparison window) 위에서의 최대 대응(maximum corespondence)을 위해 비교 및 배열되는 경우, 동일한 2개 이상의 서열 또는 서브서열(subsequence), 또는 동일한 특정 백분율의 아미노산 잔기를 갖는 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 의미한다.
"면역원성 펩티드" 또는 "펩티드 에피토프"는 대립유전자 특이성 모티프 또는 슈퍼모티프를 포함하는 펩티드를 의미하는데, 이로써 상기 펩티드가 HLA 분자를 결합시키고 CTL 및/또는 HTL 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역원성 펩티드는 적당한 HLA 분자에 결합한 후, 면역원성 펩티드가 유래하는 항원에 대한 세포독성 T 세포 반응 또는 헬퍼 T 세포 반응을 유도할 수 있다.
"분리된" 또는 "생물학적으로 순수한"이란 천연 상태에서 발견될 때에 통상적으로 그 물질에 수반되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 분리된 펩티드는 통상적으로 계내 환경 내의 펩티드와 연관된 물질을 함유하지 않는 것이 바람직하다.
"가교(link)" 또는 "연결(join)"은 펩티드를 기능적으로 연결하는 당업계에 공지된 임의의 방법(재조합 융합, 공유 결합, 이황화 결합, 이온 결합, 수소 결합및 정전기적 결합 등을 포함하나 이들에 한정되는 것은 아님)을 의미한다.
"주요 조직적합성 복합체" 또는 "MHC"는 생리학적 면역 반응의 원인이 되는 세포의 상호작용을 조절하는 역할을 하는 유전자의 클러스터(cluster)를 의미한다. 인간에 있어서, MHC 복합체는 HLA 복합체라고도 알려져 있다. MHC 및 HLA 복합체에 대한 상세한 설명은 예컨대 Paul의 문헌[FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, 제3판, 미국 뉴욕주 뉴욕 소재 Raven Press, 1993]을 참조하라.
"모티프(motif)"는 특정 HLA 분자에 의해 인식되는 한정된 길이의 펩티드(클래스 I HLA 모티프의 경우에는 약 8개 내지 약 13개의 아미노산의 펩티드이고, 클래스 II HLA 모티프의 경우에는 약 6개 내지 약 25개의 아미노산의 펩티드임) 내의 잔기의 패턴을 의미한다. 펩티드 모티프는 일반적으로 각 인간 HLA 대립유전자에 의해 암호화되는 각 단백질에 대하여 상이하고, 제1 및 제2 앵커 잔기(anchor residue)의 패턴에 있어서 상이하다.
"네가티브(negative) 결합 잔기" 또는 "유해한(deleterious) 잔기"는 펩티드 에피토프의 특정 위치(일반적으로는 제1 앵커 위치가 아님)에 존재하는 경우, 펩티드에 대응하는 HLA 분자에 대한 펩티드의 결합 친화성을 감소시키는 아미노산을 의미한다. 유해하지 않은 임의의 잔기는 "무해한(non-deleterious) 잔기이다.
"비천연(non-native)" 서열 또는 "작제물(construct)"은 자연에서 발견되지 않는, 즉 비천연의(non-naturally occurring) 서열을 의미한다. 상기 서열은 예컨대 지질화되거나 기타 변형된 펩티드, 및 천연 단백질 서열 내에 인접하지 않은 에피토프를 함유하는 폴리에피토프 조성물을 포함한다.
"펩티드"는 본 명세서에서 일반적으로 인접 아미노산의 α-아미노기 및 카르복실기 사이의 펩티드 결합에 의해 상호 연결된 일련의 잔기(일반적으로는 L-아미노산)를 지칭하며, "올리고펩티드"와 호환적으로 사용된다. 몇몇 구체예에 있어서, 본 발명의 바람직한 CTL 유도 올리고펩티드의 길이는 13개 이하의 잔기이고, 통상 약 8개 내지 약 11개의 잔기, 바람직하게는 9개 또는 10개의 잔기로 구성된다. 몇몇 구체예에 있어서, 바람직한 HTL 유도 올리고펩티드의 길이는 약 50개 이하의 잔기이고, 통상 약 6개 내지 약 30개의 잔기, 보다 통상적으로는 약 12개 내지 약 25개의 잔기, 종종 약 15개 내지 약 20개의 잔기로 구성된다.
"약학적 허용가능"이란 일반적으로 비독성이고, 비활성이며, 생리학적으로 적합한 조성물을 의미한다.
"제1 앵커 잔기"는 면역원성 펩티드와 HLA 분자 사이에 접촉 지점을 제공하는 것으로 이해되는 펩티드 서열을 따라 특정 위치에 존재하는 아미노산이다. 한정된 길이의 펩티드 내의 1개 내지 3개(통상 2개)의 제1 앵커 잔기는 일반적으로 면역원성 펩티드용 모티프를 한정한다. 이들 잔기는 HLA 분자의 펩티드 결합 그루브(groove)와 밀접하게 접촉하기에 적합하다고 이해되는데, 이들 잔기의 측쇄는 그 자체로 결합 그루브의 특정 영역에 매립된다. 일 구체예에 있어서, 제1 앵커 잔기는 본 발명에 따른 9개의 잔기 펩티드의 2번 위치(아미노 말단 위치로부터) 및 카르복실 말단 위치에 배치된다. 각 모티프 및 슈퍼모티프에 대한 제1 앵커 위치는 표 1에 설명되어 있다. 예를 들어, 유사 펩티드는 상기 제1 앵커 위치 내의 특정 잔기의 존부를 변경시킴으로써 창출할 수 있다. 상기 유사체는 특정 모티프 또는슈퍼모티프를 포함하는 펩티드의 결합 친화성을 미세하게 조절하는데 사용된다.
"무차별(promiscuous) 인식"은 다중 HLA 분자와 관련하여, 별개의 펩티드가 동일한 T 세포 클론에 의해 인식되는 것을 의미한다. 무차별 결합은 교차 반응성 결합과 동의어이다.
"보호 면역 반응" 또는 "치료 면역 반응"은 질병 증후 또는 진행을 예방하거나 적어도 부분적으로 억제하는 감염성 제제 또는 종양 항원으로부터 유래한 항원에 대한 CTL 및/또는 HTL 반응을 의미한다. 또한, 면역 반응은 헬퍼 T 세포의 자극에 의해 촉진된 항체 반응을 포함할 수 있다.
"잔기(residue)"는 아미드 결합 또는 아미드 결합 유사체에 의해 올리고펩티드 내에 혼입되는 아미노산 또는 아미노산 유사체를 의미한다.
"제2 앵커 잔기"는 펩티드 결합에 영향을 미칠 수 있는 펩티드 내의 제1 앵커 위치 이외의 위치에 있는 아미노산을 의미한다. 제2 앵커 잔기는 하나의 위치에서의 아미노산의 불규칙(random) 분포에 의해 기대되는 것보다 결합된 펩티드 사이에 유의적으로 더 높은 빈도로 발생한다. 제2 앵커 잔기는 "제2 앵커 위치"에서 발생한다고 한다. 제2 앵커 잔기는 고친화성 결합 펩티드 사이에 보다 높은 빈도로 존재하는 잔기, 또는 기타 고친화성 결합과 연관된 잔기로서 동정할 수 있다. 예를 들어, 상기 제2 앵커 위치 내의 특정 잔기의 존부를 변경시킴으로써, 유사 펩티드를 창출할 수 있다. 상기 유사체는 특정 모티프 또는 슈퍼모티프를 포함하는 펩티드의 결합 친화성을 미세하게 조절하는데 사용된다.
"아(亞)우성(subdominant) 에피토프"는 에피토프를 포함하는 전(全) 항원과의 면역화시 반응을 거의 일으키지 않거나 반응을 전혀 일으키지 않는 에피토프를 의미하는데, 이 경우 반응은 분리된 펩티드와의 면역화에 의해 얻을 수 있으며, 이 반응(잠재 에피토프의 경우와는 달리)은 전(全) 단백질이 시험관내 또는 생체내에서 반응을 소생(recall)시키는데 사용될 때 검출된다.
"슈퍼모티프(supermotif)"는 2개 이상의 대립유전자에 의해 암호화되는 HLA 분자에 의해 공유되는 펩티드 결합 특이성이다. 슈퍼모티프 함유 에피토프는 2개 이상의 HLA 항원에 의해 고친화성 또는 중간 정도의 친화성(본 명세서에서 정의된 바와 같음)으로 인식되는 것이 바람직하다.
"합성 펩티드"는 화학 합성법 또는 재조합 DNA 기법과 같은 방법을 사용하여 인공 제조되는 펩티드를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "백신"은 1개 이상의 본 발명의 펩티드를 함유하는 조성물을 의미한다. 본 발명에 따른 백신에 대한 다수의 구체예가 있는데, 그 예로는 1개 이상의 펩티드; 폴리에피토프 펩티드에 의해 포함되는 1개 이상의 본 발명의 펩티드; 또는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산[예: 폴리에피토프 펩티드를 암호화하는 미니유전자(minigene)]의 칵테일(cocktail)에 의해 제조된 백신을 들 수 있다. "1개 이상의 펩티드"는 정수 1-150의 임의의 전(全) 단위 정수를 포함할 수 있다. 예컨대, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상, 28개 이상,29개 이상, 30개 이상, 31개 이상, 32개 이상, 33개 이상, 34개 이상, 35개 이상, 36개 이상, 37개 이상, 38개 이상, 39개 이상, 40개 이상, 45개 이상, 50개 이상, 55개 이상, 60개 이상, 65개 이상, 70개 이상, 75개 이상, 80개 이상, 85개 이상, 90개 이상, 95개 이상, 100개 이상, 105개 이상, 110개 이상, 115개 이상, 120개 이상, 125개 이상, 130개 이상, 135개 이상, 140개 이상, 145개 이상, 150개 이상 또는 그 이상의 본 발명의 펩티드를 포함한다. 예컨대, 지질화, 표적화 서열 또는 기타 서열의 첨가 등에 의해 펩티드 또는 폴리펩티드를 임의로 변형시킬 수 있다. 본 발명의 HLA 클래스 I 결합 펩티드는 HLA 클래스 II 결합 펩티드와 혼합되거나 또는 HLA 클래스 II 결합 펩티드와 가교되어, 세포독성 T 림프구 및 헬퍼 T 림프구의 활성화를 촉진시킨다. 또한, 백신은 펩티드-펄스형(peptide-pulsed) 항원 제시 세포(예컨대, 수지상 세포)를 포함할 수 있다.
펩티드 화합물을 기술하는데 사용되는 명명법은 종래의 관행에 따르는데, 아미노기는 각 아미노산 잔기의 왼쪽(N-말단)에 제시되고, 카르복실기는 각 아미노산 잔기의 오른쪽(C-말단)에 제시된다. 펩티드 에피토프 내의 아미노산 잔기를 언급할 때, 아미노산 잔기의 번호는 아미노기 방향에서 카르복실기 방향으로 매겨지는데, 아미노 말단에 가장 근접한 위치에 있는 것이 1번이다. 선택된 본 발명의 특정 구체예를 나타내는 식에 있어서, 아미노 말단의 기 및 카르복실 말단의 기(비록 구체적으로 나타나있지 않지만)는 특별한 언급이 없는 한 생리학적 pH값을 나타내는 것으로 추정되는 형태로 존재한다. 아미노산 구조식에 있어서, 각 잔기는 일반적으로 표준 3개 문자 또는 단일 문자 명명에 의해 나타낸다. L 형태의 아미노산 잔기는 1개의 알파벳 대문자 또는 3개의 알파벳 기호 중 첫번째 대문자로 나타내고, D 형태의 아미노산 잔기는 1개의 알파벳 소문자 또는 3개의 알파벳 소문자로 나타낸다. 글리신은 비대칭 탄소 원자가 없고, 단순히 "Gly" 또는 G로 나타낸다. 아미노산에 대한 기호는 다음과 같다.
단일 문자 기호 3개 문자 기호 아미노산
A Ala 알라닌
C Cys 시스테인
D Asp 아스파르트산
E Glu 글루탐산
F Phe 페닐알라닌
G Gly 글리신
H His 히스티딘
I Ile 이소류신
K Lys 리신
L Leu 류신
M Met 메티오닌
N Asn 아스파라긴
P Pro 프롤린
Q Gln 글루타민
R Arg 아르기닌
S Ser 세린
T Thr 트레오닌
V Val 발린
W Trp 트립토판
Y Tyr 티로신
Ⅳ.B. HBV에 대한 CTL 및 HTL 반응의 자극
과거 10년 동안, T 세포가 항원을 인식하는 메카니즘에 대하여 기술되어 왔다. 면역 체계에 대한 본 발명자들의 새로운 이해에 기초하여, 본 발명자들은 광범위한 집단에 있어서의 HBV에 대한 치료 또는 예방 면역 반응을 유도할 수 있는 효능이 있는 펩티드 에피토프 백신 조성물을 생성시켰다. 특허청구되는 조성물의 가치 및 효능에 대하여 간단히 개관하면 다음과 같다.
HLA 분자와 펩티드 항원의 복합체는 HLA-제한 T 세포에 의해 인식되는 리간드로서 역할한다(Buss, S. 등의 문헌[Cell 47:1071, 1986]; Babbitt, B. P. 등의 문헌[nature 317:359, 1985]; Townsend, A 및 Bodmer, H의 문헌[Annu. Rev. Immunol. 7:601, 1989]; 및 Germain, R. N.의 문헌[Annu. Rev. Immunol. 11:403, 1993] 참조). 단일 아미노산 치환된 항원 유사체의 연구, 및 내인성으로 결합되고 천연 처리된 펩티드의 서열 결정을 통하여, HLA 항원 분자에 대한 특이적 결합에 필요한 모티프에 대응하는 중요 잔기를 동정하였고, 이를 명세서에 기재하고 표 I, 표 II 및 표 III에서 설명하였다(또한, 예컨대 Southwood 등의 문헌[J. Immunol. 160:3363, 1998]; Rammensee 등의 문헌[Immunogenetics 41:178, 1995]; 웹 사이트 http://134.2.96.221/scripts.hlaserver.dll/home.htm에서 찾을 수 있는 Rammensee 등의 논문[SYFPEITHI]; Sette, A. 및 Sidney, J.의 문헌[Curr. Opin. Immunol. 10:478, 1998]; Engelhard, V. H.의 문헌[Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994]; Sette, A. 및 Grey, H. M.의 문헌[Curr. Opin. Immunol. 4:79, 1992]; Sinigalia, F. 및 Hammer, J.의 문헌[Curr. Biol. 6:52, 1994]; Ruppert 등의 문헌[Cell, 74:929-937, 1993]; Kondo 등의 문헌[J. Immunol. 155:4307-4312, 1995]; Sidney 등의 문헌[J. Immunol. 157:3480-3490, 1996]; Sidney 등의 문헌[Human Immunol. 45:79-93, 1996]; 및 Sette, A. 및 Sidney의 문헌[J. Imunogenetics, in press, 19999]를 참조하라).
또한, HLA-펩티드 복합체의 X-선 결정 분석은 펩티드 리간드에 의해 보유되는 잔기를 대립유전자에 특이적인 양식으로 수용하고, 이들 잔기가 그것이 존재하는 펩티드의 HLA 결합 성능을 차례로 결정하는, HLA 분자의 펩티드 결합 열구(裂溝; cleft) 내의 영역을 밝혀냈다(예컨대, Madden, D. R.의 문헌[Rev. Immunol. 13:587, 1995]; Smith 등의 문헌[Immunity 4:203, 1996]; Fremont 등의 문헌[Immunity 8:305, 1998]; Stern 등의 문헌[Structure 2:245, 1994]; Jones, E. Y.의 문헌[Curr. Opin. Immunol. 9:7, 1997]; Brown, J. H. 등의 문헌[Nature 364:33, 1993]; Guo, H. C. 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8053, 1993]; Guo, H. C. 등의 문헌[Nature 360:364, 1992]; Silver, M. L. 등의 문헌[Nature 360:367, 1992]; Matsumura, M. 등의 문헌[Science 257:927, 1992]; Madden 등의 문헌[Cell 70:1035, 1992]; Fremont, D. H. 등의 문헌[Science 257:919, 1992]; 및 Saper, M. A., Bjorkman, P. J. 및 Wiley, D. C.의 문헌[J. Mol. Biol. 219:277, 1991]을 참조하라).
따라서, 클래스 I 및 클래스 II 대립유전자 특이성 HLA 모티프 또는 클래스 I 슈퍼모티프의 정의는 특정 HLA 항원을 결합시킬 수 있는 가능성을 갖는 단백질 내의 영역의 동정을 가능하게 한다(또한, 예컨대, Sette, A 및 Grey, H. M.의 문헌[Curr. Opin. Immunol. 4:79, 1992]; Sinigaglia, F. 및 Hammer, J.의 문헌[Curr. Biol. 6:52, 1994]; Engelhard, V. H.의 문헌[Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994]; 및 Kast, W. M. 등의 문헌[J. Immunol., 152:3904, 1994]를 참조하라).
또한, 펩티드와 HLA 간의 상호작용의 친화성을 정량하는 각종 분석법도 확립되었다. 상기 분석법은 예컨대 IC50값(즉, 항원 제시의 저해)의 측정(Sette 등의 문헌[J. Immunol. 141:3893, 1991] 참조), 시험관내 집합(assembly) 분석(Townsend 등의 문헌[Cell 62:285, 1990] 참조), 해리 속도의 측정(Parker 등의 문헌[J. Immunol. 149:1896-1904, 1992] 참조), 및 RMA.S와 같이 돌연변이화된 세포를 사용하는 FACS계 분석(Melief 등의 문헌[Eur. J. Immunol. 21:2963, 1991] 참조)을 포함한다.
본 발명자들은 면역원성과 결합 친화성의 상관관계가 후보(candidate) 펩티드를 평가할 때 고려해야 하는 중요한 인자라는 것을 발견하였다. 따라서, 모티프 연구 및 HLA-펩티드 결합 분석에 의해, 에피토프계 백신의 후보를 동정하였다. 결합 친화성의 측정 후, 추가의 확인 작업을 수행하여, 이들 백신 후보 중에서 항원성 및 면역원성의 관점에서 바람직한 특성을 갖는 에피토프를 선택할 수 있다. 하기와 같은 각종 전략을 사용하여 면역원성을 평가할 수 있다:
1) 정상적인 개체로부터 유래한 주요 T 세포 배양액의 평가(Wentworth, P. A. 등의 문헌[Mol. Immunol. 32:603, 1995]; Celis, E. 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2105, 1994]; Tsai, V. 등의 문헌[J. Immunol. 158:1796]; 및 Kawashima, I. 등의 문헌[Human Immnol. 59:1, 1998] 참조). 이 방법은 시험관 내에서 수주일 이상 항원 제시 세포의 존재 하에 시험 대상 펩티드를 사용하여 정상적인 숙주로부터 유해한 PBL을 자극하는 단계를 포함한다. 이 기간 동안에 펩티드에 대해 특이적인 T 세포를 활성화시키고, 펩티드 감작화된 표적 세포를 포함하는51Cr 방출 분석법을 사용하여 상기 T 세포를 검출한다.
2) HLA 트랜스제닉 마우스의 면역화(Wentworth, P. A. 등의 문헌[J. Immunol. 26:97, 1996]; Wentworth, P. A. 등의 문헌[Int. Immunol. 8:651, 1996]; 및 Alexander, J. 등의 문헌[J. Immunol. 159:4753, 1997] 참조). 이 방법에 있어서, 불완전한 프로인트 아쥬반트(Freund's adjuvant) 중의 펩티드를 HLA 트랜스제닉 마우스에 피하 투여한다. 면역화 후 몇주 후에, 비(脾)세포를 제거하고, 약 1주일 동안 시험 대상 펩티드의 존재 하에 시험관 내에서 배양한다. 펩티드 감작화된 표적 세포, 및 내인성으로 생성된 항원을 발현시키는 표적 세포를 포함하는51Cr 방출 분석법을 사용하여, 펩티드 특이성 T 세포를 검출한다.
3) 감염에서 회복한 면역 개체 및/또는 만성적으로 감염된 환자로부터 회수된 면역 개체로부터 소생 T 세포 반응의 증명(Rehermann, B. 등의 문헌[J. Exp. Med. 181:1047, 1995]; Doolan, D. L. 등의 문헌[Immunity 7:97, 1997]; Bertoni, R. 등의 문헌[J. Clin. Invest. 100:503, 1997]; Threlkeld, S. C. 등의 문헌[J. Immunol. 159:1648, 1997]; 및 Diepolder, H. M. 등의 문헌[J. Virol. 71:6011, 1997] 참조). 이 전략을 적용함에 있어서, 예컨대 감염을 통해 항원에 자연적으로 노출된 숙주로부터 유래한 PBL을 배양함으로써 소생 반응(recall response)을 검출하였고, 따라서 "자연적으로" 면역 반응을 생성시켰다. 시험 대상 펩티드 및 항원 제시 세포(APC)의 존재 하에 1-2주 동안 시험관 내에서 숙주로부터 유래한 PBL을 배양하여, "본래의 미변성(naive)" T 세포에 비하여 "기억(memory)" T 세포의 활성화를 가능하게 하였다. 배양 기간의 말미에, 펩티드 감작화된 표적, T 세포 증식또는 림포카인 방출에 관련된51Cr 방출을 포함하는 T 세포 활성화에 대한 분석법을 사용하여, T 세포 활성화를 검출한다.
본 발명의 펩티드 에피토프 및 이에 대응하는 핵산은 후술하는 바와 같다.
Ⅳ.C. HLA 분자에 대한 펩티드 에피토프의 결합 친화성
본 명세서에 기술되어 있는 바와 같이, 대규모의 HLA 다형성(polymorphism)은 에피토프계 백신 개발 방법에 있어서 고려해야 할 중요한 인자이다. 상기 인자를 해결하기 위해, 다중 HLA 분자에 고친화성 또는 중간 정도의 친화성으로 결합할 수 있는 펩티드의 동정을 포함하는 에피토프 선택을 사용하는 것이 바람직하고, 이들 에피토프가 2개 이상의 대립유전자 특이성 HLA 분자에 고친화성 또는 중간 정도의 친화성으로 결합하는 것이 보다 바람직하다.
백신 조성물에 중요한 CTL 유도 펩티드는 500 nM 이하의 IC50또는 클래스 I HLA 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 것을 포함하는 것이 바람직하다. HTL 유도 펩티드는 1000 nM 이하의 IC50또는 클래스 II HLA 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 것을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 시험관 내에서 정제된 HLA 분자에 결합할 수 있는 후보 펩티드의 성능을 시험함으로써, 펩티드 결합을 평가한다. 이어서, 고친화성 또는 중간 정도의 친화성을 나타내는 펩티드는 추가의 분석에 고려된다. 슈퍼타입 패밀리의 다른 구성 요소에 대하여 선택된 펩티드를 시험한다. 바람직한 구체예에 있어서, 교차 반응성 결합을 나타내는 펩티드는 그 후 백신에 사용하거나 또는 세포 스크리닝 분석에 사용한다.
본 명세서에 기재되어 있듯이, 높은 HLA 결합 친화성은 보다 더 우수한 면역원성과 상관관계가 있다. 몇몇 상이한 방법으로 보다 더 우수한 면역원성을 명확히 나타낼 수 있다. 면역원성은 면역 반응이 유도되는지 여부 및 임의의 특정 반응의 강도에 대응한다. 예를 들어, 펩티드는 다양한 배열의 집단에 있어서 면역 반응을 유도할 수 있지만, 격렬한 반응을 생성시킬 수 없다. 이러한 원리에 따르면, 고친화성의 결합 펩티드의 90% 가까이가 면역원성이 있는 반면, 중간 정도의 친화성으로 결합하는 펩티드의 약 50%가 면역원성이 있다는 것이 밝혀졌다. 더욱이, 보다 높은 친화성의 결합 펩티드는 보다 격렬한 면역원성 반응을 야기시킨다. 따라서, 고친화성의 결합 펩티드를 사용하는 경우, 유사한 생물학적 효과를 유도하는데 펩티드가 덜 필요하다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 고친화성의 결합 에피토프가 특히 바람직하다.
본 발명자들은 당업계에서 처음으로 HLA 클래스 I 분자에 대한 결합 친화성과 결합된 항원 상의 불연속 펩티드 에피토프의 면역원성의 관계를 측정하였다. 2가지 상이한 실험 방법(sette 등의 문헌[J. Immunol. 153:5586-5592, 1994] 참조)으로 결합 친화성과 면역원성의 상관관계를 분석하였다. 제1 방법에 있어서, HLA-A*0201 트랜스제닉 마우스에서 HLA 결합 친화성이 10,000배 범위인 잠재 에피토프의 면역원성을 분석하였다. 제2 방법에 있어서, 급성 간염 환자의 PBL(말초 혈액 림프구)를 사용함으로써, 약 100개의 상이한 B형 간염 바이러스 유래 잠재 에피토프(상기 에피토프는 모두 A*0201 결합 모티프를 보유함)의 항원성을 평가하였다. 이들 방법에 따라, 약 500 nM(바람직하게는 500 nM 이하의 IC50값)의 친화성 역치가 CTL 반응을 유도할 수 있는 펩티드 에피토프의 성능을 결정한다는 것을 밝혀냈다. 자연적으로 처리된 펩티드 및 합성된 T 세포 에피토프에 대한 클래스 I 결합 친화성 측정의 경우에 이들 데이타가 일치한다. 또한, 이들 데이타는 T 세포 반응의 형성(shaping)에 있어서의 결정인자(determinant) 선택의 중요한 역할을 나타낸다.
또한, HLA 클래스 II DR 분자와 관련하여 면역원성과 연관된 친화성 역치는 여러 문헌에 기재되어 있다(Southwood 등의 문헌[J. Immunology 160:3363-3373, 1998] 및 1998. 5. 29.에 출원된 U.S.S.N. 60/087192를 참조하라). DR 결합 친화성의 생물학적으로 유의적인 역치를 정의하기 위해, 제한 요소에 대한 32개의 DR 제한 에피토프의 결합 친화성의 데이타베이스를 구축하였다. 약 절반의 경우(32개의 에피토프 중 15개)에 있어서, DR 제한은 높은 결합 친화성(즉, 100 nM 이하의 IC50값에서의 결합 친화성)과 연관되어 있다. 다른 절반의 경우(32개 중 16개)에 있어서, DR 제한은 중간 정도의 결합 친화성(즉, 100-1000 nM 범위에서의 결합 친화성)과 연관되어 있다. 32개의 에피토프 중 단지 1개의 경우에 있어서, DR 제한은 1000 nM 이상의 IC50과 연관되어 있다. 따라서, 1000 nM은 DR 분자와 관련하여 면역원성과 연관된 친화성 역치로 정의될 수 있다.
하기 실시예 1에 기재되어 있는 바와 같이, HLA 분자에 대한 펩티드의 결합 친화성을 측정할 수 있다.
IV. D. 모티프 및 슈퍼모티프에 결합하는 펩티드 에피토프
과거 수년간, HLA 클래스 I 및 가능하게는 클래스 II 분자의 대형 분획이 대부분 중첩하는 펩티드 결합 레퍼토리가 특징인 상대적으로 소수의 슈퍼타입 및 주 펩티드 결합 포켓의 공통 구조물로 분류될 수 있음을 입증하는 증거가 축적되어 왔다.
HLA 분자 포켓 분석에 있어서, 결정학적 연구[참조: Guo, H. C. 등, Nature 360: 364, 1992; Saper, M.A., Bjorkman, P.J. 및 Wiley, D.C., J. Mol. Biol. 219: 277, 1991; Madden, D.R., Garboczi, D.N. 및 Wiley, D.C., Cell 75: 693, 1993]에 기술된 바와 같이, HLA 클래스 I 분자의 B 포켓 및 F 포켓을 포함하는 잔기는 문헌[참조: Parham, P., Adams, E.J., 및 Arnett, K. L., Immunol. Rev. 143: 141, 1995]에 기술된 데이타베이스로부터 컴파일하였다. 이들 분석에서, 잔기 9, 45, 63, 66, 67, 70 및 99는 B 포켓을 구성하는 것으로 생각되며, 펩티드 리간드의 제2 위치내 잔기에 대한 특이성을 결정하는 것으로 생각된다. 유사하게, 잔기 77, 80, 81 및 116은 F 포켓의 특이성을 결정하고, HLA 분자에 의해 결합된 펩티드 리간드의 C-말단 잔기에 대한 특이성을 결정하는 것으로 생각된다.
단일 아미노산 치환된 항원 유사체의 연구 및 내부적으로 결합되고 천연적으로 프로세싱된 펩티드의 시퀀싱을 통해, HLA 분자에 대한 대립유전자 특이성 결합에 요구되는 결정적인 잔기를 확인하였다. 이들 잔기의 존재는 HLA 분자에 대한 결합 친화성과 상관관계가 있다. 높은 정도의 친화성 결합 및 중간 정도의 친화성 결합과 상관관계가 있는 모티프 및/또는 슈퍼모티프의 확인은 백신에 봉입시키기 위한 면역원성 펩티드 에피토프의 확인에 관한 중요한 과제이다. 문헌[참조: Kast등, J. Immunol. 152: 3904-3912, 1994]을 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 모티프를 보유하는 펩티드는 대립유전자 특이성 HLA 클래스 I 분자에 결합하는 에피토프의 90%를 차지한다. 이 연구에서, 길이가 9개의 아미노산이고, 8개의 아미노산에 의해 중첩되는 모든 가능한 펩티드(240개의 펩티드)는 인간 파필로마바이러스 타입 16의 E6 단백질 및 E7 단백질의 전체 서열을 커버하며, 상이한 종족 군 중에서 높은 빈도로 발현되는 5개의 대립유전자 특이성 HLA 분자에 결합하는 것에 대해 평가하였다. 상기한 편향되지 않은 세트의 펩티드는 HLA 클래스 I 모티프의 예상치의 평가를 가능하게 한다. 240개 펩티드의 세트로부터, 22개의 펩티드는 높은 정도의 친화성 또는 중간 정도의 친화성으로 대립유전자 특이성 HLA 분자에 결합하는 것으로 확인되었다. 이들 22개의 펩티드 중에서, 20개(즉, 91%)의 펩티드는 모티프를 보유하고 있다. 따라서, 상기 연구는 백신에 봉입시키기 위한 펩티드 에피토프의 확인을 위한 모티프의 가치를 입증하고 있다: 모티프계 확인 기법의 적용은 잠재 에피토프의 90%의 스크리닝을 제거한다.
이러한 펩티드 에피토프는 후술하는 표에서 확인된다. HLA 클래스 I 에피토프에 대한 표는 중간 정도의 친화성 또는 높은 정도의 친화성을 보유하는 대립유전자 특이성 HLA 클래스 I 분자에 결합할 펩티드중 90% 이상을 포함한다.
또한, 본 발명의 펩티드는 MHC 클래스 II DR 분자에 결합하는 에피토프를 포함할 수 있다. 클래스 I HLA 분자와 클래스 II HLA 분자 사이의 상당한 차이는, 클래스 I 분자에 결합하는 펩티드에 대해 엄한 크기 제한이 존재함에도 불구하고, 상기 펩티드의 N 말단 및 C 말단에 대한 모티프의 크기 및 결합 프레임 위치 둘 다에서의 더 큰 정도의 이종성은 클래스 II 펩티드 리간드에 대해 입증할 수 있다는 것이다. 상기 증가된 이종성은 그의 클래스 I 대응부분과는 달리 양쪽 단부에서 개방된 클래스 II 결합 그루브의 구조에 기인하는 것이다. DRB*0101-펩티드 복합체의 결정학적 연구[참조: 예를 들어, Madden, D.R.Ann. Rev. Immunol. 13: 587 (1995)] 결과를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, DRB*0101과 복합체를 이룬 펩티드의 위치 1 및 위치 6을 점유하는 잔기는 DRBa*0101 분자 상의 2개의 상보적인 포켓과 맞물리는데, 상기 P1 위치는 가장 중요한 앵커 잔기와 가장 소수성인 포켓에 상응한다. 또한, 다른 연구는 여러가지 다른 DR 분자에 결합하기 위해 중요한 앵커 잔기로서 P6 위치에 대해 지적하고 있다.
따라서, 본 발명의 펩티드는 수개의 HLA-특이성 아미노산 모티프(예를 들어, 표 I 내지 III 참조)중 임의의 한 모티프에 의해 확인된다. 상기 모티프의 존재가 수개의 대립유전자 특이성 HLA 항원에 결합할 수 있는 능력에 상응하는 경우, 이는 슈퍼모티프라 칭한다. 특정 아미노산 슈퍼모티프를 보유하는 펩티드에 결합하는 대립유전자 특이성 HLA 분자는 HLA "슈퍼타입"으로 총체적으로 언급한다.
이하 기술하는 펩티드 모티프 및 슈퍼모티프는 본 발명에 따른 펩티드의 확인 및 용도에 대한 지침을 제공한다.
각각의 슈퍼모티프 또는 모티프를 보유하는 펩티드 에피토프의 예들은 각각의 모티프 또는 슈퍼모티프의 기술 부분에서 지정한 바와 같이 표에 적시되어 있다. 상기 표는 펩티드 에피토프중 일부분에 대해 목록화한 결합 친화성 비율을 포함한다. 상기 비율은 다음과 같은 관계식에 의해 IC50으로 전환할 수 있다: 표준 펩티드의 IC50/비율 = 테스트 펩티드(즉, 표준 펩티드)의 IC50. 클래스 I 펩티드에 대한 결합 친화성을 결정하기 위해 사용된 표준 펩티드의 IC50값은 표 IV에 적시하였다. 클래스 II 펩티드에 대한 결합 친화성을 결정하기 위해 사용한 표준 펩티드의 IC50값은 표 V에 적시하였다. 결합 분석에 대한 표준물로서 사용된 펩티드는 표준물의 예이며; 대체 표준 펩티드 또한 그러한 분석 수행시에 사용할 수 있다.
각각의 표에 적시된 펩티드 에피토프 서열을 얻기 위해, 20개의 균주로부터 유래한 단백질 서열 데이타(HPBADR, HPBADR1CG, HPBADRA, HPBADRC, HPBADRCG, HPBCGADR, HPBVADRM, HPBADW, HPBADW1, HPBADW2, HPBADW3, HPBADWZ, HPBHEPB, HPBVADW2, HPBAYR, HPBV, HPBVAYWC, HPBVAYWCI, NAD HPBVAYWE)를 지정된 슈퍼모티프 또는 모티프의 존재에 대해 평가하였다. 또한, 펩티드 에피토프는 그들의 보존성에 기초하여 선택하였다. 펩티드의 전체 서열이 특정 단백질에 대해 가용한 서열의 75% 내에서 전체적으로 보존되는 보존성의 기준이 요구된다. 선택된 펩티드 에피토프의 보존율은 상기 표에 적시하였다. 빈도, 즉 20개의 균주중 펩티드 서열이 확인된 균주의 수도 적시하였다. 표에서 "제1 위치" 란은 상기 에피토프의 제1 아미노산 잔기에 상응하는 HBV 단백질의 아미노산 위치를 지정한다. "아미노산의 수"는 에피토프 서열내 잔기의 수를 나타낸다.
CTL 유도성 펩티드 에피토프를 나타내는 HLA 클래스 I 모티프
후술하는 HLA 클래스 I 펩티드 에피토프 슈퍼모티프 및 모티프의 제1 앵커잔기는 표 I에 요약하였다. 표 I(a)에 나타낸 HLA 클래스 I 모티프는 본원에서 청구한 발명에 특별히 관련된 것들이다. 제1 및 제2 앵커 위치는 표 II에 요약하였다. HLA 클래스 I 슈퍼타입 패밀리를 포함하는 대립유전자 특이성 HLA 분자는 표 VI에 적시하였다.
IV.D1. HLA-A1 슈퍼모티프
HLA-A1 슈퍼모티프는 상기 에피토프의 위치 2내에 소형 제1 앵커 잔기(T 또는 S) 또는 소수성 제1 앵커 잔기(L, I, V 또는 M), 및 상기 에피토프의 C-말단 위치에 방향족 제1 앵커 잔기(Y, F 또는 W)의 펩티드 리간드내 존재를 특징으로 한다. A1 슈퍼모티프(HLA-A1 슈퍼타입)에 결합하는 HLA 분자의 상응하는 패밀리는 적어도 A*0101, A*2601, A*2602, A*2501 및 A*3201로 구성된다[참조: 예를 들어, DiBrino, M. 등, J. Immunol. 151:5930, 1993; DiBrino, M. 등, J. Immunol. 152: 620 (1994); Kondo, A. 등, Immunogenetics 45: 249 (1997)]. A1 슈퍼패밀리의 구성원일 것으로 예상되는 다른 대립유전자 특이성 HLA 분자는 표 VI에 적시하였다. 개개의 HLA 단백질 각각에 결합하는 펩티드는 제1 및/또는 제2 앵커 위치에서의 치환에 의해, 바람직하게는 슈퍼모티프에 대해 특정된 각각의 잔기를 선택함으로써 조절될 수 있다.
A1 슈퍼모티프를 포함하는 대표적인 펩티드 에피토프는 표 VII에 적시하였다.
IV.D.2. HLA-A2 슈퍼모티프
대립유전자 특이성 HLA A2.1 분자에 대한 제1 앵커 특이성[참조: Falk 등, Nature 351: 290-296 (1991); Hunt 등, Science 255: 1261-1263 (1992)] 및 HLA A2 패밀리 내에서의 교차반응성 결합[참조: Fruci 등, Human Immunol. 38: 187-192 (1993); Tanigaki 등, Human Immunol. 39: 155-162 (1994)]이 기술되어 있다. 본 발명은 다수의 대립유전자 특이성 HLA A2 분자에 결합하는 교차반응성을 결정하는 추가의 제1 앵커 잔기를 한정하였다[참조: Del Guercio 등, J. Immunol. 154: 685-693 (1995)]. 상기 HLA-A2 슈퍼모티프는 상기 에피토프의 위치 2에 제1 앵커 잔기로서 L, I, V, M, A, T, 또는 Q 보유하며 상기 에피토프의 C-말단 위치에서 제1 앵커 잔기로서 L, I, V, M, A 또는 T를 보유하는 펩티드 리간드를 포함한다.
HLA 분자의 상응하는 패밀리(즉, 이들 펩티드에 결합하는 HLA-A2 슈퍼타입)은 적어도 A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*0207, A*0209, a*0214, A*6802 및 A*6901을 포함한다. A2 슈퍼패밀리의 구성원일 것으로 예상되는 다른 대립유전자 특이성 HLA 분자는 표 VI에 적시하였다. 이하 설명하는 바와 같이, 개개의 대립유전자 특이성 HLA 분자 각각에 대한 결합은 제1 및/또는 제2 앵커 위치에서의 치환에 의해, 바람직하게는 슈퍼모티프에 대해 특정된 각각의 잔기를 선택함으로써 조절될 수 있다.
A2 슈퍼모티프를 포함하는 대표적인 펩티드 에피토프는 표 VIII에 적시하였다. 위치 2에 제1 앵커 잔기 V, A, T 또는 Q를 포함하며, C-말단 위치에 L, I, V, A 또는 T를 포함하는 모티프는 본원에 청구한 발명에 매우 특별히 관련된 것들이다.
IV.D.3. HLA-A3 슈퍼모티프
HLA-A3 슈퍼모티프는 상기 에피토프의 위치 2에 제1 앵커 잔기로서 A, L, I, V, M, S 또는 T, 및 상기 에피토프의 C-말단 위치(예를 들어, 9-머의 위치 9)에 양으로 하전된 잔기, R 또는 K의 펩티드 리간드내 존재를 특징으로 한다. A3 슈퍼모티프에 결합하는 HLA 분자(HLA-A3 슈퍼타입)의 상응하는 패밀리의 예시적인 구성원으로는 A*0301, A*1101, A*3101, A*3301 및 A*6801을 들 수 있다. A3 슈퍼패밀리의 구성원일 것으로 예상되는 기타 대립유전자 특이성 HLA 분자는 표 VI에 적시하였다. 이하, 상세히 설명하는 바와 같이, 개개의 대립유전자 특이성 HLA 단백질 각각에 결합하는 펩티드는 제1 및/또는 제2 앵커 위치에서의 치환에 의해, 바람직하게는 슈퍼모티프에 대해 특정된 각각의 잔기를 선택함으로써 조절될 수 있다.
A3 슈퍼모티프를 포함하는 대표적인 펩티드 에피토프는 표 IX에 적시하였다.
IV.D.4. HLA-A24 슈퍼모티프
HLA-A24 슈퍼모티프는 상기 에피토프의 위치 2내에 제1 앵커 잔기로서 방향족 잔기(F, W 또는 Y), 및 상기 에피토프의 C-말단 위치에 제1 앵커 잔기로서 소수성 잔기(Y, F, L, I, V 또는 M)의 펩티드 리간드내 존재를 특징으로 한다. A24 슈퍼모티프에 결합하는 HLA 분자의 상응하는 패밀리로는 A*2402, A*3001, 및 A*2301을 들 수 있다. A24 슈퍼패밀리의 구성원일 것으로 예상되는 기타 대립유전자 특이성 HLA 분자는 표 VI에 적시하였다. 개개의 대립유전자 특이성 HLA 단백질 각각에 결합하는 펩티드는 제1 및/또는 제2 앵커 위치에서의 치환에 의해, 바람직하게는 슈퍼모티프에 대해 특정된 각각의 잔기를 선택함으로써 조절될 수 있다.
A24 슈퍼모티프를 포함하는 대표적인 펩티드 에피토프는 표 X에 적시하였다.
IV.D.5. HLA-B7 슈퍼모티프
HLA-B7 슈퍼모티프는 상기 에피토프의 위치 2내에 제1 앵커 잔기로서 프롤린을 보유하고, 상기 에피토프의 C-말단 위치에 제1 앵커 잔기로서 소수성 아미노산 또는 지방족 아미노산(L, I, V, M, A, F, W 또는 Y)을 보유하는 펩티드를 특징으로 한다. B7 슈퍼모티프에 결합하는 HLA-분자의 상응하는 패밀리(즉, HLA-B7 슈퍼타입)로는 B*0702, B*0703, B*0704, B*0705, B*1508, B*3501, B*3502, B*3503, B*3504, B*3505, B*3506, B*3507, B*3508, B*5101, B*5102, B*5103, B*5104, B*5105, B*5301, B*5401, B*5501, B*5502, B*5601, B*5602, B*6701, 및 B*7801을 들 수 있다[참조: 예를 들어, Sidney 등, J. Immunol. 154: 247, 1995; Barber 등, Curr. Biol. 5: 179 (1995); Hill 등, Nature 360: 434 (1992); Rammensee 등, Immunogenetics 41: 178 (1995)]. B7 슈퍼패밀리의 구성원일 것으로 예상되는 기타 대립유전자 특이성 HLA 분자는 표 VI에 적시하였다. 이하, 상세히 설명하는 바와 같이, 개개의 대립유전자 특이성 HLA 단백질 각각에 결합하는 펩티드는 제1 및/또는 제2 앵커 위치에서의 치환에 의해, 바람직하게는 슈퍼모티프에 대해 특정된 각각의 잔기를 선택함으로써 조절될 수 있다.
A24 슈퍼모티프를 포함하는 대표적인 펩티드 에피토프는 표 XI에 적시하였다.
IV.D.6. HLA-B27 슈퍼모티프
HLA-B27 슈퍼모티프는 상기 에피토프의 위치 2에 제1 앵커 잔기로서 양으로 하전된 잔기(R, H 또는 K), 및 상기 에피토프의 C-말단 위치에 제1 앵커 잔기로서 소수성 잔기(F, Y, L, W, M, I, A 또는 V)의 펩티드 리간드내 존재를 특징으로 한다. 상기 B27 슈퍼모티프에 결합하는 HLA 분자의 상응하는 패밀리(즉, B27 슈퍼타입)의 예시적인 구성원으로는 B*1401, B*1402, B*1509, B*2702, B*2703, B*2704, B*2705, B*2706, B*3801, B*3901, B*3902, 및 B*7301을 들 수 있다. B27 슈퍼패밀리의 구성원일 것으로 예상되는 기타 대립유전자 특이성 HLA 분자는 표 VI에 적시하였다. 이하, 상세히 설명하는 바와 같이, 개개의 대립유전자 특이성 HLA 단백질 각각에 결합하는 펩티드는 제1 및/또는 제2 앵커 위치에서의 치환에 의해, 바람직하게는 슈퍼모티프에 대해 특정된 각각의 잔기를 선택함으로써 조절될 수 있다.
A24 슈퍼모티프를 포함하는 대표적인 펩티드 에피토프는 표 XII에 적시하였다.
IV.D.7. HLA-B44 슈퍼모티프
HLA-B44 슈퍼모티프는 상기 에피토프의 위치 2내에 제1 앵커 잔기로서 음으로 하전된 잔기(D 또는 E), 및 상기 에피토프의 C-말단 위치에 제1 앵커 잔기로서 소수성 잔기(F, W, Y, L, I, M, V, 또는 A)의 펩티드 리간드내 존재를 특징으로 한다. 상기 B44 슈퍼모티프에 결합하는 HLA 분자의 상응하는 패밀리(즉, B44 슈퍼타입)의 예시적인 구성원으로는 B*1801, B*1802, B*3701, B*4001, B*4002, B*4006, B*4402, B*4403, 및 B*4006을 들 수 있다. 개개의 대립유전자 특이성 HLA 단백질 각각에 결합하는 펩티드는 제1 및/또는 제2 앵커 위치에서의 치환에 의해, 바람직하게는 슈퍼모티프에 대해 특정된 각각의 잔기를 선택함으로써 조절될 수 있다.
IV.D.8. HLA-B58 슈퍼모티프
HLA-B58 슈퍼모티프는 상기 에피토프의 위치 2에 제1 앵커 잔기로서 소형 지방족 잔기(A, S 또는 T), 및 상기 에피토프의 C-말단 위치에 제1 앵커 잔기로서 방향족 또는 소수성 잔기(F, W, Y, L, I, V, M, 또는 A)의 펩티드 리간드내 존재를 특징으로 한다. 상기 B58 슈퍼모티프에 결합하는 HLA 분자의 상응하는 패밀리(즉, B58 슈퍼타입)의 예시적인 구성원으로는 B*1516, B*1517, B*5701, B*5702 및 B*5801을 들 수 있다. 개개의 대립유전자 특이성 HLA 단백질 각각에 결합하는 펩티드는 제1 및/또는 제2 앵커 위치에서의 치환에 의해, 바람직하게는 슈퍼모티프에 대해 특정된 각각의 잔기를 선택함으로써 조절될 수 있다.
B58 슈퍼모티프를 포함하는 대표적인 펩티드 에피토프는 표 XIII에 적시하였다.
IV.D.9. HLA-B62 슈퍼모티프
HLA-B62 슈퍼모티프는 상기 에피토프의 위치 2내에 제1 앵커 잔기로서 극성 지방족 잔기 Q 또는 소수성 지방족 잔기(L, V, M, 또는 I), 및 상기 에피토프의 C-말단 위치에 제1 앵커 잔기로서 소수성 잔기(F, W, Y, M, I, V, L, 또는 A)의 펩티드 리간드내 존재를 특징으로 한다. 상기 B62 슈퍼모티프에 결합하는 HLA 분자의 상응하는 패밀리(즉, B62 슈퍼타입)의 예시적인 구성원으로는 적어도 B*1501, B*1502, B*1513, 및 B*5201을 들 수 있다. 개개의 대립유전자 특이성 HLA 단백질 각각에 결합하는 펩티드는 제1 및/또는 제2 앵커 위치에서의 치환에 의해, 바람직하게는 슈퍼모티프에 대해 특정된 각각의 잔기를 선택함으로써 조절될 수 있다.
B62 슈퍼모티프를 포함하는 대표적인 펩티드 에피토프는 표 XIV에 적시하였다.
IV.D.10. HLA-A1 모티프
대립유전자 특이성 HLA-A1 모티프는 상기 에피토프의 위치 2에 제1 앵커 잔기로서 T, S 또는 M의 펩티드 리간드에 존재 및 상기 에피토프의 C-말단 위치에 제1 앵커 잔기로서 Y의 펩티드내 존재를 특징으로 한다. 대체적인 대립유전자 특이성 A1 모티프(즉, "서브모티프")는 위치 2 보다는 위치 3의 제1 앵커 잔기를 특징으로 한다. 이러한 서브모티프는 상기 에피토프의 위치 3내에 제1 앵커 잔기로서 D, E, A 또는 S의 존재 및 상기 에피토프의 C-말단 위치에 제1 앵커 잔기로서 Y의 존재를 특징으로 한다. 연장된 서브모티프는 위치 3에서 D의 존재 및 C-말단에서 A, I, L 또는 F의 존재를 특징으로 한다. HLA A1에 결합하는 펩티드는 제1 및/또는 제2 앵커 위치에서 치환에 의해, 바람직하게는 상기 모티프에 특이적인 각각의 잔기를 선택함으로써 조절할 수 있다.
A1 모티프를 포함하는 대표적인 펩티드 에피토프는 표 XV에 적시하였다. 도한, 위치 2에 T, S 또는 M 및 C-말단에 Y를 포함하는 이들 에피토프는 표 VII에 적시된 HLA-A1 슈퍼모티프를 보유하는 펩티드 에피토프 목록에 포함된다.
IV.D.11. HLA-A2 모티프
대립유전자 특이성 HLA-A2.1 모티프는 9 아미노산 에피토프의 위치 2에 제1 앵커 잔기로서 L 또는 M, 및 9 아미노산 에피토프의 C-말단 위치에 제1 앵커 잔기로서 L 또는 V의 펩티드 리간드내 존재를 특징으로 하는 것으로 최초 결정되었다[참조: Falk 등, Nature 351: 290-296 (1991)]. 또한, 상기 A2.1 모티프는 9 아미노산 펩티드의 위치 2에 I 및 C-말단 위치에 I 또는 A를 추가로 포함하는 것으로 결정되었다[참조: Hunt 등, Science 255: 1261-1263 (1992년 3월 6일)]. 또한, 상기 A2.1 대립유전자 특이성 모티프는 C-말단 위치에 T를 포함하는 것으로 확인되었다[참조: Kast 등, J. Immunol. 152: 3904-3912 (1994)]. 후속적으로, 상기 A2.1 대립유전자 특이성 모티프는 본 발명자들에 의해 상기 에피토프의 위치 2에 제1 앵커 잔기로서 L, I, V, M, A, T, 또는 Q를 보유하며, 상기 에피토프의 C-말단 위치에 제1 앵커 잔기로서 L, I, V, M, A, 또는 T를 보유하는 펩티드 리간드를 포함한다. HLA-A2.1 모티프의 제1 앵커 위치를 특징으로 하는 바람직하고 용인되는 잔기는 A2 슈퍼모티프의 바람직한 잔기와 동일하였다[관련 데이타를 참조할 것; 예를 들어, Del Guercio 등, J. Immunol. 154: 685-693 (1995); Sidney 등, Immunol. Today 17: 261-266 (1996); Sette 및 Sidney, Curr. Opin. in Immunol. 10: 478-482 (1998)]. 추가로, A2.1 모티프를 특징으로 하는 제2 앵커 잔기는 본원에 개시한 바와 같이 정의하였다. 이들은 표 II에 적시하였다. HLA-A2.1 분자에 결합하는 펩티드는 제1 및/또는 제2 앵커 위치에서의 치환에 의해, 바람직하게는 슈퍼모티프에 대해 특정된 각각의 잔기를 선택함으로써 조절될 수 있다.
A2.1 모티프를 포함하는 대표적인 펩티드 에피토프는 표 VII에 적시하였다. 위치 2에 제1 앵커 잔기 V, A, T, 또는 Q 및 C-말단 위치에 제1 앵커 잔기 L, I, V, A, 또는 T를 포함하는 A2.1 모티프는 본원에 청구한 발명에 특별히 관련된 것들이다.
IV.D.12. HLA-A3 모티프
대립유전자 특이성 HLA-A3 모티프는 상기 에피토프의 위치 2에 제1 앵커 잔기로서 L, M, V, I, S, A, T, F, C, G, 또는 D의 펩티드 리간드내 존재, 및 상기 에피토프의 C-말단 위치에 제1 앵커 잔기로서 K, Y, R, H, F, 또는 A의 존재를 특징으로 한다. HLA-A3에 결합하는 펩티드는 제1 및/또는 제2 앵커 위치에서의 치환에 의해, 바람직하게는 슈퍼모티프에 대해 특정된 각각의 잔기를 선택함으로써 조절될 수 있다.
A3 모티프를 포함하는 대표적인 펩티드 에피토프는 표 XVI에 적시하였다. 또한, A3 슈퍼모티프를 포함하는 이들 펩티드 에피토프도 표 IX에 적시하였다.
IV.D.13. HLA-A11 모티프
대립유전자 특이성 HLA-A11 모티프는 상기 에피토프의 위치 2에 제1 앵커 잔기로서 V, T, M, L, I, S, A, G, N, C, D, 또는 F, 및 상기 에피토프의 C-말단 위치에 제1 앵커 잔기로서 K, R, Y, 또는 H의 펩티드 리간드내 존재를 특징으로 한다. HLA-A11에 결합하는 펩티드는 제1 및/또는 제2 앵커 위치에서의 치환에 의해,바람직하게는 슈퍼모티프에 대해 특정된 각각의 잔기를 선택함으로써 조절될 수 있다.
A11 모티프를 포함하는 대표적인 펩티드 에피토프는 표 XVII에 적시하였으며; A3 대립유전자 특이성 모티프를 포함하는 펩티드 에피토프도 상기 표에 적시하였는데, 그 이유는 A3 모티프와 A11 모티프 사이의 제1 앵커 특이성이 광범위하게 중첩되기 때문이다. 또한, A3 상위펩티드를 포함하는 이들 펩티드 에피토프는 표 IX에 적시하였다.
IV.D.14. HLA-A24 모티프
대립유전자 특이성 HLA-A24 모티프는 상기 에피토프의 위치 2에 제1 앵커 잔기로서 Y, F, W, 또는 M, 및 상기 에피토프의 C-말단 위치에 제1 앵커 잔기로서 F, L, I, 또는 W의 펩티드 리간드내 존재를 특징으로 한다. HLA-A24에 결합하는 펩티드는 제1 및/또는 제2 앵커 위치에서의 치환에 의해, 바람직하게는 슈퍼모티프에 대해 특정된 각각의 잔기를 선택함으로써 조절될 수 있다.
A24 모티프를 포함하는 대표적인 에피토프는 표 XVIII에 적시하였다. 또한, 표 X에 적시된 이들 에피토프는 HLA-A24 슈퍼모티프를 보유하는 에피토프였다.
HLA 클래스 II HTL 에피토프를 나타내는 모티프
이하 설명하는 HLA 클래스 II 슈퍼모티프 및 모티프의 제1 및 제2 앵커 잔기는 표 III에 요약하였다.
IV.D.15. HLA DR-1-4-7 슈퍼모티프
또한, 모티프는 3개의 공통적인 HLA 클래스 II 대립유전자 특이성 HLA 분자,즉 HLA DRB1*0401, DRB1*0101, 및 DRB1*0701에 결합하는 펩티드에 대해 확인되었다. 총체적으로, 이들 모티프로부터 유래한 공통 잔기는 HLA DR-1-4-7 슈퍼모티프를 설명한다. DR 분자에 결합하는 펩티드는 상기 에피토프의 위치 1에 제1 앵커 잔기로서 대형 방향족 잔기 또는 소수성 잔기(Y, F, W, L, I, V, 또는 M), 및 상기 에피토프의 위치 6에 제1 앵커 잔기로서 소형의 하전되지 않은 잔기(S, T, C, A, P, V, I, L, 또는 M)를 특징으로 하는 슈퍼모티프를 보유한다. 또한, 이들 HLA 타입 각각에 대한 대립유전자 특이성 이차 효과 및 제2 앵커를 확인하였다. 이들은 표 III에 적시하였다. HLA-DR4, DR1 및/또는 DR7에 결합하는 펩티드는 제1 및/또는 제2 앵커 위치에서의 치환에 의해, 바람직하게는 슈퍼모티프에 대해 특정된 각각의 잔기를 선택함으로써 조절될 수 있다.
DR-1-4-7 슈퍼모티프(상기 모티프의 위치 1은 9개의 잔기 코어의 위치 1에 존재함)를 포함하는 9개의 잔기 코어에 상응하는 보존된 펩티드 에피토프(즉, 상기 분석을 위해 사용한 20개의 HBV 균주중 75%의 보존성)는 표 XIX에 적시하였다[참조: 예를 들어, Madden, Annu. Rev. Immunol. 13: 587-622 (1995)]. 또한, 각각 보존된 9개의 잔기 코어를 포함하는, 길이가 15 아미노산인 예시적인 각각의 펩티드 에피토프도 상기 표의 "a" 부분에 나타냈다. 펩티드 수로 나타낸 예시적인 15개 잔기의 슈퍼모티프를 보유하는 펩티드에 대한 교차반응성 데이타는 표 XIXb에 나타냈다.
IV.D.16. HLA DR3 모티프
2개의 대체적인 모티프(즉, 서브모티프)는 HLA-DR3 분자에 결합하는 펩티드 에피토프를 특징으로 한다. 제1 모티프(서브모티프 DR3A)에서, 대형의 소수성 잔기(L, I, V, M, F, 또는 Y)는 상기 에피토프의 카르복실 말단을 향해 앵커 위치 1에 존재하고, D는 앵커로서 상기 에피토프의 카르복실 말단을 향해 위치 4에 존재한다.
대체적인 DR3 서브모티프는 상기 에피토프의 카르복실 말단을 향해, 위치 6에 양전하의 존재에 의해 앵커 위치 1에 대형 소수성 잔기의 결손부 및/또는 위치 4에 음으로 하전되거나 아미드 형 앵커 잔기의 결손부를 구비한다. 따라서, 대체적인 대립유전자 특이성 DR3 모티프(서브모티프 DR3B)에 있어서, L, I, V, M, F, Y, A, 또는 Y는 앵커 위치 1에 존재하며; D, N, Q, E, S, 또는 T는 앵커 위치 4에 존재하며; K, R, 또는 H는 앵커 위치 6에 존재한다. HLA-DR3에 결합하는 펩티드는 제1 및/또는 제2 앵커 위치에서의 치환에 의해, 바람직하게는 슈퍼모티프에 대해 특정된 각각의 잔기를 선택함으로써 조절될 수 있다.
DR3A 슈퍼모티프(상기 모티프의 위치 1은 9개의 잔기 코어의 위치 1에 존재함)를 포함하는 9개의 잔기 코어에 상응하는 보존된 펩티드 에피토프(즉, 상기 분석을 위해 사용한 20개의 HBV 균주중 75%의 보존성)는 표 XXa에 적시하였다. 또한, 각각 보존된 9개의 잔기 코어를 포함하는, 길이가 15 아미노산인 예시적인 각각의 펩티드 에피토프도 상기 표의 "a" 부분에 나타냈다. 펩티드 수로 나타낸 예시적인 DR3 서브모티프 A를 보유하는 펩티드의 결합 데이타는 표 XXb에 나타냈다.
DR3B 서브모티프를 포함하는 9개의 잔기 코어 및 DR3 서브모티프-B 에피토프를 포함하는 각각의 예시적인 15-머 펩티드에 상응하는 보존된 펩티드 에피토프(즉, 상기 분석을 위해 사용한 20개의 HBV 균주에서 75% 보존율)는 표 XXc에 적시하였다. 표 XXd는 펩티드 수로 나타낸 예시적인 DR3 서브모티프 B를 보유하는 펩티드의 결합 데이타를 나타낸다.
본원의 표에 기술된 각각의 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 펩티드 에피토프는 단독으로 본 발명의 한 관점으로 간주된다. 또한, 본 발명의 다른 관점에서 각각의 펩티드 에피토프는 임의의 기타 펩티드 에피토프와 병용할 수 있다.
IV.E. 백신의 집단 적용범위의 증강
집단 적용범위가 넓은 백신이 바람직한데, 그 이유는 이들은 상업적으로 더 생존가능하며, 대부분의 사람들에게 일반적으로 적용할 수 있기 때문이다. 넓은 집단 적용범위는 전체적으로 고려하는 경우 대부분의 집단 내에 존재하는 HLA 대립유전자에 결합하는 펩티드 에피토프를 선택함으로써 본 발명의 펩티드(및 이러한 펩티드를 암호화하는 핵산 조성물)을 이용하여 획득할 수 있다. 표 XXI은 여러 인종 내에서 HLA 클래스 I 슈퍼타입의 전체적인 빈도(표 XXIa) 및 A2-, A3- 및 B7-슈퍼타입에 의해 달성되는 연합 집단 적용범위(표 XXIb)를 적시하고 있다. A2-, A3- 및 B7 슈퍼타입 각각은 이들 5가지 주요 인종군 각각에서 평균 40% 이상에 존재한다. 80%를 넘는 적용범위는 이들 슈퍼모티프의 연합에 의해 달성된다. 이들 결과는, 제한된 수의 교차반응성 펩티드의 사용시 효과적이며 비인종 편향적인 집단 적용범위가 달성됨을 암시한다. 이들 3개의 주요 펩티드 특이성을 이용하여 얻어진 상기 집단 적용범위가 높음에도 불구하고, 적용범위는 95% 이상의 집단 적용범위로 확정될수 있으며, 추가의 슈퍼모티프 또는 대립유전자 특이성 모티프를 보유하는 펩티드를 이용하면 실제로 다중 특이성 반응을 용이하게 달성할 수 있다.
B44-, A1- 및 A24-슈퍼타입은 평균적으로 이들 주요 인종 집단의 25% 내지 40% 범위 내에 존재한다(표 XXIa). 전체적으로 덜 우세하지만, B27-, B58- 및 B62-슈퍼타입 각각은 1종 이상의 주요 인종 군에서 >25%의 빈도로 존재한다(표 XXIa). 표 XXIb는 확인된 HLA 슈퍼타입의 5개의 주요 인종 군에서 추정된 연합 우세율을 요약하고 있다. A2, A3 및 B7 적용범위에 대한 A1-, A24- 및 B44-슈퍼타입 또는 본원에 기술한 모든 슈퍼타입의 봉입에 의해 얻어진 증가된 적용범위를 나타낸다. 가장 빈도가 높은 6종의 슈퍼타입으로부터 유래한 에피토프를 포함시킴으로써, 5개의 주요 인종 군에 대해 99%의 평균 집단 적용범위를 획득하였다.
A2-, A3- 및 B7-슈퍼타입의 이전 한정과 함께 본원에서 제시한 데이타는 A29, B8, 및 B46의 가능한 배제와 함께 모든 항원이 총 9개의 HLA 슈퍼타입으로 분류될 수 있음을 나타내고 있다. 가강 공통적인 6종의 슈퍼타입에 집중하면 모든 주요 인종 집단에 대해 98% 이상의 집단 적용범위가 획득된다.
IV.F. 펩티드 유사체를 자극하는 면역 반응
슈퍼패밀리의 모든 대립유전자 둥에서 적합한 교차반응성을 보유하는 펩티드는 상기한 바와 같은 스크리닝 절차에 의해 확인됨에도 불구하고, 교차반응성은 항상 완전한 것은 아니며, 그러한 경우, 펩티드의 교차반응성을 추가로 증가시키는 절차가 유용할 수 있다; 또한 그러한 절차를 이용하여 펩티드의 다른 특성을 변경시킬 수 있다. 소정 모티프 또는 슈퍼모티프 내에서 HLA 대립유전자에 대한 펩티드의 교차반응성을 지배하는 일반적인 규칙이 확립되었음에도 불구하고, 더 광범위한(또는 그렇지않으면 변경된) HLA 결합능을 획득하기 위해 특히 관심이 있는 펩티드의 구조를 변경(즉, 유사화)하는 절차를 수행할 수 있다. 더 구체적으로, 가장 광범위한 교차반응성 패턴을 나타내는 펩티드(공지된 T 세포 에피토프중, 뿐만아니라 적합한 슈퍼모티프를 함유하는 더 연장된 펩티드 세트)는 본원의 교시에 따라 생성할 수 있다.
사용된 방법은 특정 HLA 분자에 대한 결합과 상관관계가 있는 모티프 또는 슈퍼모티프를 이용한다. 상기 모티프 또는 슈퍼모티프는 제2 앵커가 변경될 수 있음에도 불구하고, 제1 앵커를 보유하는 것으로 한정된다. 유사한 펩티드는 제1 앵커, 제2 앵커 또는 제1 앵커 위치 및 제2 앵커 위치에서 아미노산 잔기를 치환함으로써 생성될 수 있다. 일반적으로, 유사체는 이미 모티프 또는 슈퍼모티프를 보유하는 펩티드에 대해 제도된다. HLA 클래스 I 및 클래스 II 결합 펩티드에 대해 한정된 슈퍼모티프 및 모티프의 바람직한 제2 앵커 잔기는 각각 표 II 및 III에 적시하였다.
본 발명에 따른 다수의 모티프 또는 슈퍼모티프에 있어서, 각각의 모티프 또는 슈퍼모티프(표 II 및 III)에 결합하는 다수의 HLA 슈퍼타입 또는 대립유전자 특이성 HLA 분자에 대한 결합에 좋지않은 영향을 미치는 잔기가 한정된다. 따라서, 결합에 유해한 잔기의 제거가 본 발명에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, A3 슈퍼타입의 경우, 그러한 유해 잔기를 보유하는 모든 펩티드가 분석된 펩티드 집단으로부터 제거되는 경우, 교차반응성은 22%에서 37%로 증가할 것이다[참조: 예를 들어,Sidney, J. 등, Hu. Immunol. 45: 79 (1996)]. 따라서, 소정의 슈퍼모티프 내에서 펩티드의 교차반응성을 개선시키는 한가지 방법은 펩티드 내에 존재하는 1종 이상의 유해 잔기를 단순히 제거하고, 소형의 "중성" 잔기, 예를 들어 Ala(펩티드의 T 세포 인식에 연향을 미치지 않을 수 있음)으로 치환하는 것이다. 펩티드내 유해 잔기의 제거와 함께 슈퍼패밀리 내에서 다중 유전자에 대한 높은 결합 친환성과 관련된 잔기를 삽입하는 경우, 교차반응성의 증가가 예상된다.
유사 펩티드가 백신으로 사용되는 경우, 상기 유사 펩티드가 생체 내에서 천연 에피토프에 대해 CTL 반응을 실질적으로 유발하는 것을 보장하기 위해(또는, 클래스 II 에피토프의 경우, 야생형 펩티드와 교차반응하는 헬퍼 T 세포를 유발하는 것을 보장하기 위해), 상기 유사 펩티드는 적합한 개개의 HLA 대립유전자로부터 시험관 내에서 T 세포를 면역화하는데 사용할 수 있다. 그후, 야생형 펩티드 감작된 표적 세포의 분해를 유도할 수 있는 면역화된 세포의 능력을 평가한다. 이는 내부적으로 생성된 항원이 관련 T 세포에 의해 인식되는지 여부를 평가하기 위해 항원 제시 세포, 감염되거나 적합한 유전자로 트랜스펙트된 세포, 또는 단지 클래스 II 에피토프의 경우, 전체 단백질 항원으로 자극된 세포로서 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
적당한 수의 교차반응성 결합제를 보장하기 위한 본 발명의 다른 구체예는 약한 결합 펩티드의 유사체를 생성하는 것이다. 500 내지 50000 nM의 결합 친화성을 나타내며, 한쪽 위치 또는 양쪽 위치에 허용가능하나 부최적 제1 앵커 잔기를 보유하는 클래스 I 펩티드는 각각의 슈퍼타입에 부합하는 바람직한 앵커 잔기를 치환함으로써 "고정"할 수 있다.
효과적인 펩티드 유사체를 생성하기 위한 다른 구체예는 액상 환경 내에서 펩티드 안정성 또는 가용성에 유해한 영향을 보유하는 잔기의 치환을 포함한다. 이러한 치환은 상기 펩티드 에피토프의 임의의 위치에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 시스테인(C)은 α-아미노 부티르산으로 치환될 수 있다. 그의 화학적 특성 때문에, 시스테인은 이황화 결합을 형성하고 펩티드를 구조적으로 충분히 변경시키는 경향을 보유하여 결합능을 감소시킨다. C를 α-아미노 부티르산으로 치환하는 것은 이 문제를 경감시킬 뿐만 아니라, 임의의 경우 결합능과 교차결합능을 실질적으로 개선시킨다[참조: A. Sette 등, In: President Viral Infection, Eds. R. Ahmed and I. Chen, John Wiley & Sons, England (1999)]. α-아미노 부티르산을 이용한 시스테인의 치환은 펩티드 에피토프의 임의의 잔기, 즉 앵커 위치 또는 비앵커 위치에서 발생할 수 있다.
일반적으로, CTL 및 HTL 반응은 모든 가능한 에피토프에 대해 유도되지는 않는다. 오히려, 이들은 몇몇 면역우성 결정기에 제한된다[참조: Zinkernagel 등, Adv. Immunol. 27: 5159 (1979); Bennink 등, J. Exp. Med. 168: 19351939(1988); Rawle 등, J. Immunol. 146: 3977-3984 (1991)]. 면역우성[참조: Benacerraf 등, Science 175: 273-279 (1972)]은 특정 HLA 단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 소정 에피토프의 능력[결정기 선택설; Vitiello 등, J. Immunol. 131: 1635 (1983); Rosenthal 등, Nature 267: 156-158 (1977)], 또는 기존의 TCR(T 세포 수용체) 특이성에 의한 선택적 인식(레퍼토리설; Klein, J., Immunology, The Science ofself nonself discrimination, John Wiley & Sons, New York, pp. 270-310 (1982)]에 의해 설명될 수 있다. 대부분 프로세싱 현상에 관련된 추가의 인자는 엄밀한 면역원성을 넘어 다수의 잠재적인 결정기중 어떤 결정기가 면역우성으로 제시될지를 지시하는데 중요한 역할을 수행한다[참조: Sercarz 등, Annu. Rev. Immunol. 11: 729-766 (1993)].
우성 및 하위우성의 개념은 감염성 질병과 암 둘 다의 면역요법과 관련되어 있다. 예를 들어, 만성 바이러스성 질병의 진행중에, 하위우성 에피토프의 동원은, 특히 우성 CTL 또는 HTL 특이성이 기능적 용인, 억제, 바이러스의 돌연변이 및 기타 메카니즘에 의해 불활성화되는 경우, 감염의 성공적인 클리어런스에 중요할 수 있다[참조: Franco 등, Curr. Opin. Immunol. 7: 524-531 (1995)]. 암 및 종양 항원의 경우, 가장 결합 친화성이 높은 펩티드중 적어도 일부를 인식하는 CTL은 기능적으로 불활성화된다. 이때 결합 친화성이 더 낮은 펩티드가 우선적으로 인식된다.
구체적으로, 공지된 비바이러스 종양과 관련돤 항원(TAA)으로부터 유래한 다수의 에피토프는 중간 정도의 친화성(50 내지 500 nM의 IC50)으로 HLA 클래스 I과 결합한다. 예를 들어, 종양 침윤 림프구(TIL) 또는 CTL에 의해 인식된 공지된 15개의 TAA 펩티드중 8개의 펩티드는 50 내지 500 nM 범위로 결합한다. (이들 데이타는 펩티드로서 인식된 공지된 바이러스 항원의 90%가 50 nM 이하의 IC50으로 HLA에 결합하나, 단지 약 10%만 50 내지 500 nM 범위로 결합할 것이라는 산정치와 대조된다; 참조: Sette 등, J. Immunol., 153: 558-5592 (1994)). 암에서, 이러한 현상이발생하는 것은 아마도 T 세포 용인 현상에 기인한 최대 결합 펩티드중 수개의 펩티드를 인식하는 CTL의 제거 또는 기능적 억제로 인한 것이다.
특정 이론에 국한되기를 원하는 것은 아니지만, 우성 에피토프에 대해 T 세포는 클론 결실되기 때문에, 하위우성 에피토프를 선택하는 것은 현존하는 T 세포의 동원을 가능하게하며, 이는 후속적으로 치료적 응답을 유도할 것이다. 그러나, 하위우성 에피토프에 대한 HLA 분자의 결합은 종종 우성 에피토프에 비해 왕성하게 일어나지 않는다. 따라서, 1종 이상의 HLA 분자에 대한 특정 면역원성 에피토프의 결합 친화성을 조절함으로써 상기 펩티드에 의해 유발된 면역 반응을 조절하는 것이 가능하다. 따라서, 더 왕성한 반응을 유발하는 유사체 펩티드를 제조할 필요성이 존재한다. 이 능력은 펩티드를 주성분으로 하는 백신 및 치료제의 유용성을 크게 증강시킬 것이다.
대표적인 유사체 펩티드는 표 XXII에 제시되어 있다. 이 표는 유사체 펩티드뿐만 아니라, 필요에 따라 모티프 또는 슈퍼모티프의 길이 및 서열을 가리킨다. "고정된 명명법" 칼럼의 정보는 각각의 유사체에 대한 지정된 위치 번호에서 치환된 잔기를 가리킨다.
IV.G. 펩티드를 함유하는 슈퍼모티프 또는 모티프에 대한 질병 관련 항원으로부터의 단백질 서열의 컴퓨터 스크리닝
표적 항원 내 슈퍼모티프 또는 모티프 함유 에피토프를 동정하기 위하여, 천연 단백질 서열, 예컨대 종양 관련 항원, 또는 감염성 유기물로부터의 서열, 또는 이식용 공여 조직은 서열 내에 슈퍼모티프 또는 모티프의 존재를 결정하기 위하여지능 계산 또는 컴퓨터와 같은 컴퓨터 조작 수단을 사용하여 스크리닝한다. 천연 펩티드의 분석으로부터 얻어지는 정보는 천연 펩티드의 상태를 평가하는 데 직접 사용할 수 있거나, 또는 펩티드 에피토프를 생성하는 데 연속적으로 이용할 수 있다.
대상 슈퍼모티프 또는 모티프의 출현에 대한 단백질 서열을 신속하게 스크리닝할 수 있는 컴퓨터 프로그램은 본 발명에 포함되며, 유사체 펩티드의 형성을 허용하는 프로그램도 이와 같다. 이러한 프로그램은 임의의 동정된 아미노산 서열을 분석하거나, 또는 미지의 서열에 대해 작동하고, 동시에 그 서열을 결정하고, 그것의 모티프 함유 에피토프를 동정할 수 있으며, 또한 유사체도 동시에 결정할 수 있다. 일반적으로, 동정된 서열은 병원성 유기물 또는 종양 관련 펩티드로부터 유래할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 고려하는 표적 분자는 모든 HBV 단백질(예컨대, 표면, 코어, 폴리머라제 및 X)을 포함한다.
동일 표적 단백질의 다중 변이체의 서열이 이용 가능한 경우, 펩티드는 그 보존율에 기초하여 선택할 수도 있다. 보존율에 대한 현재 바람직한 기준은 펩티드의 전체 서열이 특이적인 단백질에 대하여 평가된 서열의 75% 내에서 총체적으로 보존되는 것으로 정의하며; 이 보존율의 정의를 본 발명에 이용하고 있다.
펩티드 결합의 예측에 이용되는 선택 기준은 실제 결합과 가장 효율적으로 상관시키기 위하여 가능한 한 정확해야 하는 것이 중요하다. 적당한 제1 앵커의 존재를 기준으로, 예컨대 HLA-A*0201에 결합하는 단백질의 예측은 약 30% 비율에서 긍정적이다(Ruppert, J. 등,Cell74: 929, 1993). 그러나, 대규모 펩티드-HLA 결합 데이타베이스를 분석함으로써 본 발명자 제1 앵커 잔류물 단독의 존재에 기초하여 동정에 대하여 예측치를 극적으로 증가시키는 다수의 대립유전자 특이적인 다항식 알고리즘을 개발하였다. 이러한 알고리즘은 정확한 제1 앵커의 유무를 고려할 뿐만 아니라 제2 앵커 잔류물의 양성 또는 유해한 존재를 고려한다(상이한 위치의 상이한 아미노산의 영향을 고려하기 위함). 본질적으로, 이 알고리즘은 펩티드-HLA 상호 작용의 전체 친화도(또는 ΔG)가 하기 유형의 선형 다항식으로서 근사할 수 있는 전제에 기초한다:
ΔG = a1ix a2ix a3i.... x ani
상기 식에서, aij는 n 개의 아미노산의 펩티드 서열을 따른 소정 위치(i)에서의 소정 아미노산(j)의 존재의 효과를 나타내는 계수이다. 이 방법의 중요한 가정은 각각의 위치에서의 효과가 필수적으로 상호 독립적이라는 것이다. 이 가정은 펩티드가 HLA 분자에 결합되고, 본질적으로 연장된 형태로 T 세포에 의해 인식된다고 설명하는 연구에 의해 정당화된다. 특이적인 알고리즘 계수의 전개는 문헌(Gulukota, K. 등,J. Mol. Biol.267: 1258, 1997)에 기재되어 있다.
특이적인 모티프를 사용할 수 있는 바람직한 펩티드 서열을 동정하는 추가 방법은 뉴런 네트워크 및 분자 모델링 프로그램의 사용을 포함한다(예컨대, Milik 등,Nature Biotechnology16: 753, 1998; Altuvia 등,Hum. Immunol.58: 1, 1997; Altuvia 등,J. Mol. Biol.249: 244, 1995; Buus, S.Curr. Opin. Immunol.11: 209-213, 1999; Brusic, V. 등,Bioinformatics14: 121-130, 1998; Parker 등,J. Immunol.152: 163, 1993; Meister 등,Vaccine13: 581, 1995; Hammer 등,J. Exp. Med.180: 2353, 1994; Sturniolo 등,Nature Biotechnol.17: 555 1999 참조).
예를 들면, A*0201 모티프 펩티드의 세트에서, 임의의 유해한 제2 앵커 잔기의 존재를 피하면서 1 이상의 바람직한 제2 앵커 잔기를 함유하는 펩티드의 69%는 500 nM 미만의 IC50으로 A*0201을 결합할 것이다(Ruppert, J. 등,Cell74: 929, 1993). 또한, 이러한 알고리즘은 컷오프 스코어를 필요에 따라 더 크거나 더 낮은 예측 결합 성질을 갖는 펩티드의 세트를 선택하도록 조절할 수 있다는 점에서 융통적이다.
펩티드 에피토프를 동정하는 데 컴퓨터 스크리닝을 사용함에 있어, 모든 단백질 서열 또는 번역 서열은 적절한 HLA 결합 모티프를 함유하는 잠재 펩티드 서열을 동정하기 위하여 모티프 서치를 위해 개발된 소프트웨어, 예를 들면 "FINDPATTERNS" 프로그램(Devereux 등,Nucl. Acids Res.12: 387-395, 1984) 또는 MotifSearch 1.4 소프트웨어 프로그램(D. Brown, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)을 사용하여 분석할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 공지 또는 미지의 펩티드 서열에 대하여 본 발명의 모티프를 실시하는 데 사용할 수 있는 소프트웨어 및 하드웨어의 대형 어레이가 이용 가능하다. 그 다음, 동정된 펩티드는 특이적인 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 대립 유전자를 결합할 수 있는 그들의 능력을 예측하도록 주문 제작된 다항식 알고리즘을 사용하여 스코어링한다.
전술한 절차에 따르면, HLA 슈퍼타입 군 또는 대립 유전자 HLA 분자를 결합할 수 있는 HBV 펩티드 및 그것의 유사체가 동정되었다(표 VII-XX; 표 XXII).
IV.H. 펩티드 에피토프의 제조
본 발명에 따른 펩티드는 재조합 DNA 기술 또는 화학 합성에 의하거나 또는 천연 종양 또는 병원성 유기물과 같은 천연 소스로부터 합성적으로 제조할 수 있다. 펩티드 에피토프는 개별적으로 또는 폴리에피토프 펩티드로서 합성할 수 있다. 펩티드는 다른 천연 발생 숙주 세포 단백질 및 그것의 단편이 실질적으로 없는 것이 바람직하지만, 일부 구체예에서, 펩티드는 천연 단편 또는 입자에 합성적으로 콘주게이트될 수 있다.
본 발명에 따른 펩티드는 길이가 다양할 수 있으며, 그것의 중성(전하를 띠지 않는) 형태 또는 염 형태일 수 있다. 본 발명에 따른 펩티드는 글리코실화, 측쇄 산화 또는 인산화와 같은 변성이 없거나, 또는 이들은 변성이 전술한 바와 같은 펩티드의 생물학적 활성을 파괴하지 않는 조건 하에서 이러한 변성을 포함한다.
가능하다면, 본 발명의 HLA 클래스 I 결합 에피토프를 폴리에피토프 구조물에 사용되는 것과 같이 약 8 내지 약 13 아미노산 잔기, 종종 8 내지 11, 바람직하게는 9 내지 10의 길이로 최적화하는 것이 요망될 수 있다. 본 발명의 HLA 클래스 II 결합 펩티드 에피토프는 약 6 내지 약 30 아미노산 길이, 바람직하게는 약 13 내지 약 20 잔기의 길이로 최적화할 수 있다. 펩티드 에피토프는 관련 HLA 분자에 결합된 내생적으로 프로세싱된 병원체 유도 펩티드 또는 종양 세포 펩티드와 동일한 정도의 크기이지만, 또한 본 발명의 에피토프를 포함하는 펩티드의 동정 및 제조는 본 명세서에 기재된 기술을 사용하여 수행할 수 있다.
대안의 구체예에서, 본 발명의 에피토프는 폴리에피토프 펩티드로서, 또는 폴리에피토프 펩티드를 암호화하는 미니유전자로서 연결될 수 있다.
다른 구체예에서, 고농도의 클래스 I 및/또는 클래스 II 에피토프를 함유하는 천연 펩티드 영역을 동정하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 그러한 서열은 이것이 아미노산 길이당 최대 수의 에피토프를 함유한다는 점에 기초하여 선택된다. 에피토프는 중첩 방식 또는 중첩된 방식으로 존재할 수 있는데, 예를 들면 10 아미노산 길이 에피토프는 2 개의 9 아미노산 길이 에피토프 및 1 개의 10 아미노산 길이 에피토프를 함유할 수 있으며, 세포내 진행시, 각각의 에피토프가 노출되고, 그러한 펩티드의 투여시 HLA 분자에 의해 결합된다. 이러한 더 큰, 바람직하게는 다중 에피토프 펩티드는 합성적으로, 재조합적으로, 또는 천연 소스로부터의 분열에 의하여 생성될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 매우 다양한 방법으로 제조할 수 있다. 바람직한 비교적 짧은 크기의 경우, 그 펩티드는 통상의 기술에 따라 용액 내에서 또는 고형 지지체 상에서 합성할 수 있다. 다양한 자동 합성기는 시판되고 있으며, 공지 프로토콜에 따라 사용할 수 있다(예컨대, Stewart & Young, SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 2D. ED., Pierce Chemical Co., 1984 참조). 또한, 개별 펩티드 에피토프는 화학 결찰을 이용하여 접합하여 더 큰 펩티드를 생성할 수 있는데, 이는 여전히 본 발명의 범주 내에 있는 것이다.
대안으로, 관심 대상의 면역원성 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현 벡터에 삽입하고, 적당한 숙주 세포로 트랜스폼 또는 트랜스펙트시키며, 발현에 적당한 조건 하에서 배양하는 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 절차는 문헌(Sambrook 등, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989))에 기재된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 1 이상의 펩티드 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드는 적당한 T 세포 에피토프를 제공하는 데 사용할 수 있다.
본 발명에서 고려하는 바람직한 길이의 펩티드 에피토프에 대한 뉴클레오티드 암호화 서열은 화학 기술, 예를 들면 문헌(Matteucci, 등,J. Am. Chem. Soc.103: 3185 (1981))의 포스포트리에스테르 방법에 의해 합성할 수 있다. 펩티드 유사체는 천연 펩티드 서열을 암호화하는 것들에 대한 적당한 소정 핵산 염기(들)를 단순히 치환함으로서 제조될 수 있는데, 예시적인 핵산 치환은 본 명세서에서 모티프/슈퍼모티프로 정의된 아미노산을 암호화하는 것들이다. 그 다음, 암호화 서열에 적당한 링커를 제공하고, 당업계에서 통상적으로 입수 가능한 발현 벡터에 결찰하고, 이 벡터를 사용하여 적당한 숙주를 소정 융합 단백질을 생성하도록 트랜스폼할 수 있다. 다수의 그러한 벡터와 적당한 숙주 시스템이 현재 이용 가능하다. 융합 단백질의 발현을 위하여, 암호화 서열은 작동적으로 연결된 출발 및 정지 코돈, 프로모터 및 종결인자 영역, 그리고 통상적으로 복제 시스템을 갖추어 소정의 세포 숙주 내 발현을 위한 발현 벡터를 제공한다. 예를 들면, 박테리아 숙주와 상용성인 프로모터 서열은 소정 코돈 서열의 삽입을 위한 용이한 제한 부위를 함유하는 플라스미드에 제공된다. 생성된 발현 벡터는 적당한 박테리아 숙주로 트랜스폼된다. 물론, 효모, 곤충 또는 포유류 세포 숙주도 적당한 벡터 및 조절 서열을 이용하여 사용할 수 있다.
IV.I. T 세포 반응의 검출 분석
HLA 결합 펩티드가 동정되면, 이들은 T 세포 반응을 도출해내는 능력에 대해 테스트할 수 있다. 모티프 함유 펩티드의 제조 및 평가는 PCT 공보 WO 94/20127호 및 WO 94/03205호에 기재되어 있다. 간단히 말하면, 특정 항원으로부터의 에피토프를 포함하는 펩티드를 합성하고, 적당한 HLA 단백질에 결합하는 이들의 능력에 대해 테스트한다. 이러한 분석은 방사성 요오드화 기준 펩티드의 결합에 관하여 본 발명의 펩티드의 정제된 HLA 클래스 I 분자로의 결합을 평가하는 단계를 수반한다. 대안으로, 공백 클래스 I 분자(즉, 펩티드가 내부에 없음)를 발현하는 세포는 면역 형광 염색법 및 유동 미세형광계에 의하여 펩티드 결합에 대하여 평가할 수 있다. 펩티드 결합을 평가하는 데 사용할 수 있는 다른 분석으로는 펩티드 의존성 클래스 I 어셈블리 분석 및/또는 펩티드 경쟁에 의한 CTL 인식의 저해가 있다. 통상적으로, 친화도가 500 nM 이하인 클래스 I 분자에 결합하는 그러한 펩티드는 감염 또는 면역화 개체로부터 유도된 CTL에 대한 표적으로서 기능하는 이들의 능력, 뿐만 아니라 질병과 관련된 선택된 표적 세포와 반응할 수 있는 CTL 집단에서 일어날 수 있는 1차 시험관내 또는 생체내 CTL 반응을 유도하는 이들의 능력에 대하여 더 평가한다.
유사한 분석이 HLA 클래스 II 결합 펩티드의 평가에 사용된다.통상적으로,1000 nM 이하의 친화도에서 결합하는 것으로 나타나는 HLA 클래스 II 모티프 함유 펩티드는 HTL 반응을 자극하는 능력에 대해 더 평가한다.
T 세포 반응을 검출하는 데 이용되는 통상의 분석으로는 증식 분석, 림포카인 분비 분석, 직접 세포독성 분석 및 제한 희석 분석이 있다. 예를 들면, 펩티드로 항온 처리된 항원 제시 세포는 반응자 세포 개채군에서 CTL 반응을 유발하는 능력에 대하여 분석할 수 있다. 항원 제시 세포는 말초 혈관 단핵 세포 또는 수지상 세포와 같은 정상 세포일 수 있다. 대안으로, 내생적으로 프로세싱된 펩티드를 가진 클래스 I 분자를 로딩하는 능력이 결여되고, 적당한 사람 클래스 I 유전자로 트랜스펙트된 돌연변이체 비사람 포유류 세포주는 시험관내 1차 CTL 반응을 유도하는 펩티드의 능력에 대해 테스트하는 데 사용할 수 있다.
말초 혈관 단핵 세포(PBMC)는 CTL 전구체의 반응자 세포원으로서 사용할 수 있다. 적당한 항원 제시 세포를 펩티드로 항온 처리한 후, 펩티드 로딩된 항원 제시 세포를 최적화된 배양 조건 하에서 반응자 세포 집단으로 항온 처리한다. 양성 CTL 활성화는 특이적 펩티드 펄스 표적 뿐만 아니라, 펩티드 서열이 유도된 항원의 내생적으로 프로세싱된 형태를 발현하는 표적 세포인 방사선 표지된 표적 세포를 사멸시키는 CTL의 존재에 대하여 배양물을 분석함으로써 측정할 수 있다.
또한, 플루오레신 표지된 HLA 테트라머 복합체로 염색함으로써 항원 특이적인 T 세포의 직접 수량화할 수 있는 방법이 고안되었다(Altman, J.D. 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 10330, 1993; Altman, J.D. 등,Science274: 94, 1996). 다른 비교적 최근의 기술 개발로는 세포내 림포카인 염색 및 인터페론 방출분석 또는 ELISPOT 분석이 있다. 테트라머 염색, 세포내 림포카인 염색 및 ELISPOT 분석은 모두 더 통상적인 분석보다 10 배 이상 더 민감한 것으로 보인다(Lalvani, A. 등,J. Exp. Med.186: 859, 1997; Dunbar, P.R. 등,Curr. Biol.8: 413, 1998; Murali-Krishna, K. 등,Immunity8: 177, 1998).
또한, HTL 활성화는 T 세포 증식 및 림포카인, 예컨대 IL-2의 분비와 같은 당업자에게 공지된 그러한 기술을 사용하여 평가할 수 있다(예컨대, Alexander 등,Immunity1: 751-761, 1994).
대안으로, HLA 트랜스제닉 마우스의 면역화는 펩티드 에피토프의 면역원성을 측정하는 데 사용할 수 있다. 사람 A2.1, A11(또한, HLA-A3 에피토프를 분석하는 데 사용할 수 있다) 및 B7 대립 유전자를 가진 마우스를 비롯한 몇 가지 트랜스제닉 마우스 모델이 특성화되었으며, 다른 것들(예컨대, HLA-A1 및 A24에 대한 트랜스제닉 마우스)이 개발되고 있다. 또한, HLA-DR1 및 HLA-DR3 마우스 모델도 개발되고 있다. 다른 HLA 대립 유전자를 가진 추가의 트랜스제닉 마우스 모델을 필요에 따라 생성할 수 있다. 마우스는 불완전 프로인트 아쥬반트에 에멀션화된 펩티드로 면역화하고, 생성된 T 세포는 펩티드 펄스 표적 세포 및 적당한 유전자로 트랜스펙트된 표적 세포를 인식하는 이들의 능력에 대해 테스트할 수 있다. CTL 반응은 전술한 세포독성 분석을 사용하여 분석할 수 있다. 유사하게, HTL 반응은 T 세포 증식 또는 림포카인의 분비와 같은 분석을 사용하여 분석할 수 있다.
면역원성 펩티드 에피토프는 표 XXIII에 나타낸다.
III.J. 진단제로서 및 면역 반응을 평가하기 위한 펩티드 에피토프의 용도
본 발명의 한 가지 양태에서, 전술한 바와 같은 HLA 클래스 I 및 클래스 II 결합 펩티드는 면역 반응을 평가하기위한 시약으로서 사용할 수 있다. 평가하고자 하는 면역 반응은 시약으로서 사용하고자 하는 펩티드 에피토프(들)를 인식하고 이에 결합하는 항원 특이적인 CTL 또는 HTL을 생성할 수 있는 임의의 시약을 면역원으로서 사용함으로써 유발된다. 펩티드 시약을 면역원으로 사용할 필요는 없다. 그러한 분석에 사용되는 분석 시스템은 테트라머, 세포내 림포카인의 염색 및 인터페론 방출 분석 또는 ELISPOT 분석과 같은 비교적 최근의 기술 개발을 포함한다.
예를 들면, 본 발명의 펩티드는 테트라머 염색 분석에서 병원체 또는 면역원에 노출된 후, 항원 특이적인 CTL의 존재에 대한 말초 혈관 단핵 세포를 평가하는 데 사용된다. HLA-테트라머 복합체는 항원 특이적인 CTL을 직접 시각화하고(예컨대, Ogg 등,Science279: 2103-2106, 1998; 및 Altman 등,Science174: 94-96, 1996 참조), 말초 혈관 단핵 세포의 샘플에서 항원 특이적인 CTL 집단의 빈도를 측정하는 데 사용된다.
본 발명의 펩티드를 사용하는 테트라머 시약은 다음과 같이 생성한다: HLA 분자에 결합하는 펩티드는 해당 HLA 중량쇄 및 β2-마이크로글로불린의 존재 하에 리폴딩하여 삼분자 복합체를 생성한다. 이 복합체는 사전에 단백질로 가공된 부위에서 중량쇄의 카르복실 말단 단부에서 비오틴화한다. 그 다음, 테트라머 형성은 스트렙타비딘을 첨가함으로써 유도한다. 형광 표지된 스트렙타비딘에 의하여, 테트라머를 항원 특이적인 세포를 염색하는 데 사용할 수 있다. 그 다음, 이 세포를 예를 들면, 유동 세포계에 의하여 용이하게 동정할 수 있다. 그러한 절차는 진단 또는 예후 목적에 사용된다. 또한, 이 절차에 의해 동정된 세포는 치료 목적에도 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 면역 소생 반응을 평가하기 위한 시약으로서도 사용할 수 있다(예컨대, Bertoni 등,J. Clin. Invest.100: 503-513, 1997 및 Penna 등,J. Exp. Med.174: 1565-1570, 1991 참조). 예를 들면, HPV로 감염된 개체로부터의 환자 PBMC 샘플은 특이적인 펩티드를 사용하여 항원 특이적인 CTL 또는 HTL의 존재에 대하여 분석한다. 단핵 세포를 함유하는 혈액 샘플은 PBMC를 배양하고, 본 발명의 펩티드로 세포를 자극함으로써 평가할 수 있다. 적당한 배양 기간 후, 팽창된 세포 집단을, 예를 들면 CTL 또는 HTL 활성에 대하여 분석할 수 있다.
또한, 펩티드는 백신의 효율을 평가하기 위한 시약으로서 사용한다. 면역원으로 백신 접종된 환자로부터 얻은 PMBC는, 예를 들면 전술한 방법 중 임의의 것을 사용하여 분석한다. 환자는 HLA 형이고, 그 환자에게 존재하는 대립 유전자 특이적인 분자를 인식하는 펩티드 에프토프 시약이 분석에 선택된다. 백신의 면역원성은 PBMC 샘플 내 HPV 에피토프 특이적인 CTL 및/또는 HTL의 존재에 의해 나타난다.
또한, 본 발명의 펩티드는 당업계에 널리 알려져 있는 기술(예컨대,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY; 및Antibodies A Laboratory Manual Harlow, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)을 사용하여 항원을 만드는 데 사용되며, HPV 감염을 진단하기 위한 시약으로서 유용할 수 있다. 그러한 항원으로는 HLA 분자에 관한 펩티드를 인식하는 것들, 즉 펩티드-MHC복합체에 결합하는 항체가 있다.
IV.K. 백신 조성물
전술한 바와 같은 1 이상의 펩티드의 면역원적으로 유효량을 함유하는 백신 및 백신 제조 방법은 본 발명의 또 다른 구체예이다. 일단 적당하게 면역원성 에피토프를 형성하면, 이들을 분류하고, 본 명세서에서 "백신" 조성물로 언급되는 다양한 수단에 의해 송달할 수 있다. 그러한 백신 조성물은, 예를 들면 리포펩티드(예컨대, Vitiello, A. 등,J. Clin. Invest.95:341, 1995), 폴리(DL-락티드-코-글리콜리드)("PLG") 미소구에 캡슐화된 펩티드 조성물(예컨대, Eldridge, 등,Molec. Immunol.28: 287-294, 1991: Alonso 등,Vaccine12: 299-306, 1994; Jones 등,Vaccine13: 675-681, 1995 참조), 면역 자극 복합체(ISCOMS)에 함유된 펩티드 조성물(예컨대, Takahashi 등,Nature344: 873-875, 1990; Hu 등,Clin Exp Immunol.113: 235-243, 1998 참조), 다중 항원 펩티드 시스템(MAP)(예컨대, Tam, J.P.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.85: 5409-5413, 1988; Tam, J.P.J. Immunol. Methods196: 17-32, 1996 참조), 다가 펩티드로서 조제된 펩티드; 발사체 송달 시스템용 펩티드, 통상적으로 결정화된 펩티드, 바이러스 송달 벡터(Perkus, M.E. 등, In:Concepts in vaccine development, Kaufmann, S.H.E., ed., p. 379, 1996; Chakrabarti, S. 등,Nature320: 535, 1986; Hu, S.L. 등,Nature320:537, 1986; Kieny, M.-P. 등,AIDS Bio/Technology4: 790, 1986; Top, F.H. 등,J. Infect. Dis.124: 148, 1971; Chanda, P.K. 등,Virology175: 535, 1990), 바이러스 기원 또는 합성 기원의 입자(예컨대, Kofler, N. 등,J. Immunol.Methods.192: 25, 1996; Eldridge, J.H. 등,Sem. Hematol.30: 16, 1993; Falo, L.D., Jr. 등,Nature Med.7: 649, 1995), 아쥬반트(Warren, H.S., Vogel, F.R., 및 Chedid, L.A.Annu. Rev. Immunol.4: 369, 1986; Gupta, R.K. 등,Vaccine11: 293, 1993), 리포솜(Reddy, R. 등,J. Immunol.148: 1585, 1992; Rock, K.L.Immunol. Today17: 131, 1996) 또는 노출된 또는 입자 흡수된 cDNA(Ulmer, J.B. 등,Science259: 1745, 1993; Robinson, H.L., Hunt, L.A. 및 Webster, R.G.,Vaccine11: 957, 1993; Shiver, J.W. 등, In:Concepts in vaccine development, Kaufmann, S.H.E., ed., p. 423, 1996; Cease, K.B. 및 Berzofsky, J.A.,Annu. Rev. Immunol.12: 923, 1994 및 Eldridge, J.H. 등,Sem. Hematol.30: 16, 1993)를 포함할 수 있다. 또한, 아반트 임뮤노서라퓨틱스 인코포레이티드(미국 매사추세츠주 니드햄 소재)의 것과 같은 수용체 매개 표적화로 공지된 독소 표적화된 송달 기술을 사용할 수도 있다.
본 발명의 백신 조성물은 핵산 매개 양식을 포함한다. 또한, 본 발명의 1 이상의 펩티드를 암호화하는 DNA 또는 RNA를 환자에게 투여할 수 있다. 이 접근법은, 예를 들면 문헌(Wolff 등,Science247: 1465 (1990), 뿐만 아니라 미국 특허 제5,580,859호, 제5,589,466호, 제5,804,566호, 제5,739,118호, 제5,736,524호, 제5,679,647호, WO 98/04720호)에 기재되어 있으며, 하기에 더욱 상세하게 설명되어 있다. DNA 기재 송달 기술의 예로는 "노출된 DNA", 촉진된(부피비카인, 폴리머, 펩티드 매개) 송달, 양이온성 지질 복합체 및 입자 매개("유전자 총") 또는 압력 매개 송달(예컨대, 미국 특허 제5,922,687호 참조)이 있다.
치료 또는 예방 면역 목적을 위하여, 본 발명의 펩티드는 바이러스 또는 박테리아 벡터에 의해 발현될 수 있다. 발현 벡터의 예로는 경감된 바이러스 숙주, 예컨대 우두 또는 계두가 있다. 이 접근법은 본 발명의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하기 위한, 예컨대 벡터로서 우두 바이러스의 사용을 수반한다. 급성 또는 만성 감염된 숙주, 또는 비감염 숙주로 도입시, 재조합 우두 바이러스는 면역원성 펩티드를 발현하고, 이로써 숙주 CTL 및/또는 HTL 반응을 도출한다. 면역화 프로토콜에 유용한 우두 벡터 및 방법은 예컨대, 미국 특허 제4,722,848호에 기재되어 있다. 다른 벡터는 BCG(Bacille Calmette Guerin)이다. BCG 벡터는 문헌(Stover 등,Nature351: 456-460 (1991))에 기재되어 있다. 본 발명의 펩티드의 치료학적 투여 또는 면역화에 유용한 광범위한 다른 벡터, 예컨대 아데노 및 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터,Salmonella typhi벡터, 탈독소화 탄저병 독소 벡터 등은 본 명세서로부터 당업자에게 명백할 것이다.
또한, 본 발명에 따른 백신은 1 이상의 청구된 펩티드의 조성물을 포함할 수 있다. 펩티드는 백신에 개별적으로 존재할 수 있다. 대안으로, 펩티드는 다중 사본을 포함하는 호모폴리머로서, 또는 다양한 펩티드의 헤테로폴리머로서 존재할 수 있다. 폴리머는 증가된 면역 반응, 및 상이한 펩티드 에피토프가 폴리머를 구성하는 데 사용된 경우, 병원성 유기물의 상이한 항원 결정자 또는 면역 반응에 대해 표적화된 종양 관련 펩티드와 반응하는 항체 및/또는 CTL을 유발하는 추가 능력의 이점을 가진다. 조성물은 항원의 천연 발생 영역일 수 있거나, 또는 재조합적으로, 또는 화학 합성에 의하여 제조할 수 있다.
본 발명의 백신과 사용할 수 있는 담체는 당업계 널리 알려져 있으며, 예를 들면 티로글로불린, 알부민, 예컨대 사람 혈청 알부민, 테타누스 톡소이드, 폴리아미노산, 예컨대 폴리 L-리신, 폴리 L-글루탐산, 인플루엔자, B형 간염 바이러스 코어 단백질 등이 있다. 백신은 생리학적으로 내성이 있는(즉, 허용 가능한) 희석제, 예컨대 물 또는 염수, 바람직하게는 인산염 완충 염수를 함유할 수 있다. 또한, 통상적으로 백신은 아쥬반트를 포함한다. 불완전 프로인트 아쥬반트, 인산알루미늄, 수산화알루미늄 또는 명반과 같은 아쥬반트가 당업계에 널리 알려져 있는 물질의 예이다. 또한, 본 명세서에 개시된 바와 같이, CTL 반응은 본 발명의 펩티드를 지질, 예컨대 트리팔미토일-S-글리세릴시스테인일세릴-세린(P3CSS)에 콘쥬게이트함으로써 프라이밍할 수 있다.
주사, 에어로졸, 경구, 경피, 경막, 늑막내, 포막내 또는 기타 경로에 의하여 본 발명에 따른 펩티드 조성물로 면역화시, 숙주의 면역 시스템은 소정 항원에 대해 특이적인 대량의 CTL 및/또는 HTL를 생성함으로써 백신에 반응한다. 결국, 숙주는 이후의 감염에 적어도 부분적으로 면역이 되거나, 또는 시작되는 만성 감염의 발달에 적어도 부분적으로 저항하거나, 또는 항원이 종양 관련된 경우 적어도 약간의 치료 이점을 유도한다.
일부 구체예에서, 클래스 I 펩티드 성분을, 관심 대상의 표적 항원에 대한 항체 및/또는 헬퍼 T 세포 반응의 중화를 유도 또는 촉진하는 성분과 조합하는 것이 요망될 수 있다. 그러한 조성물의 바람직한 구체에는 본 발명에 따른 클래스 I및 클래스 II 에피토프를 포함한다. 그러한 조성물의 대안의 구체에는 PanDR 분자, 예컨대 PADRETM(Epimmune, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재; 미국 특허 제5,736,142호에 기재됨)과 함께 본 발명에 따른 클래스 I 및/또는 클래스 II 에피토프를 포함한다.
또한, 본 발명의 백신은 본 발명의 펩티드를 제공하기 위한 비히클로서 항원 제시 세포(APC), 예컨대 수지상 세포(DC)를 포함할 수 있다. 백신 조성물을 시험관내에서 생성한 후, 수지상 세포를 고정하고, 수거함으로로써 수지상 세포의 로딩이 시험관내에서 일어난다. 예를 들면, 수지상 세포는 예컨대, 본 발명에 따른 미니유전자로 트랜스펙트시키거나, 또는 펩티드로 펄스화한다. 그 다음, 수지상 세포를 환자에게 투여하여 생체내 면역 반응을 도출할 수 있다.
또한, DNA 또는 펩티드를 기재로 하는 백신 조성물은 수지상 세포 고정화와 함께 생체내 투여하여 수지상 세포의 로딩이 생체내에서 일어날 수 있다.
또한, 항원성 펩티드는 CTL 및/또는 HTL 반응을 생체외에서 도출하는 데 사용될 수 있다. 생성된 CTL 또는 HTL 세포는 다른 통상적인 형태의 치료에 반응하지 않거나, 본 발명에 따른 치료학적 백신 펩티드 또는 핵산에 반응하지 않을 환자의 만성 감염 또는 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 특정 항원(감염성 또는 종양 관련 항원)에 대한 생체외 CTL 또는 HTL 반응은 조직 배양 내에서 환자의, 또는 유전적으로 상용성인 CTL 또는 HTL 전구체 세포를 APC, 예컨대 DC의 공급원과 적당한 면역원성 펩티드와 함께 항온 처리함으로써 유도된다. 전구체 세포가 활성화되고,작동 세포로 팽창되는 적당한 배양 시간(통상적으로 약 7 내지 28 일) 후, 세포를 환자에게 다시 주입하는데, 여기서 이들은 특이적인 표적 세포(감염 세포 또는 종양 세포)를 파괴하거나 파괴를 촉진할 것이다. 트랜스펙트된 수지상 세포도 항원 제시 세포로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 IFN-γ등과 같은 면역 아쥬반트와의 조합 사용을 비롯하여, 만성 바이러스 감염에 사용되는 다른 치료와 조합하여 사용할 수 있다.
하기 원리는 백신용 폴리에피토프 조성물 내 포함, 또는 백신에 포함시키기고자 하고/하거나 미니유전자와 같은 핵산에 의해 암호화하고자 하는 별개의 에피토프 선택에 대한 에피토프 분석을 선택할 때 이용하는 것이 바람직하다. 각각의 하기 원리는 선택을 실시하기 위하여 균형을 맞추는 것이 바람직하다. 소정 백신 조성물에 혼입시키고자 하는 다중 에피토프는 반드시 그럴 필요는 없지만, 에피토프가 유도되는 천연 항원 내에서 연속적으로 인접할 수 있다.
1.) 투여시 HBV 클리어런스와 상호 관련있는 것으로 관찰된 면역 반응을 모사하는 에피토프를 선택한다. HLA 클래스 I의 경우, 이것은 HBV의 1 이상의 항원으로부터 유래하는 3-4 에피토프를 포함한다. 바꾸어 말하면, 자발적으로 HBV를 배제하는 환자에게서, 이들이 1 이상의 HBV 항원 상의 3 이상의 에피토프에 대하여 면역 반응을 생성하는 것으로 관찰되었다. HLA 클래스 II의 경우, 유사한 원리를 사용한다. 즉, 다시 3-4 에피토프를 1 이상의 HBV 항원 중에서 선택한다(예컨대, Rosenberg 등,Science278: 1447-1450 참조).
2.) HLA 클래스 I의 경우 IC50이 500 nM 이하, 종종 200 nM 이하이고, 클래스 II의 경우 IC50이 1000 nM 이하인 면역원성과 상호 관련 있는 것으로 입증된 필수 결합 친화도를 가진 에피토프를 선택한다.
3.) 충분한 슈퍼모티프 함유 펩티드 또는 대립 유전자 특이적인 모티프 함유 펩티드의 충분한 어레이를 광범위한 집단 적용 범위를 제공하도록 선택한다. 예를 들면, 80% 이상의 집단 적용 범위를 갖는 것이 바람직하다. 당업계에 공지된 정적 평가인 몬테 카를로 분석을 사용하여 집단 적용 범위의 폭 또는 중복성을 평가한다.
4.) 암 관련 항원 중에서 에피토프를 선택하는 경우, 환자가 천연 에피토프에 대한 내성이 생길 수 있기 때문에 유사체를 선택하는 것이 종종 유용하다. 감염성 질병 관련 항원에 대하여 에피토프를 선택하는 경우, 천연 또는 동류 에피토프를 선택하는 것이 바람직하다.
5.) "중첩 에피토프(nested epitope)"로 언급되는 에피토프가 특히 타당하다. 중첩 에피토프는 2 개 이상의 에피토프가 소정의 펩티드 서열에서 중첩되는 경우에 생긴다. 중첩 펩티드 서열은 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 에피토프를 포함할 수 있다. 중첩 에피토프를 제공하는 경우에, 일반적인 목적은 서열당 최대수의 에피토프를 제공하는 것이다. 따라서, 펩티드 내 아미노 말단 에피토프의 아미노 말단과 카르복실 말단 에피토프의 카르복실 말단보다 더 긴 펩티드를 제공하는 것을 피하는 양태이다. 중첩 에피토프를 포함하는 서열과 같은 다중 에피토프를 제공하는 경우, 일반적으로 병리학적 또는 다른 유해한 생물학적 특성을 갖지 않도록 하기 위하여 서열을 스크리닝하는 것이 중요하다.
6.) 폴리에피토프 단백질을 형성하는 경우, 또는 미니유전자를 형성하는 경우, 관심 대상의 에피토프를 포함하는 최소형 펩티드를 생성하는 것을 목적으로 한다. 이 원리는 중첩 에피토프를 포함하는 펩티드를 선택하는 경우에 사용되는 것과 동일하지는 않더라도 유사하다. 그러나, 인공 폴리에피토프 펩티드로 크기 최소화 목적은 폴리에피토프 단백질 내 에피토프 간의 임의의 스페이서 서열을 통합해야하는 필요성에 관하여 균형을 이룬다. 예를 들면, 스페이서 아미노산 잔기를 도입하여 접합성 에피토프(표적 항원에 존재하지 않고, 단지 에피토프의 인공 병렬에 의해서만 형성되는, 면역 시스템에 의해 인식되는 에피토프)를 피하거나, 또는 에피토프 사이의 분열을 촉진함으로써 에피토프 제공을 향상시킬 수 있다. 일반적으로, 접합성 에피토프는 수용자가 비천연 에피토프에 대한 면역 반응을 생성할 수 있기 때문에 피해야 한다. "우성 에피토프"인 접합성 에피토프가 특히 관심 대상이다. 우성 에피토프는 다른 에피토프에 대한 면역 반응을 감소시키거나 억제하는 그러한 열성적인 반응을 초래할 수 있다.
7.) 동일 표적 단백질의 다중 변이체의 서열이 이용 가능한 경우, 잠재 펩티드 에피토프도 그 보존율을 토대로 선택할 수 있다. 예를 들면, 보존율 기준은 HLA 클래스 I 결합 펩티드의 전체 서열 또는 클래스 II 결합 펩티드의 전체 9-머 코어가 특이적인 단백질 항원에 대해 평가된 서열의 지정된 백분율로 보존되어야 하는 것으로 정의할 수 있다.
IV.K.1. 미니유전자 백신
다중 에피토프의 동시 송달을 할 수 있는 다수의 상이한 접근법이 이용 가능하다. 본 발명의 펩티드를 암호화하는 핵산이 특히 유용한 본 발명의 구체예이다. 미니유전자 내 포함을 위한 에피토프는 앞선 섹션에 설명한 지침에 따라서 선택하는 것이 바람직하다. 본 발명의 펩티드를 암호화하는 핵산을 투여하는 바람직한 수단은 본 발명의 1 개 또는 다중 에피토프를 포함하는 펩티드를 암호화하는 미니유전자 구조물을 사용한다.
다중 에피토프 미니유전자의 사용을 후술하고자 하며, 예를 들면 계류 중인 미국 특허 출원 번호 제09/311,784호, 문헌(Ishioka 등,J. Immunol.162: 3915-3925, 1999; An, L. 및 Whitton, J.L.,J. Virol.71: 2292, 1997; Thomason, S.A. 등,J. Immunol.157: 822, 1996; Whitton, J.L. 등,J. Virol.67: 348, 1993; Hanke, R. 등,Vaccine16: 426, 1998)에 기재되어 있다. 예를 들면, 1 이상의 HBV 항원의 다중 영역으로부터 유도된 슈퍼모티프 및/또는 모티프 함유 에피토프, 보편적인 헬퍼 T 세포 에피토프, 예를 들면 PADRETM(또는 HBV 항원으로부터의 다중 HTL 에피토프) 및 내부 원형질 망상조직 전위 시그널 서열을 암호화하는 다중 에피토프 DNA 플라스미드를 설계할 수 있다. 또한, 백신은 다른 TAA로부터 유도되는 에피토프를 포함할 수 있다.
다중 에피토프 미니유전자의 면역원성은 테스트된 에피토프에 대한 CTL 유도 반응의 정도를 평가하기 위하여 트랜스제닉 마우스로 테스트할 수 있다. 또한, DNA암호화 에피토프의 생체내 면역원성은 DNA 플라스미드로 트랜스펙트시킨 표적 세포에 대한 특이적인 CTL 세포주의 시험관내 반응과 상관시킬 수 있다. 따라서, 이러한 실험은 미니유전자가 1.) CTL 반응을 생성하는 기능을 하고, 2.) 유도된 CTL이 암호화된 에피토프를 발현하는 세포를 인식하는 것을 보여줄 수 있다.
예를 들면, 사람 세포 내 발현을 위한 선택된 에피토프(미니유전자)를 암호화하는 DNA 서열을 형성하기 위하여, 에피토프의 아미노산 서열을 역번역할 수 있다. 사람 코돈 용법 표를 사용하여 각각의 아미노산에 대한 코돈 선택을 안내할 수 있다. 이러한 에피토프 암호화 DNA 서열을 직접 접합하여, 번역시 연속적인 폴리펩티드 서열이 형성되도록 한다. 발현 및/또는 면역원성을 최적화하기 위하여, 추가 요소를 미니유전자 설계에 포함시킬 수 있다. 역번역되고 미니유전자 서열에 포함될 수 있는 아미노산 서열의 예로는 HLA 클래스 I 에피토프, HLA 클래스 II 에피토프, 편재 시그널 서열 및/또는 내부 원형질 망상조직 표적 시그널이 있다. 또한, CTL 및 HTL 에피토프의 HLA 제시는 CTL 또는 HTL 에피토프에 인접한 합성(예컨대, 폴리알라닌) 또는 천연 발생 플랭킹 서열을 포함시킴으로서 개선될 수 있는데, 에피토프(들)를 포함하는 이러한 더 큰 펩티드는 본 발명의 범주 내에 있다.
미니유전자 서열은 미니유전자의 가감 표준을 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 어셈블리함으로써 DNA로 전환될 수 있다. 올리고뉴클레오티드(30-100 염기 길이)는 널리 알려진 기술을 사용하여 적당한 조건 하에 합성, 인산화, 정제 및 어닐링할 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 말단은, 예를 들면 T4 DNA 리가제를 사용하여 접합할 수 있다. 그 다음, 에피토프 폴리펩티드를 암호화하는 이 합성 미니유전자를 소정 발현 벡터로 클로닝할 수 있다.
당업자라에게 널리 알려진 표준 조절 서열을 벡터에 포함시켜서 표적 세포 내 발현을 보장하는 것이 바람직하다. 몇 가지 벡터 요소가 바람직하다: 미니유전자 삽입을 위한 하류 클로닝 부위를 가진 프로모터; 효율적인 전사 종결을 위한 폴리아데닐 시그널; 복제의E. coli기원; 및E.coli선택성 마커(예컨대, 암피실린 또는 카나마이신 내성). 다수의 프로모터, 예컨대 사람 시토메갈로바이러스(hCMV) 프로모터를 이 목적에 사용할 수 있다. 다른 적당한 프로모터 서열에 대해서는 예컨대, 미국 특허 제5,580,859호 및 제5,589,466호를 참조할 수 있다.
추가의 벡터 변형이 미니유전자 발현 및 면역원성을 최적화하는 데 요망될 수 있다. 임의의 경우에서, 인트론은 효율적인 유전자 발현에 필수적이며, 1 이상의 합성 또는 천연 발생 인트론을 미니유전자의 전사된 영역에 도입할 수 있다. 또한, mRNA 안정화 서열 및 포유류 세포 내 복제를 위한 서열의 포함을 미니유전자 발현을 증가시키기 위하여 고려할 수 있다.
발현 벡터를 선택하면, 미니유전자를 프로모터의 폴리링커 영역 하류에 클로닝한다. 이 플라스미드는 적당한E. coli균주로 트랜스폼시키고, 표준 기술을 사용하여 DNA를 제조한다. 미니유전자의 배향 및 DNA 서열, 뿐만 아니라 벡터에 포함된 다른 모든 요소는 제한 매핑 및 DNA 서열 분석을 사용하여 확인한다. 정확한 플라스미드를 고정하는 박테리아 세포는 마스터 세포 블랭크 및 작업 세포 블랭크로서 저장할 수 있다.
또한, 면역 조절 서열(ISS 또는 CpGs)은 DNA 백신의 면역원성에서 역할을 담당한다. 이러한 서열은 필요에 따라 면역원성을 향상시키기 위하여 미니유전자 암호화 서열 외부에서 벡터에 포함시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 미니유전자 암호화 에피토프 및 제2 단백질(면역원성을 향상시키거나 감소시키기 위하여 포함시킴)을 생성할 수 있는 비-시스트론 발현 벡터를 사용할 수 있다. 공발현의 경우 면역 반응을 유리하게 향상시킬 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드의 예로는 사이토카인(예컨대, IL-2, IL-12, GM-CSF), 사이토카인 유도 분자(예컨대, LeIF) 또는 공자극 분자가 있다. 헬퍼(HTL) 에피토프는 세포내 표적화 시그널에 접합하고, 발현된 CTL 에피토프로부터 별도로 발현될 수 있는데, 이는 CTL 에피토프의 것과는 상이한 세포 구획으로 HTL 에피토프를 지향할 수 있다. 필요에 따라, 이것은 HTL 에피토프의 HLA 클래스 II 통로로의 보다 효율적인 진입을 촉진할 수 있으며, 이로써 CTL 유도를 개선한다. HTL 또는 CTL 유도와는 대조적으로, 면역 억제 분자(예컨대, TGF-β)의 공발현에 의한 면역 반응을 특이적으로 감소시키는 것은 특정 질병에 유리할 수 있다.
플라스미드 DNA의 치료 정량은, 예를 들면 E. coli 내 발효 후 정제에 의해 생성할 수 있다. 작업 세포 블랭크로부터의 분액을 사용하여 성장 배지를 접종하고, 진탕 플라스크 또는 널리 알려진 기술에 따른 생반응기 내에서 포화 성장시킨다. 플라스미드 DNA는 QIAGEN, Inc.(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재) 제품인 고상 음이온 교환 수지와 같은 표준 생분리 기술을 이용하여 정제할 수 있다. 필요에 따라, 슈퍼코일 DNA는 겔 전기 영동 또는 다른 방법을 이용하여 개방 원형 및 선형으로부터 단리할 수 있다.
정제된 플라스미드 DNA는 다양한 제제를 사용하여 주사용으로 제조할 수 있다. 이들 중 가장 간단한 것은 멸균 인산염 완충 염수(PBS) 내 동결 건조된 DNA의 재구성이다. "노출된 DNA"로 알려진 이 접근법은 임상 시험에서 근육내(IM) 투여에 현재 사용되고 있다. 미니유전자 DNA 백신의 면역요법 효과를 최대화하기 위하여, 정제된 플라스미드 DNA를 조제하는 대안의 방법이 바람직할 수 있다. 다양한 방법이 기술되었으며, 새로운 기술이 유용하게 될 수 있다. 또한, 양이온성 지질을 제제에 사용할 수 있다(예컨대, WO 93/24640호, Mannino & Gould-Fogerite,BioTechniques6(7): 682(1988); 미국 특허 제5,279,833호, WO 91/06309호 및 Felgner 등,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA84: 7413 (1987) 참조). 또한, 당지질, 푸소겐 리포솜, 펩티드 및 총체적으로 보호, 상호작용, 비축합 화합물(PINC)로 언급되는 화합물을 정제된 플라스미드 DNA와 복합체화하여 안정성, 근육내 분산 또는 특이적인 기관 또는 세포 유형에 대한 트래피킹과 같은 변수에 영향을 줄 수 있다.
표적 세포 민감화는 미니유전자 암호화 CTL 에피토프의 발현 및 HLA 클래스 I 제시에 대한 기능 분석으로서 사용할 수 있다. 예를 들면, 플라스미드 DNA는 표준 CTL 크롬 방출 분석용 표적으로서 적당한 포유류 세포주에 도입한다. 사용되는 트랜스펙트 방법은 최종 제제에 의존할 것이다. 전기영동은 "노출된" DNA에 사용될 수 있는 반면에, 양이온성 지질은 시험관내 트랜스펙트에 관한다. 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 플라스미드는 코-트랜스펙트시켜서 형광 활성화 세포 분류법(FACS)을 사용하여 트랜스펙트된 세포를 부화시킬 수 있다. 그 다음, 이러한세포는 크롬-51(51Cr) 표지화하고, 에피토프 특이적인 CTL 세포주에 대한 표적 세포로 사용하며,51Cr 방출에 의해 검출되는 세포 용해는 미니유전자 암호화 CTL 에피토프의 생성 및 HLA 제시를 가리킨다.
생체내 면역원성은 미니유전자 DNA 형성의 기능 테스트에 대한 제2 접근법이다. 적당한 사람 HLA 단백질을 발현하는 트랜스제닉 마우스는 DNA 산물로 면역화한다. 투여량과 투여 경로는 제제 의존적이다(예컨대, PBS 중의 DNA의 경우 근육내, 지질 복합체화 DNA의 경우, 복강내). 면역화 21 일 후, 비세포를 수거하고, 테스트하고자 하는 각각의 에피토프를 암호화하는 펩티드의 존재 하에 1 주 동안 재자극한다. 그 후, CTL 작동 세포의 경우, 표준 기술을 사용하여 펩티드 로딩된51Cr 표지된 표적 세포의 세포 용해에 대한 분석을 수행한다. 미니유전자 암호화 에피토프에 해당하는 펩티드의 HLA 로딩에 의해 감지된 표적 세포의 용해는 CTL의 생체내 도입에 대한 DNA 백신 기능을 설명한다. HTL 에피토프의 면역원성은 트랜스제닉 마우스 내에서 유사한 방식으로 평가한다.
대안으로, 핵산은 예컨대, 미국 특허 제5,204,253호에 개시된 바와 같은 탄도 송달(ballistic delivery)을 이용하여 투여할 수 있다. 이 기술을 사용하여, DNA만으로 구성된 입자를 투여한다. 또 다른 대안의 구체예에서, DNA를 금 입자와 같은 입자에 부착시킬 수 있다.
또한, 미니유전자는 당업계에 널리 알려진 다른 박테리아 또는 바이러스 송달 시스템을 이용하여 송달할 수 있는데, 예를 들면 본 발명의 에피토프를 암호화하는 발현 구조물을 우두와 같은 바이러스 벡터에 도입할 수 있다.
IV.K.2 CTL 펩티드와 헬퍼(Helper) 펩티드의 조합
본 발명의 CTL 펩티드를 포함하는 백신 조성물은, 개선된 혈청 반감기, 사용가능한 집단 범위의 확대 또는 증가된 면역원성과 같은 원하는 특성을 제공하도록 변형될 수 있다.
예를 들어, 펩티드가 CTL 활성을 유도하는 능력은 T 헬퍼 세포 반응을 유도할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 함유하는 서열에 펩티드를 연결시킴으로써 증가될 수 있다. 면역원성을 증가시키기 위해 CTL 에피토프와 함께 T 헬퍼 에피토프를 이용하는 것은, 예를 들어 공계류중인 출원 U.S.S.N.08/820,360, U.S.S.N.08/197,484, 및 U.S.S.N.08/464,234에 예시되어 있다.
CTL 펩티드는 T 헬퍼 펩티드에 직접 연결될 수 있지만, CTL 에피토프/HTL 에피토프 연결체는 종종 스페이서(spacer) 분자에 의해 연결된다. 스페이서는 아미노산 또는 아미노산 모방체와 같은, 생리학적 조건에서 실질적으로 전하를 띠지 않는 상대적으로 작고 중성인 분자들로 이루어진다. 스페이서는 통상적으로 예를 들어 Ala, Gly, 또는 비극성 아미노산 또는 중성 극성 아미노산의 기타 중성 스페이서로부터 선택된다. 임의로 존재하는 스페이서는 동일한 잔기들로 구성될 필요는 없으며, 따라서 헤테로 올리고머일수도 또는 호모 올리고머일수도 있다. 존재할 경우, 스페이서는 대개 적어도 하나 또는 두 개의 잔기, 보다 통상적으로는 세 개 내지 여섯 개의 잔기이며, 때때로 10개 이상의 잔기일 것이다. CTL 펩티드 에피토프는 직접 또는 CTL 펩티드의 아미노 또는 카르복시 말단에 있는 스페이서를 통해 T 헬퍼 펩티드 에피토프에 연결될 수 있다. 면역원성 펩티드 또는 T 헬퍼 펩티드의 아미노 말단은 아실화될 수도 있다.
일부 실시 태양에서는, T 헬퍼 펩티드는 집단의 대다수에 존재하는 T 헬퍼 세포에 의해 인식되는 펩티드이다. 이는 HLA 클래스 II 분자의 다수, 대부분, 또는 모두에 결합하는 펩티드를 선택함으로써 이루어질 수 있다. 이들은 "느슨하게 HLA-제한된" 또는 "불규칙한" T 헬퍼 서열로 알려져 있다. 불규칙한 아미노산 서열의 예는 위치 830-843의 테타누스 독소(QYIKANSKFIGITE; SEQ ID NO:51484), 위치 378-398의 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum) 포자소체(circumsporozoite)(CS) 단백질 (DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS; SEQ ID NO:51485), 및 위치 116의 스트렙토코커스 (Streptococcus) 18kD 단백질(GAVDSILGGVATYGAA;SEQ ID NO:51486)과 같은 항원으로부터의 서열을 포함한다. 다른 예는 DR 1-4-7 수퍼모티프, 또는 DR3 모티프들중의 어느 하나를 함유하는 펩티드를 포함한다.
한편, 천연에서 발견되지 않는 아미노산 서열(예, PCT 공개 WO95/07707 참고)을 이용하여, 느슨하게 HLA-제한된 방식으로 T-헬퍼 림프구를 자극할 수 있는 합성 펩티드를 제조하는 것이 가능하다. Pan-DR-결합 에피토프로 불리는 이들 합성 화합물(예, PADRETM, Epimmune, Inc.,San Diego,CA)은 가장 바람직하게는 대부분의 HLA-DR(사람 HLA 클래스 II) 분자에 결합하도록 고안된다. 예를 들어, 식 aKXVAAWTLKAAa(여기서, X는 시클로헥실알라닌, 페닐알라닌, 또는 티로신이며, a는D-알라닌 또는 L-알라닌임)를 갖는 pan-DR-결합 에피토프 펩티드는 대부분의 HLA-DR 대립유전자에 결합하며 개체의 HLA 타입에 관계없이 대부분의 개체로부터의 T 헬퍼 림프구의 반응을 자극하는 것으로 밝혀졌다. 또 다른 pan-DR 결합 에피토프는 모든 "L" 천연 아미노산을 포함하며 에피토프를 암호하는 핵산 형태로 제공될 수 있다.
HTL 펩티드 에피토프는 또한 그들의 생물학적 특성을 바꾸기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 그들은 프로테아제에 대한 그들의 내성을 증가시키고 따라서 혈청 반감기를 연장시키기 위해 D-아미노산을 포함하도록 변형될 수 있으며, 또는 지질, 단백질, 탄수화물 등과 같은 다른 분자에 연결되어 그들의 생물학적 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, T 헬퍼 펩티드는 아미노 말단 또는 카르복실 말단에서 하나 이상의 팔미트산 쇄에 연결될 수 있다.
III.K.3. CTL 펩티드와 T 세포 감작(priming) 제제의 조합
일부 실시 태양에서는 본 발명의 약학 조성물에 세포독성 T 림프구를 감작시키는 성분을 하나 이상 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 지질은 바이러스 항원에 대해 생체내에서 CTL을 감작시킬 수 있는 제제로 확인되었다. 예를 들어, 팔미트산 잔기는 라이신 잔기의 ε과 α아미노기에 부착되고 이어서 Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser 등과 같은 하나 이상의 연결 잔기를 통해 면역원성 펩티드에 연결될 수 있다. 지질화된 펩티드는 이어서 미셀 또는 입자로 직접 투여되거나, 리포좀내로 혼입되거나, 또는 불완전 프로인트 아쥬반트와 같은 아쥬반트내에 에멀션화될 수 있다. 바람직한 실시 태양에서, 특히 효과적인 면역원성 조성물은 Lys의 ε과α아미노기에 부착된 팔미트산을 포함하며, 이는 Ser-Ser과 같은 연결체를 통해 면역원성 펩티드의 아미노 말단에 부착된다.
CTL 반응의 지질 감작의 다른 예로써, 트리팔미토일-S-글리세릴시스테이닐세릴-세린(P3CSS)과 같은 이.콜리 지질단백질이 적절한 펩티드에 공유적으로 부착될 경우 바이러스 특이적 CTL을 감작시키기 위해 이용될 수 있다(예, Deres et al., Nature 342:561, 1989 참고). 본 발명 펩티드는 예를 들어 P3CSS에 연결될 수 있으며, 이 지질단백질은 표적 항원에 대한 CTL 반응을 특이적으로 감작시키기 위하여 개체에게 투여될 수 있다. 더욱이, 중화 항체의 유도 또한 P3CSS-연결된 에피토프로 감작될 수 있기 때문에, 두 가지의 그러한 조성물은 배합되어 체액 매개 및 세포 매개 반응 둘다를 보다 효과적으로 유도할 수 있다.
CTL 및/또는 HTL 펩티드는 또한 펩티드의 말단에 아미노산을 부가하여 변형되어 펩티드가 서로 쉽게 연결되게 하거나, 담체 지지체 또는 더 큰 펩티드에 연결되게 하거나, 펩티드 또는 올리고펩티드의 물리적 또는 화학적 특성을 변형시킬 수 있다. 티로신, 시스테인, 라이신, 글루탐산 또는 아스파르트산 등과 같은 아미노산이 펩티드 또는 올리고펩티드, 특히 클래스 I 펩티드의 C- 또는 N- 말단에 도입될 수 있다. 하지만, CTL 에피토프의 카르복실 말단에서의 변형은 어떤 경우에는 펩티드의 결합 특성을 변형시킬 수도 있음을 주의해야 한다. 또한, 펩티드 또는 올리고펩티드 서열은 말단-NH2아실화(예를 들어 알카노일(C1-C20) 또는 티오글리콜릴 아세틸화), 말단-카르복실 아미드화(예, 암모니아, 메틸아민, 등)에 의해 변형되어천연 서열과 달라질 수 있다. 일부 경우에는 이들 변형이 지지체 또는 다른 분자에 연결되는 부위를 제공할 수도 있다.
IV.K.4. CTL 및/또는 HTL 펩티드로 펄스된 DC를 포함하는 백신 조성물
본 발명에 따른 백신 조성물의 실시 태양은 환자의 혈액으로부터의 PBMC 또는 여기서 분리된 DC에 에피토프-함유 펩티드의 혼합물을 생체외 투여하는 것을 포함한다. DC의 수거를 촉진하기 위한 약제, 예를 들어 프로제니포이에틴TM(Progenipoietin, Monsanto, St.Louis,MO) 또는 GM-CSF/IL-4를 이용할 수 있다. 펩티드로 DC를 펄스한 후, 환자에게 재주사하기 전에, DC를 세척하여 미결합 펩티드를 제거한다. 이 실시 태양에서, 백신은 HLA 분자와 복합체를 이룬 펄스된 펩티드 에피토프를 그들의 표면에 제공하는 펩티드-펄스된 DC를 포함한다.
DC는 펩티드 혼합물로 생체외에서 펄스될 수 있으며, 이중 일부는 하나 이상의 HBV 관심 항원에 대한 CTL 반응을 자극한다. 임의로, CTL 반응을 촉진시키기 위해 PADRE 계 분자와 같은 헬퍼 T 세포(HTL) 펩티드가 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명에 의한 백신, 바람직하게는 다중 HBV 항원으로부터의 에피토프를 포함하는 본 발명 백신이 HBV 감염을 치료하기 위해 이용된다.
IV.L. 치료 또는 예방을 위한 백신의 투여
본 발명의 펩티드와 약학 조성물 및 백신 조성물은 일반적으로 HBV 감염을 치료 및/또는 예방하기 위해 이용된다. 본 발명 펩티드를 함유하는 백신 조성물은HBV로 감염된 환자, 또는 HBV 감염에 민감한 개체, 또는 HBV 감염의 위험이 있는 개체에게 투여되어 HBV 항원에 대한 면역 반응을 유도하고 따라서 환자의 면역 반응 능력을 향상시킨다.
본원에서 개시된 바처럼, 본 발명의 CTL 및/또는 HTL 에피토프를 포함하는 펩티드는, HLA 분자에 의해 제공되고 그 펩티드에 의해 포함되는 에피토프에 특이적인 CTL 또는 HTL과 접촉될 때 면역 반응을 유도한다. 펩티드(또는 그들을 암호하는 DNA)는 개별적으로 투여되거나 또는 하나 이상의 펩티드 서열의 융합체로서 투여될 수 있다. 펩티드가 CTL 또는 HTL과 접촉되는 방식은 본 발명에 중요하지 않다. 예를 들어, 펩티드는 생체외 또는 생체내에서 CTL 또는 HTL과 접촉될 수 있다. 접촉이 생체내에서 일어나면, 펩티드 그 자체가 환자에게 투여될 수 있으며, 또는 다른 담체(예, 하나 이상의 펩티드를 암호하는 DNA 벡터, 펩티드를 암호하는 바이러스 벡터, 리포좀 등)가 이용될 수 있다.
펩티드가 생체외에서 접촉될 경우, 백신화제는 펩티드-펄스된 가지세포와 같은 세포 집단 또는 항원-제공 세포를 생체외에서 펩티드로 펄스하거나 또는 항원-제공 세포를 본 발명의 미니유전자로 형질감염시키므로써 유도된 HBV-특이적 CTL을 포함할 수 있다. 그러한 세포 집단은 이어서 치료적 유효량으로 환자에게 투여된다.
치료에 적용할 경우, 펩티드 및/또는 핵산 조성물은 바이러스 항원에 대한 효과적인 CTL 및/또는 HTL 반응을 유도하고, 증상 및/또는 합병증을 치료 또는 적어도 부분적으로 정지 또는 완화시키기에 충분한 양으로 환자에게 투여된다. 이를위해 적절한 양을 "치료적 유효량"이라고 한다. 이 용도에 효과적인 양은 투여되는 구체적 조성물, 투여 방식, 치료되어야 할 질병의 단계 및 심각성, 환자의 체중 및 일반적인 건강 상태, 그리고 처방 의사의 판단에 의존할 것이다.
약학 조성물의 경우, 본 발명의 면역원성 펩티드, 또는 이를 암호하는 DNA는 일반적으로 이미 HBV로 감염된 개체에게 투여된다. 펩티드 또는 이를 암호하는 DNA는 개별적으로 또는 하나 이상의 펩티드 서열의 융합체로서 투여될 수 있다. HBV-감염된 환자는 다른 적절한 치료와 별개로 또는 다른 치료와 함께 면역원성 펩티드로 치료될 수도 있다.
치료 용도의 경우, 투여는 일반적으로 HBV 감염의 첫 진단시에 시작한다. 이어서 적어도 증상이 실질적으로 완화될 때까지 그리고 이어서 당분간 추가 접종이 이루어진다. 환자에게 전달되는 백신 조성물의 실시 태양(즉, 펩티드 혼합물, 폴리에피토프 폴리펩티드, 미니유전자, 또는 HBV 항원-특이적 CTL 또는 펄스된 가지 세포를 포함하며 이에 한정되지 않음)은 질병의 단계 또는 환자의 건강 상태에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 만성 HBV 감염을 가진 환자에서, HBV-특이적 CTL을 포함하는 백신은 HBV-감염된 세포를 죽이는 데 있어서 다른 실시 태양보다 더욱 효과적일 수 있다.
민감한 개체들이 감염 전 또는 감염 동안 확인되는 경우, 상기 조성물은 그들을 표적으로 하여 더 큰 집단에의 투여 필요성을 최소화할 수 있다.
HBV 감염의 치료 또는 예방을 위해 이용되는 펩티드 또는 다른 조성물은 예를 들어 증상이 나타나지 않은 사람들에서 이용될 수 있다. 이 경우, 일반적으로세포독성 T 세포 반응을 효과적으로 자극하기에 충분한 투여 방식에 의해 전달된 펩티드 에피토프의 양을 제공하는 것이 중요하며, 헬퍼 T 세포 반응을 자극하는 조성물이 또한 본 발명의 실시 태양에 따라 주어질 수 있다.
초기의 치료적 면역화를 위한 투여량은 일반적으로 하한값이 약 1, 5, 50, 500 또는 1,000㎍이고 상한값이 약 10,000, 20,000, 30,000, 또는 50,000㎍인 단위 투여량 범위이다. 사람을 위한 투여량 값은 일반적으로 70kg 환자당 약 500㎍ 내지 약 50,000㎍ 범위이다. 추가 요법에 따른 수주 내지 수개월에 걸친 약 1.0㎍ 내지 약 50,000㎍의 펩티드 추가 투여량이, 환자의 혈액에서 얻어진 CTL 및 HTL의 특이적 활성을 측정함으로써 측정된 환자의 반응 및 상태에 따라 투여될 수 있다. 투여는 적어도 임상 증상 또는 실험실 시험이 바이러스 감염이 제거되었거나 감소되었음을 나타낼때까지 그리고 그 후 당분간 계속되어야 한다. 투여량, 투여 경로, 및 투여 계획은 당업계에 공지된 방법에 따라 조정된다.
일부 실시 태양에서, 본 발명의 펩티드와 조성물은 생명을 위협하거나 또는 잠재적으로 생명을 위협하는 상황과 같은 심각한 질병 상태에서 이용된다. 그러한 경우, 본 발명의 바람직한 조성물의 펩티드의 상대적으로 비독성인 특성과 최소량의 기타 물질에 의해, 상기한 투여량에 비하여 상당한 과량의 이들 펩티드 조성물을 투여하는 것이 바람직한 것으로 의사에 의해 판단될 수도 있다.
본 발명의 백신 조성물은 순수하게 예방약으로서 사용할 수도 있다. 통상, 최초 예방 접종용 투여량은 일반적으로 단위 투여 범위가 저투여치로는 약 1, 5, 50, 500 또는 1000 ㎍, 고투여치로는 약 10,000, 20,000, 30,000 또는 50,000 ㎍범위이다. 인간에게 투여하기 위한 투여치는 통상 70 kg 환자에 대하여 약 500 ㎍ 내지 약 50,000 ㎍ 범위이다. 상기 최초 백신 투여 후, 약 4 주 내지 6 개월의 규정 간격을 두고, 펩티드 약 1.0 ㎍ 내지 약 50,000 ㎍의 부스팅 투여량(boosting dosage)을 투여한다. 환자의 혈액 샘플로부터 얻은 CTL 및 HTL의 특이적 활성을 측정하여 백신의 면역원성을 평가할 수 있다.
치료 처치용 약학 조성물은 비경구, 국소, 경구, 초내(intrathecal) 또는 국부(예, 크림 또는 국소 연고) 투여용으로 의도된다. 상기 약학 조성물은 비경구적으로, 예를 들어, 정맥내, 피하, 진피내 또는 근육내 투여 방법으로 투여하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 허용 가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체에 용해 또는 현탁시킨 면역원성 펩티드 용액을 포함하는 비경구 투여용 조성물을 제공한다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충수, 0.8 % 염수, 0.3 % 글리신, 히알루론산 등을 사용할 수 있다. 이들 조성물은 종래 주지의 멸균 기술을 이용하여 멸균시키거나, 멸균 여과시킬 수 있다. 상기 생성된 수성 용액은 그대로 사용을 위하여 포장하거나, 동결 건조시킬 수 있다. 여기에서, 동결 건조 제제는 투여 전에 멸균 용액과 혼합시킨다. 상기 조성물은, 생리적 조건에 근접하게 하기 위해 요구되는 바와 같은 약학적 허용 보조 물질, 예를 들어, pH-조절 및 완충제, 장성 조절제(tonicity adjusting agent), 습윤화제, 보존제 등, 예컨대, 소듐 아세테이트, 소듐 락테이트, 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 등을 함유할 수 있다.
상기 약학 제제에 있어서의 본 발명 펩티드의 농도는 광범위하게 변화시킬수 있다. 즉, 상기 농도는, 약 0.1 중량% 미만, 통상 2 중량% 또는 2 중량% 이상 내지 20 중량% 내지 50 중량% 또는 그 이상일 수 있다. 또한, 상기 농도는 선택된 특정 투여 경로에 따라, 주로, 유체 부피, 점도 등에 의하여 선택될 것이다.
상기 펩티드 조성물의 인간 단위 제형은 통상 허용 가능한 담체, 바람직하게 수성 담체의 인간 단위 투여량을 포함하는 약학 조성물 중에 포함되며, 그러한 조성물을 인간에게 투여하기 위하여 사용되는 당업자에게 공지된 유체 부피로 투여한다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17thEdition, A. Gennaro, Editor, Mack Publising Co., Easton, Pennsylvania, 1985]을 참고하라.
본 발명의 펩티드 및/또는 그 펩티드를 암호하는 핵산은 리포솜을 이용하여 투여할 수도 있다. 상기 리포솜은 림프 조직과 같은 특정 조직에 대해 상기 펩티드를 표적화하거나, 감염 세포에 대해 선택적으로 표적화하는데 도움을 줄 수 있고, 또한 상기 펩티드 조성물의 반감기를 증가시키는데 도움을 줄 수 있다. 리포솜으로는 에멀션, 포움(foam), 마이셀(micelle), 불용성 단층, 액정, 인지질 분산물, 라멜라 층(lamellar layer) 등이 있다. 이러한 제제에 있어서, 송달되는 상기 펩티드는, 단독으로, 또는 CD45 항원에 결합되는 모노클로날 항체와 같은 림프 세포 중 우세한 수용체에 결합하는 분자와 함께 또는 기타 치료 또는 면역원성 조성물과 함께, 리포솜의 일부로서 혼입시킨다. 따라서, 본 발명의 소정 펩티드로 충진되거나 도포되어(decorated) 상기 펩티드 조성물을 송달하는 리포솜은 림프 세포의 상기 부위로 지향될 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 리포솜은 일반적으로 중성 및 음전하 인지질 및 콜레스테롤 등의 스테롤을 비롯한 표준 베시클 (vesicle)-형성 지질로부터 형성된다. 일반적으로, 예를 들어 혈류 중의 리포솜의 안정성, 산 불안정성(acid lability) 및 리포솜의 크기 등을 고려하여 지질을 선택한다. 리포솜 제조에는 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Szoka,et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), 및 미국 특허 제4,235,871호, 제4,501,728호, 제4,837,028호 및 제5,019,369호]에 기재되어 있는 바와 같은 방법을 이용할 수 있다.
면역계의 표적 세포에 있어서, 리포솜 내로 혼입되는 리간드로는 예컨대 소정 면역계 세포의 세포 표면 결정기(cell surface determinant)에 대하여 특이적인 항체 또는 그의 단편을 들 수 있다. 펩티드를 함유하는 리포솜 현탁액은, 특히, 투여 방식, 송달할 펩티드 및 치료할 질병의 상태에 따라 달라지는 투여량으로, 정맥내, 국부, 국소 투여 등으로 투여할 수 있다.
고체 조성물에 있어서, 통상의 비독성 고체 담체로는 예를 들어 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 활석, 셀룰로오스, 글루코오스, 수크로오스, 마그네슘 카보네이트 등을 사용할 수 있다. 경구 투여에 있어서, 약학적 허용 비독성 조성물은 앞에서 열거한 담체와 같은 통상 사용하는 부형제 중의 임의의 것과, 활성 성분, 즉, 본 발명의 펩티드 하나 이상을 통상 10 내지 95 %, 바람직하게 25 % 내지 75 %의 농도로 혼합함으로써 형성시킨다.
에어로졸 투여에 있어서, 면역원성 펩티드는 계면활성제 및 분사제와 함께 미세하게 분할된 형태로 제공하는 것이 바람직하다. 통상 펩티드의 퍼센트는 0.01중량% 내지 20 중량%, 바람직하게 1 중량% 내지 10 중량%이다. 물론, 상기 계면활성제는 비독성이어야 한다. 또한, 상기 계면활성제는 상기 분사제에 가용성인 것이 바람직하다. 그러한 약제의 대표적 예로는 탄소 원자수 6 내지 22의 지방산의 에스테르 또는 부분 에스테르, 예컨대, 카프로산, 옥타노산, 라우르산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레스테르산 및 올레산과 지방족 다가 알콜 또는 그의 사이클릭 무수물의 에스테르 또는 부분 에스테르 등이 있다. 혼합 에스테르, 예컨대, 혼합 또는 천연 글리세라이드를 사용할 수 있다. 상기 계면활성제는 조성물에 0.1 중량% 내지 20 중량%, 바람직하게 0.25 중량% 내지 5 중량%의 양으로 포함될 수 있다. 상기 조성물의 잔량은 통상 분사제이다. 필요에 따라, 담체도 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 비강내 송달을 위하여 레시틴을 사용할 수 있다.
IV.M. 키트
본 발명의 펩티드 및 핵산 조성물은 백신 투여를 위한 지시서와 함께 키트 형태로 제공할 수 있다. 통상, 키트는 용기 내, 바람직하게는 단위 제형 내의 소정 펩티드 조성물 및 투여를 위한 지시서를 포함할 것이다. 대안적인 키트는 투여를 위한 지시서와 함께, 용기 내에, 바람직하게는 단위 제형 내에 본 발명의 소정 핵산과 미니유전자 작제물을 포함할 것이다. IL-2 또는 IL-12 등의 림포카인도 상기 키트내에 포함시킬 수 있다. 또한, 바람직한 것일 수 있는 기타 키트 성분으로는 예를 들어 멸균 시린지, 부스터 투여량 및 기타 소정 부형제 등이 있다.
본 발명에 따른 에피토프를 사용하여 성공적으로 면역 반응을 유도하였다. 이러한 에피토프를 이용한 면역 반응은 다양한 형태로 에피토프를 투여함으로써 유도되었다. 상기 에피토프는 펩티드로서, 핵산으로서, 그리고, 본 발명의 에피토프(들)을 암호하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터로서 투여하였다. 펩티드-계 에피토프 형태의 투여 시, 면역 반응은 세포 상에서 발현되는 중공 HLA 분자 상에 에피토프를 직접 로딩한 후, 에피토프의 내재화 및 HLA 클래스 I 경로를 통한 프로세싱을 통하여 유도되었다; 어느 경우에나, 그 다음, 상기 에피토르를 발현시키는 HLA 분자는 상호 작용할 수 있었고, CTL 반응을 유도할 수 있었다. 펩티드는 직접 또는 리포솜과 같은 약제를 이용하여 송달할 수 있다. 상기 펩티드가 통상 결정형인 탄도 송달(ballistic delivery)을 이용하여, 그들을 추가 송달할 수 있다. 면역 반응을 유도하기 위하여 DNA를 사용하는 경우에, 일반적으로 약 1 내지 5 mg의 투여량 범위의 네이키드(naked) DNA로서, 또는 통상 약 10 내지 100 ㎍의 투여량 범위의 탄도 "유전자 총" 송달을 통하여, 그것을 투여할 수 있다. 상기 DNA는 다양한 배좌, 예컨대, 선형, 고리형 등으로 송달할 수 있다. 본 발명에 따른 에피토프를 암호하는 핵산을 포함하는 다양한 바이러스 벡터도 성공적으로 사용할 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 조성물은 몇 개의 형태로 존재한다. 본 발명에 따른 이들 각 조성물 형태의 실시 태양을 이용하여 면역 반응을 성공적으로 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 한 조성물은 다수의 펩티드를 포함한다. 이러한 다수의 또는 칵테일 펩티드는 일반적으로 하나 이상의 약학적 허용 부형제와 혼합한다. 상기 펩티드 칵테일은 동일한 펩티드의 다중 카피를 포함하거나, 펩티드의 혼합물을포함할 수 있다. 상기 펩티드는 천연 발생적 에피토프의 유사체일 수 있다. 상기 펩티드는 인공적 아미노산 및/또는 표면 활성 분자의 추가, 예컨대, 지질화, 아세틸화, 글리코실화, 비오틴화, 인산화 등의 화학적 개질을 포함할 수 있다. 상기 펩티드는 CTL 또는 HTL 에피토프일 수 있다. 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 펩티드 칵테일은 다수의 상이한 CTL 에피토프 및 하나 이상의 HTL 에피토프를 포함한다. 상기 HTL 에피토프는 천연적인 것이거나 비-천연적인 것[예, PADRE(등록 상표), 에피뮨 인코포레이티드(Epimmune Inc.), 샌디에고, 캘리포니아]일 수 있다. 본 발명의 실시 태양에 있어서, 구별되는 에피토프의 수는 일반적으로 1 내지 150의 단위 정수이다(예, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 150).
본 발명에 따른 조성물의 추가의 실시 태양은 폴리펩티드 다중-에피토프 작제물, 즉, 폴리에피토프 펩티드를 포함한다. 본 발명에 따른 폴리에피토프 펩티드는 당업계에 주지된 기술을 이용하여 제조한다. 이러한 주지된 기술을 이용함에 의하여, 본 발명에 따른 에피토프를 다른 에피토프와 연결시킨다. 상기 폴리에피토프 펩티드는 선형 또는 비-선형, 예컨대, 다가성일 수 있다. 이들 폴리에피토프 작제물은 인공적 아미노산, 스페이싱(spacing) 또는 스페이서 아미노산, 플랭킹(flanking) 아미노산, 또는 근접 에피토프 단위 사이의 화학적 개질을 포함할 수 있다. 상기 폴리에피토프 작제물은 헤테로폴리머 또는 호모폴리머일 수 있다. 상기 폴리에피토프 작제물은 일반적으로 2 내지 150 사이의 어느 단위 정수의 다량의 에피토프를 포함한다(예, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 150). 상기 폴리에피토프 작제물은 CTL 및/또는 HTL 에피토프를 포함할 수 있다. 상기 작제물 중의 하나 이상의 에피토프는 표면 활성 물질, 예컨대, 지질의 첨가에 의하여 개질시키거나, 또는 예컨대 아세틸화 등으로 화학적 개질시킬 수 있다. 또한, 상기 다중에피토프 작제물 중의 결합은 펩티드 결합 이외의 것일 수 있다. 예를 들어, 공유 결합, 에스테르 또는 에테르 결합, 다이설파이드 결합, 수소 결합, 이온 결합 등일 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 따른 조성물은 천연 서열에 상동성을 갖는(즉, 천연 서열에 상응하거나, 그것과 인접하는) 일련의 아미노산, 아미노산 서열, 아미노산 스트레치(stretch) 등을 포함하는 작제물을 포함한다. 상기 아미노산의 스트레치는, 더욱 긴 일련의 아미노산으로부터 개열 또는 분리되는 경우 본 발명에 따라 HLA 클래스 I 또는 HLA 클래스 II 에피토프로 기능하는 아미노산의 부서열 (subsequence) 하나 이상을 포함한다. 이러한 실시 태양에 있어서, 당업계에 제공되거나 공지된 임의의 기술들을 이용하여 상기 펩티드 서열을 개질함으로써 본 명세서에 정의된 바와 같은 작제물을 제조한다. 상기 폴리에피토프 작제물은 70 내지 100 %, 예를 들어, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100 %의 어느 단위 정수 증분으로 천연 서열에 대한 상동성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 추가 실시 태양은 본 발명에 따른 하나 이상의 에피토프를 포함하는 항원 제시 세포이다. 상기 항원 제시 세포는 수지상 세포와 같은 "전문적" 항원 제시 세포일 수 있다. 상기 항원 제시 세포는 당업계에서 정해져 있거나 공지되어 있는 임의의 수단에 의하여 본 발명의 에피토프를 포함할 수 있다. 그러한 수단으로는, 탄도 핵산 송달과 같은 핵산 투여 또는 핵산 투여를 위한 기타 당업계에 공지된 기술(예, 핵산의 바이러스 벡터 송달 등의 벡터-계 송달)에 의하여, 하나 이상의 개개의 에피토프 또는 다중 에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드를 사용하여 수지상 세포를 펄싱(pulsing)하는 것이 있다.
본 발명에 따른 조성물의 추가 실시 태양은 본 발명의 하나 이상의 펩티드를 암호하는 핵산 또는 본 발명에 따른 폴리에피토프 펩티드를 암호하는 핵산을 포함한다. 통상의 당업자가 이해하는 바와 같이, 다양한 핵산 조성물은 유전 암호의 중복성으로 인하여 동일한 펩티드를 암호할 것이다. 이들 핵산 조성물 각각은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 이러한 실시 태양은 DNA 또는 RNA를 포함하며, 특정 실시 태양에서는 DNA 및 RNA의 조합을 포함한다. 본 발명에 따른 펩티드 또는 본 발명에 따른 임의의 기타 펩티드계 조성물을 암호할 것인 핵산을 포함하는 임의의 조성물은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 펩티드-계 형태(및 그것을 암호하는 핵산)는 당업계에 이미 공지되었거나 공지될 원리를 이용하여 생성되는 본 발명의 에피토프의 유사체를 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 현재, 유사체화에 관한 원리는 당업계에 공지되어 있고, 본 명세서에 공개되어 있다; 또한, 유사체화 원리[헤테로클리틱 유사체화 (heteroclitic analoging)]는 1999년 1월 6일에 출원되어 동시 계류 중에 있는 미국 출원 제09/226,775호에 공개되어 있다. 일반적으로 본 발명의 조성물은 분리시키거나 정제한다.
V. 실시예
본 발명은 특정 실시예를 통하여 더욱 자세하게 개시될 것이다. 하기 실시예들은 예시적인 목적으로 제공되는 것이고, 본 발명을 어떤 형태로든 제한하는 것은 아니다. 당업자들은 본 발명의 변형예를 얻기 위해 변화 또는 수정될 수 있는 각종 비 기준 변수를 쉽게 인식할 것이다.
실시예 1: HLA 클래스 I 및 클래스 II 결합 분석
HLA 분자에 결합하는 펩티드의 하기 예는 HLA 클래스 I 및 클래스 II 펩티드의 결합 친화성의 정량화를 설명한다. 결합 분석은 모티프를 지니거나 또는 모티프를 지니지 않은 펩티드로 수행할 수 있다.
개시된 프로토콜(Sidney외 다수., Current Protocols in Immunol. 31:813(1994); Sidney외 다수., J. Immunol. 154:247(1995); Sette외 다수., Mol. Immunol. 31:813(1994))에 따라 세포 용균물을 제조하고, HLA 분자를 정제하였다.또한, HLA 분자의 소스로 사용된 세포주와 세포 용균물로부터 HLA 분자의 추출을 위해 사용되는 항체도 이 간행물에 개시하였다.
이러한 세포들은 시험관 내에서 엡스테인-바 바이러스(EBV)-트랜스폼된 동형접합체 세포주, 섬유아세포, CIR, 또는 721.221-트랜스폼체를 HLA 클래스 I 분자의 소스로 사용하였다. 2 mM L-글루타민(미국 뉴욕 그랜드 아일랜드에 소재하는 기브코), 50 μM 2-ME, 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신, 100 U/ml의 페니실린(어빈 사이언티픽) 및 10% 가열 불활성화된 FCS(미국 캘리포니아주 산타 아나에 소재하는 어빈 사이언티픽)로 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하여 유지하였다. 세포는 225 ㎠ 조직 배양 플라스크에서, 또는 대용량 배양물의 경우에는 로울러 병 장치에서 성장시켰다.
세포 용균물을 다음과 같이 제조하였다. 개략적으로, 세포를 1% Nonidet P-40(스위스 부취에 소재하는 플루카 바이오케미카), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA 및 2 mM PMSF를 함유하는 pH 8.5의 50 mM 트리스-HCl중에 108세포/ml의 농도로 용균하였다. 용균물은 30 분 동안 15,000 x g로 원심 분리하여 잔해 및 핵을 제거하였다.
친화성 크로마토그래피에 의해서 용균물로부터 HLA 분자를 정제하였다. 용균물을 불활성화된 Sepharose CL4-B 및 단백질 A-Sepharose의 2 개의 예비 컬럼을 통하여 2 회 통과시켰다. 그 다음, 용균물을 적절한 항체에 결합된 Sepharose CL-4B 비이드의 컬럼상에 통과시켰다. 그 다음, 항-HLA 컬럼을 1% NP-40중의 pH 8.0인 10 컬럼 부피의 10 mM 트리스-HCL, PBS, 2 컬럼 부피의 PBS, 및 0.4% n-옥틸글루코시드를 함유하는 2 컬럼 부피의 PBS로 세척하였다. 마지막으로, MHC 분자를 pH 11.5인 0.4% n-옥틸글루코시드를 함유하는 0.15M NaCl중의 50 mM 디에틸아민으로 용리하였다. pH 6.8인 1/25 부피의 2.0 M 트리스를 용리액에 첨가하여 pH를 ~8.0으로 감소시켰다. 그 다음, Centriprep 30 농축기(미국 매사츄세스주 버버리에 소재하는 아미콘)에서 2000 rpm으로 원심 분리하여 농축하였다. BCA 단백질 분석기(미국 일리노이주 락포드에 소재하는 피얼스 케미칼 컴패니)로 단백질 함량을 평가하고, SDS-PAGE로 확인하였다.
클래스 I 및 클래스 II MHC에 대한 펩티드의 결합을 측정하는 데 사용되는 프로토콜의 상세한 설명은 문헌[Sette외 다수., Mol. Immunol. 31:813, 1994; Sidney외 다수., in Current Protocols in Immunology, Margulies, Ed., John Wiley & Sons, New York, Section 18.3, 1998]에 발표되어 있다. 개략적으로, 정제된 MHC 분자(5~500 nM)는 프로테아제 억제제 혼합용액의 존재하에서 0.05% Nonidet P-40(NP40)(또는 H-2 IA 분석용 20% w/v 디기토닌)을 포함하는 PBS중에서 각종 미표지된 펩티드 억제제 및 1-10 nM125I-방사 표지된 프로브 펩티드와 함께 48 시간 동안 배양하였다. 프로테아제 억제제(각각 미국 캘리포니아주 라졸라에 소재하는 칼바이오켐)의 최종 농도는 1 mM PMSF, 1.3 nM 1.10 펜안트롤린, 73 M 펩스타틴 A, 8 mM EDTA, 6 mM N-에틸말레이미드(클래스 II 분석용), 및 200 μM N 알파-p-토실-L-리신 클로로메틸 케톤(TLCK)이다. DRB1*0301을 pH 4.5에서 수행하고DRB1*1601(DR2w21β1) 및 DRB4*0101(DRw53)을 pH 5.0에서 수행한 것을 제외하고, 모든 분석을 pH 7.0에서 수행하였다. pH는 그밖에 문헌[Sidney외 다수., in Current Protocols in Immunology, Margulies, Ed., John Wiley & Sons, New York, Section 18.3, 1998]에 개시된 바와 같이 조절하였다.
항온처리후, 0.5% NP40 and 0.1% NaN3를 함유하는 pH6.5의 PBS를 1.2 ml/분으로 용리하는 7.8 mm x 15 ㎝ TSK200 컬럼(미국 펜실배니아주에 소재하는 몬트고머리빌레에서 시판하는 TosoHaas 16215) 상에서 겔 투과하여 유리 펩티드로부터 MHC-펩티드 복합체를 분리하였다. DRB1*1501(DR2w2β1) 분석용으로 사용되는 방사 표지된 대형 펩티드는 이러한 조건하에서 미결합된 피이크로부터 결합된 피이크를 분리를 더욱 어렵게 만들기 때문에, 0.6 ml/분으로 용리하는 7.8 mm x 30 ㎝ TSK2000 컬럼을 사용하여 모든 DRB1*1501(DR2w2β1) 분석을 실시하였다. TSK 컬럼으로부터의 용리액을 Beckman 170 방사성 동위원소 검출기에 통과시키고, Hewlett-Packard 3396A 적분기를 사용하여 방사 활성을 플롯하고, 적분하여, 결합된 펩티드의 분율을 측정하였다.
클로라민-T-방법을 사용하여, 방사 표지된 펩티드를 요오드화하였다. 각 분석에 사용된 대표적인 방사 표지된 프로브 펩티드와 이의 분석 특이성 IC50nM을 하기 표 IV 및 V에 요약하였다. 통상적으로, 예비 실험에서, 고정량의 방사 표지된펩티드의 존재하에서 각 MHC 제조물을 적정하여 총 방사 활성의 10~20%의 결합에 필요한 HLA 분자의 농도를 측정하였다. 후속되는 모든 억제 및 직접 결합 분석은 이 HLA 농도를 사용하여 수행하였다.
[표지]<[HLA] 및 IC50≥[HLA]인 조건하에 있으므로, 측정된 IC50값은 실제 KD값의 합당한 근사치였다. 펩티드 억제제는 120 ㎍/ml~1.2 ng/ml의 범위의 농도로 테스트하고, 2~4 개의 완전 독립적인 실험으로 테스트하는 것이 일반적이다. 다른 실험에서 얻은 데이터를 비교하기 위해서, 억제에 대한 양성 억제의 IC50을 각 테스트된 펩디드(통상적으로 방사 표지된 프로브 펩티드의 미표지형)에 대한 IC50으로 나누어서 각 펩티드에 대해 상대 결합값을 계산하였다. 실험 상호간의 비교를 위해 상대적인 결합값을 수집하였다. 이어서, 억제에 대한 양성 대조군의 IC50nM을 소정 펩티드의 상대 결합값으로 나누어서 이 값들을 IC50nM값으로 변환할 수 있다. 이러한 데이터 편집 방법은 다른 날에 또는 상이한 양의 정제된 MHC를 사용하여 테스트한 펩티드를 비교하는 데에 가장 정확하고 일관성을 나타냈다.
HLA-DR 정제(LB3.1)를 위해 사용되는 항체는 α-쇄 특이성이므로, β1분자는 β3(및/또는 β4및 β5) 분자로부터 분리할 수 없다. 결합 분석의 β1특이성은 DRB1*0101(DR1), DRB1*0802(DR8w2) 및 DRB1*0803(DR8w3)의 경우에는 명백하나, β3는 발현되지 않는다. 또한, DRB1*0301(DR3) 및 DRB3*0101(DR52a), DRB1*0401(DR4w4),DRB1*0404(DR4w14), DRB1*0405(DR4w15), DRB1*1101(DR5), DRB1*1201(DR5w12), DRB1*1302(DR6w19) 및 DRB1*0701(DR7)의 경우에도 증명되었다. DRB1*1501(DR2w2β1), DRB5*0101(DR2w2β2), DRB1*1601(DR2w21β1), DRB5*0201(DR5lDw21) 및 DRB4*0101(DRw53) 분석의 경우 β쇄 특이성의 문제는 섬유아세포를 사용하여 회피하였다. DRβ분자 특이성에 관한 분석의 개발 및 검증은 이미 문헌[예, Southwood외 다수., J. Immunol. 160:3363-3373, 1998]에 개시되어 있다.
상기 구체화된 바와 같은 결합 분석을 사용하여, 예를 들면 실시예 2에 개시된 바와 같은 슈퍼모티프 및/또는 모티프를 지닌 에피토프를 분석할 수 있다.
실시예 2: 보존된 HLA 슈퍼모티프 CTL 후보 에피토프의 확인
본 발명의 백신 조성물은 다중 HLA 슈퍼모티프 또는 모티프를 포함하는 다중 에피토프를 포함하여 넓은 집단 적용범위를 달성할 수 있다. 이 실시예는 이러한 백신 조성물에 포함하기 위해 슈퍼모티프를 지닌 에피토프의 확인을 예시하였다. 하기 개시된 방법을 사용하여 집단 적용범위를 계산하였다. 그 후, HLA-A2, -A3 또는 -B7 슈퍼모티프, 또는 HLA-A1 또는 -A24 모티프 지닌 에피토프를 선택하였다.
슈퍼모티프 및/또는 모티프를 지닌 에피토프의 확인을 위한 컴퓨터 조사 및 알고리즘
HLA 클래스 I 또는 클래스 II 슈퍼모티프 또는 모티프를 지닌 에피토프를 위한 컴퓨터 조사를 하기와 같이 수행하였다. 모든 문자열 조사 소프트웨어 프로그램, 예컨대, MotifSearch 1.4(미국 캘리포니아주 산디에고에 소재하는 D.Brown)를 사용하여 모든 변형된 HBV 분리 서열을 분석하여, 적절한 HLA 결합 모티프를 함유하는 잠재적인 펩티드 서열을 확인하였다; 대체 프로그램은 본 건에 개시된 모티프의 관점에서 당해 분야의 정보에 따라 또 하나의 프로그램을 쉽게 생성하였다. 또한, 이러한 계산은 지적으로 수행할 수 있다. 다항식의 알고리즘을 사용하여 확인된 A2-, A3- 및 DR-슈퍼모티프 서열을 스코어하여, 특이성 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 결합하는 이들의 능력을 예측하였다. 이 다항식의 알고리즘은 확장되고 정제된 모티프를 고려하고(즉, 다른 위치에서의 기타의 아미노산의 영향을 고려함), 일반적으로 펩티드-HLA 분자 상호작용의 전체 친화성(또는 △G)는 "△G"=a1i×a2i×a3i...×ani[여기서, aji는 n 아미노산의 펩티드의 서열을 따라 주어진 위치(i)에서 주어진 아미노산(j)의 존재의 결과를 나타내는 계수임]의 선형 다항식 함수로서 근사치가 계산될 수 있다는 전제를 기초로 하는 것이 일반적이다. 이 방법의 중대한 가정은 각 위치에서의 결과가 일반적으로 서로 독립적이라는 것이다(즉, 개개의 측쇄의 독립적인 결합). 잔기 j가 펩티드중의 위치 i에서 생성되는 경우, 펩티드의 나머지 부분의 서열에 상관없이 일정량(ji)을 펩티드의 결합의 유리 에너지에 분배하는 것으로 가정할 수 있다. 이 가정은 펩티드가 MHC에 결합되고, T 세포에 의해서 일반적으로 확장된 형태로 인식된 것을 설명하는 본 발명자들의 실험식에서 수행한 연구에 의해서 증명된다(데이터를 생략함).
구체적인 알고리즘 계수의 유도 방법은 문헌[Gulukota외 다수., J. Mol.Biol. 267:1258-126, 1997; (또한, Sidney외 다수., Human Immunol. 45:79-93, 1996; 및 Southwood외 다수., J. Immunol. 160:3363-3373, 1998을 참조)]에 개시되어 있다. 개략적으로, 앵커 및 비앵커 등의 모든 i 위치에 대해, 모든 펩티드 송달 j의 평균 상대 결합(ARB)의 기하학적 평균치를 군의 나머지에 비례하여 계산하고, ji의 평가치로서 사용하였다. 클래스 II 펩티드에 대해, 다중 정렬이 가능한 경우, 가장 높은 스코어 정렬을 이용하고, 절차를 반복 수행하였다. 테스트 셋에서 소정 펩티드의 알고리즘 스코어를 계산하기 위해서, 펩티드의 서열에 상응하는 ARB값을 곱했다. 계산값이 선택된 한계치를 초과하는 경우, 펩티드는 결합된 것으로 예측된다. 적절한 한계치는 바람직한 엄밀도의 함수로 선택하였다.
HLA-A2 슈퍼타입 교차-반응성 펩티드의 선택
20 개의 HBV 분리물에서 유래한 완전한 서열을 정렬한 후, 스캔하고, 주문제작한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 HLA-A2-슈퍼타입 주 앵커 특이성을 함유하는 보존된 9-머(9-mer) 및 10-머 서열을 확인하였다.
총 150 개의 보존된 모티프-양성 서열을 확인하였다. 그 다음, A*0201-특이성 다항식 알고리즘을 사용하여 A*0101 바람직한 제2 앵커 잔기의 존재에 대해 이들 펩티드를 평가하였다. 총 85 개의 보존된 모티프 양성 서열을 선택하고 합성하였다.
그 다음, 85 개의 보존된 모티프 함유 9-머 및 10-머 펩티드를 시험관내에서정제된 HLA-A*0201 분자를 결합하는 이들의 능력에 대해 테스트 하였다. 34 개의 펩티드는 양호한 A*0201 결합제(IC50≤500 nM)이고, 15 개의 펩티드는 고 결합제(IC50≤50 nM)이고, 19 개의 펩티드는 중간 결합제(IC50은 50~500 nM임)인 것으로 확인되었다(표 XXVI).
또한, 독립적인 분석의 과정중에, 적합한 A2-슈퍼타입 주 앵커를 지닌 25 개의 보존되는 HBV 유도된 8-머 또는 11-머 서열을 합성하고, A*0201 결합에 대해 테스트하였다. 하나의 펩티드인 HBV 엔벨로프 259 11-머(펩티드 1147.14)를 500 nM 이하의 IC50을 지닌 A*0201과 결합시키고, 하기 표 XXVI에 포함시켰다. 또한, 5.1 nM의 IC50을 지닌 A*0201을 결합하는, HBV pol 538 9-머 펩티드의 단일 치환을 나타내는 유사 펩티드를 하기 표 XXVI에 나타내었다(하기 참조).
이어서, 36 개의 A*0201 결합제중 30 개를 추가의 A2-슈퍼타입 대립유전자(A*0202, A*0203 A*0206 및 A*6802)에 결합하는 능력에 대해 테스트하였다. 하기 표 XXVI에 나타낸 바와 같이, 30 개중 15 개(50%)의 펩티드는 테스트된 5 개의 A2-슈퍼타입 대립유전자중 3 개 이상에 결합하는 A2-슈퍼타입 교차-반응성 결합제인 것으로 확인되었다. 추가의 분석을 위해 이들 15 개의 펩티드를 선택하였다.
HLA-A3 슈퍼모티프를 지닌 에피토프의 선택
또한, HLA-A3-슈퍼모티프 제1 앵커를 지닌 보존된 펩티드의 존재에 대해 동일한 20 개의 분리물에서 유래한 서열을 검사하였다. 총 80 개의 보존된 9-머 또는 10-머 모티프 함유 서열을 확인하였다. 또한, A03 및 A11 알고리즘을 이용하는분석으로 상기 알고리즘중 하나 또는 모두에서 높은 스코어를 갖는 40 개의 서열을 확인하였다. 36 개의 해당 펩티드를 합성하고, 두개의 가장 우세한 A3-슈퍼타입 대립유전자인 HLA-A*03 및 HLA-A*11에 대한 결합에 대해 테스트하였다. IC50값이 ≤500 nM이거나, 친화성을 갖는 A3 및/또는 A11을 결합한 23 개의 펩티드를 확인하였다(표 XXVII).
독립적인 일련의 연구중에, 분리물 중 75% 이상에서 보존된 30 개의 HBV-유도된 8-머 및 24 개의 11-머 서열을 선택하여, A*03 및 A*11 결합에 대해 테스트하였다. 4 개의 8-머 및 9 개의 11-머는 대립유전자의 하나 또는 모두를 결합하는 것으로 발견되었다. 마지막으로, 상기한 조사 기준을 사용하여 선택되지 않으나, A*03 및/또는 A*11을 결합하는 것으로 확인된, 보존되고 HBV-유도된 펩티드인 4 개의 9-머 및 1 개의 10-머를 확인하고, 하기 표 XXVII에 포함시켰다. 이 펩티드중 2 개(펩티드 20.0131 및 20.0130)는 비정규의 앵커를 포함하고, 다른 3 개(펩티드 1142.05, 1099.03 및 1090.15)는 알고리즘 음성이다.
이어서, A*03 및/또는 A*11을 결합하는 41 개의 펩티드중 38 개를 기타의 통상의 A3-슈퍼타입 대립유전자(A*3101, A*3301 및 A*6801)에 대한 결합 교차 반응성에 대해 테스트하였다. 이 펩티드중 17 개는 테스트된 5 개의 A3-슈퍼타입 대립유전자중 3 개 이상을 결합하는 A3-슈퍼타입 교차반응형인 것으로 확인되었다(표 XXVII).
HLA-B7 슈퍼모티프를 지닌 에피토프의 선택
동일한 20 개의 분리물을 HLA-B7 슈퍼모티프를 지닌 보존된 9-머 또는 10-머 펩티드의 존재에 대해 분석하는 경우, 46 개의 서열이 확인되었다. 해당 펩티드중 34 개를 합성하고, HLA-B*0702, 즉 가장 일반적인 B7-슈퍼타입 대립유전자에 대한 결합에 대해 테스트하였다. 9 개의 펩티드는 IC50값 ≤500 nM으로 B*0702에 결합하였다(표 XXVIII). 그 다음, 이 9 개의 펩티드를 기타의 일반적인 B7-슈퍼타입 대립유전자(B*3501, B*5301, B*51 및 B*5401)에 대한 결합에 대해 테스트하였다. 9 개의 B*0702 결합제중 5 개는 테스트된 5 개의 B7-슈퍼타입 대립유전자중 3 개 이상에 결합할 수 있었다.
B7-슈퍼타입 대립유전자의 제2 앵커 필요조건을 조사하는 별도의 연구에서, B7-슈퍼모티프를 지닌 모든 가능한 펩티드를 모든 B7 슈퍼타입 대립유전자에 대한 결합에 대해 테스트하였다. 따라서, 상기한 모든 34 개의 펩티드도 다른 B7 슈퍼타입 대립유전자에 결합에 대해 테스트하였다. 이 실험으로 3 개 이상의 대립유전자를 결합한 2 개의 펩티드를 비롯하여 IC50값이 ≤500 nM인 1 개 이상의 B7-슈퍼타입대립유전자를 결합하는 추가의 10 개의 펩티드를 확인하였다. 또한, 이 10 개의 펩티드를 하기 표 XXVIII에 나타내었다.
A2- 및 A3-슈퍼타입에 비하여, 낮은 수의 보존된 B7-슈퍼타입 축퇴 HBV-유도된 9-머 및 10-머 펩티드로 인해, 20 개의 분리물을 다시 검사하여 보존된 모티프 함유 8-머 및 11-머를 확인하였다. 이 재스캔으로 51 개의 펩티드를 확인하였다. 이 중 31 개를 합성하고, 5 개의 가장 일반적인 B7-슈퍼타입 대립유전자의 각각에 대한 결합에 대해 테스트하였다. 19 개의 8-머 및 11-머 펩티드는 1 개 이상의 B7-슈퍼타입 대립유전자(IC50≤500 nM)에 높은 정도 또는 중간 정도의 친화성으로 결합하였다(표 XXVIII). 2 개의 펩티드는 테스트된 5 개의 대립유전자중 3 개에 결합하는 축퇴성 결합제이다.
요약하면, 분석된 분리물 중 75% 이상에서 축퇴성 B7-슈퍼타입 결합제인 보존된 총 9 개의 HBV-유도된 펩티드를 확인하였다(표 XXVIII).
A1 및 A24 모티프를 지닌 에피토프의 선택
집단 적용범위를 더 증가시키기 위해서, HLA-A1 및 -A24 에피토프를 본 분석에 적용하였다. 5 개의 다른 주 인종 군(카프카스인, 미국 북부 흑인, 중국인, 일본인, 라틴 아메리카인)을 통한 집단에 대해, A1은 평균적으로 12%로 존재하고, A24는 약 29%로 존재하였다. 결합된 이 대립유전자는 이 동일한 집단에서 39%의 평균 빈도로 나타났다. A1 및 A24가 A2-, A3- 및 B7-슈퍼타입 대립유전자의 적용범위로 합쳐지는 경우, 주 인종군을 통한 총 적용범위는 >95.4%인 반면, A2-, A3- 및B7-슈퍼타입의 결합에 의한 적용범위는 86.2%이다.
A1 및 A24 결합제에 대한 HBV의 분류 분석은 아직 완료되지 않았다. 그러나, 독립적인 연구중에, 15 개의 보존되고 HBV-유도된 펩티드는 IC50500 nM 미만으로 A*0101을 결합하고; 이들중 7 개는 IC50100 nM 미만으로 결합하는 것으로 확인되었다. 유사한 방법으로, HBV-유도된 펩티드를 결합하는 14 개의 보존된 A*2402도 확인하고, 이들중 6 개는 IC50100 nM 미만으로 A*2404에 결합하였다(표 XXIX).
실시예 3: 면역원성의 확인
A * 0201 면역원성의 평가
상기 확인된 15 개의 HBV-유도된 HLA-A2 슈퍼타입 교차 반응성 펩티드의 면역원성 분석을 하기 표 XXX에 개략하였다. 펩티드를 3 개의 시스템중 1 개 이상에서 면역원성에 대해 스크리닝하였다. 인간 PBMC(Wentworth외 다수., Molec. Immunol. 32:603, 1995)를 사용하여 시험관내에서 제1 항원 특이성 CTL의 유도에 대해 펩티드를 스크리닝하고, 이 데이터는 하기 표 XXX에서 "제1 CTL"로 표시하였다.
인간 PBMC에서 유래한 제1 항원 특이성 CTL의 시험관내 유도를 위한 프로토콜은 Wentworth외 다수의 문헌[Wentworth외 다수., Molec. Immunol. 32:603, 1995]에 개시되었다. CD8+T 세포가 풍부한 정상 공여자로부터 취한 PBMC를 IL-7의 존재하에 펩티드 로딩된 항원 제시 세포(SAC-I 활성화된 PBMC)와 함께 배양하였다. 7일후, 펩티드로 자극한 조사된 자가 부착성 세포를 사용하여 배양물을 재자극한 후, 7일후, 세포 독성 활성에 대해 테스트하였다.
또한, HLA 트랜스제닉 마우스를 사용하여 펩티드 면역원성을 평가하였다. 이 데이터를 하기 표 XXX에서 "트랜스제닉 CTL"로 표시하였다. 이전 연구를 통해 A*0201/Kb 트랜스제닉 마우스에서 유도된 CTL은 인간에서 유도된 CTL에 유사한 특이성을 나타내는 것으로 확인되었다(Vitiello외 다수., J. Exp. Med. 173:1007,1991; Wentworth외 다수., Eur. J. Immunol. 26:97, 1996).
트랜스제닉 마우스에서 CTL 유도 후의 펩티드 면역은 Vitiello외 다수(Vitiello외 다수., J. Exp. Med. 173:1007, 1991) 및 Alexander외 다수(Alexander외 다수., J. Immunol. 159:4753, 1997)에 개시되어 있다. 개략적으로, 합성 펩티드(50 ㎍/마우스) 및 헬퍼 에피토프 HBV 코어 128(140 ㎍/마우스)을 프레운트 불완전 아쥬반트(IFA)에 에멀션화하고, 꼬리의 베이스에 피하 주사하였다. 주사한 후 11일 후, 펩티드 로딩된 신게닉(Syngenic) LPS 블라스트(blast)의 존재하에서 비세포(splenocyte)를 배양하였다. 6일 후에, 펩티드 자극된 표적을 사용하여 배양물을 세포 독성 활성에 대해 분석하였다.
또한, 펩티드를 급성 감염된 HBV 환자(Bertoni외 다수., J. Clin. Invest. 100:503, 1997; Rehermann외 다수., J Clin. Invest. 97:1655-1665,1996; Nayersina외 다수., J. Immunol. 150:4659, 1993)에서의 소생 CTL 반응을 자극하는성능에 대해 테스트하고, 이 데이터를 하기 표 XXX에서 "환자 CTL"로 표시하였다. 환자의 면역원성 데이터는 천연 감염의 과정 동안 펩티드가 인식하는 것을 나타내는 것과 같이 특별한 정보를 제공한다. 이 데이터들은 펩티드가 CTL에 대한 표적을 나타내는 인간 세포내에서 프로세싱되고 제시되는 것을 증명한다. 또한, 이 데이터는 백신 디자인에 특히 관련이 많은데, 그 이유는 환자에서 CTL 반응의 유도는 감염의 해소와 상관 관계가 있기 때문이다.
소생 CTL 반응의 평가를 위해, Bertoni외 다수(Bertoni외 다수., J. Clin. Invest. 100:503,1997)에 개시된 바와 같이 스크리닝을 수행하였다. 개략적으로, HBV로 급성 감염된 환자에서 유래한 PBMC를 10 ㎍/ml의 합성 펩티드의 존재하에 배양하였다. 7일후, 배양물을 펩티드로 재자극하였다. 14일째에 펩티드로 자극된 표적 세포를 사용하여, 배양물을 세포 독성 활성에 대해 분석하였다.
15 개의 A2 슈퍼타입 결합 펩티드중 11 개는 이용된 시스템중 1 개 이상에서 면역원성인 것으로 밝혀졌다. 11 개의 펩티드중 5 개는 급성 HBV를 지닌 환자에서 이미 확인되었다(Bertoni외 다수., J. Clin. Invest. 100:503, 1997). 5 개의 추가의 축퇴성 펩티드(1069.06, 1090.77, 1147.14, 927.42 및 927.46)는 HLA-A*0201 트랜스제닉 마우스에서 CTL 반응을 유도하였다. 3 개의 HBV 항원, 즉 코어, 엔벨로프 및 폴리머라아제에 의해서 11 개의 면역원성 슈퍼타입 교차-반응성 펩티드가 암호화되었다.
11 개의 면역원성의 A2-슈퍼모티프를 지닌 에피토프의 이 세트는 하나의 유사체 펩티드, 즉 1090.77을 포함한다. 이 유사체가 유도되는 야생형 펩티드 1090.14는 A2-슈퍼타입 비교차-반응성이나, 급성 HBV 환자로부터의 소생 CTL반응에서 인식되고, 제1 인간 배양물 뿐 아니라 HLA-A*0201 트랜스제닉 마우스에서 면역원성인 것으로 나타났다(표 XXX). 야생형 1090.14 및 1090.77 유사체의 상호 인식을 나타내는 추가의 연구는 하기에 상세히 개시된다.
독립적인 분석의 과정중에, 1090.14를 비롯한 하기 표 XXXb에 나타낸 비교차 반응성 펩티드중 14 개의 펩티드는 1 이상의 시스템에서 면역원성인 것으로 밝혀졌다. 이 펩티드중 5 개의 펩티드는 환자에서 인식되고, 4 개의 펩티드는 트랜스제닉 마우스에서 CTL을 유도하였다.
결론적으로, 11 개의 A2-슈퍼타입 교차 반응성 펩티드는 검사된 3 개의 시스템중 1 개 이상에서 면역원성을 나타낼 수 있는 것으로 확인되었다.
A * 03/A11 면역원성의 평가
17 개의 A3-슈퍼타입 교차 반응성 펩티드중 7 개를 면역원성에 대해 평가하였다(표 XXXI). 이전 절에 기술한 바와 같이, 제1 배양물, 환자 반응 또는 HLA-A11 트랜스제닉 마우스(Alexander외 다수., J. Immunol. 159:4753, 1997)를 사용하여 A3-슈퍼모티프를 지닌 펩티드를 스크리닝하였다. 펩티드 1.0219를 제외하고, 표 XXXI에 제시된 보존된 교차-반응성 펩티드 모두는 면역원성인 것으로 확인되었다.
추가로, 교차 반응성 슈퍼타입 결합을 나타내는 불량하게 보존된 펩티드(1150.51; 40% 보존됨)는 트랜스제닉 마우스에서 면역원성인 것으로 밝혀지고, 하기 표 XXXI에 포함시켰다. 보존되나 비교차 반응성인 2 개의 다른 펩디드도 또한 급성 감염된 HBV 환자에서 인식되는 것으로 나타났다(Bertoni외 다수., J. Clin. Invest. 100:503, 1997). 이 에피토프는 하기 표 XXXI에 나타내었다.
모두 6 개의 교차 반응성 펩티드를 비롯한 8 개의 보존된 면역원성 HBV-유도된 A3-슈퍼모티프를 지닌 에피토프중 7 개에 대해, 환자에서 양성 데이터를 얻었다는 것은 주목할만 하다. 이 에피토프들은 코어 단백질 서열로부터 유도된 단지 하나의 에피토프를 지닌 폴리머라아제 단백질 서열로부터 우세하게 유도된다. 다수의 교차 반응성 펩티드는 X 항원(표 XXXI)에서 확인되지만, 지금까지 이 펩티드는 면역원성에 대해 스크리닝되지 않았다.
요약하면, 7 개의 A3-슈퍼모티프를 지닌 교차 반응성 펩티드는 급성 감염 환자에서 CTL에 의해 인식되거나 HLA-트랜스제닉 마우스에서 CTL을 유도하는 것으로 확인되었다.
B7 면역원성의 평가
HBV-유도된 HLA-B7-슈퍼모티프를 지닌 교차 반응성 펩티드에 관련된 면역원성 연구는 하기 표 XXXII에 개략하였다. HLA-B7 펩티드는 전적으로 제1 배양물 또는 급성 감염된 HBV 환자에서 반응을 측정하는 인간 시스템에서 스크리닝하였다. 스크리닝된 7 개의 축퇴성 펩티드중 4 개는 면역원성을 나타내었다. 또한, 하나의 비교차 반응성 펩티드(XRN<3), 즉 1147.04는 급성 감염된 HBV 환자에서 인식되는 것으로 나타났다(Bertoni외 다수., J. Clin. Invest. 100:503, 1997; 표 XXXII 참조).
요약하면, 급성 감염 HBV 환자에서 인식되는 5 개이 보존된 HBV-유도된 B7-슈퍼모티프를 지닌 에피토프를 확인하였다. 이 에피토프는 4 개의 다른 HBV 항원(코어, 엔벨로프, 폴리머라아제 및 X)의 적용 범위를 제공하였다.
실시예 4: 유사체의 생성에 의한 천연 펩티드의 결합능을 개선하기 위한 확장된 슈퍼모티프의 실행
HLA 모티프 및 슈퍼모티프(제1 및/또는 제2 잔기를 포함함)는 본 명세서에 개시된 바와 같이 매우 교차 반응성인 천연 펩티드를 제조하는 데에 유용하다. 또한, HAL 모티프 및 슈퍼모티프의 제한은 펩티드에게 임의의 특성, 예를 들어 슈퍼타입을 구성하는 HLA 분자 군내의 더 큰 교차반응성 및/또는 이들 HLA 분자 전부 또는 일부에 대한 더 큰 결합 친환성을 부여하기 위해 유사체화되거나 또는 "고정"될 수 있는 천연 펩티드 서열 내에서 잔기를 확인함으로써 매우 교차반응성인 에피토프를 조작하는 것을 가능하게 해준다.
제1 앵커 잔기에서의 유사체화(analoging)
클래스 I 펩티드 리간드는 개질되거나 "고정"되어서 이들의 결합 친화성 및/또는 축퇴성을 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다(Sidney외 다수., J. Immunol. 157:3480, 1996). 또한, 이 고정된 펩티드는 야생형 에피토프에 대해 특이적인 T 세포에 의해 교차 반응성 인식 및 증가된 면역원성을 증명할 수 있다(Parkhurst외 다수., J. Immunol. 157:2539, 1996; Pogue외 다수., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8166, 1995). 구체적으로, A2 슈퍼타입 펩티드의 주 앵커는 위치 2에서는 L 또는 V에, 그리고 C-말단에서는 V에 "고정"되거나 유사체화될 수 있다. 하기 표 XXVI에 표시된 바와 같이, 14 개의 A2-슈퍼타입 교차 반응성 결합 펩티드중 9 개는 이 기준에 의해서 "고정"될 수 있고, 21 개의 비교차 반응성 결합제중 16 개도 동일하다. 고정을 위한 이상적인 후보는 IC50≤5000 nM으로 3 개 이상의 A2-슈퍼타입 대립유전자-특이성 분자를 결합하는 펩티드일 것이다.
더욱 넓은 교차 반응성 에피토프를 발생시키기 위한 이 방법의 효능의 예는 펩티드 1090.14의 경우 제공된다(표 XXVI). 이전에, 이 펩티드는 검사된 각각의 시스템에서 매우 면역원성인 것으로 나타났다. 그러나, 이것은 단일 A2-슈퍼타입 대립유전자 특이성 분자, A*0201에 대한 결합만을 나타낸다. 이 에피토프의 비교차 반응성 결합능은 집단 적용범위를 제한하므로, 후보 백신에서 이 펩티드를 포함하는 값을 제한한다. 결합 친화성 및 교차 반응성을 증가시키기 위해, 펩티드 1090.14의 C-말단을 '알라닌'에서부터 A2-슈퍼모티프 바람직한 잔기 '발린'으로 변경하였다. 이 변경으로 인해 A*0201(200 nM~5.1 nM)에 대한 결합능에서 극적인(40배) 증가를 나타내었으나, 또한 3 개의 다른 A2-슈퍼타입 대립유전자 특이성 분자로 결합할 수 있는 펩티드를 생성하였다(펩티드 1090.77 참고, 표 XXVI)
HLA-A*0201 트랜스제닉 마우스의 연구는 1090.77로 면역화된 마우스로부터의 CTL 반응은 천연 발생 펩티드 1090.14 또는 발린 치환된 유사체(즉, 1090.77)로 로딩된 표적 세포를 인식하는 것으로 나타났다. 실제로, 유사체 또는 야생형 서열이 표적 세포를 로딩하는데에 사용됨에도 불구하고, CTL을 유도하는 1090.77에 의해이루어지는 세포의 용해는 구별할 수 없었다.(B. Livingston, 미공개된 데이터).
백신 구성물의 디자인에 대한 이 관찰의 타당성은 만성 HBV 환자를 강력한 바이러스 복사 억제제인 라미부딘(lamivudine)으로 처리하는 연구에 의해 나타난다. 라미부딘을 이용하는 확장된 치료는 1090.14 에피토프내의 위치 2에서 메티온이 발린으로 치환된 HBV의 약물 내성 균주의 선택으로 귀결되는데, 이는 라미부딘과 에피토프계 백신의 병용은 야생형 서열과 돌연변이 서열 모두를 인식하는 CTL 반응을 유도하는 능력을 가질 필요가 있음을 의미한다.
천연 펩티드(1090.14), 유사체 펩티드 및 라미부딘 유도된 돌연변이 M2 펩티드 사이에서 상호 인식이 가능하다는 것을 증명하기 위해서, 1090.77 유사체 펩티드를 사용하여 CTL을 발생시켰다. 그 다음, 이 CTL 배양물을 야생형 펩티드(1090.14) 또는 라미부딘 유도된 돌연변이 M2 펩티드로 자극하였다. 그 다음, 야생형 펩티드(1090.14) 또는 라미부딘 유도된 돌연변이 펩티드로 로딩된 표적 세포를 용균하는 이 CTL의 능력을 분석하였다. 펩티드를 제공하는 표적 세포는 CTL 배양물에 의해 유사하게 용균된다(표 XXVI).
이 연구는 펩티드를 유사체화하여 극적으로 증가된 HLA-A2 슈퍼타입 축퇴성을 생성할 수 있으나, 여전히 야생형 및 돌연변이 에피토프 사이에서 상호 인식될 수 있는 지를 증명한다. 더욱 구체적으로, 이 결과는 유사체 펩티드 1090.77을 이용하는 백신이 반응을 자극하여 HBV의 야생형 및 라미부딘 내성 균주를 인식할 것이라는 것을 나타낸다.
유사하게도, HLA-A3 슈퍼모티프를 지닌 에피토프의 유사체도 또한 발생될 수있다. 예를 들면, 펩티드를 유사체화하여 위치 2에서는 바람직한 V를, 그리고 C-말단에서는 R 또는 K를 지닐 수 있다. 하기 표 XXVII에서 확인된 12 개의 A3-슈퍼타입 축퇴성 펩티드는 주 앵커 고정을 위한 후보이며, 24 개의 비교차 반응성 결합제중 19 개도 동일하다.
A*03 및 A*11에 대한 결합에 대해 유사체 펩티드를 초기 테스트하고, 그 다음 초기 펩티드에 비하여 결합 특성이 동일하거나 향상된 것으로 나타내는 것들을 A3-슈퍼타입 교차 반응성에 대해 테스트하였다. 그 다음, 향상된 교차 반응성을 나타내는 유사체를 필요한 경우 면역원성에 대해 더 평가하였다.
통상적으로, B7 슈퍼모티프를 지닌 에피토프를 확인하는 것은 더욱 곤란하다. A2- 및 A3-슈퍼타입 에피토프의 경우에서와 같이, 펩티드 유사체화 방법을 이용하여 교차 반응성 결합이 증가된 추가의 B7 슈퍼모티프를 지닌 에피토프를 생성할 수 있다. 일반적으로, B7 슈퍼모티프를 지닌 펩티드를 고정하여 위치 2에서는 P를, 그리고 C-말단에서는 I를 지니게 하여야 한다.
2 개의 다른 B7형 펩티드의 C-말단에서 I 잔기로 치환된 제1 앵커 단일 아미노산을 나타내는 유사체(HBV 엔벨로프 313 및 HBV pol 541)를 합성하고, 이들의 B7-슈퍼타입 결합능에 대해 테스트하였다. 상기 2가지 경우에서, I 치환은 결합 친화성 및/또는 교차 반응성에 대해서 전체적으로 긍정적인 효과를 갖는 것으로 나타났다. HBV 엔벨로프 313의 경우에, I9(C-말단 위치 9에서의 I) 치환은 거의 400배 증가한 B*5401 결합 친화성에 의해서 결합된 4~5 대립유전자의 교차 반응성을 증가시키는 데에 효과적이다. HBV pol 541의 경우에, 증가된 교차반응성은 B*5401 결합의 실질적인 증가에 의해서 유사하게 달성되었다. 또한, B*0702, B51 및 B*5301에 대한 결합 친화성에서 유의적인 이득은 HBV pol 541 I9 유사체를 이용해도 관찰된다.
제2 앵커 잔기에서의 유사체화
또한, HLA 슈퍼모티프는 이러한 교차 반응 특성과 관련된 제2 앵커 위치에서의 특정한 잔기를 확인하여 매우 교차 반응성인 펩티드를 조작하는 데 중요하다. 위치 1에서 신중한 단일 아미노산 치환을 나타내는 펩티드의 제2 세트의 능력을 입증하기 위해서, 5 개의 다른 B7-슈퍼타입 결합 펩티드중 3 개를 합성하고, 이들의 B7-슈퍼타입 결합능에 대해 테스트하였다. 4/4 경우에, 위치 1에서 천연 잔기를 방향족 잔기 F로 치환("F1" 치환)하는 효과는 초기 펩티드에 비하여 교차 반응성을 증가시키며, 대부분의 경우에, 결합 친화성은 3배 이상 증가하였다(표 XXVIII). 더욱 구체적으로, F1 치환 유사체를 사용하여 HBV 엔벨로프 313, MAGE2 170 및 HBV 코어 168에 대해 완전한 슈퍼타입 교차 반응성을 얻었다. 이 이득은 B*5401 결합 친화성을 극적으로 증가시킴으로써 달성된다. 또한, 친화성에서의 이득은 HBV 코어 168(B*3501 및 B*5301) 및 MAGE2 170(B*3501, B51 및 B*5301)의 경우에 다른 대립유전자에 대해서 주목된다. 마지막으로, MAGE3 196의 경우에, F1 치환은 B7*0702 결합에서의 이득 때문에, 교차 반응성을 증가시키는 데에 효과적이다. B51 결합능에서거의 70배 증가한 것도 또한 주목된다.
또한, 위치 3에서 슈퍼모티프 양성 F 치환("F3" 치환)을 사용하여 2 개의 유사체를 제조하였다. 이 2 개의 실시 태양에서, 결합 친화성 및 교차 반응성의 증가를 달성하였다. 구체적으로, HBV pol 541의 경우에서, F3 치환은 B*5401 결합에 대한 이것의 효과에 의해서, 교차 반응성을 증가시키는 데에 효과적이다. MAGE3 196의 경우에, B*0702 및 B*3501 결합능을 증가시켜서 완전한 슈퍼타입 교차 반응성이 획득되었다. 또한, MAGE3 196의 경우에, B*3501, B51, B*5301 및 B*5401에 대해 40배 내지 5000배 사이의 결합능 증가를 얻을 수 있다는 것은 주목할 만하다.
결론적으로, 이 데이터는 단일 아미노산 치환을 사용하여, HLA 슈퍼타입 분자에 대한 펩티드 리간드의 교차 반응성 및/또는 결합 친화성을 증가시킬 수 있는 것을 나타낸다.
실시예 5: HLA-DR 결합 모티프를 지닌 보존된 HBV-유도된 서열의 확인
HLA 클래스 II 슈퍼모티프 또는 모티프를 지닌 펩티드 에피토프는 또한 하기 구체화된 바와 같이 실시예 1-3에 개시된 것과 유사한 방법론을 사용하여 확인될 수 있다.
HLA-DR-슈퍼모티프를 지닌 에피토프의 선택
HLA 클래스 II 분자는 일반적으로 길이가 12~20 개의 잔기인 펩티드와 결합한다. 그러나, HLA-클래스 I과 유사하게도 상호 작용의 특이성 및 에너지는 약 9 개의 잔기의 짧은 코어 영역내에 포함된다. 대부분의 DR 분자는 위치 1(P1)에서 소수성 잔기가 주 앵커인 9-머내에서 중첩 특이성을 공유한다(O'Sullivan외 다수., J. Immunol. 147:2663, 1991; Southwood외 다수., J. Immunol. 160:3363, 1998). 또한, 위치 6(P6)에서 소형 또는 소수성인 잔기의 존재는 대부분의 DR-펩티드 상호작용을 위해 중요하다. 9-머 코어 영역내에서의 이 중첩 P1-P6 특이성은 DR-슈퍼모티프로서 정의된다. 클래스 I 분자와는 달라, DR 분자는 결합 홈의 양 단부에서 개방되므로, 가변 길이의 더 긴 펩티드를 수용할 수 있다. 실제로, 펩티드-DR 상호작용의 대부분의 에너지는 코어 영역에 기인하는 것으로 생각되지만, 측면 잔기는 고 친화성 상호작용을 위해 중요한 것으로 생각된다. 또한, MHC 결합에 대해 꼭 필요하지 않을지라도, 측면 잔기는 대부분의 경우 T 세포 인식을 위해 필요하다.
HBV-유도된 DR 교차 반응성 HTL 에피토프를 확인하기 위해서, HLA 클래스 I 모티프 서열의 확인을 위해 스캔된 동일한 20 개의 HBV 폴리프로테인을 결합 HLA-DR을 위한 모티프를 지닌 서열의 존재에 대해 스캔하였다. 구체적으로, 9-머를 함유하는 DR-슈퍼모티프와 3 개의 잔기 N- 및 C-말단 측면 영역으로 구성되는 15-머 서열을 선택하였다. 또한, 15-머 서열의 100%는 스캔된 HBV 균주의 85%(17/20) 이상이 보존될 필요가 있다. 이러한 기준을 사용하여, 36 개의 미중복 서열을 확인하였다. 이후에, 35 개의 펩티드를 합성하였다.
또한, 펩티드가 DR 분자에 결합하는 것을 예측하기 위한 알고리즘도 개발되어 왔다(Southwood외 다수., J. Immunol. 160:3363, 1998). 개별 DR 분자에 대해 구체적인 이 알고리즘들은 9-머 코어 영역의 스코어링 및 랭킹을 가능하게 한다. 선택 표를 사용하여, 이 알고리즘이 적절한 DR 분자의 결합에 높은 확률을 갖는 펩티드 서열을 효과적으로 선택하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 알고리즘, 구체적으로 DR1, DR4w4 및 DR7에 대한 알고리즘을 구동하여 DR 교차 반응성 펩티드를 효과적으로 선택할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
이 알고리즘이 추가의 펩티드를 확인하는지 알아보기 위해, 상기 사용된 동일한 HBV 폴리프로테인을 100%의 9-머 코어 영역이385%(17/20 균주) 보존된 15-머 펩티드의 존재에 대해 재스캔하였다. 그 다음, DR1, DR4w4 및 DR7 알고리즘을 사용하여 이 펩티드의 각각의 9-머 코어 영역을 스코어링하였다. 결과로서, 8 개의 추가의 서열을 확인하고 합성하였다.
요약하면, 9-머 코어 영역이 DR 슈퍼모티프를 포함하거나, DR-결합 서열 예견하는 알고리즘을 사용하여 선택된 44 개의 15-머 펩티드를 확인하였다. 이 펩티드중 43 개를 합성하였다(표 XXXIII).
또한, 상술된 HBV-유도된 펩티드의 분석을 수행하는 동안, 이들의 DR1, DR4w4 및 DR7 알고리즘 프로필을 기초로 DR-교차-반응성 결합 펩티드일 것으로 예견되나, 80%만 보존된 9-머 코어 영역을 갖는 9 개의 펩티드를 확인하였다. 95% 보존되나, N-말단으로부터 제거된 하나의 잔기에만 위치된 DR-슈퍼모티프 코어 영역을 포함하는 추가의 펩티드를 미리 합성하였다. 또한, 이 10 개의 펩티드를 추가의 분석을 위해 선택하고, 하기표 XXXIII에 나타내었다.
마지막으로, 상기 선택된 펩티드(27.0280)로 중복된 2 개의 펩티드, CF-08 및 1186.25를 추가의 분석에 대해 고려하였다. 펩티드 1186.25는 다중 DR-슈퍼모티프 서열을 포함한다. 펩티드 CF-08은 27.0280 및 1186.25을 중첩시킨 20-머다. 이 펩티드들을 하기 표 XXXIII에 나타내었다.
상기 확인된 55 개의 HBV-유도된 펩티드를 통상의 HLA-DR 대립유전자를 결합하는 이들의 능력에 대해 테스트하였다. 집단 적용범위와, 대부분의 DR 대립유전자의 결합 레퍼토리들 사이의 관계를 최소화하기 위해서(예, Southwood외 다수., J. Immunol. 160:3363, 1998), 펩티드를 DR 분석의 순차 패널에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 이 스크린 패널의 조성과 관련된 항원의 표현형 빈도(frequency)를 하기 표 XXXIV에 나타내었다. 모든 펩티드를 제1 패널에서 대립유전자(DR1, DR4w4 및 DR7)에 대한 결합에 대해 초기 테스트하였다. 그 다음, 3 개의 대립유전자중 2 개 이상을 결합하는 펩티드만을 제2 분석(DR2w2 β1, DR2w2 β2, DR6wβ1및 DR9)에서 결합에 대해 테스트하였다. 마지막으로, 4 개의 제2 패널 대립유전자중 2 개 이상을 결합하는 펩티드, 즉 총 7 개의 대립유전자중 4 개만을 삼차 분석(DR4w15, DR5w11, 및 DR8w2)에서 결합에 대해 스크리닝하였다.
테스트중에, 최초의 55 개 펩티드중 25 개는 2 개 이상의 제2 패널 대립유전자를 결합하는 것으로 확인되었다. 이 25 개의 펩티드를 제2 분석에서 연속적으로 테스트하는 경우, 20 개는 제1 및 제2 분석 패널에서의 7 개의 DR 대립유전자중 4 개 이상을 결합하는 것으로 나타났다. 마지막으로, 제2 스크린 상을 통과하는 20 개의 펩티드중 18 개를 삼차 분석에서 결합에 대해 테스트하였다. 결과적으로, 12 개의 펩티드가 10 개의 통상의 HLA-DR 대립유전자중 7 개 이상을 결합하는 것으로나타났다. 이 12 개의 펩티드의 서열과 삼차 패널을 통한 첫번째 각 분석에 대한 이들의 결합능을 하기 표 XXXV에 나타내었다. 또한, 펩티드 CF-08 및 857.02는 지금까지 각각 테스트한 대립유전자의 5/5 및 5/6를 결합하는 것으로 나타났다.
요약하면, HBV 게놈의 12 개의 독립 영역으로부터 유도된 14 개의 펩티드는 다중 HLA-DR 대립유전자를 결합할 수 있는 것으로 확인되었다. 펩티드의 이 세트는 각각 코어(Nuc), 폴(pol) 및 엔벨로프(Env) 항소스로부터 2 개 이상의 에피토프를 포함한다.
보존된 DR3 모티프 펩티드의 선택
HLA-DR3은 백인, 흑인 및 라틴 아메리카인에서 우세한 대립유전자가기 때문에, DR3 결합능은 HTL 에피토프의 선택에서 중요한 기준이다. 그러나, 기존에 발생된 데이터에서는 DR3만이 기타의 DR 대립유전자과 교차 반응하는 것으로 나타났었다(Sidney외 다수., J. Inimunol. 149: 2634-2640,1992; Geluk외 다수., J. Immunol. 152: 5742-5748,1994; Southwood외 다수., J. Immunol. 160: 3363-3373,1998). 이것은 DR3 펩티드 결합 모티프가 대부분의 기타의 DR 대립유전자의 특이성과 다르게 나타나는 것은 전혀 놀랍지 않다.
DR3을 결합하는 펩티드를 효과적으로 확인하기 위해서, 표적 단백질은 Geluk등[J. Immunol. 152: 5742-5748, 1994]에 의해 보고된 2 개의 DR3 특이성 결합 모티프중 하나를 보유하는 보존된 서열에 대해 분석하였다. 18 개의 서열을 확인하였다. 이들 서열중 8 개는 하기 표 XXXVI에 나타낸 펩티드와 크게 중복되었고, 3 개는 기타의 연구를 위해 이미 합성된 펩티드와 중복되었다. 7 개의 독특한 서열을합성하였다.
DR3 모티프를 함유하는 18 개의 펩티드중 17 개를 그들의 DR3 결합능에 대해 테스트하였다. 4 개의 펩티드는 1000 nM 또는 그 이상의 친화성으로 DR3를 결합하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 6: HPV-유도된 HTL 에피토프의 면역원성
본 실시예는 실시예 5의 방법론을 사용하여 확인된 것들 중에, 면역원성 DR 슈퍼모티프- 및 DR3 모티프를 지닌 에피토프를 결정한다.
HTL 반응을 자극할 수 있는 능력을 평가하거나, 및/또는 적절한 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여, CTL 에피토프의 면역원성의 결정과 유사한 방법으로 HTL 에피토프의 면역원성을 평가하였다. 면역원성은 1) 정상 PBMC를 사용하는 시험관내 제1 유도, 또는 2) 암 환자 PBMC로부터의 소생 반응을 스크리닝하여 결정하였다.
실시예 7: 집단 적용범위의 폭을 결정하기 위한 각종 인종 배경에서 HLA-슈퍼타입의 표현형 빈도의 계산
본 실시예는 다중 슈퍼모티프 및/또는 모티프를 포함하는 다중 에피토프로 구성된 백신 조성물의 집단 적용범위의 폭의 평가를 예시한다.
집단 적용범위를 분석하기 위하여, HLA 대립유전자의 유전자 빈도를 측정하였다. 각 HLA 대립유전자에 대한 유전자 빈도는 항원 또는 대립유전자 빈도로부터 분배 다항식 gf=1-(SQRT(1-af))을 사용하여 계산하였다(예컨대, Sidney외 다수., Human Immunol. 45:79-93, 1996 참조). 전체 표현형 빈도를 얻기 위해서, 누적 유전자 빈도를 계산하고, 역 다항식 [af=1-(1-Cgf)2]을 이용하여 누적 항원 빈도를 유도하였다.
빈도 데이터가 DNA 타이핑의 레벨에서 이용할 수 없는 경우, 혈청학적으로 제한되는 항체 빈도에 해당하는 것으로 가정하였다. 총 잠재적인 슈퍼타입 집단 적용범위를 얻기 위해서, 연관 불균형은 가정하지 않았으며, 각각의 슈퍼타입에 속하는 것으로 확인된 대립유전자만을 포함시켰다(최소 평가). 고려된 B 대립유전자(예, 총량=A+B*(1-A))에 의해서 커버될 것으로 예상되는 비-A 커버된 집단의 비율을 A 적용범위에 추가하여 내부 유전자 좌 조합에 의해서 획득되는 총 잠재적인 적용범위를 평가한다. A3형 슈퍼타입의 확인된 구성원은 A3, A11, A31, A*3301 및 A*6801이다. A3형 슈퍼타입이 잠재적으로 A34, A66 및 A*7401을 포함할 수 있지만, 이들 대립유전자들은 전체 빈도 계산에 포함시키지 않았다. 마찬가지로, A2형 슈퍼타입 부류의 확인된 구성원은 A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206, A*0207, A*6802 및 A*6901이다. 마지막으로, B7형 슈퍼타입 확인된 대립유전자는 B7, B*3501-03, B51, B*5301, B*5401, B*5501-2, B*5601, B*6701 및 B*7801(또한, 잠재적으로는 B*1401, B*3504-06, B*4201 및 B*5602)이다. A2-, A3- 및 B7-슈퍼타입을 결합시켜 달성되는 집단 적용범위는 5 개의 주 인종 군(하기 표 XXI 참조)에서 약 86%이다. 적용범위는 A1 및 A24 모티프를 지니는 펩티드를 포함하여서 확장될 수있다. 평균적으로, 5 개의 주 인종 군(카프카스인, 미국 북부 흑인, 중국인, 일본인, 라틴 아메리카인)에 걸쳐서 A1은 집단의 12%로 존재하고, A24는 집단의 29%로 존재한다. 함께, 이 대립유전자는 동일한 인종 집단에서 39%의 평균 빈도로 나타난다. A1 및 A24가 A2-, A3- 및 B7-슈퍼타입 대립유전자의 범위와 연합되는 경우, 주 인종들에 걸쳐 총 적용범위는 >95%이다.
HLA 클래스 II 분자에 대한 집단 적용범위는 본 원을 기초로 유사하게 향상시킬 수 있다.
후보 HLA 클래스 I 및 클래스 II 에피토프의 개요
요약하면, 상기 제시된 데이터를 기초로 하여 백신 후보로서 34 개의 보존된 CTL 에피토프를 선택하였다(표 XXXVII). 이 34 개의 에피토프중 7 개는 코어로부터 유도하고, 18 개는 폴리머라아제로부터 유도하고, 9 개는 엔벨로프로부터 유도하였다. 이 단백질은 소량으로 발현되어 면역학적으로 중요성이 떨어지기 때문에, X 항원으로부터의 에피토프는 패키지에 포함시키지 않았다.
CTL 에피토프의 이러한 패널에 의해서 제공된 집단 적용범위는 5 개의 주 인종 집단의 각각에서 95%를 초과하는 것으로 평가된다. 몬테 카를로(Monte Carlo) 분석(도 1)을 사용하여, 백인, 북미 흑인, 일본인, 중국인, 라틴 아메리카인으로 구성된 집단에서 약 90%의 개인이 백신 후보 에피토프들중 5 개 이상을 인식하는 것으로 예견된다.
바람직한 CTL 에피토프는 34 개의 분리된 펩티드를 포함하지만, 2 개의 펩티드는 더욱 긴 펩티드내에 전체적으로 중첩되므로, 백신 후보에서 포함되어야 하는펩티드의 수를 감소시킨다. 구체적으로, A2-제한된 펩티드 927.15는 B7-제한된 펩티드 26.0570내로 중첩되고, B7-제한된 펩티드 988.05는 A2-제한된 펩티드 924.07내로 중첩된다. 유사하게도, A24-제한된 펩티드 20.0136 및 A2-제한된 펩티드 1013.01은 오직 제1 아미노산에서 다른 동일한 코어 아미노산을 포함한다. 관련 주에서, A2-제한된 펩티드 1090.14 및 B7-제한된 펩티드 1147.05는 2 개의 아미노산에 의해 중첩되어, 이 2 개의 에피토프를 하나의 인접하는 펩티드 서열로서 송달할 가능성을 증가시킨다.
펩티드의 세트는 9 개의 A2-제한된 CTL 에피토프(4 개의 폴리머라아제-유도된 에피토프, 4 개의 엔벨로프-유도된 에피토프 및 하나의 코어 에피토프)를 포함한다. 이 9 개의 펩티드중 7 개는 급성 환자로부터의 소생 CTL 분석에서 인식된다. 환자에서 인식된 7 개의 펩티드중 2 개는 비 교차 반응성 결합 펩티드이다. 잠재적인 백신 후보로서의 이들 펩티드의 포함은 HLA-A*0201이 검사된 모든 인종에서 우세하게 발현된 A2-슈퍼타입 대립유전자라는 관찰로부터 이루어진 것이다. 이와 같이, 비 교차 반응성 A*0201 결합 펩티드의 포함은 항원 적용범위 및 집단 적용범위의 중복성을 증가시킨다. 환자 면역원성 데이터가 부족한 단지 2 개의 A2-제한된 펩티드는 펩티드 1090.77 및 1069.06이다. 1090.77 펩티드는 급성 HBV 환자에서 인식된 고 면역원성 펩티드의 유사체이다. 환자에서의 소생 반응은 유사체 펩티드를 인식할 수 있는 능력에 대해 테스트하지 않았지만, HLA 트랜스제닉 마우스에서 실행되는 면역원성 연구에서는 1090.77로 유도된 CTL이 천연 발생 서열로 로딩된 표적 세포를 인식할 수 있는 것으로 나타났다. 이 데이터는 1090.77 펩티드에 대해 생성된 높아진 CTL이 교차 반응성이고, BV-감염 세포를 인식해야 하는 것을 나타내고 있다. A*6802에 대한 고 결합 친화성에 의해 큰 집단 적용범위를 생성하므로, 1069.06 펩티드는 잠재적인 백신 에피토프로서 포함되었다. 상기 펩티드는 HLA-A2 트랜스제닉 마우스 및 제1 인간 배양물에서 면역원성이다.
바람직한 CTL 에피토프는 7 개의 A3-슈퍼타입-제한된 펩티드, 폴리머라아제 항소스로부터 유도된 6 개의 펩티드 및 코어 영역으로부터의 1 개의 펩티드를 포함한다. A3-슈퍼타입 백신 후보 펩티드 모두는 환자에서 면역원성이다. 펩티드 1142.05가 비교차 반응성 A3-제한된 펩티드일지라도, 환자에서 인식되고, HLA-A1을 결합할 수 있는 것으로 확인되었다.
9 개의 B7-제한된 펩티드는 실시예들에서 확인된 바람직한 CTL 에피토프이다. 이 군중 3 개의 에피토프는 환자에서 인식되는 것으로 나타났다. 이 펩티드중 하나, 즉 1147.04는 비교차 반응성 결합제이지만, 이것은 100 nM 미만의 IC50또는 결합 친화성값으로 주 B7 슈퍼타입 대립유전자중 2 개를 결합한다. 6 개의 B7-슈퍼타입 에피토프는 슈퍼타입 결합을 기초로한 바람직한 에피토프로서 포함하였다. 인간에서의 면역원성 연구(Bertoni외 다수., 1997; Doolan외 다수., 1997; Threlkeld외 다수., 1997)는 고 교차 반응성 펩티드가 거의 항상 에피토프로서 인식되는 것을 증명해 왔다. 주어진 이 결과와 이용가능한 제한된 면역원성 데이터를 통하여, 선택 기준으로서의 B7-슈퍼타입 결합 친화성의 용도는 적절한 것으로 간주되었다.
유사하게도, A1- 및 A24-제한된 펩티드에 관한 면역원성 데이터는 거의 없다. 하나의 바람직한 CTL 에피토프, 즉 1069.04는 급성 HBV 환자로부터의 소생 반응에서 인식되는 것으로 발표되었다. 이전 단락에서 논의된 바와 같이, 결합 친화성가 <100 nM인 고 비율(%)의 펩티드는 면역원성인 것으로 밝혀졌다. 이러한 이유로, 결합 친화성가 <100 nM인 모든 A1 및 A24 펩티드는 바람직한 CTL 에피토프로서 고려되었다. 이 선택 기준을 사용하여, 3 개의 A1-제한된 펩티드 및 6 개의 A24-제한된 펩티드를 후보 에피토프로서 확인하였다. 추가의 분석으로 3 개의 코어 유도된 펩티느가 중간 친화성인 A24를 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이 연구 동안 코어 에피토프는 상대적으로 거의 없는 것으로 확인되어서, 항원 범위에서 큰 중복도를 제공하기 위해, 중간 A24 결합 코어 펩티드를 바람직한 에피토프의 세트내에 포함시켰다.
바람직한 HBV-유도된 HTL 에피토프의 목록을 하기 표 XXXVII에 요약하였다. HTL 에피토프의 세트는 12 개의 DR 슈퍼모티프 결합 펩티드와 4 개의 DR3 결합 펩티드를 포함한다. 큰 HTL 에피토프는 폴리머라아제로부터 유도되고, 또한, 2 개의 엔벨로프 및 2 개의 코어 유도된 에피토프도 바람직한 HTL 에피토프의 세트에 포함된다. HTL 에피토프의 패널에 의해서 나타낸 평가된 총 집단 적용범위는 5 개의 주 인종 군 각각에서 91%를 초과한다(표 XXXVIII).
실시예 8: 감작(priming) 후 내생적으로 프로세싱된 항원 생성의 인식
본 실시예에서는 실시예 1 내지 5에 기재된 바와 같이 동정되고 선택된 천연 또는 유사체화된 에피토프에 의하여 유도된 CTL이 내생적으로 합성된, 즉, 천연 항원을 인식한다는 것을 입증한다.
실시예 3에서와 같은 펩티드 에피토프, 예컨대, HLA-A2 슈퍼모티프-함유 에피토프로 면역화시킨 트랜스제닉 마우스에서 분리된 작동 세포(effector cell)를 시험관 내에서 펩티드-코팅된 자극 세포(stimulator cell)로 재-자극시킨다. 6일 후, 작동 세포를 세포독성에 대하여 분석하고, 펩티드-특이적 세포독성 활성을 갖는 세포주를 추가로 재-자극시킨다. 또 다시 6일 후, 펩티드의 존재 또는 부재하에51Cr 표지된 저캣(Jurkat)-A2.1/Kb표적 세포 상에서 상기 세포주들의 세포독성 활성에 대하여 시험하고, 또 예컨대 HBV 발현 벡터로 안정하게 트랜스펙트된 세포와 같은 내생적으로 합성된 항원을 함유하는51Cr 표지된 표적 세포 상에서 상기 세포주들의 세포독성 활성에 대하여 시험한다.
그 결과는 펩티드 에피토프로 감작된 동물에서 유래한 CTL 주가 내생적으로 합성된 HBV 항원을 인식한다는 것을 보여준다. 그러한 분석에 사용되는 트랜스제닉 마우스 모델의 선택은 평가할 에피토프(들)에 따라 달라진다. HLA-A*0201/Kb트랜스제닉 마우스에 더하여, A3 에피토프를 평가하는데 사용할 수도 있는 인간 A11을 갖는 마우스를 비롯한 기타 몇몇 트랜스제닉 마우스 모델, 및 B7 대립유전자를 특성화하였으며, 기타의 것들(예, HLA-A1 및 A24에 대한 트랜스제닉 마우스)을 개발하고 있다. 또한, HLA-DR1 및 HLA-DR3 마우스 모델을 개발하였으며, 이는 HTL 에피토프를 평가하는데 사용할 수 있다.
실시예 9: 트랜스제닉 마우스 중의 CTL-HTL 접합 에피토프의 활성
본 실시예에서는 HBV CTL/HTL 펩티드 접합체를 사용하여 트랜스제닉 마우스 내의 CTL 및 HTL을 유도하는 것을 설명한다. 유사한 연구는 문헌[Oseroffet al. Vaccine16:823-833(1998)]에서 찾을 수 있다.
상기 펩티드 조성물은 다중 CTL 및/또는 HTL 에피토프를 포함할 수 있고, 또한 다중 HPV 표적 항원에서 선택된 에피토프를 포함할 수 있다. 상기 에피토프들은 실시예 1 내지 6에 기재한 바와 같은 방법을 이용하여 동정한다. 예를 들어, 그러한 펩티드 조성물은, 예를 들어, 다중 HLA 패밀리 구성원에 500 nM 이하의 친화도로 결합하는 하나 이상의 CTL 에피토프를 포함하는 바람직한 CTL 에피토프 또는 그 에피토프의 유사체에 접합되는 HTL 에피토프를 포함할 수 있다. 경우에 따라, 상기 펩티드를 지질화시킬 수 있다.
면역화 과정: 문헌[Alexanderet al., J. Immunol. 159:4753-4761, 1997]에 기재되어 있는 바와 같이 트랜스제닉 마우스의 면역화를 수행한다. 예를 들어, 인간 HLA A2.1 대립유전자에 대하여 트랜스제닉되고, HLA-A*0201 모티프- 또는 HLA-A2 슈퍼모티프-함유 에피토프의 면역원성 평가에 유용한 A2/Kb마우스는 불완전 플로인트 아쥬반트(Incomplete Freund's Adjuvant) 중의 펩티드 0.1 ㎖로; 상기 펩티드 조성물이 지질화된 CTL/HTL 접합체인 경우에는, DMSO/염수 중의 펩티드 0.1 ㎖로; 또는 상기 펩티드 조성물이 폴리펩티드인 경우에는, PBS 또는 불완전 플로인트 아쥬반트 중의 펩티드 0.1 ㎖로 피하(꼬리 기저)에 감작시킨다. 감작 7 일 후에, 펩티드로 코팅한 동계(syngenic) 조사 LPS-활성화 림프아구을 이용하여 상기 동물들에서 얻어진 비장 세포를 재자극시킨다.
세포주: 펩티드-특이적 세포독성 분석을 위한 표적 세포는 HLA-A2.1/Kb키메라 유전자로 트랜스펙트된 저캣 세포이다(예, Vitielloet al., J. Exp. Med.173:1007, 1991).
시험관내 CTL 활성화: 감작 1 주일 후에, 비장 세포(30 x 106세포/플라스크)는 10 ㎖의 배양 배지/T25 플라스크 중의 동계 조사(3000 rad)된 펩티드 코팅된 림프아구(10 x 106세포/플라스크)와 37 ℃에서 동시 배양한다. 6일 후, 작동 세포를 수확하고, 세포독성 활성에 대하여 분석한다.
세포독성 활성에 대한 분석:51Cr 200 ㎕의 존재하 37 ℃에서 표적 세포(1.0 x 106내지 1.5 x 106)를 항온처리한다. 60분 후, 세포를 세 번 세척하고, R10 배지에 재현탁시킨다. 농도 1㎍/㎖의 요구되는 펩티드를 첨가한다. 상기 분석에 있어서, U-바닥 96-웰 플레이트 중의 상이한 농도의 작동 세포에 104 51Cr-표지된 표적 세포를 첨가한다(최종 부피는 200 ㎕). 37 ℃에서 6 시간 항온 처리한 후에, 상청액 0.1 ㎖의 분취량을 각 웰에서 취하여, 마이크로메딕 오토매틱 감마 계수기 (Micromedic automatic gamma counter)에서 방사활성을 측정한다. 특이적 세포 용해 퍼센트는 하기 식으로 계산한다: 특이적 방출 퍼센트 = 100 x (실험적 방출 - 자발적 방출)/(최대 방출 - 자발적 방출). 동일한 조건하에서 실행한 분리 CTL 분석 간의 비교를 용이하게 하기 위하여,51Cr 방출 % 데이터는 세포 용해 단위/106세포로 표현한다. 하나의 세포 용해 단위는 6시간의51Cr 방출 분석에서 10,000 개의 표적 세포의 30 %가 세포 용해되는데 요구되는 작동 세포의 수라고 임의로 정의한다. 특이적 세포 용해 단위/106를 얻기 위하여, 펩티드의 존재하에 얻어진 세포 용해 단위/106에서 펩티드의 부재하에 얻어진 세포 용해 단위/106를 뺀다. 예를 들어, 30 %의51Cr 방출이 작동 세포(E):표적 세포(T)의 비가 펩티드의 부재하에서는 50:1(즉, 10,000개의 표적 세포 당 5 x 105개의 작동 세포), 펩티드의 존재하에서는 5:1(즉, 10,000개의 표적 세포 당 5 x 104개의 작동 세포)인 경우에 얻어지는 것이라면, 상기 특이적 세포 용해 단위는 [(1/50,000)-(1/500,000)] x 106= 18 LU일 것이다.
결과는 면역원성 CTL/HTL 접합체 백신 제제로 주사한 동물의 CTL 응답의 크기를 평가하여 분석하고, 실시예 3에 기재된 바와 같은 CTL 에피토프를 사용하여 달성되는 CTL 반응의 크기와 비교한 것이다. 이와 유사한 분석을 수행하여 다중 CTL 에피토프 및/또는 다중 HTL 에피토프를 함유하는 펩티드 접합체의 면역원성을 평가할 수 있다. 이러한 과정에 따라, 상기 조성물의 투여시 CTL 반응이 유도됨과 동시에 HTL 반응이 유도된다는 사실이 밝혀진다.
실시예 10: HBV-특이적 백신 내의 봉입(inclusion)을 위한 CTL 및 HTL 에피토프의 선택
본 실시예에서는 본 발명의 백신 조성물용 펩티드 에피토프의 선택 과정을 설명한다. 상기 조성물 중의 펩티드는 펩티드(들)을 암호하는 단일 또는 하나 이상의 서열(즉, 미니유전자)인 핵산 서열 형태이거나, 단일 및/또는 폴리에피토프 펩티드일 수 있다.
백신 조성물 내의 봉입을 위한 에피토프 어레이(array)를 선택하는 경우에, 하기 원리를 이용한다. 하기 각각의 원리는 선택을 위해 균형 맞추어 진다.
투여 시에, HBV 클리어런스(clearance)로 보정될, 관찰된 면역 반응을 모방하는 에피토프를 선택한다. 사용되는 에피토프의 수는 HBV를 자발적으로 청정화시키는 환자의 관찰에 따라 달라진다. 예를 들어, HBV를 자발적으로 청정화시키는 환자가 하나 이상의 HPB 항원에 대하여 3개 이상의 에피토프에 대해 면역 반응을 생성하는 것이 관찰된 경우에, HLA 클래스 I에 대하여 3-4개의 에피토프를 포함하여야 한다. 유사한 원리를 이용하여 HLA 클래스 II 에피토프를 결정한다.
종종, HLA 클래스 I 분자에 대하여 500 nM 이하 IC50의 결합 친화도를 갖거나, 클래스 II에 대하여 1000 nM 이하 IC50의 결합 친화도를 갖는 에피토프들을 선택한다.
충분한 슈퍼모티프 함유 펩티드 또는 충분한 대립유전자-특이적 모티프 함유 펩티드 어레이를 선택하여, 광범위한 집단 적용범위를 제공한다. 예를 들어, 에피토프를 선택하여 80 % 이상의 집단 적용범위를 제공한다. 당업계에 공지된 통계학적 평가 방법인 몬테 카를로 분석법(Monte Carlo analysis)을 이용하여, 집단 적용범위의 폭 또는 중복성을 평가할 수 있다.
폴리에피토프 조성물, 예를 들어, 미니유전자를 제조하는 경우에, 통상, 당해 에피토프를 포함할 수 있는 가장 작은 펩티드를 생성시키는 것이 바람직하다. 사용되는 원리로는, 중첩(nested) 에피토프를 포함하는 펩티드를 선택할 때 사용하는 원리와 동일하지 않다면 유사한 원리를 이용한다.
동일한 표적 단백질의 다중 변이체 서열을 이용할 수 있는 경우에, 잠재적인 펩티드 에피토프를 또한 그 보존율에 기초하여 선택할 수 있다. 예를 들어, 보존율에 대한 기준은 HLA 클래스 I 결합 펩티드의 전체 서열 또는 클래스 II 결합 펩티드의 전체 9-머(9-mer) 코어가 특정 단백질 항원에 대하여 평가한 서열의 디자인된 퍼센트로 보존되는 것으로 정의할 수 있다.
백신 조성물 내의 봉입을 위한 에피토프는 예를 들어 표 XXXVIIa 및 b에 나열한 것으로부터 선택한다. 선택된 펩티드로 구성된 백신 조성물은, 투여시에, 안전하고, 효능이 있으며, 급성 HBV 감염을 청정화시키는 면역 반응의 크기와 유사한 면역 반응을 유도해 낸다.
실시예 11: 미니유전자 다중-에피토프 DNA 플라스미드의 작제
본 실시예는 미니유전자 발현 플라스미드의 작제에 대한 가이드라인을 제공한다. 물론, 미니유전자 플라스미드는 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTL 및/또는 HTL 에피토프 또는 에피토프 유사체의 다양한 입체구조를 가질 수 있다. 발현 플라스미드의 작제 및 평가의 예는, 예를 들어, 1999년 5월 13일에 출원되어 동시 계류 중인 미국 특허 출원 제09/311,784호에 기술되어 있다. 그러한 플라스미드의 예는 도 2에 도시되어 있는데, 그 도 2에서는 미니유전자 작제물 중의 HBV 에피토프의 배향을 설명하고 있다. 그러한 플라스미드는, 예를 들어, 다중 CTL 및 HTL 펩티드 에피토프를 포함할 수도 있다.
미니유전자 발현 플라스미드는 통상 다중 CTL 및 HTL 펩티드 에피토프를 포함한다. 본 실시예에서는, HLA-A2, -A3, -B7 슈퍼모티프-함유 펩티드 에피토프 및 HLA-A1 및 -A24 모티프-함유 펩티드 에피토프를 DR 슈퍼모티프-함유 에피토프 및/또는 DR3 에피토프와 함께 사용한다(도 2). 바람직한 에피토프는, 예를 들어, 표 XXVI-XXXIII의, 다중 HBV 항원, 예컨대, 코어, 폴리머라아제, 엔벨로프 및 X 단백질로부터 유도된 HLA 클래스 I 슈퍼모티프 또는 모티프-함유 펩티드 에피토프로 동정되고, 다중 슈퍼모티프/모티프가 광범위한 집단 적용범위의 확보를 나타내도록 선택된다. 유사하게, HLA 클래스 II 에피토프는 광범위한 집단 적용범위를 제공하도록 다중 HBV 항원으로부터 선택한다. 즉, HLA DR-1-4-7 슈퍼모티프-함유 에피토프 및 HLA DR-3 모티프-함유 에피토프 모두를 미니유전자 작제물 내의 봉입을 위하여 선택한다. 그 다음, 선택된 CTL 및 HTL 에피토프는 발현을 위하여 발현 벡터 내 미니유전자 내로 혼입시킨다.
본 실시예에서는 그러한 미니유전자-함유 발현 플라스미드의 작제에 이용되는 방법을 설명한다. 미니유전자 조성물에 사용할 수 있는 기타 발현 벡터는 구입할 수 있으며, 당업자에게 공지되어 있다.
상기 미니유전자 DNA 플라스미드는 공통 코작 서열(consensus Kozaksequence) 및 공통 뮤린 카파 Ig-경쇄 신호 서열을 포함하며, 이어서 본 명세서에 공개된 원리에 따라 선택된 CTL 및/또는 HTL 에피토프의 스트링을 포함한다.
대략 70 뉴클레오티드 길이에서 평균 15 뉴클레오티드 중복이 있는 중복 올리고뉴클레오티드, 예컨대, 8 올리고뉴클레오티드를 합성하고, HPLC-정제한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 선택된 펩티드 에피토프 및 적당한 링커 뉴클레오티드를 암호한다. 최종 다중에피토프 미니유전자는 PCR을 이용한 반응의 세 개의 셋트에서 상기 중복 올리고뉴클레오티드를 신장시킴으로써 조합한다. 퍼킨/엘머 (Perkin/Elmer) 9600 PCR 장치를 사용하고, 다음과 같은 조건을 사용하여 총 30 주기를 수행한다: 95 ℃에서 15 초, 어닐링 온도(각 프라이머 쌍의 가장 낮은 계산된 Tm 5 °이하)에서 30 초, 및 72 ℃에서 1 분.
첫 번째 PCR 반응에서, 두 올리고뉴클레오티드 각각을 5 ㎍씩 어닐링하고, 신장시킨다:Pfu폴리머라아제 완충액[1x=10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 20 mM 트리스 클로라이드, pH 8.75, 2 mM MgSO4, 0.1 % 트리톤 X-100, 100 ㎍/㎖ BSA), 각 dNTP 0.25 mM 및Pfu폴리머라아제 2.5 U를 함유하는 반응물 100 ㎕ 중에 올리고뉴클레오티드 1+2, 3+4, 5+6 및 7+8을 배합한다. 전장 다이머 생성물을 겔-정제하고, 생성물 1+2 및 3+4, 및 생성물 5+6 및 7+8을 함유하는 두 반응물을 혼합하고, 어닐링한 후, 10 주기 동안 신장시킨다. 그 다음, 두 반응물의 절반을 혼합하고, 5 주기 동안 어닐링 및 신장을 수행한 후, 플랭킹 프라이머를 첨가하여, 추가 25 주기 동안 전장 생성물을 증폭시킨다. 상기 전장 생성물을 겔-정제하고, pCR-블런트(인비트로겐) 으로 클로닝하고, 개개의 클론을 시퀀싱에 의하여 스크리닝한다.
실시예 12: 플라스미드 작제물 및 그것이 면역원성을 유도하는 정도
플라스미드 작제물, 예를 들어, 실시예 11에 따라 작제한 플라스미드가 면역원성을 유도할 수 있는 정도는 시험관내에서 APC에 의한 에피토프 제시 시험 후 에피토프-발현 핵산 작제물로 APC를 트랜스덕트 또는 트랜스펙트함으로써 평가할 수 있다. 그러한 연구는 "항원성"을 측정하는 것이며, 인간 APC의 사용을 허용한다. 상기 분석에서는 세포 표면 상의 에피토프-HLA 클래스 I 복합체의 밀도를 정량함으로써 T 세포에 의하여 인식되는 상황에서 APC에 의해 제시되는 에피토프의 능력을 측정한다. APC에서 용출된 펩티드의 양을 직접 측정함으로써 정량을 수행할 수 있고[예를 들어, 문헌(Sijtset al., J. Immunol.156:683-692, 1996; Demotzet al., Nature342:682-684, 1989)을 참고하라]; 또는 세포 용해량 또는 감염이나 트랜스펙트된 표적 세포에 의하여 유도된 림포카인 방출량을 측정한 후, 얻어진 세포 용해 또는 림포카인 방출의 동등한 레벨에 필요한 펩티드 농도를 확인함으로써 펩티드-HLA 클래스 I 복합체의 수를 평가할 수 있다[예를 들어, 문헌(Kageyamaet al., J. Immunol.154:567-576, 1995)을 참고하라].
대안적으로, 면역원성은 마우스 생체내 주사에 이은 CTL 및 HTL 활성의 시험관내 평가를 통하여 평가할 수 있다. 여기에서, 세포독성 및 증식 분석을 이용하여 각각 분석하는데, 상세한 사항은 예를 들어 1999년 5월 13일자로 출원되어 동시 계류 중에 있는 미국 특허 출원 제09/311,784호 및 문헌[Alexanderet al., Immunity1:751-761, 1994]에 기재되어 있다.
예를 들어, 생체내에서 CTL을 유도하는 하나 이상의 HLA-A2 슈퍼모티프 펩티드를 함유하는 DNA 미니유전자 작제물(예, 미국 특허 출원 제09/311,784호에 기재되어 있는 바와 같이 제조한 pMin 미니유전자 작제물)의 커패서티(capacity)를 평가하기 위하여, 예를 들어, HLA-A2.1/Kb트랜스제닉 마우스를 네이키드 cDNA 100 ㎍으로 근육내 면역화한다. cDNA 면역화에 의하여 유도된 CTL의 레벨을 비교하는 수단으로서, 상기 미니유전자에 의하여 암호되는 것과 같은 단일 폴리펩티드와 같이 합성된 다중 에피토프를 포함하는 실제 펩티드 조성물로 대조군 동물들도 면역화시킨다.
면역화된 동물에서 유래한 비장 세포를 각 조성물(미니유전자 중에 암호된 펩티드 에피토프 또는 폴리에피토프 펩티드)로 각각 두 번 자극한 후,51Cr 방출 분석에서 펩티드-특이적 세포독성 활성을 분석한다. 그 결과는 A2-제한 에피토프에 대한 CTL 반응의 크기를 지시하고, 그래서 미니유전자 백신 및 폴리에피토프 백신의 생체내 면역원성을 지시한다. 따라서, 상기 미니유전자가 상기 폴리에피토프 펩티드 백신과 같이 HLA-A2 슈퍼모티프 펩티드 에피토프에 대한 면역 반응을 유도한다는 것이 밝혀진다. 또한, 다른 HLA-A3 및 HLA-B7 트랜스제닉 마우스 모델을 이용하여, HLA-A3 및 HLA-B7 모티프 또는 슈퍼모티프 에피토프에 의한 CTL 유도를 평가하는 유사한 분석을 수행한다.
DR 트랜스제닉 마우스, 생체내 HTL을 유도하는 미니유전자를 암호하는 클래스 II 에피토프 또는 적절한 마우스 MHC 분자와 교차 반응하는 에피토프의 커패서티를 평가하기 위하여, 예를 들어, I-Ab-제한된 마우스를 플라스미드 DNA 100 ㎍으로 근육내 면역화한다. DNA 면역화에 의하여 유도되는 HTL의 레벨을 비교하는 수단으로서, 완전 플로인트 아쥬반트 중에 에멀션화시킨 실제 펩티드 조성물로 대조군 동물들도 면역화시킨다. 면역화된 동물들의 비장 세포로부터 CD4+ T 세포, 즉, HTL을 정제하고, 각 조성물(상기 미니유전자에서 암호되는 펩티드) 각각으로 자극한다. 상기 HTL 반응은3H-티미딘 혼입 증폭 분석법을 이용하여 측정한다[예를 들어, 문헌(Alexander et al. Immunity 1:751-761, 1994)을 참고하라]. 그 결과는 HTL 반응의 크기를 나타내고, 따라서 상기 미니유전자의 생체내 면역원성을 입증한다.
또한, 실시예 11에 기술된 바와 같이 작제한 DNA 미니유전자는 프라임 부스트 프로토콜(prime boost protocol)을 이용하여 부스팅 약제(boosting agent)와 혼합한 백신으로 평가할 수 있다. 상기 부스팅 약제는, 예를 들어, 당해 완전 단백질을 암호하는 DNA 또는 미니유전자를 발현시키는, 재조합 백시니아[예를 들어, 문헌(Hankeet al., Vaccine16:439-445, 1998; Sedegah et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA95:7648-53, 1998; Hanke and McMichael,Immunol. Letters66:177-181, 1999; 및 Robinsonet al., Nature Med.5:526-34, 1999)을 참고하라], 또는 재조합 단백질[예를 들어, 문헌(Barnettet al., Aids Res. and Human Retroviruses14, Supplement 3:S299-S309, 1998)을 참고하라]로 구성될 수 있다.
예를 들어, 처음에, 트랜스제닉 마우스에서 프라임 부스트 프로토콜에서 사용하는 상기 DNA 미니유전자의 효능을 평가한다. 본 실시예에 있어서, A2.1/Kb트랜스제닉 마우스는 하나 이상의 HLA-A2 슈퍼모티프-함유 펩티드를 비롯한 면역원성 펩티드를 암호하는 DNA 미니유전자 100 ㎍으로 면역화시킨 IM이다. 항온처리 기간(3 내지 9 주) 후, 상기 DNA 미니유전자에 의하여 암호되는 동일한 서열을 발현시키는 재조합 백시니아 바이러스 107pfu/마우스로 상기 마우스를 IP 부스팅시킨다. 대조군 마우스는, 미니유전자 서열 없이 100 ㎍의 DNA 또는 재조합 백시니아로, 또는 백시니아 부스트 없이 미니유전자를 암호하는 DNA로 면역화시킨다. 2 주의 추가 항온처리 기간 후, ELISPOT 분석으로 상기 마우스에서 유래한 비장 세포를 펩티드-특이적 활성에 대하여 즉시 분석한다. 또한, 재조합 백시니아 및 미니유전자에서 암호된 A2-제한된 펩티드 에피토프로 비장 세포를 생체내 자극한 후, IFN-γELISA에서 펩티드-특이적 활성에 대하여 분석한다.
프라임-부스트 프로토콜에서 사용한 미니유전자는 DNA 단독을 이용한 경우보다 HLA-A2 슈퍼모티프 펩티드에 대한 더 큰 면역 반응을 유도한다는 것이 밝혀진다. 그러한 분석을 HLA-A11 또는 HLA-B7 트랜스제닉 마우스 모델을 이용하여 수행하여, HLA-A3 또는 HLA-B7 모티프 또는 슈퍼모티프 에피토프에 의한 CTL 유도를 평가할 수도 있다.
인간에서 프라임 부스트 프로토콜을 이용하는 것은 실시예 20에 기술한다.
실시예 13: 예방 용도를 위한 펩티드 조성물
본 발명의 백신 조성물을 사용하여 HJBV 감염 위험이 있는 사람의 HJBV 감염을 예방할 수 있다. 예를 들어, 예컨대, 실시예 9 및/또는 10에서 선택된 것(이것은 그 집단의 80 % 이상을 표적화하여 선택한 것임)과 같은, 다중 CTL 및 HTL 에피토프를 포함하는 폴리에피토프 펩티드 에피토프 조성물(또는 동일한 것을 포함하는 핵산)을 HBV 감염 위험이 있는 개체에게 투여한다.
예를 들어, 다중 에피토프를 포함하는 단일 폴리펩티드로서 펩티드-계 조성물을 제공할 수 있다. 상기 백신은 통상 불완전 플로인트 아쥬반트와 같은 아쥬반트를 포함하는 생리학적 용액으로 투여한다. 최초 면역화를 위한 펩티드의 투여량은 70 kg 환자에 대하여 약 1 내지 약 50,000 ㎍, 일반적으로 100 내지 5,000 ㎍이다. 백신의 최초 면역화 후, 4 주 후에 부스터 투여량을 투여하고, 그 후 PBMC 샘플 중의 에피토프-특이적 CTL 집단의 존재를 측정하는 기술을 이용하여 상기 환자에 있어서의 면역 반응의 크기를 평가한다. 필요에 따라, 추가의 부스터 투여량을 투여한다. 상기 조성물은 HPV 감염의 예방에 효과적이고 안전하다는 것이 밝혀졌다.
대안적으로, 통상 트랜스펙팅 약제를 포함하는 조성물을 사용하여, 본 명세서에 공개된 사항과 당업계에 공지된 방법에 따라 핵산-계 백신을 투여할 수 있다.
실시예 14: 천연 HBV 서열에서 유도된 폴리에피토프 백신 조성물
바람직하게는 클래스 I 및/또는 클래스 II 슈퍼모티프 또는 모티프 각각에 대하여 정의된 컴퓨터 알고리즘을 이용하여, 천연 HBV 폴리단백질 서열을 스크리닝함으로써, 다중 에피토프를 포함하고 바람직하게는 그 길이가 전체 천연 항원보다 짧은 폴리단백질의 "비교적 짧은" 영역을 동정한다. 중복되더라도 구별되는 다중에피토프를 포함하는 상기 비교적 짧은 서열을 선택·사용하여, 미니유전자 작제물을 생산한다. 상기 작제물을 조작하여, 상기 천연 단백질 서열에 상응하는 펩티드를 발현시킨다. 상기 "비교적 짧은" 펩티드는 아미노산 길이가 일반적으로 250 미만, 종종 100 미만, 바람직하게 75 미만, 더욱 바람직하게 50 미만이다. 상기 백신 조성물의 단백질 서열은 그것이 그 서열에 포함된 최대 에피토프의 수를 갖기 때문에, 즉, 그것은 고농도의 에피토프를 갖기 때문에 선택된다. 본 명세서에 기재한 바와 같이, 에피토프 모티프는 중첩되거나 중복될 수 있다(즉, 서로에 대해 프레임 시프트될 수 있다). 예를 들어, f 중복 에피토프를 갖는 두 개의 9-머 에피토프 및 하나의 10-머 에피토프가 10 아미노산 펩티드 중에 존재할 수 있다. 그러한 백신 조성물은 치료 또는 예방 목적으로 투여한다.
상기 백신 조성물은 예를 들어 하나 이상의 HTL 에피토프 및 하나 이상의 HBV 표적 항원에서 유래한 세 개의 CTL 에피토프를 포함할 것이다. 이러한 폴리에피토프 천연 서열은 상기 펩티드를 암호하는 핵산 서열로서 또는 펩티드로서 투여한다. 대안적으로, 이러한 천연 서열로부터 유사체를 제조할 수 있고, 이에 의하여 하나 이상의 에피토프는 상기 폴리에피토프 펩티드의 결합 친화성 및/또는 교차-반응성을 변경시키는 치환을 포함한다.
본 실시예의 실시 태양은 아직까지 밝혀지지 않은 면역계의 프로세싱의 양태가 천연 중첩 서열에 적용될 가능성을 고려함에 의하여 치료 또는 예방 면역 반응-유도 백신 조성물의 제조를 촉진시킨다. 또한, 그러한 실시 태양은 현재 알려지지 않은 HLA 구조에 대한 모티프-함유 에피토프의 가능성을 고려한다. 또한, 이 실시태양(유사체 부재)은 천연 HBV 항원에 실질적으로 존재하는 다중 펩티드 서열에 대한 면역 반응을 지향하여, 어느 접합 에피토프(junctional epitope)를 평가할 필요를 없앤다. 마지막으로, 본 실시 태양은 핵산 백신 조성물을 생산하는 경우에 경제성을 제공한다.
이 실시 태양에 있어서, 당업계의 원칙에 따라 컴퓨터 프로그램을 구동시켜, 표적 서열 내에서 서열 길이 당 최대 에피토프 수를 확인할 수 있다.
실시예 15: 복합 질병에 대한 폴리에피토프 백신 조성물
본 발명의 HBV 펩티드 에피토프를 하나 이상의 기타 질병에 관한 표적 항원에서 유래한 펩티드 에피토프와 함께 사용하여, HBV의 예방 및 치료뿐만 아니라 다른 질병에도 유용한 백신 조성물을 제조한다. 다른 질병의 예로는 HIV, HCV 및 HPV 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, HBV 및 HIV 감염 양자 모두에의 위험이 있는 개체에게 투여하기 위하여, 집단의 98 % 이상을 표적화하는 다중 CTL 및 HTL 에피토프를 포함하는 폴리에피토프 펩티드 조성물을 제조할 수 있다. 상기 조성물은 다양한 질병-관련 소스에서 유래한 다중 에피토프를 혼입시킨 단일 폴리펩티드로서 제공할 수도 있고, 또는 하나 이상의 분리된 에피토프를 포함하는 조성물로서 투여할 수도 있다.
실시예 16: 면역 반응 평가를 위한 펩티드의 용도
본 발명의 펩티드는 HBV에 대하여 특이적인 CTL 또는 HTL 집단의 존재에 대한 면역 반응을 분석하는데 사용할 수 있다. 그러한 분석은 문헌[Ogget al., Science279:2103-2106, 1998]에 기재되어 있는 바와 같은 방식으로 수행할 수 있다. 이하에 기술하는 본 실시예에서는 본 발명에 따른 펩티드를, 면역원으로서가 아닌, 진단 또는 예후 목적을 위한 시약으로서 사용한다.
본 실시예에 있어서, 고감도 인간 백혈구 항원 테트라머 복합체("테트라머")는, 예를 들어, 감염의 상이한 단계에서 HLA A*0201-양성 개체로부터 HBV HLA-A*0201-특이적 CTL 빈도의 횡단면 분석 또는 A*0201 모티프를 함유하는 HBV 펩티드를 사용하는 추후의 면역화를 위하여 사용한다. 테트라머 복합체는 문헌[Museyet al., N. Engl. J. Med.337:1267, 1997]에 기재되어 있는 바와 같이 합성한다. 요약하면, 정제된 HLA 중쇄(본 실시예에서는 A*0201) 및 β2-마이크로글로불린을 원핵 발현 시스템을 이용하여 합성한다. BirA 효소의 비오틴화 부위를 포함하는 서열의 COOH-말단 첨가 및 트랜스멤브레인-사이토졸 테일의 결실에 의하여, 상기 중쇄를 개질시킨다. 상기 중쇄, β2-마이크로글로불린 및 펩티드를 희석하여 리폴딩 (refolding)시킨다. 45-kD 리폴딩 생성물을 고속 단백질 액체 크로마토그래피로 분리한 후, 비오틴(Sigma, St. Louis, Missouri), 아데노신 5'트리포스페이트 및 마그네슘의 존재하에 BirA로 비오틴화시킨다. 스트렙트아비딘-피코에리트린 접합체를 1:4 몰비로 첨가하고, 상기 테트라머 생성물을 1 mg/㎖로 농축시킨다. 생성된 생성물은 테트라머-피코에리트린으로 칭한다.
환자 혈액 샘플을 분석하기 위하여, 약 100만개의 PBMC 300 g을 5 분 동안 원심분리하고, 차가운 포스페이트-완충 염수 50 ㎕에 재현탁시킨다. 항-CD8-트리칼라 및 항-CD38과 함께 테트라머-피코에리트린으로 삼색 분석을 수행한다. 얼음상에서 상기 PBMC를 테트라머 및 항체와 함께 30 내지 60 분 동안 항온처리한 후, 두 번 세척한 다음, 포름알데히드 고정시킨다. 대조군 샘플의 99.98 % 초과를 함유하도록 게이트를 적용한다. 상기 테트라머에 대한 대조군은 A*0201-음성 개체 및 A*0201-양성 비감염 공여체 양자 모두를 포함한다. 그 다음, 유동 세포계측법을 이용하여 테트라머로 염색된 세포의 퍼센트를 측정한다. 그 결과는 에피토프-제한된 CTL을 포함하는 PBMC 샘플 중의 세포 수를 나타내고, 그에 의하여 HBV 에피토프에 대한 면역 반응의 정도를 용이하게 나타내며, 따라서 HBV로 감염된 단계, HBV에 노출된 상태, 또는 보호 또는 치료 반응을 유도하는 백신에의 노출 상태를 용이하게 나타낸다.
실시예 17: 소생 반응 평가를 위한 펩티드 에피토프의 용도
본 발명의 펩티드 에피토프는 환자의 급성 또는 소생 반응(recall response) 등의 T 세포 반응을 평가하는 시약으로서 사용한다. 그러한 분석은, 감염으로부터 회복되었거나, HBV로 만성적으로 감염되거나, HBV 백신으로 백신 처리된 환자에게서 수행할 수 있다.
예를 들어, 백신 처리된 환자의 클래스 I 제한된 CTL 반응을 분석할 수 있다. 상기 백신은 임의의 HBV 백신일 수 있다. PBMC는 HLA-타입 및 백신 처리된 개체로부터 수집한다. 그 다음, 최적으로, 다중 HLA 슈퍼타입 패밀리 멤버와의 교차-반응성을 제공하는 슈퍼모티프를 포함하는 본 발명의 적절한 펩티드 에피토프를 사용하여, HLA 타입을 포함하는 개체에서 유래한 샘플을 분석한다.
백신 처리된 개체에서 유래한 PBMC는 피콜-히스토파크(Ficoll-Histopaque) 밀도 구배(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)로 분리하고, HBSS(GIBCO Laboratories) 중에서 세 번 세척하고, L-글루타민(2 mM), 페니실린(50 U/㎖), 스트렙토마이신(50 ㎍/㎖) 및 10 % 열-불활성화 인간 AB 혈청(완전 RPMI)을 함유하는 헤페스(10 mM)로 보충된 RPMI-1640(GIBCO Laboratories) 중에 재현탁시키고, 미소배양 포맷을 이용하여 도말한다. 본 발명의 에피토프를 포함하는 합성 펩티드는 각 웰에 10 ㎍/㎖ 씩 첨가하고, HBV 코어 128-140 에피토프는 자극 첫 주 동안에 T 세포 보조 공급원으로서 각 웰에 1 ㎍/㎖ 씩 첨가한다.
상기 미소배양 포맷에 있어서, 완전 RPMI 100 ㎕/웰의 96-웰 둥근 바닥 플레이트 중의 8 복제 배양물 중의 펩티드로 4 x 105PBMC를 자극한다. 3일과 10일에, 완전 RPMI 100 ㎖ 및 rIL-2 최종 농도 20 U/㎖를 각 웰에 첨가한다. 7일에, 상기 배양물을 96-웰 평탄-바닥 플레이트 내로 이동시키고, 펩티드, rIL-2 및 105조사(3,000 rad)된 자가유래 피더(feeder) 세포로 재자극한다. 14일에 상기 배양물을 세포독성 활성에 대하여 시험한다. 양성 CTL 반응은, 문헌[Rehermann,et al., Nature Med.2:1104, 1108, 1996; Rehermannet al., J. Clin. Invest.97:1655-1665, 1996; 및 Rehermannet al. J. Clin. Invest.98:1432-1440, 1996]에 이미 기재되어 있는 바와 같이, 비감염 대조군 피검체와의 비교에 기초하여, 10 % 특이적51Cr 방출보다 큰 방출을 나타내는 8 복제 배양물 둘 이상을 요한다.
표적 세포주는, 조직적합성 및 면역유전학을 위한 아메리칸 소사이어티(American Society for Histocompatibility and Immunogenetics; ASHI, Boston, MA)에서 구입하거나, 문헌(Guilhot,et al. J. Virol. 66:2670-2678, 1992)에 기재된 바와 같이 환자의 푸울(pool)에서 얻은 자가유래 및 대립유전자 EBV-트랜스폼된 B-LCL이다.
다음과 같은 방식으로 세포독성 분석을 수행한다. 표적 세포는, 본 발명의 합성 펩티드 에피토프 10 μM로 밤새도록 항온처리하고,51Cr 100 μCi(Amersham Corp., Arlington Heights, IL)로 표지하고, 1 시간 후, HBSS로 네 번 세척한, 대립유전자 HLA-매치된 또는 자가유래 EBV-트랜스폼된 B 림프아세포주로 구성된다.
3,000 표적/웰을 포함하는 U-바닥 96 웰 플레이트를 사용하는 표준 4-h, 스플리트 웰51Cr 방출 분석으로 세포 용해 활성을 측정한다. 14 일에, 20-50:1의 작동 세포/표적 세포(E/T) 비율로 자극된 PBMC를 시험한다. 하기 식으로 세포독성 퍼센트를 결정한다: 100 x [(실험적 방출 - 자발적 방출)/(최대 방출 - 자발적 방출)]. 세제(2 % 트리톤 X-100; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)로 표적을 세포용해시켜 최대 방출을 측정한다. 모든 실험에 있어서, 자발적 방출은 최대 방출의 25 % 미만이다.
그러한 분석 결과는 HLA-제한된 CTL 집단이 HBV 또는 HBV 백신에 대한 이전 노출에 의하여 자극된 정도를 나타낸다.
클래스 II 제한된 HTL 반응을 또한 분석한다. 96-웰 평탄 바닥 플레이트 내에서 1.5 x 105세포/웰의 밀도로 정제된 PBMC를 배양하고, 10 ㎍/㎖ 합성 펩티드,전체 항원 또는 PHA로 자극한다. 각 조건에 대하여 4-6 웰의 복제물에 세포들을 통상적으로 도말한다. 배양 7 일 후에, 배지를 제거하고, 10 U/㎖ IL-2를 함유하는 새로운 배지로 교체한다. 2 일 후, 각 웰에 1 μCi3H-티미딘을 첨가하고, 추가 18 시간 동안 항온처리를 계속한다. 그 다음, 세포 DNA를 유리 섬유 매트 상에 수확하고,3H-티미딘 혼입에 대하여 분석한다. 항원-특이적 T 세포 증식은 항원 존재하의3H-티미딘 혼입을 항원 부재하의3H-티미딘 혼입으로 나눈 비로서 계산한다.
실시예 18: 인간의 특이적 CTL 반응의 유도
본 발명의 HBV CTL 및 HTL 에피토프를 포함하는 면역원성 조성물에 대한 인간 임상 시험은 IND I상, 투여량 에스컬레이션 연구(5, 50 및 500 ㎍)로 설계하고, 무작위 2중 맹검 플라세보-조절 시험으로 수행한다. 그러한 시험은 예를 들어 다음과 같이 설계한다:
총 약 27 피검체를 등록하고, 3 그룹으로 나눈다.
그룹 Ⅰ: 3 피검체에게 플라세보를 주사하고, 6 피검체에게 펩티드 조성물 5 ㎍을 주사한다;
그룹 Ⅱ: 3 피검체에게 플라세보를 주사하고, 6 피검체에게 펩티드 조성물 50 ㎍을 주사한다;
그룹 Ⅲ: 3 피검체에게 플라세보를 주사하고, 6 피검체에게 펩티드 조성물 500 ㎍을 주사한다.
첫 번째 주사 4 주 후, 모든 피검체에게 동일한 투여량의 부스터 접종을 실시한다.
본 연구에서 측정한 종료점은 펩티드 조성물의 안전성 및 내성, 및 그 면역원성에 관련된다. 상기 펩티드 조성물에 대한 세포 면역 반응은 본 펩티드 조성물의 고유 활성의 인덱스이고, 따라서 생물학적 효능의 척도로 볼 수 있다. 이하에서 안정성 및 효능 종료점에 관한 임상적 데이터 및 실험실 데이터를 요약한다.
안정성: 플라세보 및 약물 처리 그룹에 있어서 불리한 효과의 발생을 모니터하고, 정도 및 가역성을 평가한다.
백신 효능의 평가: 백신 효능의 평가에 있어서, 주사 전 및 후에 피검체에서 채혈한다. 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 밀도 구배 원심분리에 의하여 헤파린 처리된 새로운 혈액에서 말초 혈액 단핵구 세포를 분리하고, 동결 배지에서 분취한 후, 동결 저장한다. CTL 및 HTL 활성에 대하여 샘플을 분석한다.
그래서, 백신의 안정성 및 효능을 밝힌다.
실시예 19: HBV로 감염시킨 환자에게서의 Ⅱ상 시험
Ⅱ상 시험을 수행하여, 만성 HBV 감염이 있는 환자(남성 및 여성)에게 CTL-HTL 펩티드 조성물을 투여하는 경우의 효과를 연구한다. 본 시험의 주목적은 만성적으로 감염된 HBV 환자에게 CTL을 유도하는 요법 및 유효량을 결정하는 것, 이러한 환자에게 유도된 CTL 반응의 안정성을 확립하는 것, 및 알라닌 아미노트랜스퍼라아제(ALT)에서의 일시적인 발적, ALT의 정상화, 및 HBV DNA의 환원에 의하여 명백히 나타나는 바와 같이, 어느 정도의 CTL 활성화가 만성적으로 감염된 CTL 환자의 임상 사진을 개선시키는 지를 밝히는 것이다. 이러한 연구는 예를 들어 다음과같이 설계된다:
본 연구는 미국 및 캐나다의 다수 센터에서 수행한다. 본 시험은 개방 표지, 비조절, 투여량 에스컬레이션 프로토콜로 설계하는데, 여기에서, 상기 펩티드는 단일 투여량으로 투여하고, 6 주 후, 동일한 투여량의 단일 부스터 투여한다. 상기 투여량은 주사 당 50, 500 및 5,000 마이크로그램이다. 약물-관련 역효과를 기록한다.
환자를 세 개의 그룹으로 나눈다. 첫 번째 그룹에는 상기 펩티드 조성물 50 마이크로그램을 주사하고, 두 번째 및 세 번째 그룹에는 상기 펩티드 조성물을 각각 500 및 5,000 마이크로그램 주사한다. 각 그룹에 속하는 환자들은 연령이 21 내지 65세이고, 남성과 여성이 모두 포함된다. 상기 환자들은 다양한 민족적 배경을 대표한다. 그들 모두는 5 년에 걸쳐서 HBV로 감염되며, HIV, HCV 및 HDV 음성이나, HBe 항원 및 HBs 항원의 양성 레벨을 갖는다.
혈중 HBV DNA의 레벨 및 ALT 발적의 크기 및 발생률을 모니터하여, 상기 펩티드 조성물의 투여 효과를 평가한다. 혈중 HBV DNA의 레벨은 치료 진행의 간접적 징후이다. 상기 백신 조성물은 만성적 HBV 감염의 치료에 효과적이고 안전하다는 것이 밝혀졌다.
실시예 20: 프라임 부스트 프로토콜을 이용한 CTL 반응의 유도
인간에 대한 백신 투여를 위하여 프라임 부스트 프로토콜을 이용할 수도 있다. 그러한 백신 요법은 예를 들면 네이키드 DNA의 초기 투여 후, 백신을 암호하는 재조합 바이러스를 이용하는 부스트 투여, 또는 아쥬반트로 투여되는 펩티드 혼합물 또는 재조합 단백질/폴리펩티드 투여를 포함할 수 있다.
예를 들어, 다중 부위에서 0.5 내지 5 mg의 양으로, 네이키드 핵산의 IM(또는 SC 또는 ID) 투여 형태로, 실시예 11에서 작제한 바와 같은 발현 벡터를 이용하여, 상기 초기 면역화를 수행할 수 있다. 유전자 총을 이용하여 상기 핵산(0.1 내지 1000 ㎍)을 투여할 수도 있다. 3 내지 4 주의 항온처리 기간 후, 부스터 투여량을 투여한다. 상기 부스터는 5 x 107내지 5 x 109pfu의 투여량으로 투여되는 재조합 포울폭스(fowlpox) 바이러스일 수 있다. 부스터용으로 다른 재조합 바이러스, 예를 들어, MVA, 카나리폭스(canarypox), 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 의존 바이러스를 사용할 수도 있고, 폴리에피토프 단백질 또는 펩티드의 혼합물을 투여할 수도 있다. 백신 효능 평가를 위하여, 환자의 혈액 샘플을 채취한 후, 면역화하고, 최초 백신 투여하고, 일정 간격으로 백신의 부스터 투여량을 투여한다. 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 밀도 구배 원심분리에 의하여 헤파린 처리된 새로운 혈액으로부터 말초 혈액 단핵구 세포를 분리하고, 동결 배지에서 분취한 후, 동결 저장한다. CTL 및 HTL 활성에 대하여 샘플을 분석한다.
그 결과는 HBV에 대한 보호 면역을 달성하고 HBV 감염을 치료하기에 충분한 반응의 크기를 생성하는 것을 나타낸다.
실시예 21: 수지상 세포(DC)를 사용한 백신 조성물의 투여
APC(예, DC)를 사용하여 본 발명의 펩티드 에피토프를 포함하는 백신을 투여할 수 있다. 본 실시예에서, 상기 펩티드-펄스화된(peptide-pulsed) DC를 환자에게 투여하여 생체내 CTL 반응을 자극한다. 이 방법에 있어서, 수지상 세포를 분리하고, 팽창시키고, 본 발명의 펩티드 CTL 및 HTL 에피토프를 포함하는 백신으로 펄스화한다. 상기 수지상 세포를 환자에게 다시 주입하여 생체내 CTL 및 HTL 반응을 유도한다. 그 다음, 상기 유도된 CTL 및 HTL은 상기 백신 중의 에피토프가 유도되는 단백질을 갖는 특정 표적 세포의 파괴를 촉진시키거나 그러한 세포를 파괴한다.
예를 들어, 에피토프-함유 펩티드의 칵테일을 생체외 PBMC 또는 그것으로부터 분리된 DC로 투여한다. DC 수확을 촉진시키는 약제, 예컨대, 프로게니포이에틴 (Progenipoietin)TM(Monsanto, St. Louis, MO) 또는 GM-CSF/IL-4를 사용할 수 있다. 펩티드로 DC를 펄스화한 후, 그리고 환자에게 재주입하기 전에, 상기 DC를 세척하여 미결합 펩티드를 제거한다.
임상적으로 인정되고, 임상적 결과에 기초하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있는 바와 같이, 환자에 대한 DC 재주입 횟수는 변화될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Nature Med. 4:328, 1998;Nature Med. 2:52, 1996 및Prostate32:272, 1997]을 참고하라. 환자 당 2-50 x 106의 DC를 투여하는 것이 통상적이지만, 다수의 DC(예, 107또는 108)를 제공할 수도 있다. 그러한 세포 집단은 통상 50 내지 90 % DC를 포함한다.
몇몇 실시 태양에 있어서, 펩티드-로딩된 PBMC는 DC의 정제 없이 환자에게 주사한다. 예를 들어, 프로게니포이에틴TM과 같은 약제로 치료한 후 생성되는 DC를함유하는 PBMC를 그 DC의 정제 없이 환자에게 주사한다. 투여하는 PBMC의 총 수는 종종 108내지 1010범위에 있다. 일반적으로, 환자에게 주사하는 세포 투여량은, 예를 들어, 특정 항-DC 항체를 이용한 면역형광 분석법으로 측정한 바와 같은, 각 환자의 혈중 DC의 퍼센트에 기초한다. 그래서, 예를 들면, 프로게니포이에틴TM이 주어진 환자의 말초 혈액 중의 2% DC를 동원하고, 그 환자는 5 x 106DC를 수용하는 경우, 그 환자에게는 총 2.5 x 108펩티드-로딩된 PBMC를 주사하게 될 것이다. 프로게니포이에틴TM과 같은 약제로 동원되는 DC 퍼센트는 통상 2 내지 10 %인 것으로 추정되나, 당업자가 이해하는 바와 같이 이는 변화될 수 있다.
CTL/HTL 반응의 세포외 활성화
대안적으로, HPV 항원에 대한 세포외 CTL 또는 HTL 반응은 조직 배양에 있어서 환자의 또는 일반적으로 상용성 있는 CTL 또는 HTL 전구체 세포를 DC와 같은 APC의 소스 및 적당한 면역원성 펩티드와 함께 항온처리함으로써 유도할 수 있다. 상기 전구체 세포가 활성화되어 작동 세포로 팽창되는 적당한 항온처리 시간(통상, 약 7 내지 28일) 후, 상기 세포를 환자에게 다시 주입하는데, 이 때, 그들은 그들의 특이적 표적 세포의 파괴를 촉진(HTL)하거나 그러한 세포를 파괴(CTL)할 것이다.
실시예 22: 모티프-함유 펩티드를 동정하는 대안적 방법
모티프-함유 펩티드를 동정하는 다른 방법은 규정 MHC 분자를 포함하는 세포로부터 그것을 용출시키는 것이다. 예를 들어, 조직 유형화에 사용하는 EBV 트랜스폼된 B 세포는, 광범위하게, 그들이 발현시키는 어느 HLA 분자를 측정하는 것을 특징으로 한다. 일정 경우에 있어서, 이들 세포는 단일 유형의 HLA 분자만을 발현시킨다. 이들 세포는 병원성 유기체로 감염시키거나, 당해 항원, 예를 들어, HBV 단백질을 발현시키는 핵산으로 트랜스펙트시킬 수 있다. 그 다음, 감염의 결과(또는 트랜스펙트의 결과)로서 생성된 펩티드의 내생적 항원 프로세싱에 의해 생성된 펩티드는 상기 세포 내에서 HLA 분자에 결합될 것이고, 상기 세포 표면 상에 수송되어 표시될 것이다. 그 다음, 온화한 산성 조건에 노출시켜 상기 HLA 분자로부터 펩티드를 용출시키고, 예를 들어, 질량 분석법으로 그들의 아미노산 서열을 확인한다. 예를 들어, 문헌[Kuboet al., J. Immunol. 152:3913, 1994]을 참고하라. 특정 HLA 분자에 결합하는 대부분의 펩티드는 모티프를 포함하기 때문에, 이것은 상기 세포 상에서 발현되는 특정 HLA 분자와 서로 관련되는 모티프-함유 펩티드를 얻기 위한 대안적인 방식이다.
대안적으로, 내생적 HLA 분자를 발현시키지 않는 세포주는 단일 HLA 대립유전자를 암호하는 발현 작제물을 이용하여 트랜스펙트시킬 수 있다. 그 다음, 이들 세포를 전술한 바와 같이 처리할 수 있다. 즉, 그들을 병원체로 감염시키거나, 당해 항원을 암호하는 핵산으로 트랜스펙트시켜, 상기 세포 표면에 제시된 당해 항원 또는 병원체에 상응하는 펩티드를 분리할 수 있다. 그러한 분석으로부터 얻어진 펩티드는 상기 세포 내에서 발현되는 단일 HLA 대립유전자에 대한 결합에 상응하는 모티프를 포함할 것이다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 당업자는 하나 이상의 HLA 대립유전자를 포함하는 세포 상에서 유사한 분석을 수행하고, 이어서 발현된 각각의 HLA 대립유전자에 대하여 특이적인 펩티드를 확인할 수 있다. 또한, 당업자는 감염 또는 트랜스펙트와는 다른 수단, 예를 들어, 단백질 항원의 로딩과 같은 수단을 사용하여 상기 세포에 항원의 소스를 제공할 수 있다는 것도 이해할 수 있을 것이다.
본 명세서에 기재된 실시예는 본 발명을 설명하기 위하여 제공된 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다. 본 발명의 기타 변형예는 당업자에게 명백할 것이며, 특허청구범위에 포함되는 것이다. 본 명세서에 인용된 모든 공개 문헌, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위하여 참고로 포함되는 것이다.
[표 Ⅰ]
굵게 기재한 잔기는 바람직한 것이고, 이탤릭체로 기재한 잔기는 덜 바람직한 것이다: 펩티드가 상기 표에 특정한 바와 같은 모티프 또는 슈퍼모티프에 대한 제1 앵커(primary anchor) 위치 각각에 제1 앵커를 갖는다면, 그 펩티드는 모티프를 포함하는 것(motif-bearing)으로 간주된다.
[표 Ⅰa]
2가 V 또는 Q라면, C-말단은 L이 아니다.
굵게 기재한 잔기는 바람직한 것이고, 이탤릭체로 기재한 잔기는 덜 바람직한 것이다: 펩티드가 상기 표에 특정한 바와 같은 모티프 또는 슈퍼모티프에 대한 제1 앵커 위치 각각에 제1 앵커를 갖는다면, 그 펩티드는 모티프를 포함하는 것으로 간주된다.
[표 Ⅱ]
이탤릭체로 기재한 잔기는 덜 바람직하거나, "내성있는(tolerated)" 잔기를 나타낸다.
표 Ⅱ에 나타낸 정보는 다른 특별한 언급이 없는 한 9-머(9-mer)에 특이적인 것이다.
제2 앵커 특이성은 각 위치에 대하여 독립적으로 설계된다.
[표 Ⅲ]
이탤릭체로 기재한 잔기는 덜 바람직하거나, "내성있는" 잔기를 나타낸다. 제2 앵커 특이성은 각 위치에 대하여 독립적으로 설계된다.
[표 Ⅳ] HLA 클래스 I 표준 펩티드 결합 친화도
[표 Ⅴ] HLA 클래스 II 표준 펩티드 결합 친화도
[표 Ⅵ]
a. 입증된 대립유전자로는, 그 특이성을 푸울 시퀀싱 분석, 펩티드 결합 분석에 의하여 측정하거나, CTL 에피토프의 서열 분석에 의하여 측정한 대립유전자가있다.
b. 예측되는 대립유전자는 그 특이성을 슈퍼타입과 특이성이 중복되는 B 및 F 포켓 구조에 기초하여 예측한 대립유전자이다.
[표 Ⅶ] HBV A01 슈퍼 모티프(결합 정보와 함께)
[표 Ⅷ] HBV A02 슈퍼 모티프(결합 정보와 함께)
[표 Ⅸ] HBV A03 슈퍼 모티프(결합 정보와 함께)
[표 Ⅹ] HBV A24 슈퍼 모티프(결합 정보와 함께)
[표 ⅩⅠ] HBV B07 슈퍼 모티프(결합 정보와 함께)
[표 ⅩⅡ] HBV B27 슈퍼 모티프(이용 가능한 결합 데이터 없음)
[표 ⅩⅢ] HBV B58 슈퍼 모티프
[표 ⅩⅣ] HBV B62 슈퍼 모티프
[표 ⅩⅤ] 결합 정보가 있는 HBV A01 모티프
[표 ⅩⅥ] 결합이 있는 HBV A03 모티프
[표 ⅩⅦ] 결합 정보가 있는 A11 모티프
[표 ⅩⅧ] 결합 정보가 있는 HBV A24 모티프
[표 ⅩⅨa] HBV DR-슈퍼 모티프
[표 ⅩⅨb] 결합 데이터가 있는 HBV DR-슈퍼 모티프
[표 ⅩⅩa] HBV DR-3A 모티프
[표 ⅩⅩb] HCV DR 3A 모티프
[표 ⅩⅩc] HBV DR-3B 모티프
[표 ⅩⅩd] 결합 정보가 있는 HBV DR-3B 모티프
[표 ⅩⅩⅠ] 결합된 HLA 슈퍼타입을 갖는 집단 적용범위
[표 ⅩⅩⅡ] HBV 유사체
[표 ⅩⅩⅢ] HBV-유도 펩티드의 면역원성
초기 배양물, 급성 환자(a-Bertoni et al, J Clin Invest 100:503, b-Rehermann et al., J. Clin. Invest 97:1655, c-Nayersina et al., J Immunol 150:4659) 또는 트랜스제닉 마우스로부터 유도된 면역원성 평가. 양성 평가(+)는반응자가 이들 시스템의 하나에 기록된 경우를 나타낸다. unk는 미공지를 나타낸다.
[표 ⅩⅩⅣ] MHC-펩티드 결합 분석: 세포주 및 방사표지된 리간드
[표 ⅩⅩⅤ] MHC 정제에 사용하는 항체
[표 ⅩⅩⅥ] 보존된 HBV-유도 펩티드의 HLA-A2-슈퍼타입 대립유전자에 대한 시험관내 결합
1. 조사된 분리물 중의 전체 서열의 빈도.
2. 결합된 슈퍼타입 대립유전자의 수. 3 이상의 대립유전자에 결합하는 펩티드는 변성된 것으로 간주한다.
3. 대쉬(-)는 IC50을 나타낸다.
[표 ⅩⅩⅦ] 보존된 HBV-유도 펩티드의 HLA-A3-슈퍼타입 대립유전자에 대한 시험관내 결합
1. 조사된 분리물 중의 전체 서열의 빈도.
2. 결합된 슈퍼타입 대립유전자의 수. 3 이상의 대립유전자에 결합하는 펩티드는 변성된 것으로 간주한다.
3. 대쉬(-)는 IC50을 나타낸다.
[표 ⅩⅩⅧ] 보존된 HBV-유도 펩티드의 HLA-B7 슈퍼타입 대립유전자에 대한 시험관내 결합
1. 조사된 분리물 중의 전체 서열의 빈도.
2. 결합된 슈퍼타입 대립유전자의 수. 3 이상의 대립유전자에 결합하는 펩티드는 변성된 것으로 간주한다.
3. 대쉬(-)는 IC50을 나타낸다.
[표 ⅩⅩⅨ] HBV 유도 A1- 및 A24-모티프 함유 펩티드
대쉬는 IC50nM을 나타낸다.
대쉬는 IC50nM을 나타낸다.
[표 ⅩⅩⅩa] HBV-유도 A2-슈퍼모티프 교차-반응 펩티드의 면역원성
초기 배양물, 급성 환자(a-Bertoni et al, J Clin Invest 100:503, b-Rehermann et al., J. Clin. Invest 97:1655, c-Nayersina et al., J Immunol 150:4659) 또는 트랜스제닉 마우스로부터 유도된 면역원성 평가. 양성 평가(+)는 반응자가 이들 시스템의 하나에 기록된 경우를 나타낸다.
[표 ⅩⅩⅩb] 비-교차 반응성 HBV A2-슈퍼모티프 펩티드의 면역원성
초기 배양물, 급성 환자(a-Bertoni et al, J Clin Invest 100:503, b-Rehermann et al., J. Clin. Invest 97:1655, c-Nayersina et al., J Immunol 150:4659) 또는 트랜스제닉 마우스로부터 유도된 면역원성 평가. 양성 평가(+)는 반응자가 이들 시스템의 하나에 기록된 경우를 나타낸다.
[표 ⅩⅩⅩc] pol 538 유사체로 유도된 CTL a 에 의한 HBV pol 538 및 라미부딘(Lamivudine) 유도 pol 538 변이체의 교차-인지
자극 펩티드 6일 CTL 반응(△LU)
HBV pol 538(YMDDVVLGA)b HBV pol 538 돌연변이체(YVDDVVLGA)
HBV pol 538 27.8 54.2
HBV pol 538 돌연변이체 35.3 27.9
a. CTL은 HBV pol 538의 1090.77 유사체(펩티드 1090.14)를 사용하여 유도하였다. 1090.77은 DNA 미니유전자 pEP2.AOS 내에서 암호화하였다.
b. 나타낸 값들은 2개의 독립된 배양물로부터 얻은 △LU의 기하 평균을 나타낸다. 표적 세포 상에 로딩된 펩티드는 1090.14(HBV pol 538) 또는 1353.02(pol 538의 라미부딘 유도 돌연변이체) 였다.
[표 ⅩⅩⅩⅠa] HBV-유도 A3-슈퍼모티프 교차-반응성 펩티드의 면역원성
1. 초기 배양물, Bertoni et al, J Clin Invest 100:503 또는 트랜스제닉 마우스로부터 유도된 면역원성 평가. 양성 평가(+)는 반응자가 이들 시스템의 하나에 기록된 경우를 나타낸다. 음성 평가(-)는 조사시 반응자가 없는 것을 나타낸다.
[표 ⅩⅩⅩⅠb] 비-교차 반응성 HBV A3-슈퍼모티프 펩티드의 면역원성
1. 초기 배양물, Bertoni et al, J Clin Invest 100:503 또는 트랜스제닉 마우스로부터 유도된 면역원성 평가. 양성 평가(+)는 반응자가 이들 시스템의 하나에 기록된 경우를 나타낸다. 음성 평가(-)는 조사시 반응자가 없는 것을 나타낸다.
[표 ⅩⅩⅩⅡa] HBV B7-슈퍼모티프 교차-반응성 펩티드의 면역원성
1. 초기 배양물, Bertoni et al, J Clin Invest 100:503 또는 트랜스제닉 마우스로부터 유도된 면역원성 평가. 양성 평가(+)는 반응자가 이들 시스템의 하나에 기록된 경우를 나타낸다. 음성 평가(-)는 조사시 반응자가 없는 것을 나타낸다.
[표 ⅩⅩⅩⅡb] 비-교차 반응성 HBV B7-슈퍼모티프 펩티드의 면역원성
1. 초기 배양물, Bertoni et al, J Clin Invest 100:503 또는 트랜스제닉 마우스로부터 유도된 면역원성 평가. 양성 평가(+)는 반응자가 이들 시스템의 하나에 기록된 경우를 나타낸다. 음성 평가(-)는 조사시 반응자가 없는 것을 나타낸다.
[표 ⅩⅩⅩⅢ] 후보 HBV-유도 HTL 에피토프
[표 ⅩⅩⅩⅣ] HLA-DR 스크리닝 패널
[표 ⅩⅩⅩⅤ] HBV-유도 교차-반응성 HLA-DR 결합 펩티드
a. 대쉬는 IC50nM ＞ 20,000을 나타낸다.
[표 ⅩⅩⅩⅥ] HBV-유도 DR3-결합 펩티드
*펩티드 35.0100으로서 시험.
[표 ⅩⅩⅩⅦa] HBV 바람직한 CTL 에피토프
[표 ⅩⅩⅩⅦb] HBV 바람직한 HTL 에피토프
[표 ⅩⅩⅩⅧ] HBV 유도 HTL 에피토프의 패널에 의하여 평가된 집단 적용범위
1. 총 집단 적용범위는 다수 민족 집단 내의 DRX의 존재에 대한 고려를 위하여 조정하였다. DRX 대립유전자에 의하여 표현되는 특이성의 범위는 이전에 특징지워진 HLA-DR 대립유전자의 그것을 반영할 것이라고 보았다. 각 모티프 하에 혼입된 DRX의 집단은 그 집단의 나머지에서의 그 모티프의 빈도를 대표하는 것이다. 총 적용범위는 미공지 유전자형에 대한 고려를 위하여 조정하지 않았다.
2. 에피토프의 수는 표 12에 나타낸 에피토프만을 고려한 최소 평가를 나타낸다. 중첩 에피토프에 의하여 결합 가능한 추가의 대립유전자는 고려하지 않았다.

Claims (37)

  1. 하나 이상의 B형 간염 바이러스(HBV) 펩티드를 포함하는 조성물로서, 상기 HBV 펩티드는 하기 군으로부터 선택되는 서열로 구성되는 분리 제조된 에피토프를 포함하는 것인 조성물:
    ALMPLYACI,WLSLLVPFV,YMDDVVLGA,
    LLPIFFCLWV,HTLWKAGILYK,NVSIPWTHK,
    LVVDFSQFSR,QAFTFSPTYK,SAICSVVRR,
    KVGNFTGLY,FPHCLAFSYM,IPIPSSWAF,
    HPAAMPHLL,YPALMPLYACI,TPARVTGGVF,
    DLLDTASALY,LSLDVSAAFY,WMMWYWGPSLY,
    RWMCLRRFII,SWLSLLVPF,SWWTSLNFL,
    EYLVSFGVWI,AYRPPNAPI,WFHISCLTF,
    SWPKFAVPNL,KYTSFPWLL,LQSLTNLLSSNLSWL,
    KQAFTFSPTYKAFLC,AGFFLLTRILTIPQS,GTSFVYVPSALNPAD,
    VSFGVWIRTPPAYRPPNAPI,RHYLHTLWKAGILYK,LVPFVQWFVGLSPTV,
    LHLYSHPIILGFRKI,PFLLAQFTSAICSVV,KQCFRKLPVNRPIDW,
    AANWILRGTSFVYVP,PHHTALRQAILCWGELMTLA,LCQVFADATPTGWGL,
    ESRLVVDFSQFSRGN,VGPLTVNEKRRLKLI 및SSNLSWLSLDVSAAF.
  2. 제1항에 있어서, FLLSLGIHL, FLPSDFFPSV, LPSDFFPSV, FLLTRILTI, LLVPFVQWFV, LYSHPIILGF, STLPETTVVRR 및 GLSRYVARL로 구성된 군으로부터 선택되는 에피토프를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 에피토프가 아미노산 링커(linker)에 결합되는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 에피토프가 CTL 에피토프에 혼합되거나 결합되는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 에피토프가 HTL 에피토프에 혼합되거나 결합되는 것인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 HTL 에피토프가 pan-DR 결합 분자인 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 리포솜을 추가로 포함하며, 상기 에피토프는 상기 리포솜 상에 또는 그 안에 존재하는 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 에피토프가 지질에 결합되는 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 에피토프가 헤테로폴리머인 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 에피토프가 호모폴리머인 것인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 에피토프가 HLA 중쇄, β2-마이크로글로불린 및 스트레프아비딘 복합체에 결합되어 테트라머(tetramer)를 형성하는 것인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 항원 제시 세포를 추가로 포함하며, 상기 에피토프는 상기 항원 제시 세포 상에 또는 그 안에 존재하는 것인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 에피토프가 상기 항원 제시 세포 상의 HLA 분자에 결합됨으로써, 상기 HLA 분자로 제한된 세포독성 T 림프구(CTL)가 존재하는 경우에, 상기 CTL의 수용체가 상기 HLA 분자 및 상기 에피토프의 복합체에 결합하는 것인 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 항원 제시 세포가 수지상 세포인 것인 조성물.
  15. 하나 이상의 펩티드를 포함하고, 둘 이상의 에피토프를 추가로 포함하는 조성물로서, 상기 에피토프 중 하나는 하기 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 것이며, 상기 하나 이상의 펩티드 각각은 B형 간염 바이러스(HBV)의 천연 펩티드 서열과 100 % 동일한 인접 아미노산 50 미만을 포함하는 것인 조성물:
    ALMPLYACI,WLSLLVPFV,YMDDVVLGA,
    LLPIFFCLWV,HTLWKAGILYK,NVSIPWTHK,
    LVVDFSQFSR,QAFTFSPTYK,SAICSVVRR,
    KVGNFTGLY,FPHCLAFSYM,IPIPSSWAF,
    HPAAMPHLL,YPALMPLYACI,TPARVTGGVF,
    DLLDTASALY,LSLDVSAAFY,WMMWYWGPSLY,
    RWMCLRRFII,SWLSLLVPF,SWWTSLNFL,
    EYLVSFGVWI,AYRPPNAPI,WFHISCLTF,
    SWPKFAVPNL,KYTSFPWLL,LQSLTNLLSSNLSWL,
    KQAFTFSPTYKAFLC,AGFFLLTRILTIPQS,GTSFVYVPSALNPAD,
    VSFGVWIRTPPAYRPPNAPI,RHYLHTLWKAGILYK,LVPFVQWFVGLSPTV,
    LHLYSHPIILGFRKI,PFLLAQFTSAICSVV,KQCFRKLPVNRPIDW,
    AANWILRGTSFVYVP,PHHTALRQAILCWGELMTLA,LCQVFADATPTGWGL,
    ESRLVVDFSQFSRGN,VGPLTVNEKRRLKLI 및SSNLSWLSLDVSAAF.
  16. 제15항에 있어서, FLLSLGIHL, FLPSDFFPSV, LPSDFFPSV, FLLTRILTI, LLVPFVQWFV, LYSHPIILGF, STLPETTVVRR 및 GLSRYVARL로 구성된 군으로부터 선택되는 에피토프를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 하나의 펩티드가 둘 이상의 에피토프를 포함하는 것인 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 상기 하나 이상의 펩티드 중 적어도 하나가 헤테로폴리머인 것인 조성물.
  19. 제15항에 있어서, 제15항에 언급된 상기 군으로부터 선택된 에피토프가 세포독성 T 림프구(CTL) 에피토프에 결합되는 것인 조성물.
  20. 제15항에 있어서, 제15항에 언급된 상기 군으로부터 선택된 에피토프가 헬퍼 T 림프구(HTL) 에피토프에 결합되는 것인 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 HTL 에피토프가 pan-DR 결합 분자인 것인 조성물.
  22. 제15항에 있어서, 상기 조성물이 리포솜을 추가로 포함하며, 상기 에피토프는 상기 리포솜 상에 또는 그 안에 존재하는 것인 조성물.
  23. 제15항에 있어서, 제15항에 언급된 상기 군으로부터 선택된 에피토프가 지질에 결합되는 것인 조성물.
  24. 제15항에 있어서, 상기 조성물이 항원 제시 세포를 추가로 포함하며, 제15항에 언급된 상기 군으로부터 선택된 에피토프는 상기 항원 제시 세포 상에 또는 그 안에 존재하는 것인 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 에피토프가 상기 항원 제시 세포 상의 HLA 분자에 결합됨으로써, 상기 HLA 분자로 제한된 세포독성 T 림프구(CTL)가 존재하는 경우에, 상기 CTL의 수용체가 상기 HLA 분자 및 상기 에피토프의 복합체에 결합하는 것인 조성물.
  26. 제24항에 있어서, 상기 항원 제시 세포가 수지상 세포인 것인 조성물.
  27. 제15항에 있어서, 상기 하나 이상의 펩티드와 혼합된 추가의 펩티드를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 추가의 펩티드가 CTL 또는 HTL 에피토프를 포함하는 것인 조성물.
  29. 펩티드 단위 투여량 및 약학적 부형제를 포함하는 백신 조성물로서, 상기 펩티드는 B형 간염 바이러스의 천연 펩티드 서열과 100 % 동일한 인접 아미노산 50 미만을 포함하고, 하기 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 에피토프를 포함하는것인 조성물:
    ALMPLYACI,WLSLLVPFV,YMDDVVLGA,
    LLPIFFCLWV,HTLWKAGILYK,NVSIPWTHK,
    LVVDFSQFSR,QAFTFSPTYK,SAICSVVRR,
    KVGNFTGLY,FPHCLAFSYM,IPIPSSWAF,
    HPAAMPHLL,YPALMPLYACI,TPARVTGGVF,
    DLLDTASALY,LSLDVSAAFY,WMMWYWGPSLY,
    RWMCLRRFII,SWLSLLVPF,SWWTSLNFL,
    EYLVSFGVWI,AYRPPNAPI,WFHISCLTF,
    SWPKFAVPNL,KYTSFPWLL,LQSLTNLLSSNLSWL,
    KQAFTFSPTYKAFLC,AGFFLLTRILTIPQS,GTSFVYVPSALNPAD,
    VSFGVWIRTPPAYRPPNAPI,RHYLHTLWKAGILYK,LVPFVQWFVGLSPTV,
    LHLYSHPIILGFRKI,PFLLAQFTSAICSVV,KQCFRKLPVNRPIDW,
    AANWILRGTSFVYVP,PHHTALRQAILCWGELMTLA,LCQVFADATPTGWGL,
    ESRLVVDFSQFSRGN,VGPLTVNEKRRLKLI 및SSNLSWLSLDVSAAF.
  30. 제29항에 있어서, 추가의 에피토프를 추가로 포함하는 것인 백신 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 추가의 에피토프가 FLLSLGIHL, FLPSDFFPSV, LPSDFFPSV, FLLTRILTI, LLVPFVQWFV, LYSHPIILGF, STLPETTVVRR 및 GLSRYVARL로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  32. 제30항에 있어서, 상기 추가의 에피토프가 PanDR 결합 분자인 것인 백신 조성물.
  33. 제29항에 있어서, 상기 약학적 부형제가 아쥬반트(adjuvant)를 포함하는 것인 백신 조성물.
  34. 제29항에 있어서, 항원 제시 세포를 추가로 포함하는 것인 백신 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 에피토프가 상기 항원 제시 세포 상의 HLA 분자에 결합됨으로써, 상기 HLA 분자로 제한된 세포독성 T 림프구(CTL)가 존재하는 경우에, 상기 CTL의 수용체가 상기 HLA 분자 및 상기 에피토프의 복합체에 결합하는 것인 백신 조성물.
  36. 제34항에 있어서, 상기 항원 제시 세포가 수지상 세포인 것인 백신 조성물.
  37. 제29항에 있어서, 상기 조성물이 리포솜을 추가로 포함하며, 상기 하나 이상의 에피토프는 상기 리포솜 상에 또는 그 안에 존재하는 것인 백신 조성물.
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