DE69334155T2

DE69334155T2 - Rekombinante mutanten zur induktion spezifischer immunantworten

Info

Publication number: DE69334155T2
Application number: DE69334155T
Authority: DE
Inventors: Daniel Ladant; Claude Leclerc; Peter Sebo; Agnès ULLMAN
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1992-04-21
Filing date: 1993-04-21
Publication date: 2008-02-14
Anticipated expiration: 2013-04-22
Also published as: PT637335E; ATE368113T1; DE69334155D1; EP0637335A1; WO1993021324A1; DK0637335T3; EP1715047A3; US5503829A; EP0637335B1; US5679784A; CA2133999A1; EP1715047A2; ES2290950T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Induzierung einer Immunantwort, wobei die Zusammensetzung eine rekombinante Adenylatcyclase umfaßt, die durch Expression des cyaC-Gens von Bordetella sp. gewonnen wird, welches operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden ist, und ein rekombinantes cyaA-Gen von Bordetella sp. welches die Adenylatcyclase codiert, die operativ an eine Expressionskontrollsequenz gebunden ist, wobei das cyaA-Gen mindestens eine Insertion einer heterologen DNA-Sequenz in mindestens einer permissiven Stelle enthält, und wobei der Adenylatcyclase katalytische Aktivität fehlt; und wobei die Expression ferner in einer Wirtszelle durchgeführt wird, die aus der Gruppe der Bakterien, eukaryontischen Zellen und Hefen ausgewählt ist.
Diese Anmeldung beschreibt ein rekombinantes DNA-Molekül, welches das Adenylatcyclasetoxin-Gen (cyaA) oder ein Fragment davon umfaßt, welches eine Insertion einer heterologen DNA-Sequenz an einer permissiven Stelle enthält, wobei das Fragment ein Polypeptid codiert, welches die gleichen immunologischen Eigenschaften wie das CyaA-Genprodukt aufweist. In spezifischen Ausführungsformen dieser Erfindung codiert die heterologe DNA-Sequenz ein immunologisches Epitop. CyaA kann aus irgendeinem Mikroorganismus oder sonstwie gewonnen werden.
Diese Anmeldung beschreibt auch eine rekombinante Adenylatcyclase, welche ein heterologes Epitop an einer permissiven Stelle umfaßt. In spezifischen Ausführungsformen dieser Erfindung ist das heterologe Epitop in die N-terminale katalytische Domäne der rekombinanten Adenylatcyclase inseriert und kann dem Immunsystem in Verbindung mit Klasse I des Haupthistokompatibilitätskomples (MHC) präsentiert werden. In anderen Ausführungsformen dieser Erfindung ist das heterologe Epitop in die C-terminale katalytische Domäne inseriert und kann dem Immunsystem in Verbindung Klasse II-MHC präsentiert werden.
Verfahren zur Induzierung spezifischer Immunreaktionen in Tieren, die durch immunologische Zusammensetzungen immunisiert sind, welche rekombinante Adenylatcyclase umfassen, sind ebenfalls offenbart. In spezifischen Ausführungsformen dieser Erfindung werden B-Zell-, CD4⁺- und cytotoxische T-Zell-Reaktionen spezifisch induziert. Mit dem Auftreten der rekombinanten DNA-Techniken zur Modifizierung von Proteinsequenzen ist beträchtlicher Aufwand darauf gerichtet worden, spezifische existierende Proteine zu verändern oder zu verbessern. Modifizierungen spezifischer Aminosäuren von Enzymen bei bekannten Strukturen, um die Spezifität zu ändern, ist durch ortsspezifische Mutagenese erzielt worden. Obwohl das Wissen über die dreidimensionale Struktur auf eine begrenzte Anzahl an Proteinen beschränkt ist, bieten Sequenzvergleiche zwischen Mitgliedern von Familien aus homologen Proteinen wie auch zunehmend akkurate Vorhersagen der Sekundär- und Tertiärstrukturen eine nützliche Grundlage zum Redesign von Enzymfunktion.
Ein weiterer Ansatz von großem potentiellen Interesse ist die Insertion neuer Peptidsequenzen in ein definiertes Protein. Die Insertionsmutagenese ist effizient verwendet worden, um die Topologie von Membranproteinen zu untersuchen (Charbit et al., 1986, 1991) und im Falle von löslichen Proteinen, um Regionen natürlicher Flexibilität zu bestimmen (Barany, 1985a, 1985b; Freimuth und Ginseberg, 1986; Starzyk et al., 1989; Freimuth et al., 1990; Kumar und Black, 1991). Daneben ist die Insertion spezifischer exogener Peptide innerhalb eines Enzyms in der Lage die katalytischen oder regulatorischen Eigenschaften verändern zu können, wodurch eine rationale Grundlage zur Proteinrekombination bereitgestellt wird. Zusätzlich kann die Proteinrekombination verwendet werden, um die Immunreaktion spezifisch zu ändern oder gegen ein definiertes Epitop zu richten, indem das Umfeld des Epitops geändert wird.
Die Immunreaktion kann in zwei unterschiedliche Systeme unterteilt werden, die zelluläre Immunität und die humorale Immunität. Die humorale Immunität wird durch lösliche Moleküle vermittelt, in der Hauptsache Antikörper. Im Gegensatz dazu wird die zelluläre Immunität durch intakte Zellen vermittelt, meistens durch T-Lymphozyten. Die genaue Immunreaktion, die durch ein fremdes Antigen erzeugt wird, hängt von der Art des Antigens und der Umgebung ab, in der das Antigen oder ein Epitop des Antigens dem Immunsystem präsentiert wird.
Das auslösende Ereignis einer humoralen Immunreaktion ist die Bindung eines B-Epitops an ein Membran-assoziiertes Immunglobulin (Ig) auf einer spezifischen Unterklasse von B-Zellen. Diese Bindung stimuliert den Eintritt der B-Zellen in den Zellzyklus, was schließlich zur Produktion von Antikörpern führt, die spezifisch das B-Epitop erkennen. Die Antikörperreaktion, die durch ein B-Epitop ausgelöst wird, kann T-Zell-abhängig oder T-Zell-unabhängig sein. T-Zell-abhängige Reaktionen werden durch eine sehr geringe Primärreaktion charakterisiert, gefolgt von einer IgG-Erinnerungsreaktion. Die T-Zell-unabhängige Reaktion ist demgegenüber durch eine schnelle, intensive und fortgesetzte IgM-Antikörperreaktion gekennzeichnet.
Die T-Zell-vermittelte Immunreaktion wird durch T-Epitope aktiviert. T-Epitope fallen allgemein in zwei Kategorien. Viele Epitope können sowohl T-Zellen und B-Zellen aktivieren und sind daher sowohl T-Epitope und B-Epitope. Andere T-Epitope sind denaturierte Formen nativer antigener Determinanten und können eine B-Zell-abhängige Zell-vermittelte humorale Immunreaktion nicht aktivieren.
Um eine Zell-vermittelte Immunreaktion zu aktivieren, muß das T-Epitop mit Molekülen des Haupthistokampatibilitätskomplexes (MHC) assoziiert sein. Der MHC ist ein Bereich hochpolymorpher Gene, deren Produkte auf der Oberfläche zahlreicher Zellen exprimiert sind. Es gibt zwei Hauptgruppen von MHC. Klasse I-MHC ist ein Transmembranprotein, welches aus zwei Polypeptidketten besteht. Das Molekül enthält eine extrazelluläre Peptidbindungsregion, die an der Peptidbindungsstelle polymorph ist, eine Immunglobulin-artige Region, eine Transmembranregion und eine cytoplasmische Domäne, die Phosphorylierungsstellen für cAMP-abhängige Proteinkinase enthält.
Klasse I-MHC wird auf nahezu allen kernhaltigen Zellen gefunden. Klasse I-MHC assoziieren sich im allgemeinen mit endogenen synthetisierten T-Epitopen zur Präsentierung für das zellvermittelte Immunsystem. Da diese Assoziierung der Klasse I-MHC mit spezifischem Antigen im endoplasmatischen Retikulum auftritt, sind Antigene, die durch eine Antigen-präsentierende Zelle über den Endocytoseweg internalisiert werden, allgemein nicht mit Klasse I MHC assoziiert. Die Assoziierung eines spezifischen T-Epitops mit Klasse I-MHC und die Inkorporation des Antigen-MHC-Klasse I-Komplexes auf der Oberfläche einer Zelle stimuliert spezifische cytotoxische T-Lymphozyten (CTL). Die stimulierten cytotoxischen T-Lymphozyten können dann die Zelle abtöten, die den Antigen-MHC-Komplex exprimiert, durch Granulaexozytose eines Membranporen-bildenden Proteins, welches die Zelllyse verursacht, sowie durch die Sekretion eines Zelltoxins, das die DNA-degradierenden Enzyme aktiviert. Jedoch benötigt die Aktivierung der CTL-Zellen in einigen Fällen auch die Aktivierung von T-Helferzellen.
Die andere Hauptklasse an MHC-Proteinen sind die Klasse II-MHCs. Klasse II-MHCs sind auch Transmembranproteine. Wie die Klasse I-MHC umfassen Klasse II-MHC Polypeptidketten und schließen eine polymorphe Peptidbindungsregion ein, eine Immunglobulin-artige Region, eine Transmembranregion und eine cytoplasmatische Domäne. Anders als jedoch die Klasse I-MHC sind Klasse II-Moleküle nur auf "Antigen-präsentierenden Zellen" wie beispielsweise B-Lymphozyten, Makrophagen, dendritischen Zellen, Endothelzellen und wenigen anderen exprimiert. T-Epitope werden mit Klasse II-MHC assoziiert, wenn ein Antigen, das das T-Epitop umfaßt an die Oberfläche einer Antigen-präsentierende Zelle bindet. Das Antigen dringt in die Zelle durch Phagozytose oder durch Rezeptor-vermittelte Endozytose in Clathrin-ausgekleidete Vesikel ein. Alternativ dazu können lösliche Antigene durch Flüssigphasen-Pinocytose internanalysiert werden. Sobald das Antigen internalisiert wurde, wird es durch zelluläre Proteasen in sauren Vesikeln prozessiert, was zu Peptiden von 10 bis 20 Aminosäuren Länge führt. Diese Epitope binden das MHC-Klasse II-Molekül in intrazellulären Vesikeln und der Komplex wird zur Zelloberfläche transportiert. Das Vorhandensein des MHC-Klasse II-Antigen-Komplex auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen führt zur Stimulierung von Subpopulationen von T-Helferzellen. Diese Zellen helfen der CTL-Funktion wie auch den B-Zell-Reaktionen. Zusätzlich können T-Helferzellen entzündliche Reaktionen vermitteln.
Zwei wichtige Faktoren bei der Bestimmung des Charakters einer Immunreaktion sind die Art des Antigens, welches erkannt wird, und das intrazelluläre oder extrazelluläre Ausrichten des Antigens. So wird ein T-Zellepitop, das so ausgerichtet ist, daß es eine Antigen-präsentierende Zelle in einem Rezeptor-vermittelten Endocytose-abhängigen Weg betritt mit Klasse II-MHC assoziiert und aktiviert T-Helferzellen, aber nicht CTL-Zellen. Außerdem wird, wenn ein fremdes T-Zellepitop in das Cytoplasma einer Zielzelle dirigiert werden kann, in einer Rezeptor-vermittelten Endocytose unabhängigen Weise das Epitop mit Klasse I-MHC assoziiert und erlaubt die Aktivierung von CTL-Zellen. Daher besteht in dem Fachgebiet die Notwendigkeit spezifisch Zielepitope auszurichten, um selektiv eine zellvermittelte oder humorale Reaktion zu aktivieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Induzierung einer Immunreaktion, wobei die Zusammensetzung eine rekombinante Adenylatcyclase umfaßt, die durch Expression des cyaC-Gens von Bordetella sp., welches operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden ist, gewonnen wird, und durch ein rekombinantes cyaA-Gen von Bordetella sp., welches Adenylatcyclase operativ verbunden mit einer Expressionskontrollsequenz codiert, wobei das cyaA-Gen mindestens eine Insertion einer heterologen DNA-Sequenz in mindestens einer permissiven Stelle enthält und wobei der Adenylatcyclase die katalytische Aktivität fehlt; und wobei die Expression ferner in einer Wirtszelle durchgeführt wird, die aus der Gruppe der Bakterien, eukaryontischen Zellen und Hefen ausgewählt ist.
Ein rekombinantes Plasmid, das zur Exprimierung der Adenylatcyclase nützlich ist, wird offenbart, wobei das Plasmid die cyaA und cyaC-Gene von Bordetella sp.-Adenylatcyclase umfaßt, die operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden sind, wobei das rekombinante Plasmid die Expression von Bordetella sp.-Adenylatcyclase in einer transformierten Wirtszelle steuert, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Bakterien, eukaryontischen Zellen und Hefe besteht. In einer spezifischen Ausführungsform dieser Erfindung sind das cyaA-Gen und cyaC-Gen das cyaA-Gen und das cyaC-Gen von Bordetella pertussis. In anderen spezifischen Ausführungsformen dieser Erfindung ist die Wirtszelle E. coli, die Expressionskontrollsequenz umfaßt den Lac-Promotor oder das cyaA-Gen umfaßt DNA, welcher ein heterologes Epitop codiert. In einer spezifischen Ausführungsform ist das rekombinante Plasmid pCACT3.
Diese Anmeldung beschreibt auch ein rekombinantes DNA-Molekül, das das cyaA-Adenylatcyclase-Gen von Bordetella sp. oder Homologe davon umfaßt, wobei das cyaA-Gen mindestens eine Insertion einer heterologen DNA-Sequenz an mindestens einer permissiven Stelle enthält. In Ausführungsformen dieser Erfindung codiert die heterologe DNA-Sequenz weniger als 25 Aminosäuren, zwischen 10–20 Aminosäuren und 16 Aminosäuren. In spezifischen Ausführungsformen dieser Erfindung ist die heterologe DNA-Sequenz ein Epitop des Poliovirus, HIV-Virus, Influenzavirus oder lymphozytischen Choriomeningitis-Virus und ist in die N-terminale katalytische Domäne oder die C-terminale Domäne inseriert.
Diese Anmeldung beschreibt ferner eine rekombinante Bordetella pertussis-Adenylatcyclase, welche ein heterologes Epitop an einer permissiven Stelle umfaßt. In einer Ausführungsform dieser Erfindung liegt die Adenylatcyclase in detoxifizierter Form vor. In spezifischen Ausführungsformen dieser Erfindung ist das heterologe Epitop in die N-terminale katalytische Domäne inseriert und das heterologe Epitop führt den CD8⁺-T-Lymphozyten in Verbindung mit Molekülen des Klasse I-Haupt-Histo kompatibilitätskomplexes präsentiert. In anderen spezifischen Ausführungsformen dieser Erfindung ist das heterologe Epitop in die C-terminale Domäne inseriert und wird CD4⁺-T-Lymphozyten in Verbindung mit Molekülen des Klasse II-Haupt-Histokompatibilitätskomplexes präsentiert.
In einer spezifischen Ausführungsform dieser Erfindung wird die permissive Stelle der Bordetella pertussis Adenylatcyclase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Resten 137–138, den Resten 224–225, den Resten 228–229, den Resten 235–236 und den Resten 317–318. In anderen spezifischen Ausführungsformen dieser Erfindung ist das heterologe Epitop der rekombinanten Bordetella pertussis-Adenylatcyclase das Epitop 118–132 des Nukleoproteins des lymphozytischen Choriomeningitis-Virus, eines Epitops des HIV-Virus, insbesondere des Epitops welches in die V3-Schlaufe eingeschlossen ist, eines Epitops des Influenzavirus oder eines Epitops des Poliovirus, insbesondere Epitop 103–116 von Poliovirus.
Außerdem beschreibt diese Erfindung ein Verfahren zum Induzieren einer B-Zell-Immunreaktion, umfassend die Immunisierung von Tieren mit lebenden Bakterien, welche eine rekombinante Adenylatcyclase exprimieren, oder eine immunologische Zusammensetzung, welche eine rekombinante Adenylatcyclase umfaßt, oder ein Fragment von AC, wobei die rekombinante Adenylatcyclase ein heterologes B-Epitop umfaßt.
In spezifischen Ausführungsformen dieser Erfindung sind die in dem Verfahren zur Induzierung einer B-Zellreaktion verwendeten Bakterien E. coli. In einer weiteren Ausführungsform sind die Tiere, die mit der immunologischen Zusammensetzung oder Bakterien immunisiert werden, Menschen. In spezifischen Ausführungsformen ist das heterologe B-Epitop ein Poliovirus-B-Epitop, ein HIV-B-Epitop, ein lymphozytisches Choriomeningitis-Virus-B-Epitop, oder ein Influenzavirus-B-Epitop.
Ein Verfahren zur Induzierung einer CD4⁺-T-Zel1-Immunreaktion ist ebenfalls beschrieben, wobei das Verfahren die Immunisierung von Tieren mit einer immunologischen Zusammensetzung umfaßt, welche eine rekombinante Adenylatcyclase umfaßt, wobei die rekombinante Adenylatcyclase ein heterologes T-Epitop an einer permissiven Stelle in der C-terminalen Domäne dieser rekombinanten Adenylatcyclase umfaßt.
In einer spezifischen Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt die immunologische Zusammensetzung ferner ein geeignetes Adjuvans. In einer weiteren Ausführungsform ist das heterologe T-Epitop ein T-Epitop von Poliovirus, HIV, Influenzavirus oder lymphozytischem Choriomeningitis-Virus.
Diese Anmeldung offenbart ferner ein Verfahren zur Induzierung von CD8⁺-T-Zell-Immunreaktion, wobei das Verfahren die Immunisierung von Tieren mit einer immunologischen Zusammensetzung umfaßt, welche eine rekombinante Adenylatcyclase umfaßt, wobei die rekombinante Adenylatcyclase mindestens ein heterologes CTL-Epitop an mindestens einer permissiven Stelle in der N-terminalen katalytischen Domäne der rekombinanten Adenylatcyclase umfaßt.
In einer spezifischen Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt die immunologische Zusammensetzung ferner ein geeignetes Adjuvans, wie beispielsweise Aluminiumhydroxid. In einer weiteren Ausführungsform ist das heterologe T-Epitop ein T-Epitop von Poliovirus, HIV, Choriomeningitis-Virus, insbesondere Epitop 118–132 des Nukleoproteins des Choriomeningitis-Virus oder Influenzavirus.
Kurze Beschreibung der Figur
Die Figur stellt schematisch ein Verfahren zur Konstruktion von Plasmid pCACT3 dar.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Induzierung einer Immunantwort, wobei die Zusammensetzung eine rekombinante Adenylatcyclase umfaßt, die durch Expression des cyaC-Gens von Bordetella sp. gewonnen wird, welche operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden ist, und ein rekombinantes cyaA-Gen von Bordetella sp. welches die Adenylatcyclase codiert, die operativ an eine Expressionskontrollsequenz gebunden ist, wobei das cyaA-Gen mindestens eine Insertion einer heterologen DNA-Sequenz in mindestens einer permissiven Stelle enthält, und wobei der Adenylatcyclase katalytische Aktivität fehlt; und wobei die Expression ferner in einer Wirtszelle durchgeführt wird, die aus der Gruppe der Bakterien, eukaryontischen Zellen und Hefen ausgewählt ist.
Diese Anmeldung offenbart rekombinante DNA-Moleküle, die das Bordetella pertussis-cyaA-Gen umfassen, wobei das cyaA-Gen eine Insertion einer heterologen DNA-Sequenz an einer permissiven Stelle enthält. Diese Erfindung betrifft auch eine rekombinante Adenylatcyclase aus Bordetella pertussis, umfassend ein heterologes Epitop an einer permissiven Stelle.
Ein Verfahren zur Induzierung einer T-Zell-Immunreaktion, umfassend das Immunisieren von Tieren mit einer immunologischen Zusammensetzung ist ebenfalls beschrieben, wobei die immunologische Zusammensetzung eine rekombinante Bordetella pertussis-Adenylatcyclase mit einem heterologen T-Epitop an einer permissiven Stelle innerhalb der C-terminalen Domäne umfaßt. Ebenfalls beschrieben ist ein Verfahren zum Induzieren in einer CD8⁺-T-Zellimmunreaktion, umfassend das Immunisieren von Tieren mit einer immunologischen Zusammensetzung, wobei die immunologische Zusammensetzung eine rekombinante Bordetella pertussis-Adenylatcyclase mit einem heterologen T-Epitop an einer permissiven Stelle innerhalb der N-terminalen katalytischen Domäne umfaßt.
So wie es hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff "Expressionskontrollsequenz" auf eine Sequenz einer Nukleinsäure, die die Transkription und/oder Translation eines Struktur-Gens reguliert. Diese Regulierung kann direkt oder indirekt sein. So schließen Beispiele für Expressionskontrollsequenzen Promotoren, Operatoren, Ribosomen-Bindungsstellen und DNA ein, welche Ribosomen-Bindungsstellen codiert.
So wie es hier verwendet wird, bezeichnet der Begriff "heterologe DNA-Sequenz" eine DNA-Sequenz, die von der DNA einer Spezies abstammt, die anders ist als die DNA des Restes des Moleküls oder Gens, in der die heterologe Sequenz lokalisiert ist. Die heterologe DNA-Sequenz kann enzymatisch oder chemisch synthetisiert sein. Alternativ dazu kann die heterologe DNA-Sequenz direkt aus einem Quellenorganismus isoliert sein.
So wie es hier verwendet wird, bezieht sich hier unter Bezugnahme auf ein Protein der Begriff "permissive Stelle" auf eine Stelle innerhalb des Proteinmoleküls, wo exogene Aminosäuren hinzugefügt werden können, ohne die funktionalen Eigenschaften des Proteins merkbar zu beeinflussen.
So wie es hier verwendet wird, bezieht sich unter Bezugnahme auf eine Nukleinsäure der Begriff "permissive Stelle" auf eine Stelle innerhalb der Nukleinsäure, wo exogene Nukleotide eingefügt werden können, während das Leseraster bewahrt wird, ohne die funktionalen Eigenschaften eines Proteins, das von dieser Nukleinsäure exprimiert wird, zu beeinflussen.
So wie es hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff "Epitop" auf eine Sequenz aus Aminosäuren, oder ein anderes Molekül oder Fragment davon, das eine Immunreaktion auslösen kann.
So wie es hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff "B-Epitop" auf eine Sequenz von Aminosäuren, oder eines anderen Moleküls oder eines Fragments davon, das eine Immunreaktion induzieren kann, die B-Lmyphozyten einschließt.
So wie es hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff "heterologes Epitop" auf ein Epitop, das in ein Protein durch rekombinante Technik inseriert werden kann, wobei das inserierte Epitop natürlicherweise nicht in diesem Protein gefunden wird.
E. coli-Stamm XL-1, welcher pCACT3 enthält, wurde bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes des Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris, Cedex 15, Frankreich unter der Zugangsnummer I-1201 am 8. April 1992 hinterlegt.
Der Mechanismus, durch den die Immunogenizität der definierten Peptidepitope kontrolliert wird, schließt sowohl die intrinsischen Eigenschaften eines gegebenen Epitops und die Umgebungsfaktoren ein. Diese Umgebungsfaktoren schließen ein, ob das Epitop als Teil eines Komplexes und organisierter Strukturen wie beispielsweise Parasiten oder Bakterien exponiert ist. Durch Exprimieren eines gegebenen Peptidepitops in verschiedenen permissiven Stellen zahlreicher bakterieller Proteine ist es möglich die Umgebungsfaktoren zu ändern, und dadurch spezifisch die Immunogenizität des Peptidepitops zu modifizieren.
Die Adenylatcyclase von Bordetella pertussis stellt ein geeignetes Vehikel dar, um die immunogene Reaktion eines heterologen Peptidepitops in Ausführungsformen dieser Erfindung zu spezifizieren. Die Bordetella pertussis-Adenylatcyclase stellt eines der wesentlichen Toxine dieses Organismus dar, welches das verantwortliche Agens von Keuchhusten ist. Die Adenylatcyclase wird durch Bordetella pertussis sezerniert und besitzt die Fähigkeit in anvisierte eukaryontische Zellen einzudringen, durch Calmodulin (CaM) aktiviert zu werden, und es katalysiert die Synthese von cyclischen AMP (cAMP) wodurch der zelluläre Metabolismus gestört wird. Die Adenylatcyclase (AC) wird in Form eines Polypeptids aus 1706 Aminosäuren synthetisiert und sezerniert: die Calmodulin-abhängige katalytische Aktivität liegt in den ersten 400 Aminosäuren. Der C-terminale Teil von ungefähr 1300 Resten ist für die Bindung an Zielzellen und für die Translozierung der N-terminalen katalytischen Domäne durch die Cytoplasmamembran dieser Zellen verantwortlich. Zusätzlich besitzt diese C-terminale Portion schwache hämolytische Aktivität.
Mehrere Eigenschaften von Bordetella pertussis AC weisen darauf hin, daß dieses Toxin als Vehikel für die Induzierung einer spezifischen immunogenen Reaktion verwendet werden kann:

1) diese Adenylatcyclase ist in der Lage in viele verschiedene Zellen einzudringen, insbesondere in zahlreiche Zellarten die mit dem Immunsystem assoziiert sind;
2) die Adenylatcyclase kann durch die Zielzellen unabhängig von Rezeptor-vermittelter Endocytoseprozessen internalisiert werden, was nahe legt, daß die katalytische Domäne des Toxins zum direkten Eindringen durch die Cytoplasmamembran der Zielzellen in der Lage ist;
3) die N-terminale katalytische Domäne durchläuft eine schnelle Proteolyse innerhalb der Zielzellen, was ermöglicht, daß Epitope, die mit dieser Domäne assoziiert sind, den Klasse I-MHC-Weg der antigenen Präsentation betreten; und
4) eine Anzahl an Aminosäure, die an der katalytischen Aktivität von AC beteiligt sind, sind identifiziert worden, was die Konstruktion modifizierter AC-Toxine ermöglicht, denen die enzymatische Aktivität fehlt, und die daher nicht länger cytotoxisch sind. Siehe H. Sakamoto, P. Sebo, J. Ladant, Biol. Chem., 267: 13598–13602 (1992).

Der Bordetella pertussis-Adenylatcyclase (Cya) Toxin-codierende genetische Locus (cya) besteht aus 5 Genen (cyaA-E). Das cyaA-Gen codiert die Adenylatcyclase. Die Expression des cyaA-Gens in E. coli führt zur Produktion eines 200 kDa-Genproduktes, welches katalytische Aktivität aufweist, aber dem die invasiven hämolytischen Aktivitäten fehlen. Jedoch verleiht die Co-Expression des cyaC-Genprodukts dem cyaA-Holotoxin invasive und hämolytische Eigenschaften in einem rekonstituierenden Expressionssystem in E. coli. Die Co-Expression der cyaB-, -D- und -E-Gene in trans zu cyaA verleiht keine Invasionsfähigkeit und hämolytischen Eigenschaften beim Holotoxin, noch potenziert es die Aktivitäten, die durch das cyaC-Genprodukt verliehen werden.
Es wird vermutet, daß die cyaC-vermittelte Aktivierung von cyaA zu einer post-translationalen Modifizierung führt. Diese Modifizierung geht nicht während der Toxinreinigung aus B. pertussis verloren, wenn ein Verfahren durchgeführt wird, was eine 8 M Harnstoffextraktion oder SDS-PAGE-Auftrennung einschließt (Hewlett et al., 1989). Dieser Befund zeigt, daß die Modifizierung kovalenter Natur ist.
Die invasiven und hämolytischen Aktivitäten von cyaA-Toxin, welche rekombinant in E. coli oder natürlich in B. pertussis produziert werden, wurden verglichen. Die Ergebnisse zeigen, daß die cyaC-aktivierten Proteine, welche in E. coli produziert werden 5-mal niedrigere hämolytische Aktivitäten haben, als das Toxin, das in B. pertussis hergestellt wird. Das Verhältnis von hämolytischen vs. invasiven Eigenschaften änderte sich nicht signifikant durch die Reinigung der Proteine, was darauf hindeutet, daß die verminderte hämolytische Aktivität nicht auf irgendeinen inhibitorischen Faktor zurückzuführen ist, welcher in E. coli-Extrakten vorhanden ist, sondern eher eine intrinsische Eigenschaft der Toxine darstellt, welche in E. coli produziert werden. Zwei zusätzliche Argumente unterstützen diese Interprätation. Zunächst ist der zeitliche Verlauf der Hämolyse fast linear, unabhängig von der Quelle der Toxine, was darauf hinweist, daß die Stabilitäten der Proteine, welche aus E. coli gereinigt werden und des von B. pertussis ähnlich sind. Zum zweiten können mögliche Unterschiede in der Ausgangskonformation der Toxine, welche in den zwei Organismen hergestellt werden, ausgeschlossen werden, da die Reinigungsverfahren eine komplette Denaturierung in 8M-Harnstoff einschließen.
Diese Daten zeigen an, daß die invasiven und hämolytischen Eigenschaften des cyaA-Toxins voneinander getrennt werden können. Dies legt nahe, daß verschiedene strukturelle Bestandteile innerhalb des cyaA-Toxins an den invasiven und hämolytischen Aktivitäten beteiligt sind. Die verminderte hämolytische Aktivität des Toxins, das in E. coli produziert wird, könnte ebenfalls auf einen Unterschied in der Art der posttranslationalen Modifizierungen zurückzuführen sein, welche in den zwei Organismen stattfindet oder auf das Vorhandensein eines zusätzlichen Faktors, welcher in B. pertussis vorhanden ist, welcher notwendig ist, um dem Toxin volle hämolytische Aktivität zu verleihen.
Expressionsvektoren wurden konstruiert, welche die Expression sowohl des cyaA-Gens und des cyaC-Gens (Sebo et al., 1991) dirigieren. Zusätzlich wurde ein weiterer Plasmid-Expressionsvektor, pCACT3, konstruiert, welcher sowohl die cyaA- als auch die cyaC-Gene enthält. Dieser Expressionsvektor erlaubt einem zweiten kompatiblen Plasmid, Gene zu tragen, die für die Sekretion der cytotoxischen AC in E. coli notwendig sind, wie beispielsweise hlyB und hlyD, welche in Meckman et al., 1985 beschrieben sind.
Plasmid pCACT3 wurde in mehreren Schritten hergestellt (siehe 1):

1) Plasmid pAHL1 wurde durch Inserieren zwischen die einigartigen PstI- und EcoRI-Stellen des Plasmids pACM384 von Oligonukleotid 5'CTG CAGG TCG ACT CTA GAG GAT CCC CGG GTA CCT AAG TAAC TAA GAA TTC3' konstruiert;
2) Das 1,4 kb-PvuII-EcoRI-Fragment von pAHL1 wurde in die Mehrfachklonierungsstelle des Phagemids pTZ19R (Pharmacia) zwischen die PstI-Stelle (umgewandelt in ein glattes Ende mit T4-Polymerase) und die EcoRI-Stelle subkloniert. Das erhaltene Plasmid ist pACDL21;
3) Ein 5,4 kb-BclI-ScaI-Fragment, welche aus dem Plasmid pACT7 (Sebo et al., 1991) stammt, wurde zwischen die einzigartigen BclI-ScaI-Schnittstellen von pACDL21 inseriert, um das Plasmid pDLACT1 zu ergeben;
4) Ein 0,636 kb-NaeI-DdeI-Fragment des Plasmids pDIA4 (Glaser et al., 1988), welches das cyaC-Gen enthält wurde in die SmaI-Schnittstelle des Vektors pTZ18R (Pharmacia) subkloniert, um das Plasmid pCYACI zu ergeben, in dem das cyaC-Gen unter Kontrolle des Lac-Promotors liegt;
5) Das HindIII-ScaI-Fragment aus pDLACT1, welches das cyaA-Gen (6,2 kb) enthält, wurde zwischen die HindIII- und ScaI-Schnittstellen von pCYAC1 subkloniert, um das Plasmid pCACT3 zu ergeben.

Auf diese Weise kann das AC-Toxin in E. coli exprimiert werden und/oder durch dieses Bakterium in großen Mengen sezerniert werden, und es wird leicht gereinigt (Affinitätschromatographie auf CaM Affi-Gel-Harz).
Wir haben eine Methode entwickelt, welche es möglich macht, unter Verwendung einer Doppelselektion (Resistenz gegenüber einem Antibiotikum und einem kalorimetrischen Test auf Schälchen durch α-Komplementierung), Oligonukleotidinsertion (welche zwischen dem Leserahmen konserviert sind) in dem Teil des Gens zu identifizieren, welche für die N-terminale katalytische Domäne des Toxins codieren. Die funktionalen Konsequenzen dieser Mutationen auf die katalytische Aktivität des Toxins können leicht analysiert werden, sowohl genetisch (funktionale Komplementierung eines E. coli-cya^–-Stamms) und biochemisch (Charakterisierung der Stabilität der modifizierten ACs, von ihrer enzymatischen Aktivität oder ihrer Interaktion mit CaM, etc.). Diese Methode hat es ermöglicht, eine große Anzahl an Mutationen zu durchmustern, um die Stellen zu identifizieren, die möglicherweise für die Insertion von antigenen Determinanten vorteilhaft sind. Die Plasmide, welche für diese Identifizierung verwendet wurden, waren Derivate von pDIA5240 (P. Sebo, P. Glaser, H. Sakamoto und A. Ullman, Gene 1991, 104, 19–24, deren Inhalte hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind), welche die ersten 459 Codons des cyaA-Gens enthalten und welche im N-terminalen Teil der AC (399 Aminosäuren) exprimiert sind, denen jegliche invasive oder cytotoxische Aktivität fehlt.
Spezifisch wurde ein PvuII-Bst-Fragment von pDIA5240, umfassend 373 bp Codons von cyaA mit dem 3'-terminalen Teil des Gens (3999 Basenpaare bis 1333 Codons) ligiert. Das erhaltene Protein erhielt in Gegenwart des Produkts des cyaC-Gens seine invasive Eigenschaft zurück. Zusätzliche Peptidsequenzen von 10 bis 20 Aminosäuren wurde dann an den zuvor identifizierten Stellen inseriert, um die Cytotoxizität der rekombinanten Toxine zu analysieren. In spezifischen Ausführungsformen dieser Erfindung ist diese Insertion an Restriktionsschnittstellen des cyaA-Gens. Die modifizierten Toxine, welche ihre Cytotoxizität bewahren (d.h. deren N- terminale katalytische Domäne normal in das Cytoplasma der Zielzellen transportiert wird) können als Vehikel für die Präsentation antigener Determinanten verwendet werden. Siehe Ladant et al., 1992, deren Inhalte hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind. Wir haben auf diese Weise fünf permissive Stellen im N-terminalen Teil der AC definiert (Insertion zwischen den Aminosäuren 137–138, 224–225, 228–236, 228–229, 235–236 und 317–318). Eine umfassendere Kartierung wird einer gewöhnlichen Fachkraft auf dem Gebiet ermöglichen andere permissive Stellen unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren zu lokalisieren.
Wir haben eine zweite Methode (Resistenz gegenüber einem Antibiotikum und einen Hämolysetest auf Petrischalen, die Blut enthalten) entwickelt, welche die im Leseraster Oligonukleotid-Insertionen im Teil des Gens, welcher für den hämolytischen C-terminalen Teil des Toxins codiert, zu identifizieren. Diese Insertionen werden auf einem Plasmid getragen, welches die Co-Expression sowohl der cyaA- und der cyaC-Gene erlaubt, wie beispielsweise pCACT3. Siehe oben. Dieser Vorteil der Charakterisierung "permissiver" Stellen zur Insertion zusätzlicher Peptidsequenzen in dem Carboxy-terminalen Anteil des Toxins liegt an der Tatsache, daß im Gegensatz zum N-terminalen Teil diese Domäne mit der äußeren Oberfläche der Cytoplasmamembran assoziiert bleibt. So können Epitope, die in diesem Bereich des Toxins inseriert werden in den Weg der Antigenpräsentation umgeleitet werden, welcher spezifisch für Klasse II-MHC ist. Auf diese Weise können Toxine hergestellt werden, die doppelt modifiziert sind – in der N-terminalen katalytischen Domäne und in der C-terminalen Domäne – und die in der Lage sind, beide Epitope zu besitzen, die für Klasse I-MHC und andere Epitope, die für Klasse II-MHC ausgerichtet sind.
A Rekombinante Adenylatcyclasen, die heterologe Epitope exprimieren: Impfstoff-Anwendungen
1. Insertion von B- oder T-Epitopen
B. Pertussis AC-Toxin wird verwendet, um Epitope von Impfstoffbedeutung für das Immunsystem zu präsentieren. Dieses rekombinante Toxin kann als Bestandteil des Vakzins verwendet werden, entweder alleine oder in Gegenwart anderer Antigenpräparate. Es kann in toxischer oder entgifteter Form verwendet werden. Die entgiftete Form kann durch direkte Mutagenese gewonnen werden. Beispielsweise durch Austauschen von Lys58 oder Lys65 (Glaser er al., 1989, deren Inhalte hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind) durch einen Gin-Rest. Alternativ dazu kann die entgiftete Form durch Inserieren des Oligonukleotids CTG CAG in die EcoRV-Schnittstelle an Position 564 der codieren Phase des cyaA-Gens gewonnen werden. Siehe Ladant et al., 1992.
DNA, welche B. pertussis-Adenylatcyclase-Derivat der Erfindung codiert, kann beispielsweise wie folgt gewonnen werden.
Plasmid pDIA5240 wird in einer Restriktionsstelle der DNA linearisiert, welche ein heterologes Epitop codiert, inseriert werden soll. In spezifischen Ausführungsformen dieser Erfindung ist die Restriktionsschnittstelle NruI, wenn die permissive Stelle an den Resten 137–138 liegt oder an den Resten 235–236. In anderen Ausführungsformen ist die Restriktionsschnittstelle HindIII, wenn die permissive Stelle an den Resten 224–225 oder an den Resten 228–229 oder an den Resten 317–318 ist. Das resultierende pDIA5240-Derivat, welches heterologe Epitope an einer permissiven Stelle enthält, wird mit PvuII und BstBI geschnitten. Ein 1,4 Kb-Fragment wird isoliert, welches den Anteil des Adenylatcyclase-Gens enthält, welcher für die N-terminale katalytische Domäne codiert und ein heterologes Epitop umfaßt. Das Restriktionsfragment wird dann mit dem Rest des cyaA-Gens fusioniert, indem dies zwischen der HindIII-Schnittstelle (verbunden mit einem geglätteten Ende durch T4 DNA-Polymerase) und einer BstBI-Schnittstelle von pCACT3 inseriert wird. Das heterologe Epitop kann in pDIA5240 als Teil eines Linkers inseriert werden, welcher mit einer geeigneten permissiven Stelle kompatibel ist. In spezifischen Ausführungsformen dieser Erfindung codiert dieser Linker für ungefähr 16 Aminosäuren.
Irgendein Epitop, das von Zellen des Immunsystems, B- oder T-Lymphozyten, erkannt werden kann, kann in die permissiven Stellen der AC eingebaut werden. Jedes Molekül des Toxins kann eine oder mehrere Kopien des gleichen Epitops umfassen, oder eine Kombination verschiedener Epitope, B oder T, welche an verschiedenen Stellen des Toxins lokalisiert sind.
1.1. B-Epitope:
Irgendein Epitop, welches durch B-Lymphozyten erkannt wird und in der Lage ist Antikörper zu induzieren, die biologische Aktivität besitzen, kann in das Toxin eingeschleust werden. So werden beispielsweise das C3-Epitop des Poliovirus oder das V3-Epitop des HIV-Virus, welche in der Lage sind, Antikörper zu induzieren, die diese Viren neutralisieren, in das Toxin eingeschleust. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das V3-Epitop des HIV-Virus, das inseriert werden soll RIQRGPGRAFVTIGK (Reste 315–329). Im Fall des V3-Epitops können V3-Epitope, die verschiedenen Isolaten des Virus entsprechen, in verschiedene Stellen des Toxins eingeschleust werden.
Gleichermaßen können rekombinante Toxine, die andere Epitope des HIV-Virus besitzen (und insbesondere konservierte Epitope) hergestellt werden. Jedes Molekül eines Toxins kann daher verschiedene B-Epitope in Gegenwart oder Abwesenheit anderer Epitope (und insbesondere von T-Epitopen) präsentieren. Die Impfstoffpräparate können Moleküle eines rekombinanten Toxins umfassen, welches verschiedene Epitope besitzt.
Alternativ dazu können diese Epitope ebenfalls in anderen Vektorproteinen exprimiert werden. Beispielsweise können die zwei E. coli-Hüllproteine LamB und MalE verwendet werden. Wenn das Epitop auf der Oberfläche der transformierten Bakterien als Teil des äußeren Membranproteins LamB exprimiert wird, wird eine T-Zell-unabhängige Antikörperreaktion, welche durch eine schnelle Induktion von IgM- und IgG-Antikörpern charakterisiert ist, induziert. Im Gegensatz dazu wird, wenn das Epitop als Teil des periplasmischen MalE-Proteins exprimiert wird, eine T-Zell-abhängige Antikörperantwort, welche zur IgG-Klasse gehört, induziert.
Die Immunisierung mit den Molekülen der rekombinanten Toxine und der Nachweis von Antikörper wird wie in Leclercl et al. 1991 beschrieben, welches hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
1.2. Helfer-T-Epitope (CD4⁺):
Die Monomere des rekombinanten Toxins können ebenfalls verwendet werden, um Epitope zu präsentieren, die durch CD4⁺-T-Lymphozyten erkannt werden. Diese Epitope werden entweder alleine oder in Kombination mit anderen T- oder B-Epitopen inseriert. Es können daher die T-Epitope 103–116 des Poliovirus alleine oder in Folge mit dem B-Epitop 93–103 inseriert werden, T-Epitope des HIV-Virus und insbesondere das T-Epitop, welches im V3-Loop enthalten ist oder das T-Epitop des lymphozytischen Choriomeningitis-Virus, welches in dem Bereich 118–132 des Nukleoproteins eingeschlossen ist. Die Sequenz des Bereichs 118–132 des Nukleoproteins des lymphozytischen Choriomeningitis-Virus ist RPQASGVYMGNLTAQ:
Die Sequenz des B-Epitops 93–103 des Poliovirus (C3-Epitop) ist:
DNPASTTNKDK
Die Sequenz des T-Epitops ist:
KLFAVWKITYKDT.
Zur Erzeugung von Helfer-CD4⁺-T-Reaktionen werden T-Epitope vorzugsweise in den C-terminalen Bereich des Toxins inseriert, welcher in der Lage ist, die präsentierende Zelle durch den endozytoxischen Weg zu betreten. Toxin-Moleküle, die AC-Aktivität besitzen oder mutiert sind, um diese Aktivität zu lockern, können verwendet werden, abhängig von der Art der gewünschten CD4⁺-Reaktion. Das rekombinante Molekül kann aus einem Fragment oder dem kompletten Adenylatcyclase-Protein bestehen, welches fremde Epitope exprimiert.
1.3 Nachweis von CD4⁺-Reaktionen nach Immunisierung mit Adenylatcyclase-Molekülen, welche ein oder mehrere T-Epitope repräsentieren, welche von CD4⁺-Lymphozyten erkannt werden:
Tiere, wie beispielsweise Mäuse verschiedener Stämme, werden mit den Molekülen des rekombinanten Toxins in Gegenwart eines geeigneten Adjuvans wie beispielsweise Freunds komplettes Adjuvans, Freunds unvollständiges Adjuvans oder Aluminiumhydroxid immunisiert. Zwei Wochen später werden die CD4⁺-T-Reaktionen durch Proliferation von Lymphozyten (Milz oder benachbarte Lymphknoten) bestimmt, welche mit dem Peptid kultiviert werden, welches dem inserierten T-Epitop entspricht, wie zuvor beschrieben. Siehe Fayolle et al., 1991. Andererseits wird die Erkennung von Lymphozyten von Mäusen, die mit Peptiden von Molekülen des rekombinanten Toxins immunisiert werden in vitro durch Einbau von Thymidin bestimmt. Siehe Leclerc et al., 1991.
1.4. Insertion von T-Epitopen, welche durch cytotoxische T-Lymphozyten erkannt werden:
AC-Toxin besitzt die Fähigkeit in das Cytoplasma von Zielzellen einzudringen. Das macht es möglich, T-Epitope zu verabreichen, welche durch CD8⁺-T-Lymphozyten erkannt werden, in das Cytoplasma dieser Zellen einzuschleusen und erlaubt die Assoziierung dieser Epitope mit Molekülen der Klasse I-MHC. Quellen für AC sind Bordetella sp., Homologe davon oder andere Organismen, die AC exprimieren. In erfindungsgemäßen Ausführungsformen ist die Adenylatcyclase eine Calmodulin-abhängige AC. In spezifischen Ausführungsformen ist die AC Bordetella pertussis AC.
1.5. Induzierung der cytotoxischen T-Zellen:
Cytotoxische T-Reaktionen können durch die Immunisierung mit einem rekombinanten Toxin gewonnen werden, entweder alleine oder in Gegenwart eines Adjuvans wie beispielsweise Aluminiumhydroxid. Die Darreichungswege können auf oralem Wege, subkutanem oder intramuskulärem Wege sein.
Das rekombinante Toxin exprimiert ein oder mehrere Epitope, die durch cytotoxische T-Zellen erkannt werden. Andere Epitope, insbesondere Epitope, die von CD4⁺-Helfer-T-Lymphozyten erkannt werden, können in das gleiche Molekül des Toxins inseriert werden. Die Identifizierung eines Epitops als CTL-Epitop oder T-Helferepitop wird experimentell bestimmt.
Als Beispiel haben wir in das Toxin des Epitops 118–132 des Nukleoproteins des lymphozytären Choriomeningitis-Virus (Aichele et al., 1990) inseriert, welches sowohl ein CTL- und ein T-Helfer-Epitop ist. Die Aminosäuresequenz dieses Epitops ist: RPQASGVYMGNLTAQ. Epitope anderer Pathogene insbesondere von HIV können inseriert werden (CTL-Epitope der env-, gag-, nef-Proteine etc.). Beispiele für geeignete Epitope sind beschrieben von Nixon et al., 1992, welches ausdrücklich durch Bezugnahme hier eingeschlossen ist. Mehrere Epitope, die die Sequenz zahlreicher Isolate des HIV-Virus darstellen, können in das gleiche Molekül des Toxins eingeschleust werden. Gleichermaßen ist es möglich eine Mischung aus Molekülen eines rekombinanten Toxins zu verwenden, wobei jedes ein CTL-Epitop darstellt, welches einem gegebenen Isolat eines HIV-Virus entspricht.
1.6. Detektion cytotoxischer T-Reaktionen:
Lymphozyten, die aus Tieren gewonnen werden, welche mit dem rekombinanten Toxin immunisiert werden, werden für 5 Tage mit syngenen Zellen stimuliert, welche mit dem Peptid beschichtet sind, welches dem inserierten Epitop entspricht, oder in Gegenwart des rekombinanten Toxins. Der Nachweis der cytotoxischen T-Effektoren wird wie zuvor beschrieben durchgeführt (Fayolle et al., 1991). Die Zielzellen, welche mit Chrom-51 ([51Cr]) markiert sind und die Klasse I-Moleküle besitzen, welche mit den Effektorzellen kompatibel sind, werden zuvor mit dem Peptid inkubiert, welches dem inserierten CTL-Epitop des rekombinanten Toxins entspricht. Die cytotoxische T-Reaktion wird durch Freisetzung von [51Cr] durch die lysierten Zielzellen abgeschätzt.
B Rekombinante Adenylatcyclasen welche heterologe Epitope oder einen Liganden für einen gegebenen Rezeptor exprimieren: Immunotoxinanwendung
Das rekombinante AC-Toxin kann verwendet werden, um Zielzellantigene und Rezeptoren anzuvisieren. Nachfolgend sind Beispiele verschiedener Konstruktionen, die in Betracht gezogen werden können:

1) Konstruktion aus Fusionsproteinen, die die ersten 1490 Aminosäuren der AC enthalten (diese verkürzte Form des Toxins ist nicht in der Lage an die Zielzellen zu binden und ist daher nicht toxisch), fusioniert mit einem Wachstumsfaktor wie beispielsweise TGF-α (bei dem das Ziel der EGF-Rezeptor ist), mit IL-2, IL-4 oder IL-6 oder irgendeinem anderem Lymphokin, mit variablen Bereichen von Antikörpern mit starker Affinität für Rezeptoren oder Antigene, die anvisiert werden sollen, zum Beispiel Tumor-Antigene;
2) Insertion von B-Epitopen in die AC zum Anvisieren der spezifischen B-Zellen oder die Insertion irgendeines andere Peptidliganden, welches durch spezifische Rezeptoren erkannt wird;
3) Konstruktion einer AC, welche zusätzliches Cystein am C-terminalen Ende des Proteins trägt, welches einem spezifischen Polypeptid ermöglichen wird an die AC durch chemische Bindung fusioniert zu sein. Es sollte sich daran erinnert werden, daß das AC ein Protein ist, das kein Cystein enthält.

Die potentielle Bedeutung von B. pertussis AC-Toxin verglichen mit anderen Toxinen liegt in der Tatsache begründet, daß die Vergiftung der Zielzellen durch die AC unabhängig von einer Rezeptor-vermittelten Endocytoseprozessierung abläuft. Daher könnte irgendein Oberflächenmarker, der spezifisch für eine gegebene Zelle ist, als Rezeptor zur Anvisierung des rekombinanten AC-Toxins dienen, welches ein verkürztes AC-Toxin umfaßt, das mit einem spezifischen Liganden fusioniert ist.
Referenzen

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Zusammensetzung zum Induzieren einer Immunreaktion, wobei die Zusammensetzung eine rekombinante Adenylatcyclase umfaßt, die durch Expression des cyaC-Gens von Bordetella sp. gewonnen wird, das operativ an eine Expressionskontrollsequenz gebunden ist, und eines rekombinanten cyaA-Gens von Bordetella sp., welches eine Adenylatcyclase codiert, die operativ an eine Expressionskontrollsequenz gebunden ist, wobei dieses cyaA-Gen mindestens eine Insertion einer heterologen DNA-Sequenz an mindestens einer permissiven Stelle enthält und wobei die Adenylatcyclase keine katalytische Aktivität hat; und worin diese Expression außerdem in einer Wirtszelle ausgeführt wird, die aus der Gruppe aus Bakterien, eukaryontischen Zellen und Hefen ausgewählt wird.
Zusammensetzung wie in Anspruch 1 beansprucht, worin diese Immunreaktion eine T-Zell-Immunreaktion ist und diese heterologe DNA-Sequenz ein heterologes T-Epitop ist.
Zusammensetzung wie in Anspruch 1 oder 2 beansprucht, worin diese rekombinante Adenylatcyclase ein Teil eines Fusionsproteins ist, umfassend ein Lymphokin, insbesondere ein Lymphokin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IL-2, IL-4 und IL-6.
Zusammensetzung wie in Ansprüchen 1 bis 3 beansprucht, worin diese Wirtszelle E. coli ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin diese Immunreaktion eine B-Zell-Immunreaktion ist und die heterologe DNA-Sequenz ein heterologes B-Epitop ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, worin die Zusammensetzung lebende Bakterien umfaßt, die das cyaC-Gen von Bordetella sp. und ein rekombinantes cyaA-Gen von Bordetella sp., das Adenylatcyclase codiert, exprimieren, wobei das cyaA-Gen mindestens eine Insertion einer heterologen DNA-Sequenz an mindestens einer permissiven Stelle enthält.
Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, worin das cyaA-Gen das cyaA-Gen von Bordetella pertussis ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, worin das cyaC-Gen das cyaC-Gen von Bordetella pertussis ist.
Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, worin die cyaA- und cyaC-Gene im rekombinanten Plasmid pCACT3 vorliegen, hinterlegt beim CNCM unter der Zugangsnummer I-1201 am 8. April 1992.
Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, worin die heterologe DNA-Sequenz weniger als 25 Aminosäuren codiert.
Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, worin die permissive Stelle aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus DNA besteht, die die Reste 137–138 des Genprodukts des cyaA-Gens codiert, DNA, die die Reste 224–225 des Genprodukts des cyaA-Gens codiert, DNA, die die Reste 228–229 des Genprodukts des cyaA-Gens codiert, DNA, die die Reste 235–236 des Genprodukts codiert, und DNA, die die Reste 317–318 des Genprodukts des cyaA-Gens codiert.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 11, worin diese permissive Stelle DNA ist, die die Reste 235–236 des Genprodukts dieses cyaA-Gens codiert.
Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, worin diese heterologe DNA-Sequenz das C3-Epitop des menschlichen Poliovirus codiert.
Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, worin die heterologe DNA-Sequenz ein Epitop von HIV codiert.
Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, worin das Epitop das V3-Epitop des HIV-Virus ist.
Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, worin die heterologe DNA-Sequenz die Reste 118–132 des Nukleoproteins des lymphozytischen Choriomeningitisvirus sind.
Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, worin das Adenylatcyclase-Gen mindestens eine Insertion einer heterologen DNA-Sequenz in der DNA enthält, die die Reste 235–236 des Genprodukts dieses Adenylatcyclase-Gens codiert, und worin die heterologe DNA-Sequenz das C3-Epitop des menschlichen Poliovirus oder ein Epitop des HIV-Virus codiert.
Zusammensetzung wie in Anspruch 17 beansprucht, worin dieses Epitop das V3-Epitop von HIV ist.
Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, worin das Adenylatcyclase-Gen mindestens eine Insertion einer heterologen DNA-Sequenz an einer permissiven Stelle enthält, die in einer DNA-Sequenz lokalisiert ist, die die N-terminale Domäne des Genprodukts des cyaA-Gens codiert.
Zusammensetzung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, worin das Adenylatcyclase-Gen mindestens eine Insertion einer heterologen DNA-Sequenz an einer permissiven Stelle enthält, die in einer DNA-Sequenz lokalisiert ist, die die C-terminale Domäne des Genprodukts des cyaA-Gens codiert.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 20, worin diese heterologe DNA-Sequenz ein T-Epitop des Poliovirus oder ein T-Epitop des HIV-Virus codiert, insbesondere ein T-Helfer-Epitop wie das V3-T-Epitop des HIV-Virus, oder weiter ein T-Epitop eines Influenzavirus.
Zusammensetzung wie in Anspruch 21 beansprucht, worin das rekombinante cyaA-Gen ein zweite heterologe DNA-Sequenz umfaßt, die ein Epitop codiert, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Poliovirus-Epitop, einem HIV-Virus-Epitop und einem Influenzavirus-Epitop.
Zusammensetzung wie in Anspruch 20 beansprucht, worin das T-Epitop das T-Epitop des lymphozytischen Choriomeningitisvirus ist, das in der Region 118–132 des Nukleoproteins dieses Choriomeningitisvirus eingeschlossen ist.
Zusammensetzung wie in Anspruch 17 beansprucht, worin das cyaA-Gen weiter eine Mutation umfaßt, die die katalytische Wirkung des cyaA-Genprodukts zerstört.