DE60220136T2

DE60220136T2 - Universeller träger zum zielrichten von molekülen zu rezeptor gb3 - exprimierenden zellen

Info

Publication number: DE60220136T2
Application number: DE60220136T
Authority: DE
Inventors: Ludger Johannes; Eric Tartour; Bruno Goud; Wolf Herve Fridman
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Pierre et Marie Curie Paris 6; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Curie
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Pierre et Marie Curie Paris 6; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Curie
Priority date: 2001-02-01
Filing date: 2002-02-01
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2022-02-02
Also published as: CA2435712C; EP1355928A1; EP1355928B1; CA2435712A1; US7632514B2; US20150045536A1; EP1229045A1; ES2287239T3; DK1355928T3; JP2004531230A; ATE362483T1; PT1355928E; JP4296536B2; DE60220136D1; WO2002060937A1; US9603923B2; CY1106789T1; US20100196418A1; US20040110935A1; US8852612B2

Description

Die Erfindung betrifft einen universellen polypeptidischen Träger zum Zielrichten von Molekülen auf einen Gb3-Rezeptor für die B-Untereinheit von Shiga-Toxin exprimierenden Zellen und seine Verwendung für den intrazellulären Transport und die Prozessierung der genannten Moleküle.
Shiga-Toxin ist ein bakterielles Toxin der AB₅-Untereinheiten-Familie, das von Shigella dysenteriae sekretiert wird. Die A-Untereinheit ist die toxische Einheit und verhindert die Proteinsynthese in höheren eukaryontischen Zielzellen nach Übertragung in das Cytoplasma der genannten Zellen. Die B-Untereinheit ist ein homopentameres Protein (5B-Fragmente) und ist für Toxinbindung und Internalisierung in die Zielzelle verantwortlich, indem sie mit dem Glycolipid Gb3 in Wechselwirkung tritt, welches auf den Plasmamembranen dieser Zellen angetroffen wird. Das B-Fragment ist nicht toxisch, bewahrt aber die intrazellulären Transporteigenschaften des Gesamttoxins, welches in vielen Gb3 exprimierenden Zeilen in einer rückwärts gerichteten Weise von den Plasmamembranen über Endosomen zum Cytosol transportiert wird.
Es ist ebenfalls berichtet worden, dass der Glycolipid-Gb3-Rezeptor bevorzugt in einigen vom Ektoderm stammenden Tumoren (Plasma) und einigen Burkitt-Lymphomen exprimiert wird. Er ist auch als CD77 bekannt. In dem vorliegenden Text soll der Ausdruck Gb3 als ein Äquivalent zu CD77 angesehen werden.
Die Verfasser haben bereits gezeigt, dass ein menschliches CD8-Tumor-Antigen, das an die B-Untereinheit des Shiga-Toxins fusioniert ist, wirksam in einer auf HLA- Klasse I beschränkten Weise spezifischen CTL präsentiert werden konnte (1).
Dieses Ergebnis wurde unabhängig davon durch eine andere Studie bestätigt, die zeigte, dass Shiga-Holotoxin, welches ein definiertes Peptid-Epitop des influenza-Virus trug, das Antigen in den intrazellulären MHC-Klasse I-Stoffwechselweg abgeben konnte (3).
Die Verfasser haben ebenfalls gezeigt, dass Fusionsproteine zwischen dem Gb3-Rezeptor bindenden, nicht toxischen B-Fragment des bakteriellen Shiga-Toxins von Shigella dysenteriae und einem Antigen oder einem Epitop von einem Modelltumor-Antigen spezifische cytotoxische T-Lymphocyten-Antwort (CTL) hervorrufen können, wohingegen jede einzelne Einheit des genannten Fusionsproteins für sich allein nicht zu CTL-Induktion führt (1, 2 und WO 99/03881 ).
Die Schwierigkeit bei dieser Technik ist, dass für jede Anwendung, d.h. für jedes Antigen oder Fragment davon, die Notwendigkeit für eine spezifische Konstruktion eines Fusionsproteins besteht, was eine spezifische Konstruktion eines rekombinanten Vektors erforderlich macht, der die dieses Fusionsprotein codierenden Sequenzen trägt, die in einer Wirtszelle exprimiert werden sollen.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die vorstehend genannten Nachteile zu überwinden und einen universellen Haken oder einen universellen Träger zum Zielrichten eines Moleküls auf eine den Gb3-Rezeptor exprimierende Zelle bereit zu stellen, um zu ermöglichen, dass dieses Molekül in die den Gb3-Rezeptor exprimierende Zelle internalisiert, dort prozessiert und/oder, exprimiert wird.
In der vorliegenden Erfindung ist ein Derivat oder eine Mutante der B-Untereinheit des Shiga-Toxins (STxB), STxB-Cys genannt, entworfen worden. In diesem Protein ist ein Cystein an den C-Terminus des reifen STxB angefügt worden. Wenn das Protein aus Bakterien gereinigt wird, trägt es als Wildtyp-STxB die interne Disulfid-Brücke, während die Sulfhydryl-Gruppe am C-terminalen Cys frei ist. Auf Grund ihrer Nucleophilie sind Sulfhydryl-Gruppen ausgezeichnete Akzeptoren für gerichtete Bindungsvorhaben (4).
Daher betrifft die vorliegende Erfindung einen universellen polypeptidischen Träger zum direkten oder indirekten Zielrichten eines interessierenden Moleküls zu Gb3-Rezeptor exprimierenden Zellen mit der nachstehenden Formel: STxB-Z(n)-Cys, worin gilt:

– STxB ist die B-Untereinheit des Shiga-Toxins oder ein funktionelles Äquivalent davon,
– Z ist eine Aminosäure, die keine Sulfhydyl-Gruppe aufweist, n ist 0, 1 oder eine Aminosäuresequenz,
– Cys ist die Aminosäure Cystein.

Die STxB-Einheit des universellen Trägers hat die in (8) beschriebene Sequenz oder ist ein funktionelles Äquivalent davon. Ein funktionelles Äquivalent ist eine polypeptidische Sequenz, die die Fähigkeit aufweist, spezifisch an den Gb3-Rezeptor zu binden und/oder eine Internalisierung eines Antigens und seine Präsentation in einem auf MHC-Klasse I oder sowohl auf MHC-Klasse I als auch auf Klasse II beschränkten Stoffwechselweg auf derselben Antigen präsentierenden Zelle auszulösen.
Im Licht der Heterogenität der Expression von Tumor-Antigenen, des Allel-spezifischen Verlustes der MHC-Klasse I-Expression auf der Oberfläche von Tumorzellen und der Notwendigkeit, eine gemeinsame Präsentation von Antigenen sowohl durch MHC-Klasse I als auch Klasse II auf derselben Antigen präsentierenden Zelle zu haben, ist es vorteilhaft, zum Zielrichten zu dendritischen Zellen Antigen-Proteine in voller Größe an die B-Untereinheit zu binden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist n = 0, und der universelle Träger weist die nachstehende Sequenz auf (SEQ ID NO 1):
COOH – MKKTLLIAASLSFFSASALATPDCVTGKVE
YTKYNDDDTFTVKVGDKELF
TNRWNLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFRC - NH2
Es liegt in der Natur der Sache, dass, wenn der Z-Linker zu lang ist, d.h., wenn n gleich oder größer als 2 ist, einige interne Disulfid-Brücken auftreten können und entweder die Bindung von STxB an den Gb3-Rezeptor und besonders die Bindung an das interessierende Molekül verhindern.
Im Einklang mit der Erfindung wird das interessierende Molekül aus einer aus Proteinen, Peptiden, Oligopeptiden, Glycoproteinen, Glycopeptiden, Nucleinsäuren, Polynucleotiden oder einer Kombination davon bestehenden Gruppe ausgewählt.
In einem anderen Aspekt der Erfindung ist das interessierende Molekül ein Antigen, das auf Antigen präsentierende Zellen zielgerichtet ist. Solche Zellen werden aus einer T-Lymphocyten, dendritische Zellen, Makrophagen, Langerhans-Zellen und dergleichen umfassenden Gruppe ausgewählt.
In einem anderen Aspekt der Erfindung besteht das interessierende Molekül aus Wirkstoffen wie etwa Haptenen, Psoralenen oder anderen Verbindungen, vorausgesetzt dass sie eine chemische Gruppe aufweisen, die mit der -SH-Gruppe der Cystein-Einheit von STxB-Cys verknüpft werden kann.
Der Wirkstoff kann entweder direkt oder nach Aktivierung durch Verbindungen wie etwa Bromacetat oder durch jedes andere Verfahren, das Fachleuten bekannt ist, gebunden werden, vorausgesetzt dass das Ergebnis der Reaktion eine chemische Einheit ist, die die folgende Formel STxB-Cys-M aufweist, wobei M jedes der vorstehend genannten interessierenden Moleküle sein kann.
Der Bindungsansatz für die kovalente Bindung einer Peptid- oder einer Polypeptid-Einheit an STxB-Z(n)-Cys kann jedes Verfahren oder jeder Prozess sein, der beschrieben ist oder von einer Fachperson durchgeführt wird.
Ein erstes Verfahren, das verwendet werden kann, ist die Verwendung des heterobifunktionalen Vernetzungsmittels SPDP, der von Carlsson et al. (5) beschrieben wird. SPDP kann jedoch von Serum-Thiolasen gespalten werden, was ein Grund für die Verringerung der Ausbeute der Reaktion ist.
Ein zweites Verfahren zur kovalenten Bindung von STxB-Z(n)-Cys-Petiden mit einem anderen interessierenden Peptid besteht darin, Bromacetyl- oder Maleimidfunktionen auf letzterem herzustellen, wie von P. Schelte et al. (4) beschrieben. In Kürze, das interessierende Peptid wird mit Bromacetat-Anhydrid beziehungsweise durch eine Maleimid-Gruppe chemisch aktiviert. Bei geeigneten Reaktionsbedingungen (pH-Wert, Temperatur, Inkubationszeiten) werden diese Gruppen cis-eliminiert, wobei man kovalente Bindungen an -S-S, -S-CH₂-, an -S-CO- bzw. an -S-NH- erhält.
Als ein Beispiel wird der N-Terminus des Polypeptides oder des Peptides, das an die -SH-Einheit des C-terminalen Cysteins des universellen Trägers gebunden werden soll, mit Bromessigsäureanhydrid nach dem nachstehenden Reaktionsschema aktiviert: Br-CH₂-CO-O-CO-CH₂-Br+NH₂-Peptid → Br-CH₂-CO-NH-Peptid+Br-CH₂-COOH
Die Bromacetyl-Funktion besitzt hohe Chemoselektivität für Thiol-Gruppen in Peptiden, und das aktivierte Peptid kann mit STxB-Cys wie folgt reagieren: STxB-Cys-SH+Br-CH₂-CO-NH-Peptid → STxB-Cys-S-CH₂-CO-NH-Peptid+HBr Die entstandene Thioether-Bindung ist gegenüber Hydrolyse stabil.
Ein anderes Verfahren zur Bindung eines Moleküls an den universellen Träger der Erfindung ist, MBS (m-Maleimidbenzoyl-N-hydroxysuccinimidester) zu verwenden, wie in 6 dargestellt und in Beispiel 5 erklärt wird. Diese Bindung erlaubt den Transport und die Prozessierung von großen Molekülen wie antigenen Proteinen oder Glycoproteinen durch MHC-Klasse I- und/oder MHC-Klasse II-Stoffwechselwege.
Daher betrifft ein anderer Aspekt der Erfindung das Produkt, das aus einer kovalenten Bindung von STxB-Z(n)-Cys mit einem interessierenden Molekül durch eine -S-S-, -S-CO- oder S-CH₂- oder -S-NH-Bindung entsteht.
In einer Ausführungsform besteht das interessierende Molekül, das auf eine Antigen präsentierende Zellen zielgerichtet ist, aus einer Polypeptid-Struktur wie Antigenen oder Epitope davon, Glycopeptiden oder Glycoproteinen, Lipopeptiden oder Lipoproteinen oder umfasst diese.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Produkt, das aus der Bindung von STxB-Z(n)-Cys mit einem Antigen oder einem Fragment davon entstanden ist, wobei (n) = 0,1 oder 2 und bevorzugt 0 ist, in einem auf MHC-Klasse I und MHC-Klasse II beschränkten Stoffwechselweg präsentiert werden.
In einer anderen Ausführungsform ist das interessierende Molekül ein Polypeptid, das in der Lage ist, mit Polynucleotid-Strukturen wie etwa DNA- oder RNA-Molekülen eine Bindung einzugehen. Solche Moleküle können Vektoren oder Plasmide sein, die eine interessierende Sequenz, die in einer Zielzelle exprimiert werden soll, umfassen. In der vorliegenden Erfindung ist eine Zielzelle eine eukaryontische Zelle, die auf ihrer Membran den Gb3-Rezeptor trägt.
Daher ist der universelle Träger der vorliegenden Erfindung auch ein Träger zum Einführen einer Nucleotidsequenz in eine Zielzelle, entweder zur Gentherapie oder zum Erhalten von rekombinanten Zellen, die heterologe Proteine exprimieren.
In einer anderen Ausführungsform kann der universelle Träger im Einklang mit der vorliegenden Erfindung direkt durch eine kovalente Bindung oder indirekt durch einen Linker funktionell an einen cytotoxischen Wirkstoff gebunden werden, um auf Tumorzellen, die den Gb3-Rezptor exprimieren, zielgerichtet zu werden.
Der Ausdruck „indirekte Bindung" bedeutet, dass der universelle Träger kovalent durch die Sulfhydryl-Einheit des C-terminalen Cysteins an einen Linker gebunden ist, wobei der genannte Linker funktionell an einen Wirkstoff oder ein Prodrug gebunden ist, der/das in die den Gb3-Rezeptor tragenden Zellen internalisiert werden soll.
Diese Bindung kann eine kovalente Bindung oder eine nicht kovalente Bindung sein, vorausgesetzt dass die Affinität zwischen dem Linker und dem Wirkstoff (oder dem Prodrug) höher als 10^–9 Mol/l ist.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein isoliertes Polynucleotid, ausgwählt aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) einem Polynucleotid, das die Nukleotidsequenz STxB, die die B-Untereinheit des Shiga-Toxins codiert, oder ein funktionelles Äquivalent davon umfasst, welche/welches an ihrem/seinem 3'-Ende das Codon TGT oder das Codon TGC aufweist, welches Cystein codiert;
(b) einem Polynukleotid, das eine Nucleotidsequenz umfasst, welche mindestens 80 % Sequenzidentität zu einer Nucleotidsequenz, die die B-Untereinheit des Shiga-Toxins codiert, oder einem funktionellen Äquivalent davon aufweist, welche/welches an ihrem/seinem 3'-Ende das Codon TGT oder TGC trägt; und
(c) einer Nukleotidsequenz, die komplementär zu der Sequenz von a) oder b) ist. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Polynucleotid die nachstehende SEQ ID NO:2 auf:

Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen rekombinanten Vektor oder ein Plasmid, welcher/s eine wie vorstehend beschriebene Polynucleotidsequenz umfasst und in der Lage sind, den universellen Träger STxB-Z(n)-Cys in einer geeigneten Wirtszelle zu exprimieren, wobei (n) = 0, 1 oder 2 ist, STxB und Z die selbe Bedeutung wie vorstehend genannt, aufweisen.
Als ein Beispiel wird als gebräuchlicher Vektor das Plasmid pSu108 in Abschnitt (7) beschrieben.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Gewinnung eines Plasmids, das STxB-Z(n)-Cys exprimiert, bereit zu stellen, welches umfasst:

a) Bereitstellung eines Plasmids, das eine STxB-Sequenz umfasst;
b) Durchführung von zwei PCR-Amplifizierungsschritten unter Verwendung von zwei Primer-Paaren, AA' und BB', – wobei A und B komplementär zueinander sind und das Cys-Codon umfassen, – A' und B' außerhalb der STxB-Sequenz liegen;
c) Isolierung der amplifizierten Fragmente;
d) Hybridisierung der amplifizierten Fragmente;
e) Durchführung einer PCR-Amplifizierung mit den hybridisierten Fragmenten;
f) Insertion des amplifizierten Fragments in ein Plasmid.

In einer bevorzugten Ausführungsform wurde das Plasmid pSU108 (7), das ein STxB-Fragment enthielt, modifiziert, um das Cystein-Codon TGT am 3'-Ende der cDNA für das B-Fragment einzuführen. Die Primer für Schritt b) sind AA' beziehungsweise BB':

– Primer A: 5'-AGCGAAGTTATTTTTCGTTGTTGACTCAGAATAGCTC-3' (SEQ ID NO:3) und
– Primer B: 5'-GAGCTATTCTGAGTCAACACGAAAAATAACTTC-3' (SEQ ID NO:4).
– Primer A': Primer ShigaAtpE: 5'-CACTACTACGTTTTAAC-3' (SEQ ID NO: 5) und
– Primer B'; Primer Shiga-fd: 5'-CGGCGCAACTATCGG-3' (SEQ ID NO:6)

Die PCR des Schrittes e) ergibt ein Fragment, das in die SphI- und SalI-Restriktionsstellen von pSU108 cloniert wird. Sequenzen, die aus der PCR stammen, werden durch Didesoxy-Sequenzierung bestätigt.
Fachleute auf dem Gebiet können leicht die Auswahl von Primern und Plasmiden zur Herstellung eines Vektors durchführen, welcher die Polynucleotidsequenz trägt, die STxB-Z(n)-Cys in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert, vorausgesetzt dass diese Schrittfolge die Interpretation des Cys-Codons in das amplifizierte Fragment erlaubt.
Die Erfindung liefert auch eine rekombinante Zelllinie, die durch Transformation mit dem rekombinanten Vektor erhalten wird, welcher die Polypeptisequenz enthält, die den vorstehend beschriebenen universellen Träger codiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die genannte Zelllinie eine prokaryontische Zelle, bevorzugt E. coli.
In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform ist das Plasmid pSU108, bei dem die SEQ ID NO:2 zwischen den Restriktionsstellen SphI und SalI integriert ist, und die zugehörige Zelllinie wurde bei CNCM am 19. Dezember 2000 mit der Registriernummer I-2604 hinterlegt.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Herstellung eines wie vorstehend beschriebenen universellen Trägers, umfassend:

a) Kultivierung einer rekombinanten Zelllinie, wie vorstehend beschrieben.
b) Gewinnung eines periplasmatischen Extraktes aus den genannten Zellen und
c) Reinigung des genannten Polypeptides.

Die Zelllinie ist bevorzugt E. coli, und unter c) wird die Reinigung durch Anionenaustausch-Säulenchromatographie mit anschließender Gelfiltrations-Säulenchromatographie durchgeführt.
Ein solches Verfahren ist besonders für die Herstellung des universellen Trägers in großem Maßstab vorteilhaft, solange er anschließend durch kovalente Bindung funktionell mit einem interessierenden Molekül verbunden und in einem weiten Anwendungsbereich verwendet werden kann.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Abgabe einer interessierenden Sequenz an den MHC-Klasse I-Stoffwechselweg unter Verwendung eines Produktes, das durch kovalente Bindung der Cys-Einheit des universellen Trägers mit der genannten interessierenden Sequenz erhalten worden ist; dies Verfahren ist vorteilhaft für das Hervorrufen einer CTL-Antwort auf ein gegebenes Antigen oder Epitop davon, solange das Produkt spezifisch für die Zelle ist, die an dem MHC-Klasse I-Stoffwechselweg beteiligt ist.
In der Tat haben die Erfinder gezeigt, dass ein immundominantes Peptid, das vom Ovalbumin-Protein abstammte und chemisch an STxB-Cys gebunden war, durch Antigen präsentierende Zellen spezifischen Hybridomzellen präsentiert werden konnte, wodurch gezeigt wurde, dass STxB exogenes immunogenes Peptid in den MHC-Klasse I-Stoffwechselweg abgeben konnte. Um einen systematischen Fehler („bias") durch die Anwesenheit von freien Peptiden, die das Material verunreinigen, auszuschließen, zeigten Experimente, die fixierte dendritische Zellen verwendeten, deutlich, dass die Internalisierung des Fusionsproteins für diesen Prozess erforderlich war. Die Erfinder haben ebenfalls gezeigt, dass der Shiga-Toxin-Rezeptor Gb₃ ebenfalls an der Fähigkeit von STxB-Cys zur Zielrichtung von exogenem Peptid auf den endogenen MHC-Klasse I-Stoffechselweg beteiligt war.
Die Erfindung beinhaltet auch ein Verfahren zur Abgabe eines Expressionsvektors, der eine interessierende Sequenz enthält, in eine den Gb3-Rezeptor exprimierende Zelle, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass der genannte Expressionsvektor an ein Lysin-reiches Peptid gebunden ist, welches kovalent mit der Cys-Einheit des universellen Trägers verbunden ist.
Beispielhaft ist das Lysin-reiche Peptid ein 16-mer-Polylysin, das in der Lage ist, jede beliebige Polynucleotidsequenz zu binden, sei sie von DNA- oder RNA-Natur. Ein solches Peptid, das ein 16-Mer an Lysin-Einheiten trägt, wird an seinem N-Terminus durch Bromacetat-Anhydrid aktiviert und an STxB-Cys gebunden. Expressionsplasmide werden an dieses Bindungsprodukt gebunden, und die Vektorisierung von DNA in Zielzellen wird unter Verwendung herkömmlicher Reportersysteme durchgeführt, wie etwa dem grün fluoreszierenden Protein oder Luciferase.
Es wird erwartet, dass die Fähigkeit, Expressionsplasmide mit der Hilfe von STxB auf den Kern von Antigen präsentierenden Zellen auszurichten, die Wirksamkeit dieses Vektors weiter verbessert, da i) die DNA noch leichter an neuexperimentelle oder klinische Bedürfnisse angepasst werden kann und ii) auf Grund seiner Potenzierungswirkung würde die Expression von antigenen Peptiden oder Proteinen von der DNA die Sensitivität der von STxB abhängigen Antigen-Präsentation weiter steigern.
Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Abgabe eines Wirkstoffes oder eines Prodrugs in eine Zelle, besonders in eine Krebszelle, die den Gb3- (oder CD77-)Rezeptor trägt.
Es ist berichtet worden, dass der Glycolipid-Gb₃-Rezeptor bevorzugt in einigen vom Neuroektoderm stammenden Tumoren (Gliome) und einigen Burkitt-Lymphomen exprimiert wird. Da die sekundären Nebenwirkungen der Wirkstoffe auf Grund ihrer Toxizität auf normale Zellen eine Einschränkung der Verwendung von Chemotherapie bei Krebserkrankungen darstellt, werden die Wirkstoffe durch die Verwendung von STxB-Cys bevorzugt in Tumorzellen vektorisiert. Die Wirkstoffe werden aktiviert, um mit der Sulfhydryl-Gruppe von STxB-Cys reagieren zu können. Um dies zu erreichen, kann eine Maleimid-Gruppe in einen Wirkstoff, zum Beispiel Psoralen-Verbindungen, eingeführt werden.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf:

– ein Arzneimittel zur Verstärkung der Immunogenität eines Peptids oder eines Proteins oder eines Glycoproteins oder eines Lipopeptids, welches den universellen Träger kovalent durch seine Cys-Einheit mit dem genannten Peptid oder Protein oder Glycoprotein oder Lipopeptid verbunden enthält;
– ein Arzneimittel zur Behandlung von Tumorzellen, die den Gb3-Rezeptor (CD77) tragen, welche den universellen Träger im Einklang mit der Erfindung enthält, der kovalent durch seine Cys-Einheit an einen Wirkstoff oder ein Prodrug, der für die genannten Tumorzellen toxisch ist, gebunden ist.

Ohne den Rahmen des universellen Trägers der Erfindung und seine weit gefächerte Verwendung bei unterschiedlichen Anwendungen zu begrenzen, erläutern die nachstehenden Beispiele und Abbildungen die Vorteile der vorliegenden Erfindung.
Legende zu den Abbildungen:
1 stellt das Protein-Profil der letzten SephaDex 75-Säule dar, die gereinigtes STxB-Cys ergibt. Die Fraktionen 20-25 enthalten überwiegend monomeres STxB-Cys (die Positionen von monomerem und dimerem STxB-Cys werden an der rechten Seite angegeben). Molekulargewichtsmarkierungen werden an der linken Seite angegeben.
2a stellt die Bindung von Typ2 von Pep2 [wie in Beispiel 2 definiert] an STxB-Cys dar, gefolgt von einer in vitro-Untersuchung zur Antigen-Präsentation auf dendritischen D1-Zellen, wie unter (2) beschrieben. Zwei unterschiedliche Präparationen von STxB-Cys, gebunden an das SL8-Peptid, ein immundominantes Epitop von Ovalbumin, (genannt 4A und 9A) wurden verwendet. Bei Fixierung wird eine Antigen-Präsentation aufgehoben, was anzeigt, dass keine extrazelluläre Prozessierung auftrat.
2b stellt ein Kontrollexperiment zu 2a dar, in dem gezeigt wird, dass fixierte D1 immer noch freies SL8-Peptid präsentieren kann.
3 stellt ein weiteres Experiment mit fixierten und nicht fixierten D1-Zellen dar, in dem eine Bindungsreaktion des Typs1 an STxB-SH und Pep1 verwendet wird [wie in Beispiel 2 definiert].
4 stellt die von der B-Untereinheit abhängige Präsentation von antigenen Peptiden dar, die von einer Bindung von Pep2 an B-Glyc-Cys-KDEL stammen. Die Verwendung von Fab-Fragmenten eines Antikörpers, der die STxB-Bindung an Gb3 neutralisiert, verhindert auch die Antigen-Präsentation.
5 zeigt, dass der Inhibitor der Gb3-Synthese, PPMP, die von der B-Untereinheit abhängige Antigen-Präsentation verhindert (5a) und dass SL8-Präsentation in Zellen, die mit PPMP behandelt wurden, nicht vermindert ist.
6 stellt ein Reaktionsschema für Ova voller Größe dar, das unter Verwendung des heterobifunktionalen Vernetzungsmittels MBS an STxB-Cys bindet. Oben: erste Reaktion, die MBS an primäre Amine von Ova bindet. Mitte: zweite Reaktion zwischen aktiviertem Ova und STxB-Cys. Unten: Struktur von MBS.
7 zeigt eine Western-Analyse von Ova, das an STxB-Cys bindet. Der obere Teil der Abbildung stellt einen Immunblot unter Verwendung eines anti-STxB-Antikörpers dar, der untere Teil einen Immunblot unter Verwendung eines anti-Ova-Antikörpers. Die Zwischenprodukte der verschiedenen Schritte des Reinigungsverfahrens werden dargestellt. Linie 1: ungebundene Proteine (durch ein Kreuz gekennzeichnet). Linie 2: Bindungsreaktion (Bindungsprodukt durch einen Pfeil gekennzeichnet). Linie 3: Eluat der Immunaffinitätssäule, die mit anti-STxB-Antikörper bestückt war. Linien 4-7: Fraktionen aus der Gelfiltrationssäule. Linie 4: Fraktionen 9-10. Linie 5: Fraktionen 11-12. Linie 6: Fraktionen 13-14. Linie 7: Fraktionen 15-19 (freies STxB-Cys). Die Fraktionen 11-12 enthalten den Hauptanteil des monomeren Bindungsproduktes. Einiges Material mit geringerer elektrophoretischer Mobilität kann ebenfalls nachgewiesen werden, welches vermutlich von dimerem Ova stammt, das im Ausgangspräparat vorhanden war.
8 stellt eine immunfluoreszenz-Analyse des Transportes von STxB-Cys-Ova in HeLa-Zellen dar. Das Bindungsprodukt STxB-Cys-Ova (oberer Teil der Abbildung) oder ein Gemisch aus STxB-Cys und Ova (unterer Teil der Abbildung) wurden mit HeLa-Zellen auf Eis inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen über 45 min auf 37°C erwärmt, fixiert und mit den angegebenen Antikörpern gefärbt. Man beachte, dass, wenn Ova an STxB-Cys gebunden ist (oben), das Protein in den Golgi-Apparat vektorisiert wird, der ebenfalls durch die Golgi-Markierung Rab6 angefärbt wird. Wenn Ova nur mit STxB-Cys vermischt wird (unten), kann das Protein nicht auf den Zellen nachgewiesen werden.
9 zeigt auf MHC-Klasse I und II beschränkte Antigen-Präsentation, die durch Inkubation von D1-Zellen mit STxB-Cys-Ova induziert wurde. Einzelheiten im Text.
Beispiel 1: Herstellung des universellen Trägers
a) Konstruktion eines Plasmids, das STxB-Cys exprimiert:
In einer bevorzugten Ausführungsform wurde das Plasmid pSU108 (7) modifiziert, um das Cystein-Codon tgt am 3'-Ende der cDNA für das B-Fragment einzuführen.
PCR-Primer A:
SEQ ID NO:3 (5'-AGCGAAGTTATTTTTCGTTGTTGACTCAGAATAGCTC-3')
und Primer A':
SEQ ID NO:4 (5'-GAGCTATTCTGAGTCAACACGAAAAATAACTTC-3')
wurden mit Plasmid-spezifischen Primern ShigaAtpE verwendet:
SEQ ID NO: 5 (5'-CACTACTACGTTTTAAC-3')
und Shiga-fd:
SEQ ID NO:6 (5'-CGGCGCAACTATCGG-3');
um DNA-Fragmente herzustellen, die in einer zweiten PCR mit den Primern Shiga AtpE und Shiga-fd ein Fragment ergaben, das in die SphI- und SalI-Restriktionsstellen von pSU108 hinein cloniert wurde. Die durch PCR erhaltenen Sequenzen wurden durch Didesoxy-Sequenzierung überprüft.
b) Proteinreinigung:
b) 1. Die Herstellung des periplasmatischen Extraktes wurde wie folgt durchgeführt:

– Animpfen von 125 ml LB/Amp mit 125 μl einer über Nacht bei 30°C gezüchteten Kultur,
– Züchten bei 30°C über Nacht,
– Übertragen in 375 ml LB/Amp bei 50°C; Inkubieren über 4 Stunden bei 42°C,
– Zentrifugieren, um Zellen abzusetzen,
– Waschen der Zeilen dreimal mit 10 mM Tris/HCl, pH-Wert 8,0,
– Resuspendieren der Zellen in 200 ml 25 %iger Saccharose, 1 mM EDTA, 10 mM Tris/HCl, pH-Wert 8,0; Inkubieren bei Zimmertemperatur über 10 min,
– Zentrifugieren, um Zellen abzusetzen,
– Resuspendieren der Zellen in 200 ml eisgekühltem Wasser, das einen Cocktail zur Hemmung von Protease enthält; Inkubieren auf Eis über 10 min,
– Zentrifugieren; Gewinnen des Überstandes; Zugabe von 20 mM Tris/HCl, pH-Wert 8,0.

b) 2. Reinigung über Säulen:
Der periplasmatische Extrakt wurde auf eine QFF-Anionenaustausch-Säule (Pharmacia) gegeben und mit 230 mM NaCl eluiert. STxB-Cys enthaltende Fraktionen wurden zusammengegeben, vierfach verdünnt und auf eine Mono-Q-Anionenaustausch-Säule (Pharmacia) gegeben, anschließend erfolgte die Elution mit 230 mM NaCl. Nach der Konzentration mit Mikrokonzentrationsvorrichtungen von PaliFiltron wurden die zusammengegebenen Fraktionen durch eine Sephadex 75-Gelfiltrationssäule gegeben. Die Reinheit lag über 95 % (1).
b) 3. Charakterisierung des Produktes:
Die B-Fragmente von STxB-Cys, gereinigt aus den Sephadex 75-Gelfiltrationssäulen liegen im Wesentlichen in monomerer Form vor (1). Dies ist ein entscheidender Unterschied zu Konstruktionen, bei denen das Cystein an mehr als 2 Aminosäuren des natürlichen C-Terminus des B-Fragmentes angefügt wurde. In diesen Fällen sind die benachbarten B-Fragmente innerhalb eines Pentamers an Disulfid-Brücken beteiligt.
Beispiel 2: Bedingungen für die Bindung von aktivierten Peptiden an den universellen Träger:
a) Träger:
Drei verschiedene Träger sind miteinander verglichen worden:

1) STxB-Cys: B-Fragment, an das ein Cys direkt an seinen C-Terminus angefügt worden ist. Dieses Protein eluiert als ein Monomer aus den Reinigungssäulen.
2) STxB-Z₂-Cys: Träger mit einem kurzen Spacer (2 Aminosäuren, die aus einer Clonierungskassette stammen) zwischen dem C-Terminus des Wildtyp-B-Fragmentes und dem Cys. Der größte Teil dieses Proteins eluierte in Form von Dimeren aus den Reinigungssäulen. Sie können unter reduzierenden Bedingungen getrennt werden, was auf die Bildung von Disulfid-Brücken zwischen den Monomeren in dem pentameren Komplex der B-Untereinheit hinweist.
3) STxB-Glyc-Cys-KDEL: Träger, bei dem das Cys zwischen einer Glycosylierungskassette mit einer Länge von 9 Aminosäuren und einem C-terminalen KDEL-Peptid liegt. Der größte Teil dieses Proteins eluierte in Form von Dimeren aus den Reinigungssäulen. Sie können unter reduzierenden Bedingungen getrennt werden, was auf die Bildung von Disulfid-Brücken zwischen den Monomeren in dem pentameren Komplex der B-Untereinheit hinweist.

b) Test-Peptide:

1) Pep1: ein synthetisches Peptid aus 16 Aminosäuren, das das aus dem Ovalbumin von Küken stammende, antigene Peptid SL8 trägt.
2) Pep2: ein synthetisches Peptid aus 24 Aminosäuren wie vorstehend, zusätzlich aber mit einer His-Markierung an seinem C-Terminus.
3) SL8: das antigene Peptid aus Ovalbumin, das sich direkt mit Peptiden auf MHC-Klasse I-Komplexen an der Plasmamembran von Antigen präsentierenden Zellen austauschen kann.

c) Bindungsbedingungen:
Unter reduzierenden Bedingungen (Typ 1): Die Fusionsproteine wurden über Nacht mit DTT behandelt, dann wurde aktiviertes Peptid (mit einer Bromacetat-Gruppe an seinem N-Terminus) im Überschuss zugegeben. Die Bedingungen, die für die ersten Fusionsproteine verwendende Bindungsexperimente verwendet werden, werden die Monomere zum größten Teil dimerisieren (Proteine STxB-Z₂-Cys und STxB-Glyc-Cys-KDEL).
Unter nicht reduzierenden Bedingungen (Typ 2): Die Fusionsproteine reagieren direkt mit den aktivierten Peptiden.
d) Biochemische und morphologische Kontrollen:
Pep2 trägt eine His-Markierung: Dies erlaubte es uns, die Anwesenheit von Pep2 auf der B-Untereinheit unter Verwendung eines anti-His-Antikörpers durch Western-Blot-Analyse and den von der B-Untereinheit abhängigen Transport von Pep2 in HeLa-Zellen nachzuweisen.
2a zeigt, dass eine von der Dosis abhängige Stimulierung des B3Z-CTL-Hybridoms (Messung der Aktivität von β-Galactosidase) bei nicht fixierten Zellen beobachtet wurde, während die Fixierung die Antigen-Präsentation aufhob.
Man beachte, dass Antigen-Präsentation nur bei nicht fixierten Zellen funktioniert, was anzeigt, dass die beobachtete Präsentation nicht auf verunreinigendes freies Pep2 zurückzuführen ist.
2b stellt das Kontrollexperiment zu 2a dar, in dem gezeigt wird, dass fixierte D1-Zellen immer noch freies SL8-Peptid präsentieren können.
In 3 scheint es bei dieser Art von Protokoll so zu sein, dass einiges freies Pep1 mit dem Fusionsprotein zusammen gereinigt zu werden scheint, da bei hohen Dosierungen (200-1000 nM) eine gewisse Präsentation auf fixierten Zellen beobachtet wurde. Präsentation durch SL8 wird auf der rechten Seite dargestellt.
In 4 wurde das gebundene Protein (Linien 1 und 2) oder das SL8-Peptid (Linien 5 und 6) mit dem anti-B-Untereinheit-Fab-Fragment, welches vom 13C4-Antikörper stammte, der die Bindung der B-Untereinheit an Gb3 hemmt, inkubiert (Linien 2 und 5) oder ohne dieses Fragment inkubiert (Linien 1 und 4). Man beachte, dass das Fab-Fragment die Fähigkeit der B-Untereinheit neutralisiert, das antigene Peptid in den Klasse I-Stoffwechselweg einzuführen, während die Präsentation mit SL8 unter diesen Bedingungen nicht beeinträchtigt ist. Das Hintergrundsignal betrug in diesem Experiment 0,3.
In 5a wurden D1-Zellen mit PPMP (vgl. 3b von (2)) über 3 Tage vorbehandelt. Diese Behandlung führte zu einer wichtigen Verringerung der Expression von Gb3 an der Zelloberfläche, ohne sie jedoch vollständig zu eliminieren. Unter dieser Bedingung war die Antigen-Präsentation aus einer Bindungsreaktion von Pep1 mit STxB-Glyc-Cys-KDEL signifikant reduziert, was anzeigt, dass Gb3 für das Präsentationsphänomen eine wichtige Rolle spielt.
Aus all diesen Experimenten hat es den Anschein, dass die Bindung unter nicht reduzierenden Bedingungen an STxB-Cys überraschend wirkungsvoll ist (in Bezug auf Sensitivität; man beachte, dass, wie in 1 dargestellt, nur 4 nM STxB-Cys-Pep2 nötig sind, um eine Antwort zu erhalten). Daher ist der universelle Träger STxB-Cys auf Grund der Einfachheit seiner Herstellung und der Reproduzierbarkeit der Bindung bevorzugt.
Die optimalen Bedingungen für die Bindung von aktivierten Peptiden an STxB-Cys waren somit die Nachstehenden:

– Dialysieren von STxB-Cys gegen 20 mM Borat-Pufferlösung, pH-Wert 9,0, 150 mM NaCl,
– Konzentrieren auf 1 mg/ml,
– Lösen des N-terminal aktivierten Peptids (aktiviert mit Bromacetat-Anhydrid) zu 12 mM in DMSO,
– Verdünnen des Peptids auf 0,2 mM in Proteinlösung,
– Inkubieren über 12 Stunden bei Zimmertemperatur,
– Dialysieren gegen PBS.

Beispiel 3: Charakterisierung von STxB auf seine Fähigkeit zur Antigen-Präsentation
Die nachstehenden experimentellen Reihen werden helfen, die Fähigkeit von STxB, im System der Antigen-Präsentation Funktionen auszuüben, vollständig zu beschreiben.
a) Auf Klasse I- und Klasse II beschränkte Antigen-Präsentation:
Ein Peptid, das auf Klasse I- und II- beschränkte, antigene Peptide von Küken-Ovalbumin
(Br-CH2-CO-NH-LEQLESIINFEKLTEWSLKISQAVHAAHAEINEAGR, Sequenzen 257-264 und 323-339) trägt, wurde an STxB-Cys gebunden, und die auf Klasse I- und Klasse II beschränkte Präsentation dieser Peptide wurden unter Verwendung der zugehörigen T-Zell-Hybridome untersucht.
b) Bindung von Proteinen in ganzer Größe.
Unsere zuvor gewonnenen Ergebnisse legen nahe, dass Küken-Ovalbumin an STxB-Cys gebunden werden kann. Diese Experimente sind mit dem heterobifunktionalen SPDP-Vernetzungsmittel durchgeführt worden. (Carlsson et al., 1978).
Eine erste Reihe von Experimenten zur Antigen-Präsentation deutete darauf hin, dass das Ovalbumin-Protein in den endogenen, auf MHC-Klasse 1 beschränkten Stoffwechselweg zur Antigen-Präsentation von dendritischen Zellen der Maus eingeführt werden kann. SPDP besitzt den Nachteil, dass es von Serum-Thiolasen gespalten werden kann. Dieses Vernetzungsmittel wurde erfolgreich durch MBS ersetzt, das nicht spaltbar ist. Andere antigene Proteine (hart 1 und Polypeptide, die von HPV16-E7 und Muc1 stammen) werden untersucht, um zu zeigen, dass das Verfahren universell anwendbar ist.
c) Bindung von komplexen Protein-Gemischen.
Es wird ein Lysat der von einem Cervix-Karzinom stammenden Zelllinie Caski verwendet. Diese Cervix-Karzinom-Zelllinie, die das Allel HLA-A2 auf seiner Membran exprimiert, exprimiert auch Peptide, die vom Papillomvirus des Menschen stammen. E7 ist ein früh transkribierter ORF von HPV, der für die Transformation von primären Keratinocyten notwendig ist. Da auf HLA A2-beschränkte anti-E7-CTL in vitro hervorgerufen werden, wird die Wirksamkeit der Bindung die Protein-Gemisches wurde durch eine Präsentationsuntersuchung, die für von HLA-A2-E7 stammende Peptide spezifisch ist, untersucht. Als Kontrolle wurde ein Lysat von einer HLA-A2-positiven Zelllinie, die E7 nicht exprimiert, (Croft-Zellen oder Daudi) an STxB-lys gebunden.
Beispiel 4: Anwendung auf auf MHC-Klasse I beschränkte Antiqen-Präsentation
Das Experiment aus 4 zeigt, dass von STxB-Cys abhängige Antigen-Präsentation gehemmt wird, wenn die Wechselwirkung mit Gb3 verhindert wird. Hier ist herausgefunden worden, dass eine vorherige Bindung des Fab-Fragmentes von monoclonalem Ak gegen STxB an 0,1 pM STxB-Cys, gebunden an SL8, die Antigen-Präsentation hemmte, was nahe legte, dass die Bindung von STxB-Cys an Gb3 für die Antigen-Präsentation notwendig ist. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Gb3-Expression durch einen Wirkstoff gehemmt wurde (4).
Beispiel 5: Reaktionskette zur Bindung von Ovalbumin an das STxB-Cys
Das Reaktionsschema wird in 6 dargestellt.
In einer ersten Reaktion reagiert die Einheit des N-Hydroxysuccinimid-Esters von MBS mit primären Aminen auf einem antigenen Zielprotein wie etwa dem Modellprotein Ovalbumin (Ova). Das Reaktionsprodukt wird gereinigt und dann in einer zweiten Reaktion mit STxB-Cys inkubiert, was zur Bindung über die Maleimidbenzoyl-Einheit führt.
7 zeigt die SDS-PAGE- und Western-Analyse einer typischen Bindungsreaktion zwischen STxB-Cys und Ova. Zur Bindung wurden 20 mg/ml Ova in 100 mM HEPES, pH-Wert 7,4, mit 4,5 mM MBS über 30 min bei Zimmertemperatur inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird durch eine mit 10 mM PBS/EDTA äquilibrierte Gelfiltrationssäule gegeben. Eluiertes Ova wird auf 20 mg/ml konzentriert. 1 Volumen an STxB-Cys mit 3,5 mg/ml in PBS/EDTA wird mit 1 Volumen aktiviertem Ova vermischt und über Nacht bei Zimmertemperatur inkubiert.
7 zeigt, dass innerhalb der Bindungsreaktion Banden mit geringerer elektrophoretischer Mobilität (mit Pfeilen gekennzeichnet; Bindungsprodukt) zusätzlich zu ungebundenem STxB (oberer Teil) und ungebundenem Ova (unterer Teil; ungebundene Proteine sind mit einem Kreuz gekennzeichnet) nachgewiesen werden können. Das Reaktionsprodukt wird durch Passage durch eine Immunaffinitätssäule, hergestellt mit monoclonalem anti-STxB-Antikörper 13C4, gereinigt (Spur IP-Säule). Man beachte, dass freies Ova eliminiert wird. Eluiertes STxB-Cys (gebunden und nicht gebunden) lässt man dann durch eine Gelfiltrationssäule laufen, um freies STxB (Fraktionen 15-19) von gebundenem STxB-Cys (Fraktionen 9-14) zu trennen; (man beachte, dass die Fraktionen 11-12 den größten Teil des gebundenen Proteins enthalten; die obere Bindungsbande, die im Vergleich zur unteren Bande schwächer ist, ist möglicherweise auf dimeres Ova zurückzuführen).
Beispiel 6: Intrazelluläre Transportcharakteristika des Bindungsproduktes STxB-Cys-Ova
0,5 μM STxB-Cys-Ova wurde auf Eis mit HeLa-Zellen inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und über 45 min auf 37°C erwärmt, fixiert und auf die angegebenen Antikörper gefärbt. Wie in 8 gezeigt, konnte Ova-Immunreaktivität zusammen mit STxB-Immunreaktivität im Golgi-Apparat, der durch Rab6 gefärbt wird, nachgewiesen werden, wenn STxB-Cys und Ova durch MBS verbunden waren. Wenn beide Proteine als separate Einheiten mit HeLa-Zellen inkubiert werden, wird nur STxB-Cys zum Golgi-Apparat transportiert, während Ova nicht auf den Zellen nachgewiesen werden kann. Diese Daten zeigen deutlich, dass gebundenes STxB-Cys immer noch in der gleichen Weise wie ungebundenes STxB-Cys transportiert wird und dass Ova über STxB-Cys vektorisiert wird.
Beispiel 7: Das STxB-Cys gestattet sowohl auf MHC-Klasse I als auch II begrenzte Präsentation von Peptiden, die von exogenen, antigenen Proteinen in voller Größe stammen
In einem ersten Experiment (9, links) haben wir gezeigt, dass, wenn STxB-Cys-Ova verwendet wird, um die murine dendritische Zellline D1 zu sensibilisieren, ein deutlicher Anstieg der Präsentation des auf die MHC-Klasse II beschränkten Ova-stämmigen Peptides Ova_323-339 im Vergleich zu D1-Zellen, die mit nicht vektorisiertem Ova gepulst waren, beobachtet werden kann. Tatsächlich konnte eine signifikante Präsentation des Peptides Ova_323-339 mit einer so geringen Menge wie 0,01 nM STxB-Cys-Ova nachgewiesen werden, wohingegen 10 nM Ova in voller Größe für eine wirksame Präsentation des selben Peptids erforderlich waren. Die Präsentation des auf IA^b beschränkten Peptides Ova_323-339 wurde unter Verwendung des B097.10-Hybridoms erhalten, welches nach Erkennung dieses Peptides IL-2 produziert. Als eine Kontrolle beobachteten wir keine IL-2-Sekretion, wenn ein irrelevantes, auf MHC-Klasse II beschränktes Hybridom statt B097.10 verwendet wurde (Daten nicht dargestellt).
In einem zweiten Experiment pulsten wir die selbe dendritische, auf H2^b beschränkte D1-Zelllinie entweder mit Ova allein oder mit STxB-Cys-Ova. Es wurde keine Präsentation des von Ova stammenden immundominanten Peptides SL8 (Ova_257-284) beobachtet, wenn die D1-Zellen mit bis zu 100 nM freiem Ova sensibilisiert wurden, während 1-10 nM STxB-Cys-Ova die Präsentation des Peptides SL8 gestatteten, wie durch das spezifische B3Z-Hybridom gezeigt wurde, das das Peptid SL8 in Verbindung mit Kb-Molekülen erkennt. Als eine Kontrolle wurde gezeigt, dass unter den selben experimentellen Bedingungen keine Aktivierung eines irrelevanten Hybridoms beobachtet wurde.
Zusammen zeigen diese Ergebnisse deutlich, dass STxB-Cys mit hoher Wirksamkeit Proteine voller Größe sowohl in den MHC-Klasse I- als auch den -Klasse II-Stoffwechselweg lenkt.
LITERATURVERZEICHNIS

(1) Ren-Shiang Lee, Eric Tartour, Pierre van der Bruggen, Valérie Vantomme, Isabelle Joyeux; Bruno Goud, Wolf Herman Fridman und Ludger Johannes, "Major histocompatibility complex class I Presentation of exogenous soluble tumor antigen fused to the B-fragment of Shiga toxin". Eur. J. Immunol. (1998) 28: 2726-2737.
(2) Nacilla Haicheur, Emmanuelle Bismuth, Sophie Basset, Olivier Adotevi, Guy Warnier, Valérie Lacabanne, Armelle Regnault, Catherine Desaymard, Sebastian Amigorena, Paola Ricciardi-Castagnoli, Bruno Goud, Wolf H. Fridman, Ludger Johannes und Eric Tartour, "The B Subunit of Shiga Toxin Fused to a Tumor Antigen Elicits CTL and Targets Dendritic Cells to Allow MHC Class I-Restricted Presentation of Peptides Derived from Exogenous Antigens". The Journal of Immunology (2000) 165: 3301-3308.
(3) Noakes, K.L., H.T. Teisseranc, J.M. Lord, P.R. Dunbar, V. Cerundolo und L.M. Roberts "Exploiting retrograde transport of Shigalike toxin 1 for the delivery of exagenous antigens into the MHC class I presentation pathway". Febs. Lett, (1999) 453:95.
(4) Philippe Schelté, Christophe Boeckler, Benoît Frisch und Francis Schuber "Differential Reactivity of Maleimide and Bromoacetyl functions with Thiols: Application to the Preparation of Liposomal Diepitope Constructs". Eur. J. Immunol. (1999) 29:2297-2308.
(5) Carlsson, J., H. Drevin, und R. Axen. 1978. Protein thiolation and reversible protein-protein conjugation. N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate, a new heterobifunctional reagent. Biochem. J. 173:723-737.
(6) Su, G.F., H.N. Brahmbhatt, J. Wehland, M. Rohde und K.N. Timmis "Construction of stable LamB-Shiga toxin B subunit hybrids: analysis of expression in Salmonella typhimurium aroA strains and stimulation of B subunit-specific mucosal and serum antibody responses". (1992) Infect. Immun. 60:3345-3359.
(7) Johannes, L., Tenza, D., Antony, C. und Goud, B., "Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin". (1997) J. Biol. Chem. 272: 19554-19561.
(8) N. A. Stockbine, M. P. Jackson, L.M. Sung, R.K. Holmes. AD. O'Brien, J Bacteriol 170, 1116-22 (1988).

ANHANG SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Universeller polypeptidischer Träger zum Zielrichten eines Moleküls zu Gb3-Rezeptor-exprimierenden Zellen, der die folgende Formel STxB-Z(n)-Cys aufweist, wobei: – STxB die Shiga-Toxin-B-Untereinheit oder ein funktionelles Äquivalent davon ist, wobei das funktionelle Äquivalent die Fähigkeit hat, spezifisch an den Gb3-Rezeptor zu binden und/oder eine Internalisierung eines Antigens und seine Präsentation in einem MHC-Klasse-I-beschränkten Weg auszulösen, oder sowohl MHC-Klasse I als auch Klasse II auf derselben Antigen-präsentierenden Zelle, – Z eine Aminosäure ist, die keine Sulfydrylgruppe aufweist, wobei n 0,1 oder ein Polypeptid ist, – Cys die Aminosäure Cystein ist.
Universeller Träger nach Anspruch 1, wobei n 0 ist.
Universeller Träger nach Anspruch 1 oder 2, der an ein Molekül gebunden ist, wobei das Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Peptiden, Oligopeptiden, Glycoproteinen, Glycopeptiden, Nucleinsäuren, Polynucleotiden oder einer Kombination davon.
Universeller Träger nach Anspruch 1 oder 2, der an ein Molekül gebunden ist, wobei das Molekül durch eine -S-S- oder -S-CO- oder -S-CH₂- oder -S-N-H-Bindung kovalent an den -S-Rest des universellen Trägers gebunden ist.
Universeller Träger nach Anspruch 4, wobei das Molekül ein auf Antigen-präsentierende Zellen zielzurichtendes Antigen ist.
Universeller Träger nach Anspruch 1 oder 2, wobei der universelle Träger durch eine -S-S- oder -S-CO- oder -S-CH₂- oder -S-NH-Bindung kovalent an ein Oligopeptid oder ein Polypeptid gebunden ist und das zielzurichtende Molekül an das Oligopeptid oder Polypeptid gebunden ist.
Universeller Träger nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass er kovalent an ein Polylysin-Oligopeptid gebunden ist und das zielzurichtende Molekül eine Nucleinsäure oder ein Oligonucleotid ist, die/das an die Polylysin-Einheit gebunden ist.
Universeller Träger nach Anspruch 4, wobei das Molekül ein cytotoxischer Wirkstoff oder Pro-Wirkstoff ist, der auf Gb3-Rezeptor-exprimierende Tumorzellen zielzurichten ist.
Isoliertes Polynucleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Polynucleotid, umfassend die die Shiga-Toxin-B-Untereinheit codierende Nucleotidsequenz STxB oder ein funktionelles Äquivalent davon, das an seinem 3'-Ende das Cystein codierende Codon TGT oder TGC trägt, wobei das funktionelle Äquivalent die Fähigkeit hat, spezifisch an den Gb3-Rezeptor zu binden und/oder eine Internalisierung eines Antigens und seine Präsentation in einem MHC-Klasse-I-beschränkten Weg auszulösen, oder sowohl MHC-Klasse I als auch Klasse II auf derselben Antigen-präsentierenden Zelle, b) eine zu der Sequenz in a) komplementäre Nucleotidsequenz.
Polynucleotid nach Anspruch 9, das die SEQ ID NO:2 aufweist.
Rekombinanter Vektor oder Plasmid, umfassend eine Polynucleotidsequenz nach Anspruch 9 oder 10 zur Expression des universellen Vektors nach Anspruch 1 in einer geeigneten Wirtszelle.
Rekombinante Zelllinie, erhalten durch Transformation mit dem rekombinanten Vektor nach Anspruch 11.
Rekombinante Zelllinie nach Anspruch 12, die eine prokaryontische Zelllinie ist.
Rekombinante Zelllinie nach Anspruch 11, 12 oder 13, am 19. Dezember 2000 unter der Hinterlegungsnummer I-2604 beim CNCM hinterlegt.
Verfahren zur Konstruktion eines rekombinanten Vektors nach Anspruch 11 oder 12, umfassend: a) Bereitstellen eines die STxB-Sequenz umfassenden Plasmids; b) Anwenden zweier PCR-Amplifikationsschritte mit Hilfe von zwei Primerpaaren, AA' und BB', – wobei A und B komplementär zueinander sind und das Cys-Codon umfassen, – wobei A' und B' sich außerhalb der STxB-Sequenz befinden; c) Isolieren der amplifizierten Fragmente; d) Hybridisieren der amplifizierten Fragmente; e) Anwenden einer PCR-Amplifikation auf die hybridisierten Fragmente; f) Insertion des amplifizierten Fragments in ein Plasmid.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Fragment in Schritt f) in die SphI- und SalI-Restriktionsstelle des Plasmids pSU108 insertiert wird.
Verfahren zur Herstellung eines polypeptidischen Trägers nach Anspruch 1, umfassend: a) Züchten einer Zelllinie nach einem der Ansprüche 12 bis 14, b) Gewinnen eines periplasmatischen Extrakts der Zellen, c) Reinigen des Polypeptids.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei in a) die Zelllinie E. coli ist und in c) die Reinigung mit Hilfe von Anionenaustauscher-Chromatographie gefolgt von Gelfiltrations-Säulenchromatographie durchgeführt wird.
Produkt, erhalten durch kovalente Bindung der Cys-Einheit des universellen polypeptidischen Trägers nach Anspruch 1 mit einer Sequenz von Interesse zur Verwendung für die Abgabe der Sequenz von Interesse in den MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Weg.
Expressionsvektor, der eine Sequenz von Interesse enthält und funktionell mit einem lysinreichen Peptid verknüpft ist, das kovalent an die Cys-Einheit des universellen polypeptidischen Trägers nach Anspruch 1 gebunden ist, zur Verwendung für die Abgabe der Sequenz von Interesse in Gb3-Rezeptor-exprimierende Zellen.
Expressionsvektor nach Anspruch 20, wobei das lysinreiche Peptid ein 16-Mer-Polylysin ist.
Produkt nach Anspruch 19 oder Expressionsvektor nach den Ansprüchen 20 und 21, wobei die Sequenz von Interesse ausgewählt ist aus: – einer ein immunogenes Peptid codierenden Sequenz, oder – einer Sequenz, die einen Wirkstoff oder Pro-Wirkstoff codiert, der für die Gb3-Rezeptor-exprimierenden Zellen toxisch wird, oder – einer ein therapeutisch aktives Molekül codierenden Sequenz.
Arzneimittel für die Steigerung der Immunogenität eines Peptids oder eines Proteins oder eines Glycoproteins oder eines Lipopeptids, das den polypeptidischen Träger nach Anspruch 1 oder 2 durch seine Cys-Einheit kovalent an das Peptid, Protein, Glycoprotein oder Lipopeptid gebunden enthält.
Arzneimittel für die Behandlung von Gb3-Rezeptor-tragenden Tumorzellen, das den polypeptidischen Träger nach Anspruch 1 oder 2 durch seine Cys-Einheit kovalent an einen für die Tumorzellen toxischen Wirkstoff oder Pro-Wirkstoff gebunden enthält.