EA013469B1 - Слитый белок, содержащий домен bh3 белка "bh3-только" - Google Patents

Abstract

В изобретении приведено описание слитого белка, включающего по меньшей мере один первый компонент (I), который содержит транспортирующую последовательность, и по меньшей мере один второй компонент (II), который содержит полноразмерную или частичную последовательность домена ВН3 белка "ВН3-только", где слитый белок содержит в своем компоненте (I) D-энантиомерные аминокислоты в ретроинвертированном порядке. Кроме того, приведено описание фармацевтических композиций, содержащих такой слитый белок, а также применение указанного слитого белка.

Description

Настоящее изобретение относится к слитым белкам, включающим по меньшей мере один первый компонент (I), который содержит транспортирующую последовательность, и по меньшей мере один второй компонент (II), который содержит полноразмерную или частичную последовательность домена ВН3 белка ВНЗ-только, где слитый белок содержит Ό-энантиомерные аминокислоты в ретроинвертированном порядке. Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим такие слитые белки, а также к применению указанных слитых белков.

Клетки многоклеточных организмов являются представителями высокоорганизованного сообщества. Количество клеток в этом сообществе строго регулируется не только путем контроля скорости деления клеток, но также и путем контроля скорости гибели клеток. Если определенные клетки оказываются более не нужными, то они самоуничтожаются путем активации внутриклеточной программы гибели. Этот важный процесс называют апоптозом. Апоптоз называют также запрограммированной гибелью клеток, и он запускается каскадом белков. Изменения, например мутации участвующих в этом процессе белков, которые препятствуют этой нормальной запрограммированной гибели клеток, играют существенную роль во многих заболеваниях, прежде всего раковых заболеваниях. Таким образом, рост раковых клеток часто обусловлен нарушением контроля гибели клеток. Более того, устойчивость к апоптозу является основной характерной особенностью злокачественных клеток, которая позволяет им размножаться и выживать.

Зависящий от митохондрий путь апоптоза регулируется семейством белков Вс1-2. Вс1-2, Вс1-хЬ, Вак и многие другие представители семейства Вс1-2 имеют состоящий из аминокислот гидрофобный участок вблизи их карбоксиконца, который связывает (заякоривает) их с внешней митохондриальной мембраной. В отличие от этого другие представители семейства Вс1-2, такие как В1б, В1т и Ваб, не имеют таких связывающихся с мембраной доменов, но они направляются к митохондриям в ответ на определенные стимулы. Еще одна группа белков имеет связывающийся с мембраной домен, но он спрятан в теле белка до тех пор, пока отсутствуют стимулы для его презентации (например, Вах).

Семейство белков Вс1-2 сохранилось в ходе эволюции многоклеточных организмов, его гомологи обнаружены у позвоночных и беспозвоночных видов животных. Некоторые типы вирусов животных также несут в своих геномах гены семейства Вс1-2, включая вирусы герпеса простого, участвующие в раковых заболеваниях, такие как вирус Эпштейна-Барра (ЕВУ) и вирус герпеса саркомы Капоши (К8НУ). Как проапоптозные, так и антиапоптозные белки семейства Вс1-2 подверглись изменениям в направлении трансдифференцировки. Относительное соотношение анти- и проапоптозных белков семейства Вс1-2 определяет в конечном итоге чувствительность или устойчивость клеток к различным апоптозным стимулам, включая уменьшение уровней факторов роста, гипоксию, радиацию, противораковые лекарственные средства, оксиданты и избыточное количество Са²⁺.

В процессе апоптоза белки семейства Вс1-2 прежде всего регулируют (стимулируют или ингибируют) высвобождение белков, таких как цитохром с, 8тас/П1АВЬО, индуцирующий апоптоз фактор, Н!гА2 и эндонуклеаза О, из митохондрий. Определенные белки семейства Вс1-2 (проапоптозные представители) являются главными регуляторами передачи сигнала о запрограммированной гибели клеток, а также исполнителями сигналов о гибели в митохондрии. В целом, семейство Вс1-2 состоит из проапоптозных представителей, запускающих высвобождение митохондриальных белков, и антиапоптозных представителей, ингибирующих высвобождение митохондриальных белков. Кроме того, семейство можно разделить на три основных подкласса: (а), (б) и (в). Подклассы (а) и (б), по-видимому, имеют структуру, сходную со структурой порообразующих доменов бактериальных токсинов, таких как колицины и дифтерийный токсин. Эти белки, напоминающие спиральные белки пор, включают как антиапоптозные белки (подкласс (а)), так и содержащие несколько доменов проапоптозные белки (подкласс (б)). Представители антиапоптозных белков (а), например Вс1-2 и Вс1-хЬ, являются консервативными по всем четырем гомологичным доменам (ВН) Вс1-2 (ВН1-4, также называемые мультидоменными антиапоптозными белками). Некоторые представители проапоптозных белков (б), например Вах и Вак, имеют гомологичные последовательности доменов ВН1-3 (ВН1-3, также называемые мультидоменными проапоптозными белками). В отличие от этого некоторые проапоптозные представители подкласса (в), например В1б, Иоха, Рита, В1к, В1т, Ваб, ВтГ, ЭР5/Нгк и Вок, имеют гомологичные последовательности только одного домена, а именно α-спирального домена ВНЗ (называемые белками ВНЗ-только). Домен ВНЗ, как правило, состоит из амфипатической α-спирали, имеющей длину примерно 15-20 аминокислот, как правило 16 аминокислот.

Белки ВНЗ-только (подкласс (в)) действуют в качестве афферентных эффекторов различных проапоптозных и антиапоптозных сигналов (Нии! А. е! а1., 8с1епсе 29З, 2001, р. 1784-1785). Все белки ВНЗтолько обладают способностью связываться с антиапоптозными белками семейства Вс1-2 и оказывать антагонистическое действие на их функцию (Нип! А. е! а1., выше). Их домен ВНЗ встраивается в гидрофобную щель на поверхности антиапоптозных белков, таких как Вс1-хЬ. Они передают многочисленные сигналы гибели в митохондрию путем взаимодействия с антиапоптозными белками семейства Вс1-2 и индуцируют апоптоз с помощью механизма, который требует наличия по меньшей мере одного из мультидоменных проапоптозных белков Вах или Вак семейства Вс1-2. Кроме того, некоторые, но не все

- 1 013469 белки ВН3-только обладают способностью связываться с мультидоменными проапоптозными представителями Вах или Вак.

Например, белок ВНЗ-только В1б может сам стимулировать проапоптозную сборку и функцию Вах и Вак, в то время как другие белки ВНЗ-только не функционируют сами по себе. С использованием коротких пептидов, представляющих собой α-спиральный домен ВНЗ белка ВНЗ-только ВИ, было установлено, что такие ВИ-пептиды способны индуцировать олигомеризацию Вах и Вак с высвобождением цитохрома с. Это свойство присуще белку ВНЗ-только В1т (Когктеуег 8.1. с! а1., Се11 Эса111 ΌίίГег 7, 2000, р. 1166-1173). В целом, ВИ связывается с (мультидоменными) проапоптозными Вах и Вак, а также с (мультидоменными) антиапоптозными Вс1-2 и Ве1-хЬ и обладает способностью непосредственно активировать Вах и Вак.

В противоположность этому у пептидов, представляющих собой домены ВНЗ белков ВНЗ-только Ваб или В1к, отсутствует способность непосредственно активировать Вах и Вак, но сохраняется способность связываться с антиапоптозными белками семейства Вс1-2 (Ье!а1 А. е! а1., Сапсег Се11 2, 2002, р. 18З192). Это продемонстрировано также в другом исследовании с использованием пептидов, полученных из домена ВНЗ белка ВНЗ-только Ваб, который стимулирует активность Вах только в присутствии Вс1-хЬ (Могеаи Р.-Р. е! а1., Тке 1оигпа1 оГ Вю1од1са1 Скет151гу, νο1. 278, №. 21, 200З, р. 19426-194З5). Таким образом, домены ВНЗ белков ВНЗ-только обладают различными функциями. ВИ-подобный домен ВНЗ активирует проапоптозные белки Вах и Вак, в то время как Ваб-подобный домен ВНЗ сенсибилизирует проапоптозные белки Вах и Вак, оккупируя карман антиапоптозных представителей семейства Вс12. В целом, домены ВНЗ белков ВНЗ-только представляют собой два класса рабочих соединений, которые инициируют гибель клеток с помощью определяемых генетическими факторами путей (Ье!а1 А. е! а1., Сапсег Се11 2, 2002, р. 18З-192).

Как описано выше, характеристики белков ВНЗ-только были изучены в различных исследованиях, в которых были проанализированы их функция и механизм действия. Результаты свидетельствуют о том, что домены ВНЗ указанных белков могут эффективно индуцировать апоптоз клеток с высоким уровнем экспрессии антиапоптозных представителей семейства Вс1-2 путем запуска высвобождения активных мультидоменных проапоптозных белков из указанных антиапоптозных белков.

Таким образом, домены ВНЗ белков ВНЗ-только представляют собой перспективный объект и эффективный инструмент для лечения различных заболеваний, обусловленных нарушенным контролем запрограммированной гибели клеток. Однако существующий уровень техники не позволяет найти путь осуществления непосредственной транспортировки указанных белков или их доменов ВНЗ соответственно в требуемое место в организме или клетке. Одной из основных проблем является повышение способности проникать через внутреннюю мембрану клеток. В некоторых исследованиях описан первый подход на основе трансдукции полиаргинина (^аид е! а1., Сапсег Век. 60, 2000, р. 1498-1502; Нокпдег е! а1., 1. Вю1. Скет. 274, 1999, р. 1З298-1ЗЗ04). Однако различные амфипатические α-спиральные пептиды, прежде всего катионные пептиды, могут притягиваться к несущим отрицательный заряд мембранам, включая митохондриальные мембраны, где они могут неспецифически разрушать липидный матрикс и мембранную барьерную функцию (МаЬихакг Вюскет. 8ос. Тгапк. 29, 2001, р. 598-601; Е11егЬу е! а1., ΝηΙ. Меб. 5, 1999, р. 10З2-10З8). При применении другого подхода с использованием конструкции ΑΝΤВНЗВАО, объединяющей антенпедии (ΑΝΤ) в качестве интернализующего фрагмента и их домен ВНЗ В АО, обнаружена токсичность. Однако токсичность не коррелировала с Вс1-2 (У1епа е! а1., Опсодепе 21, 2002, р. 196З-1977; 8сЫттег е! а1., Се11 Оеа1к ОгГГег. 8, 2001, р. 725-7ЗЗ).

Таким образом, в основу настоящего изобретения была положена задача разработать систему, позволяющую непосредственно транспортировать домен ВНЗ белка ВНЗ-только в требуемое место в организме.

В изобретении предлагается слитый белок, включающий по меньшей мере один первый компонент (I), который содержит транспортирующую последовательность, и по меньшей мере один второй компонент (II), который содержит частичную или полноразмерную последовательность домена ВНЗ белка ВНЗ-только, где слитый белок содержит в своем компоненте (I) и необязательно в компоненте (II) Э-энантиомерные аминокислоты в ретроинвертированном порядке.

Слитый белок, предлагаемый в изобретении (по меньшей мере, в своем компоненте (I)) содержит Э-энантиомерные аминокислоты в ретроинвертированном порядке (его называют также ретроинвертированным белком или ретроинвертированным слитым белком). Понятие ретроинвертированный относится к изомеру линейного пептида, в котором направление обычной или нативной Ь-аминокислотной последовательности изменено на обратный и инвертирована хиральность каждого аминокислотного остатка (вследствие хиральности Ώ-аминокислот в отличие от встречающихся в естественных условиях Ь-аминокислот). Подразумевается, что понятия слитый белок и белок, предлагаемый в изобретении, имеют такое же значение. Ретроинвертированные слитые белки, предлагаемые в изобретении, можно конструировать, например, путем синтеза обратной аминокислотной последовательности по отношению к соответствующей нативной Ь-аминокислотной последовательности. В Ώ-ретроинвертированных энантиомерных (слитых) белках положения карбонильных и аминогрупп в

- 2 013469 каждой простой амидной связи инвертированы, гарантируя тем самым, что положения групп боковых цепей на каждом α-атоме углерода сохраняются по отношению к обычным Ь-аминокислотным пептидным последовательностям. Ретроинвертированные слитые белки, предлагаемые в изобретении, обладают рядом полезных свойств. Например, они более эффективно проникают в клетки, являются более стабильными (прежде всего, ίη νίνο) и обладают меньшей иммуногенностью по сравнению с соответствующими Ь-аминокислотными слитыми белками. Поскольку встречающиеся в естественных условиях белки содержат Ь-аминокислоты, почти все расщепляющие ферменты типа протеаз или пептидаз расщепляют пептидные связи между смежными Ь-аминокислотами. Следовательно, белки, состоящие из Ό-энантиомерных аминокислот в ретроинвертированной форме, более устойчивы по отношению к протеолитическому расщеплению. Очевидно, что время удерживания в клетке слитых белков, предлагаемых в изобретении, повышается по сравнению с их обычными неинвертированными Ь-аминокислотными аналогами.

Компонент (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, служит в качестве носителя или транспортирующей последовательности. Транспортирующая последовательность или последовательностьноситель (в качестве компонента слитого белка, предлагаемого в изобретении) представляет собой любую аминокислотную последовательность, которая направляет слитый белок или компонент (II) слитого белка соответственно в цитоплазму клетки или даже в конкретное место назначения (область-мишень) в клетке. Транспортирующая последовательность может, например, направлять слитый белок в требуемое место внутри клетки, например в ядро, рибосому, эндоплазматический ретикулум, лизосому или пероксисому. Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления изобретения транспортирующая последовательность слитого белка, предлагаемого в изобретении, направляет слитый белок в определенное место в клетке. В целом, транспортирующая последовательность может направлять слитый белок, предлагаемый в изобретении, через плазматическую мембрану, например, из внеклеточного окружения через плазматическую мембрану в цитоплазму, повышая тем самым включение слитого белка или его лекарственного компонента (II) (транспортируемый компонент) соответственно, прежде всего, путем повышения его способности проникать в клетку или путем увеличения времени его удерживания в клетке.

В целом, функционально эффективный компонент (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, который содержит транспортирующую последовательность, представляет собой аминокислотную последовательность, включающую по меньшей мере 4 (смежные) Ό-аминокислоты. Функционально эффективные аминокислоты, содержащиеся в компоненте (I), должны обладать выраженными основными свойствами. Предпочтительно функционально эффективные аминокислотные последовательности содержат по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 96% основных аминокислот, предпочтительно аргинина и/или лизина. Функционально эффективные компоненты (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, предпочтительно содержат аминокислотную последовательность, состоящую из 4-50 Ό-аминокислот, более предпочтительно из 4-40 Ό-аминокислот, еще более предпочтительно из 4-30 Ό-аминокислот, еще более предпочтительно из от 4 до примерно 20 Ό-аминокислот и наиболее предпочтительно из от 4 до примерно 10 Ό-аминокислот.

Предпочтительно транспортирующую последовательность, предлагаемую в изобретении, можно получать, например, из известной последовательности, которая обладает способностью к транслокации через мембрану. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения транспортирующая последовательность слитого белка, предлагаемого в изобретении, представляет собой Ό-энантиомерную аминокислотную последовательность, расположенную в ретроинвертированном порядке по отношению к белку ТАТ вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). ТАТ представляет собой вирусный белок, необходимый для цикла заражения ВИЧ. Этот белок описан, например, в АО 94/04686, И8 5804604 и И8 5674980, каждый из указанных документов включен в настоящее описание в качестве ссылки. Компонент (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, связывают с компонентом (II), где компонент (I) содержит некоторые из или все 86 аминокислот полноразмерной последовательности Та!, но в своей ретроинвертированной Ό-форме. В частности, можно применять функционально эффективный компонент (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, который имеет менее 86 аминокислот и который еще обладает при этом усиленной способностью проникать в клетки и необязательно несет дополнительную информацию о локализации для проникновения в ядро клетки. Сегменты последовательности Та!, ответственные за обеспечение проникновения и включения в клетки, можно определять с помощью известных методов (см., например, Егапкей е! а1., Ргос. №111. Асай. 8с1, И8А 86: 1989, р. 7397-7401). Предпочтительно компонент (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, содержит основную область ТАТ (аминокислоты 48-57 или 49-57 соответственно) и не содержит богатую цистеином область ТАТ (аминокислоты 22-36), а также кодируемую экзоном 2 карбоксиконцевую область (аминокислоты 73-86) встречающегося в естественных условиях белка ТАТ. В качестве компонента (I) или части компонента (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, можно применять расположенную в обратном порядке основную область Та! (АК 57-48 или 57-49), состоящую из Ό-аминокислот. Последовательности, содержащие или пред

- 3 013469 ставляющие собой расположенную в обратном порядке основную область Та!, обозначены в настоящем описании как последовательности Ό-Та!.

Таким образом, предпочтительный функционально эффективный компонент (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, содержит последовательность Ό-ТАТ, например ИН₂-ЯККрККККК6-СООН или ΝΗ₂-ΚΚΚρΚΚΚΚΚ-ΟΘΘΗ (обе представляют собой ретроинвертированные последовательности указанной выше встречающейся в естественных условиях основной области ТАТ) или содержит варианты последовательности, соответствующие общей формуле последовательности Ό-ТАТ ΝΗ₂-ΧΧΧΑΧΧΧΧΧ-ί.ΌΟΗ. в которой X обозначает аминокислоты аргинин или лизин и А обозначает любую неосновную аминокислоту. Предпочтительно А находится в положении 4 указанной выше общей формулы. Однако в альтернативном варианте А может располагаться в любом положении внутри последовательности, т.е. в положении 2, 3, 5, 6, 7 или 8 вместо положения 4. Кроме того, вышеуказанную формулу можно модифицировать интродукцией дополнительных неосновных остатков путем замены от одного до четырех основных остатков общей формулы неосновными остатками. В соответствии с вышеизложенным последовательности компонента (I) состоят исключительно из Ό-аминокислот для того, чтобы иметь такую же структурную схему боковых цепей, что и соответствующие неинвертированные последовательности, состоящие из Ь-аминокислот.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения компонент (I) содержит транспортирующие последовательности, содержащие аминокислоты, представленные на фиг. 1А или 1Б.

В другом варианте осуществления изобретения функционально эффективные компоненты (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, содержат родовую аминокислотную последовательность, которая имеет одну из следующих формул: NΗ₂-АтXАοXАη-СΟΟΗ, NΗ₂-АтXXXАη-СΟΟΗ, NΗ₂-АтXXАXАη-СΟΟΗ, NΗ₂-АтXАXXАη-СΟΟΗ или ΝΗ^ΧΑΑΧ-СООН, в которых Χ обозначает аминокислоту аргинин или лизин; А обозначает любую неосновную аминокислоту; т обозначает целое число от 0 до 14; п обозначает независимо от т целое число от 0 до 14 и о обозначает независимо от т и п целое число от 0 до 5. Следует отметить, что представленные указанными выше общими формулами транспортирующие последовательности, предлагаемые в изобретении, состоят исключительно из Ό-энантиомерных аминокислот.

Конкретные примеры функционально эффективных компонентов (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, содержат или могут состоять из следующих последовательностей, обладающих выраженными основными свойствами:

МН₂-КТВК-СООН, МН₂-ВЬКК-СООН, МН₂-КРВК-СООН, Х'Н;-КШ^;('№-СОО11, МН₂-ОК1ВК-СООН, NΗ₂-NIΟΚΒΒN-СΟΟΗ, МН₂-КАО№ОК-СООН, У1Ь-НР1Ш-СС)О11, УН-ОКИНО-СОО! Р

ПН₂-КККЕ-СООН, N1Р-1ЮКИС1С18-СОО1Р N1Р-ИК8И-СОО1Р N1Р-ИС18ИИ-СОО1Р N1Р-И1ЮК-СОО1Р №₂-КАККО-СООН, N1Р-ИОИК-СОО! Р N1Р-ИИИР8-СОО1Р УН_;-ИРИИР8Р-СОО1Р

N1Р-ИОИК ¥-СОО1 Р МН₂-ВРКВ6МО-СООН, УН-ОХРИИ-СОО! Р Х'Н;-С1УККХС,Р8И-СОО1Р №₂-КЕ8ВЬ8К-СООН, Х'Н-ИИУИ-СОО! Р УН_;-ИИ8ИР-СОО1 Р МН₂-ВККМ-СООН,

МН₂-К8МАЬТВК66¥-СООН, МН₂-КБВВО-СООН, Х'Н_;-К\1УРРРУ-СОО1 Р

Следует отметить, что указанные выше транспортирующие последовательности, предлагаемые в изобретении, состоят исключительно из Ό-энантиомерных аминокислот.

Компонент (I) может содержать только одну (т.е. непрерывную) основную, обладающую способностью к транслокации через клеточную мембрану (транслоцирующую) последовательность (Ό-ретроинвертированная форма), аналогичную соответствующей (встречающейся в естественных условиях) транслоцирующей последовательности, например указанной выше последовательности Та!. В альтернативном варианте компонент (I) может содержать две или большее количество аминокислотных последовательностей в ретроинвертированном порядке, которые соответствуют одинаковым или различным транслоцирующим последовательностям с выраженными основными свойствами. Эти ретроинвертированные Ό-формы транслоцирующих мотивов синтезируют на основе встречающегося(ихся) в естественных условиях белка(ов) с использованием Ό-аминокислот и изменяя порядок их аминокислотной последовательности на обратный. Другими словами, слитый белок, предлагаемый в изобретении, может содержать, например, в компоненте (I) комбинацию двух или большего количества транслоцирующих последовательностей, которые все синтезированы в виде ретроинвертированной Ό-формы последовательностей. Как правило, такая комбинация транслоцирующих мотивов не присутствует ни в одной из встречающихся в естественных условиях последовательностей белка (в виде Ь-формы). Эти две или большее количество транслоцирующих последовательностей компонента (I) могут быть связаны друг с другом с помощью линкерной последовательности или без нее. Если целесообразно использовать линкерную последовательность, то ее длина предпочтительно составляет от 2 до 20 аминокислот.

Как указано выше, компонент (I) может содержать (один или большее количество) Ό-энантиомерных аминокислотных транслоцирующих мотивов (в ретроинвертированном порядке по сравнению с нативной последовательностью), которые получают на основе его соответствующего встречающегося в естественных условиях аналога, имеющего Ь-форму. В альтернативном варианте компонент (I) может содержать Ό-аминокислотные ряды (в ретроинвертированном порядке) имеющих Ь-форму последовательностей, которые последовательно модифицируют по сравнению с встречающимися в естест

- 4 013469 венных условиях последовательностями белка (обозначаемыми в настоящем описании также как производные). Эти производные компонента (I) (которые присутствуют в ретроинвертированной Ό-форме, иными словами, производное Ό-формы представляет собой аналог производного Ь-формы), как правило, обладают свойствами носителя, т.е. активностью в отношении включения в клетку (или даже предпочтительно в ядро клетки), которая практически аналогична активности соответствующего встречающегося в естественных условиях белка, даже если их последовательности не идентичны встречающимся в естественных условиях последовательностям белка.

Кроме того, к слитому белку, предлагаемому в изобретении, в частности к компоненту (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, или в конечном итоге - к любому другому компоненту можно добавлять фрагменты сахаров и/или липидов, например холестерина или других липидов, для того, чтобы еще более усиливать растворимость слитого белка в мембране, например добавлять их к одному или обоим концам компонента (I) для обеспечения локальной липофильности на одном или обоих концах. В альтернативном варианте или дополнительно фрагменты сахаров или липидов можно связывать с Ό-аминокислотными боковыми цепями, в частности боковыми цепями, имеющими гидроксильные и аминогруппы.

Компонент (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, должен сохранять такие функции, как свою способность проникать в клетку и/или свою способность удерживаться внутри клетки. Однако с помощью модификаций, интродуцируемых в компонент (I), можно добавлять другие функции. Так, компонент (I) можно модифицировать, например, для того, чтобы эффективно направлять слитый белок, предлагаемый в изобретении, в конкретную область-мишень внутри клетки. В соответствии с этим компонент (I) модифицируют так, чтобы придавать конкретную внутриклеточную локализацию компоненту (I) без потери его повышенной способности проникать в клетку. Как правило, в компонент (I) можно интродуцировать направляющую последовательность для направленного переноса слитого белка, предлагаемого в изобретении, в конкретные клеточные компартменты (например, эндоплазматический ретикулум, митохондрию, аппарат с неизвестной функцией (д1оош аррагаШк), лизосомные пузырьки). С другой стороны, можно добавлять специфические последовательности, которые обеспечивают цитоплазматическую локализацию слитого белка, предлагаемого в изобретении. Например, компонент (I) может содержать по меньшей мере одну дополнительную последовательность, которая связывается с одной или большим количеством цитоплазматических(ой) структур(ой), для того, чтобы удерживать слитый белок, предлагаемый в изобретении, в цитоплазме. В альтернативном варианте изменения основной области, которая, как полагают, является важной для ядерной локализации (см., например, Эапд и Ьее, 1. Вю1. Сйеш. 264, 1989, р. 18019-18023; НаиЬег е! а1., 1. Уйо1. 63, 1989, р. 1181-1187; ВиЬеп е! а1., 1. Уйо1. 63, 1989, р. 1-8), могут приводить к цитоплазматической локализации или частичной цитоплазматической локализации компонента (I) и, следовательно, слитого белка, предлагаемого в изобретении. Таким образом, компонент (I) может содержать измененные сигналы ядерной локализации, которые приводят к цитоплазматической локализации слитого белка, предлагаемого в изобретении.

Как описано выше, белки ВН3-только являются представителями семейства Вс1-2, обладающими способностью регулировать апоптоз путем взаимодействия с другими представителями семейства Вс1-2. Компонент (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую одну или большее количество частичных или полноразмерных последовательность(ей) домена ВН3 белка ВН3-только (классифицированных как подкласс белков семейства Вс1-2). Компонент (II) либо может содержать Ό-ретроинвертированную форму встречающейся в естественных условиях (полноразмерной или частичной) последовательности домена ВН3, тем самым гарантируется, что его Ό-аминокислотные боковые цепи имеют такое же положение, как и в нативной последовательности, состоящей полностью из Ь-аминокислот, либо в альтернативном варианте может содержать нативную, состоящую полностью из Ь-аминокислот последовательность, оба варианта обладают способностью индуцировать апоптоз либо путем взаимодействия по меньшей мере с одним белком семейства Вс1-2, либо путем активации или сенсибилизации по меньшей мере одного проапоптозного представителя семейства Вс1-2.

Если компонент (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, содержит частичную последовательность домена ВН3, она должна иметь (для того чтобы обладать функциональной эффективностью) по меньшей мере 4 (смежные) Ό- или Ь-аминокислоты либо в нативном, либо в ретроинвертированном порядке (отражающем соответствующий фрагмент, состоящий по меньшей мере из 4 Ь-аминокислот домена ВН3 белка ВН3-только). В предпочтительном варианте осуществления изобретения компонент (II) содержит исключительно Ό-аминокислоты. Предпочтительные функционально эффективные компоненты (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, содержат полноразмерную или частичную последовательность домена ВН3, состоящую из Ό-аминокислот в ретроинвертированном порядке, которая содержит от 4 до 20 Ό-аминокислот, более предпочтительно от 4 до 18 Ό-аминокислот, более предпочтительно от 4 до 15 Ό-аминокислот, еще более предпочтительно от 4 до 13 Ό-аминокислот, более предпочтительно от 4 до примерно 10 Ό-аминокислот и еще более предпочтительно от 4 до 8 Ό-аминокислот. Если в качестве компонента (II) или части компонента (II) используют частичные последовательности домена ВН3, то они должны сохранять функциональную активность, следует ожидать, что, среди проче

- 5 013469 го, они должны сохранять свою проапоптозную активность. Их функциональную активность можно тестировать с помощью пригодных методов анализа, например с помощью анализов связывания (связывания компонента II слитого белка, предлагаемого в изобретении, или самого слитого белка, предлагаемого в изобретении, с его нативным партнером по связыванию) или путем анализа его проапоптозной активности с помощью анализа апоптоза.

Предпочтительно компонент (II) содержит частичную или полноразмерную последовательность домена ВН3 белка ВН3-только, выбранного из группы, включающей В1б, Ваб, Νοχα, Рита, В1т, В1к, Вт£, ИР5/Нгк и Вок либо в их нативной Ь-форме, либо в их ретроинвертированной Ό-форме. Последовательности ВН3 (полноразмерные или частичные) можно выбирать, например, из последовательностей любого белка ВНЗ-только млекопитающих, в частности из человеческих изоформ. Таким образом, компонент (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, содержит аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 2А-2Д или 2Е (либо в ее нативной форме, состоящей из Ь-аминокислот, как показано на фиг. 2А-2Е, либо в ее ретроинвертированной Ό-форме (состоящей из Ό-аминокислот), это означает, что последовательности, представленные на фиг. 2А-2Е, должны быть инвертированы так, чтобы концы поменялись местами: нативный С-конец становится Ν-концом инвертированной формы и нативный Ν-конец становится С-концом инвертированной формы). Компонент (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, может содержать фрагменты нативной полноразмерной последовательности белка ВНЗ-только (в его либо Ь-, либо Ό-форме), например фрагменты, состоящие по меньшей мере из 50, предпочтительно менее чем из 40 и еще более предпочтительно менее чем из 30 аминокислот. Эти фрагменты нативных последовательностей, как правило, содержат полностью или, по меньшей мере, частично последовательность домена ВНЗ (по меньшей мере 7 аминокислот последовательности домена ВН3).

Последовательность компонента (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, может содержать одну или большее количество частичных или полноразмерных последовательностей домена ВН3 белков ВНЗ-только либо в ее/их нативной Ь-аминокислотной форме, либо в ее/их инвертированной форме, состоящей из Ό-аминокислот. Если компонент (II) состоит из Ь-аминокислот, его можно синтезировать либо с помощью методов рекомбинации, известных специалистам в данной области, либо с помощью методов пептидного синтеза, например твердофазного синтеза. После этого Ь-аминокислотную последовательность компонента (II) подвергают сочетанию (на второй стадии) с Ό-аминокислотной последовательностью компонента (I). В альтернативном варианте с помощью химического синтеза можно синтезировать непосредственно (без использования второй стадии сочетания) слитый белок, предлагаемый в изобретении, который содержит Ό-аминокислоты в своем компоненте (I) и Ь-аминокислоты в своем компоненте (II). Однако, если компонент (II) содержит также Ό-аминокислоты, слитый белок синтезируют химическим путем (согласно таким же методам, которые применяют при синтезе Ьаминокислотных последовательностей) с использованием Ό-энантиомерных аминокислот в ретроинвертированном порядке для того, чтобы инвертировать встречающуюся в естественных условиях частичную или полноразмерную последовательность домена ВН3 и, например, встречающуюся в естественных условиях транспортирующую последовательность, например встречающуюся в естественных условиях основную последовательность Та!.

Аминокислотную последовательность встречающихся в естественных условиях белков ВНЗтолько или их фрагментов, содержащих домен ВН3, и, соответственно, их ретроинвертированных аналогов, состоящих из Ό-энантиомерных аминокислот, представляющих часть компонента (II), можно модифицировать, например, путем добавления, делеции и/или замены по меньшей мере одной аминокислоты встречающегося в естественных условиях белка с получением модифицированных ненативных последовательностей. Модификации, прежде всего консервативные модификации, могут требоваться, например, для модификации связывающих свойств компонента (II) или модификации его стабильности, например увеличения или уменьшения его стабильности. Компонент (II) с модифицированной исходной последовательностью (по сравнению с встречающимися в естественных условиях последовательностями домена ВНЗ или белка ВНЗ-только) можно получать с помощью тех же методов, которые применяют для синтеза немодифицированных Ь- или Ό-аминокислотных последовательностей.

Слитые белки, предлагаемые в изобретении, состоят, по меньшей мере, из компонента (I) и компонента (II). Более того, слитый белок, предлагаемый в изобретении, может содержать дополнительные компоненты (III), (IV), (V) и т.д. Эти необязательные дополнительные компоненты могут придавать дополнительные функции слитому белку, предлагаемому в изобретении. По меньшей мере один дополнительный компонент может представлять собой аминокислоту, олигопептид или полипептид или низкомолекулярное органическое химическое соединение и может быть связан со слитым белком, предлагаемым в изобретении, в приемлемом положении, например на Ν-конце, С-конце или во внутреннем положении с боковыми аминокислотными цепями. Дополнительные компоненты (например, НА, Н^-Тад, Н18б) могут делать слитый белок более пригодным для очистки и/или выделения. Затем по окончании процесса производства при необходимости можно удалять участвовавшего в слиянии партнера из слитого белка, предлагаемого в изобретении (например, с помощью протеолитического расщепления или других методов, известных в данной области). В альтернативном варианте с молекулой, предлагаемой в изо бретении, можно сливать дополнительные транспортирующие последовательности, предназначенные для обеспечения переноса в конкретные клеточные компартменты, или другие функциональные последовательности либо в виде дополнительного компонента, либо путем встраивания в компонент (I) или (II). Предпочтительно дополнительный компонент (например, компонент (III)) позволяет слитому белку, предлагаемому в изобретении, специфически связываться с определенным типом клеток, например иммуноцитами, гепатоцитами, прежде всего опухолевыми клетками органа, например лимфоцитами, нейронами и т.д. Эта специфичность обеспечивается путем слияния лигандов (например, лигандов для внеклеточных фрагментов мембранных белков типа рецепторов или антител к внеклеточным фрагментам мембранных белков, маркеров опухолевых клеток), которые связываются с этими клеточными маркерами, со слитым белком, предлагаемым в изобретении. В результате этого слитый белок, предлагаемый в изобретении, можно избирательно направлять в определенные клетки или ткани животного, подлежащего лечению.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения в слитый белок, предлагаемый в изобретении, можно встраивать более одной, предпочтительно две или три идентичные или различные частичные или полноразмерные последовательности домена ВН3 либо в виде части компонента (II), либо в виде дополнительного компонента (например, (III)). В частности, частичные или полноразмерные последовательности домена ВН3 различных белков ВНЗ-только можно объединять со слитым белком, предлагаемым в изобретении, например В1б и Ваб, В1т и Ваб, В1к и Ваб, Рита и Ваб, Νοχα и Ваб, Вт! и Ваб, ЭР5/Нгк и Ваб, Вок и Ваб, В1к и В1т, В1к и В1б, В1к и Рита, В1к и Νοχη. В1к и Вт!, В1к и ЭР5/Нгк, В1к и Вок, В1б и Рита, В1б и Νοχη, В1б и В1т, В1б и Вт!, В1б и ЭР5/Нгк, В1б и Вок, В1т и Νοχη, В1т и Рита, В1т и Вт!, В1т и ЭР5/Нгк, В1т и Вок, Рита и Ыоха, Рита и Вт!, Рита и ЭР5/Нгк, Рита и Вок, Νοχη и Вт!, Ыоха и ЭР5/Нгк и Ыоха и Вок. Если более чем один слитый белок, предлагаемый в изобретении, содержит более чем один домен ВНЗ, то предпочтительно слитый белок, предлагаемый в изобретении, содержит (частичный или полноразмерный) домен ВНЗ В1б-подобного и Ваб-подобного белка ВНЗ-только. Как правило, если в слитом белке, предлагаемом в изобретении, присутствует более чем один домен ВНЗ, то они оба или все находятся либо в ретроинвертированной Ό-форме, либо в обычной нативной Ь-форме. В альтернативном варианте слитый белок, предлагаемый в изобретении, может объединять домены ВНЗ, имеющие Ό- и Ь-формы.

Следовательно, слитый белок, предлагаемый в изобретении, как правило, имеет длину по меньшей мере от 12 до примерно 200 аминокислот или более (в зависимости от дополнительных частей и/или длины компонента (II)), предпочтительно от 12 до примерно 150 аминокислот, более предпочтительно примерно от 20 до примерно 100 аминокислот, еще более предпочтительно примерно от 20 до примерно 75 аминокислот, еще более предпочтительно примерно от 20 до примерно 50 аминокислот. Если компонент (II) состоит из Ь-аминокислот, слитый белок, предлагаемый в изобретении, предпочтительно имеет последовательность, представленную на фиг. ЗА-ЗД или ЗЕ. В альтернативном варианте слитый белок может иметь транспортирующую последовательность (содержащуюся в компоненте (I)), представленную на этих чертежах, и фрагмент (содержащийся в компоненте (I)), состоящий, как правило, менее чем из 50 смежных аминокислот полноразмерных последовательностей белка ВНЗ-только, представленных на этих чертежах, фрагмент, содержащий по меньшей мере часть последовательности домена ВНЗ белка ВНЗ-только. В другом варианте осуществления изобретения последовательности каждого компонента (II), представленные на этих чертежах, могут состоять из Ό-аминокислот и располагаться в обратном порядке в результате изменения порядка расположения концов, что приводит к образованию содержащих только Ό-аминокислоты ретроинвертированных последовательностей компонента (II).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один первый компонент (I) и по меньшей мере один второй компонент (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, связывают ковалентной связью. Понятие ковалентная связь относится к стабильной химической связи между двумя атомами, образующейся в результате объединения одной или большего количества пар электронов. Дополнительные компоненты (III), (IV), (V) и т.д., как указано выше, если они присутствуют, также могут быть связаны ковалентной связью либо с компонентом (I), либо с компонентом (II).

В целом, компонент (I) и компонент (II) можно сочетать с помощью линкера или непосредственно (без линкера), например с помощью амидной связи, образованной между Ν- и С-концами соответственно аминокислот компонентов (I) и (II). С-концевую аминокислоту компонента (I) можно связывать с Ν-концевой аминокислотой компонента (II) или Ν-концевую аминокислоту компонента (I) можно связывать с С-концевой аминокислотой компонента (II). Так, слитые белки, предлагаемые в изобретении, могут иметь, например, С- или Ν-концевую транспортирующую последовательность (компонент (I)) в зависимости от того, какой конец компонента (I) ковалентно связан с компонентом (II), причем между компонентом (I), например последовательностью, содержащей последовательность Ό-ΤΑΤ, и компонентом (II), представляющим собой компонент, содержащий частичную или полноразмерную последовательность домена ВНЗ, можно добавлять линкер.

Указанные выше дополнительные компоненты (III), (IV), (V) и т.д., если они присутствуют, можно сочетать аналогичным образом с компонентом (I) и/или компонентом (II) или необязательно друг с другом. Можно использовать также линкерные последовательности для слияния слитого белка, предлагае

- 7 013469 мого в изобретении, по меньшей мере с одним другим фрагментом/фрагментами, как описано ниже. Необязательные компоненты (III), (IV) и т.д. можно связывать со слитым белком, предлагаемым в изобретении, через боковые цепи их Ό-аминокислот или их можно присоединять к любому концу компонента (I) или (II). Связь через боковые цепи предпочтительно осуществляют с помощью амино- или гидроксильных групп боковых цепей, например с помощью сложного или простого эфира. Следует отметить, что согласно изобретению все аминокислоты (любого из компонентов (I), (II), (III), (IV), (V) и т.д.) представляют собой Ό-энантиомерные аминокислоты, которые соответствуют своим встречающимся в естественных условиях аналогам, будучи связанными в ретроинвертированном порядке.

Если используют линкерные последовательности для слияния компонентов (I) и (II) или для слияния другого компонента, например (III) с компонентом (I) и/или (II), то линкерные последовательности предпочтительно представляют собой гибкую последовательность, состоящую из 5-50 остатков, более предпочтительно из 5-15 остатков. В предпочтительном варианте осуществления изобретения линкерная последовательность (последовательность, состоящая либо полностью из Ό-, либо полностью из Ь-аминокислот) содержит по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 40% и еще более предпочтительно по меньшей мере 50% остатков С1у. Специалист в данной области легко может выбрать и создать соответствующие линкерные последовательности.

Компонент (I) и компонент (II) можно связывать также путем химического сочетания любым пригодным методом, известным в данной области. Однако следует обращать внимание на то, что многие известные методы химического перекрестного сшивания являются неспецифическими, т.е. они не направляют точку сшивания в конкретный сайт транспортируемого белка (или полипептида) или транспортируемого фрагмента. Так, неспецифические перекрестно сшивающие агенты в случае их использования могут атаковать функциональные сайты или стерически блокировать активные сайты, приводя к тому, что слитые белки становятся биологически неактивными. Указанные выше дополнительные компоненты (III), (IV), (V) и т.д., если они присутствуют, можно подвергать аналогичным методом сочетанию друг с другом или с компонентом (I) и/или (II).

Специфичность сочетания можно повышать путем непосредственного химического сочетания с функциональной группой, встречающейся только один раз или лишь небольшое количество раз в одном или обоих белках/пептидах/полипептидах, которые требуется перекрестно сшить. Примером является цистеин, который представляет собой единственную аминокислоту, содержащую тиольную группу, и который во многих белках встречается лишь небольшое количество раз. Также, например, если белок/пептид/полипептид не содержит остатков лизина, то перекрестно сшивающий реагент, обладающий специфичностью в отношении первичных аминов, будет обладать избирательным действием в отношении аминоконца указанного белка/пептида/полипептида. Однако для успешного применения этого подхода с целью повышения специфичности сочетания необходимо, чтобы белок/пептид/полипептид имели достаточно редко встречающиеся и реакционноспособные остатки в областях молекулы, которые можно изменять без потери биологической активности молекулы.

Остатки цистеина можно заменять, если они встречаются в таких частях последовательности белка/пептида/полипептида, где в противном случае их участие в реакции перекрестного сшивания может влиять на биологическую активность. Если остаток цистеина заменяют, то, как правило, желательно минимизировать образующиеся изменения складчатости белка (или полипептида). Изменения складчатости компонента (I) минимальны, когда замена является химически и стерически близкой цистеину. Таким образом, для замены цистеина предпочтительно использовать серии. Однако когда встраивают остаток цистеина, то предпочтительно встраивание осуществляют на Ν- или С-конце или вблизи него. Для таких модификаций аминокислотной последовательности можно применять общепринятые методы независимо от того, получали ли рассматриваемый белок/пептид/полипептид химическим синтезом или путем экспрессии рекомбинантной ДНК.

Сочетание двух составных частей, например сочетание Ό-формы компонента (I) с Ь-формой компонента (II), можно осуществлять посредством связующего или конъюгирующего агента. Существует несколько агентов для межмолекулярного перекрестного сшивания, которые можно использовать, см., например, Меаик и Бееиеу, С11С1шса1 МобШсайои о! РгоЮиъ. изд-во Но1беи-Оау, 1974, р. 39-43. К этим реагентам относятся, например, №сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (СПДП) или ^№-(1,3-фенилен)-бис-малеимид; НИ-этилен-бис-(йодацетамид) или другой аналогичный реагент, имеющий 6-11 углеродных метиленовых мостиков; и 1,5-дифтор-2,4-динитробензол. К другим перекрестно сшивающим реагентам, пригодным для этой цели, относятся: р,р'-дифтор-т,т'-динитрофенилсульфон; диметиладипимидат; фенол-1,4-дисульфонилхлорид; гексаметилендиизоцианат или диизотиоцианат, или азофенил-парадиизоцианат; глутаровый альдегид и дис-диазобензидин. Перекрестно сшивающие реагенты могут быть гомобифункциональными, т. е. иметь две функциональные группы, участвующие в одной и той же реакции. Предпочтительным гомобифункциональным перекрестно сшивающим реагентом является бис-малеимидогексан (БМГ). БМГ содержит две малеимидные функциональные группы, которые специфически взаимодействуют с содержащими сульфгидрил соединениями в мягких условиях (рН 6,5-7,7). Две малеимидные группы соединены углеводородной цепью. Таким образом, БМГ можно применять для необратимого перекрестного сшивания белков (или полипептидов), ко- 8 013469 торые содержат остатки цистеина. Перекрестно сшивающие реагенты могут быть также гетеробифункциональными. Гетеробифункциональные перекрестно сшивающие реагенты имеют две различные функциональные группы, например реактивную аминогруппу и реактивную тиольную группу, которые должны перекрестно сшивать два белка, имеющих свободные амины и тиолы соответственно. Примерами гетеробифункциональных перекрестно сшивающих агентов являются сукцинимидил-4-ζΝмалеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (СМЦК), сложный метамалеимидобензоил-Νгидроксисукцинимидиловый эфир (МБС) и сукцинимид-4-(парамалеимидофенил)бутират (СМФБ), представляющий собой аналог МБС с удлиненной цепью. Сукцинимидильная группа этих перекрестно сшивающих линкеров взаимодействует с первичным амином и реактивная тиольная группа малеимида образует ковалентную связь с тиольной группой остатка цистеина. Поскольку перекрестно сшивающие реагенты часто обладают низкой растворимостью в воде, к перекрестно сшивающему реагенту можно добавлять гидрофильный фрагмент, такой как сульфонатная группа, для повышения растворимости в воде. Сульфо-МБС и сульфо-СМЦК являются примерами перекрестно сшивающих реагентов, модифицированных с целью повышения растворимости в воде. Многие перекрестно сшивающие реагенты приводят к образованию конъюгата, который практически не расщепляется в условиях клеточного окружения. Поэтому некоторые перекрестно сшивающие реагенты содержат ковалентную связь, такую как дисульфид, которая расщепляется в условиях клеточного окружения. Например, реагент Траута, дитио-бис(сукцинимидилпропионат) (ДСП) и №сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (СПДП) представляют собой широко известные расщепляемые перекрестно сшивающие линкеры. Использование расщепляемого перекрестно сшивающего реагента позволяет транспортируемому фрагменту отделяться от транспортирующего полипептида после введения в клетку-мишень. Для этой цели можно применять также прямую дисульфидную связь. Химическое перекрестное сшивание можно осуществлять также с использованием спейсерных плечей. Спейсерные плечи обеспечивают внутримолекулярную гибкость или регулируют внутримолекулярные расстояния между конъюгированными молекулами и тем самым могут помогать сохранять биологическую активность. Спейсерное плечо может представлять собой фрагмент белка (или полипептида), который содержит спейсерные аминокислоты, например пролин. В альтернативном варианте спейсерное плечо может представлять собой часть перекрестно сшивающего реагента, такого как СПДП с длинной цепью (фирма Р1егсе Сйсш. Со., Рокфорд, шт. Иллинойс, каталожный номер 21651 Н). В продаже имеются многочисленные перекрестно сшивающие реагенты, включая перечисленные выше. Подробные инструкции по их применению легко можно получить от коммерческих поставщиков. Общие сведения о перекрестном сшивании белков и получении конъюгатов приведены у Уопд, СйетИйу о! Рго1еш Сопщдайоп апб Сгозз-Ыпкшд. изд-во ОРО Ргезз (1991).

Под объем настоящего изобретения подпадают также слитые белки, которые сходны с нативными функциональными последовательностями, или их аналоги, имеющие Л-форму, но которые имеют модифицированную последовательность. Эти модифицированные варианты обозначают как производные, и они также представляют собой слитые белки, предлагаемые в изобретении. Производное может представлять собой производное компонента (I) и/или компонента (II), а также компонента (III), компонента (IV), компонента (V) и т.д. (если они присутствуют) встречающейся в естественных условиях Ь-последовательности или ее соответствующей ретроинвертированной Л-формы. Следует отметить, что слитый белок, который получают из нативной Ь-последовательности (или ее аналога, имеющего Л-форму) путем замены одной или большего количества Ь- или Л-аминокислот в одном или большем количестве сайтов аминокислотной последовательности, делеции одной или большего количества Ь- или Л-аминокислот либо на любом одном, либо на обоих концах аминокислотной последовательности, предлагаемой в изобретении, или в одном или большем количестве сайтов аминокислотной последовательности, или инсерции одной или большего количества аминокислот в одном или большем количестве сайтов аминокислотной последовательности, предлагаемой в изобретении, должен сохранять свою характерную для него активность. Предпочтительно, замена аминокислот(ы) представляет собой консервативную замену. Консервативные замены, как правило, представляют собой замены в пределах следующих классов: глицин и аланин; валин, изолейцин и лейцин; аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; аспарагин и глутамин; серии и треонин; лизин и аргинин и фенилаланин и тирозин. Так, предпочтительными группами консервативных замен являются аспартат-глутамат; аспарагин-глутамин; валин-лейцин-изолейцин; аланин-валин; фенилаланин-тирозин и лизин-аргинин. С помощью таких изменений последовательности компонента (I) и/или (II) (а также компонента (III), (IV), (V), если они присутствуют) можно модифицировать, например повышать стабильность и/или эффективность слитых белков, предлагаемых в изобретении. Слитые белки, предлагаемые в изобретении, которые модифицированы по сравнению с их нативной Ь-формой (или ее аналогом, имеющим Л-форму; как Ь-, так и Л-форму, соответствующие нативной последовательности, обозначают также как родительские последовательности), должны сохранять гомологию, например последовательности, функции и антигенного свойства или другой функции, с белком, имеющим соответствующую родительскую последовательность. Наиболее предпочтительно, чтобы производные транспортирующей последовательности, будучи включенными в компонент (I), сохраняли функциональную способность (сохраняли свои характеристики как фрагмента, обладающего способностью проникать в клетку), в то время как производные нативной (частичной или полноразмерной) после

- 9 013469 довательности домена ВН3, будучи включенными в компонент (II), сохраняли свои проапоптозные свойства. Такие слитые белки, предлагаемые в изобретении, полученные из нативной родительской последовательности, обладают измененными свойствами, которые могут оказаться в определенном отношении более предпочтительными по сравнению со свойствами родительской последовательности (например, могут иметь более высокое оптимальное значение рН, более высокую термостойкость и т.д.). Следует понимать, что, например, фрагмент (I) слитого белка, предлагаемого в изобретении, может либо соответствовать ретроинвертированной Ό-форме аналога нативной Ь-формы, либо соответствовать производному ретроинвертированной Ό-формы (аналогу нативной Ь-формы), полученному в результате интродукции модификации(й) в последовательность.

Производные нативных Ό- или Ь-форм последовательностей (образующие слитые белки, предлагаемые в изобретении), как правило, практически идентичны нативным аминокислотным последовательностям, например представленным в настоящем описании на фиг. 2А-2Е последовательностям компонента (II). Особенно предпочтительными являются аминокислотные последовательности, идентичные по меньшей мере на 60%, предпочтительно по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно на 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95% указанным последовательностям. Идентичность последовательностей можно оценивать, например, с помощью программ анализа последовательностей (пакет программ анализа последовательностей Группы компьютерной генетики, Биотехнологический центр Университета Висконсина (8ес.|иепсе АпаЕъЬ 8ойгаге Раскаде о£ 111е СеиеНск СотрШсг Огоир, ИшуегаНу о£ ХУксощш Вю1есйио1оду Сеи1ег), 1710 ЬшусгЩу Ауеиие, Мэдисон, шт. Висконсин 53705) с использованием соответствующих, задаваемых по умолчанию параметров.

Получение нативных последовательностей белка, состоящих из Ь-аминокислот, с помощью методов рекомбинации или трансляции ш ν Иго хорошо известно и его можно осуществлять согласно стандартным методам, хорошо известным специалисту в данной области (см., например, 8атЬгоок I., МашаБк Т., 1989, выше). Согласно одному из вариантов осуществления изобретения можно применять методы рекомбинации для получения определенных компонентов слитого белка, предлагаемого в изобретении, например компонента (II), если он содержит нативные последовательности Ь-формы, предлагаемые в изобретении, или их производные. Затем на отдельной стадии эту Ь-форму компонента (II) связывают с Ό-формой компонента (I) согласно описанному выше методу. В целом, получение компонента слитого белка, предлагаемого в изобретении, методами рекомбинации осуществляют либо путем отбора требуемой нативной последовательности ДНК, либо путем модификации нативной последовательности ДНК, трансформации этой последовательностью ДНК пригодного хозяина и экспрессии (модифицированной) последовательности ДНК с образованием требуемой последовательности белка. Выделение требуемой последовательности белка можно проводить с помощью стандартных методов, включающих выделение клеток (хозяев) из среды путем центрифугирования или фильтрации, при необходимости после разрушения клеток, осаждение белковых компонентов супернатанта или фильтрата с помощью соли, например сульфата аммония, последующей очистки с использованием различных хроматографических методов, например ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии, или аналогичных применяемых в данной области методов (см., например, 8атЬгоок I., ΜαηίαΙίδ Т., 1989, выше).

Более подробно, методы рекомбинации включают трансформацию пригодной клетки-хозяина нуклеиновой кислотой или вектором, предлагаемыми в настоящем описании, которые кодируют Ь-форму, например компонента (II) слитого белка, и культивирование полученного рекомбинантного микроорганизма, предпочтительно Е.соИ, в условиях, пригодных для роста клетки-хозяина и экспрессии нуклеиновой кислоты, например, в присутствии индуктора, пригодных сред, дополненных соответствующими солями, факторами роста, антибиотиками, питательными добавками и т.д., в которых происходят экспрессия нуклеиновой кислоты и продуцирование кодируемого слитого белка.

Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту нативной Ь-формы компонента (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, определяет нуклеотидную последовательность, которая содержит (помимо других последовательностей) одну или большее количество нуклеотидных последовательностей, например, находящихся в Ь-форме компонента (II). В результате трансформации вектором соответствующей клетки-хозяина можно осуществлять экспрессию указанной нуклеиновой кислоты. Вектор может представлять собой плазмиду, фаговую частицу или просто потенциальную геномную вставку. После трансформации пригодного хозяина вектор может реплицироваться и функционировать независимо от генома хозяина или может в соответствующих условиях интегрироваться в сам геном. Предпочтительными векторами, предлагаемыми в изобретении, являются Е.соБ ХЬ-В1ие МКГ и плазмида рВК-СМУ.

Вышеупомянутое понятие другие последовательности вектора относится к следующему: в целом, пригодный вектор содержит сайт инициации репликации, например Оп р, со1Е1 Оп, последовательности, которые позволяют осуществлять экспрессию встроенной нуклеиновой кислоты (транскрибированной и/или транслированной), и/или селектируемый генетический маркер, включающий, например, ген, кодирующий флуоресцентный белок типа зеленого флуоресцентного протеина (СЕР), гены, которые придают устойчивость к антибиотикам, такие как ген р-лактамазы из Ти3, ген, придающий устойчивость к канамицину, из Тп903 или ген, придающий устойчивость к хлорамфениколу, из Тп9.

- 10 013469

Понятие плазмида обозначает внехромосомный, как правило, самореплицирующийся генетический элемент. Плазмиды, как правило, обозначают прописной буквой Р, перед которой и/или после которой следуют буквы и цифры. Исходные плазмиды, указанные в настоящем описании, либо имеются в продаже, являются общедоступными, либо их можно конструировать из пригодных плазмид согласно опубликованным методам. Кроме того, специалисту в данной области известны плазмиды, эквивалентные плазмидам, указанным в описании. Исходную плазмиду, применяемую для получения вектора, предлагаемого в настоящем изобретении, можно выделять, например, из соответствующего штамма Е.со11, содержащего указанные плазмиды, с помощью стандартных методов, таких как выделение ДНК с помощью хлорида цезия.

Понятие пригодный вектор относится также к (рекомбинантному) клонирующему ДНК вектору, а также к (рекомбинантному) экспрессионному вектору. Клонирующий ДНК вектор относится к автономно реплицирующемуся агенту, включая (но не ограничиваясь ими) плазмиды и фаги, содержащие молекулу ДНК, к которой присоединены одна или большее количество дополнительных нуклеиновых кислот, например, компонента (II) слитого белка в его нативной Ь-форме. Экспрессионный вектор относится к любой рекомбинантной конструкции клонирующего ДНК вектора, который содержит предназначенную для экспрессии нуклеотидную последовательность, функционально связанную с соответствующей контролирующей последовательностью, которая обладает способностью осуществлять экспрессию и контролировать транскрипцию встроенной нуклеиновой кислоты в пригодном хозяине. Такие плазмиды можно также легко модифицировать с получением экспрессионных векторов, которые продуцируют требуемую последовательность в различных организмах, включая, например, Е.сой, 8£9 (в качестве хозяина для бакуловируса), 8робор1ега и 8ассйаготусез. В литературе описаны методы конструирования экспрессионных векторов АУ12 и трансформации клеток-хозяев с помощью АУ12. И8 4992373, включенный в настоящее описание в качестве ссылки, представляет собой один из многочисленных документов, в котором описаны указанные методы.

Функционально связанный означает, что нуклеотидная последовательность связана с контролирующей последовательностью так, что может осуществляться экспрессия (например, транскрипция и/или трансляция) нуклеотидной последовательности. Транскрипция обозначает процесс, при котором информация, содержащаяся в нуклеотидной последовательности ДНК, переносится в комплементарную последовательность РНК.

Контролирующие последовательности хорошо известны в данной области и их выбирают для осуществления экспрессии нуклеиновой кислоты Ь-формы слитого белка, предлагаемого в изобретении, и для контроля транскрипции. Такие контролирующие последовательности включают (но не ограничиваясь ими) сигнал полиаденилирования, промотор (например, встречающийся в естественных условиях или синтетический промотор) или энхансер для осуществления транскрипции, необязательно операторную последовательность для контроля транскрипции, локус-контролирующую область или молчащий элемент для осуществления тканеспецифической транскрипции, последовательность, кодирующую пригодные сайты связывания рибосомы на мРНК, последовательность, обладающую способностью стабилизировать мРНК, и последовательности, контролирующие терминацию транскрипции и трансляции. Эти контролирующие последовательности можно модифицировать, например, путем делеции, добавления, инсерции или замены одной или большего количества нуклеиновых кислот, сохраняя при этом их контролирующую функцию. В данной области хорошо известны другие пригодные контролирующие последовательности, которые описаны, например, Соеббе1, Сепе Ехргеззюп Тесйпо1оду:Ме1йобз ίη Епхуто1оду 185, изд-во Асабетю Ргезз, Сан-Диего, шт. Калифорния, 1990.

Известно очень большое количество разнообразных промоторов для различных организмов. Например, предпочтительным промотором для векторов, которые применяют в Васб1и5 зиЬййз, является промотор АргЕ; предпочтительным промотором, который применяют в Е.сой, является промотор Т7/Ьас, предпочтительным промотором, который применяют в 8ассйаготусез сегеу151ае, является РСК1, предпочтительным промотором, который применяют в АзрегдШиз шдег, является д1аА, а предпочтительным промотором, который применяют в Тпсйобегша геезе1 (геезе1), является сЬЫ. Промоторы, которые можно применять в прокариотических хозяевах, включают бета-лактамазную (вектор рСХ2907 (АТСС 39344), содержащий репликон и ген бета-лактамазы) и лактозную промоторные системы (Сйапд е1 а1., ИаШге (Лондон), 275, 1978, р. 615; Соеббе1 е1 а1., Иа1иге (Лондон), 281, 1979, р. 544), щелочно-фосфатазную, триптофановую (1гр) промоторную систему (вектор рАТН1 (АТСС 37695), сконструированный с целью облегчения экспрессии открытой рамки считывания в виде слитого белка 1грЕ, находящегося под контролем промотора 1гр) и гибридные промоторы, такие как промотор 1ас (который можно выделять из плазмиды рИК.540, АТСС-37282). Однако специалист в данной области может связывать и другие функциональные бактериальные промоторы, нуклеотидные последовательности которых широко известны, с ДНК, кодирующей требуемую последовательность белка, например, компонента (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, в его Ь-формах с использованием линкеров или адаптеров для создания любых необходимых сайтов рестрикции. Промоторы, применяемые в бактериальных системах, должны содержать также последовательность Шайна-Дальгарно, функционально связанную с ДНК, кодирующей требуемую последовательность белка, предназначенного для использования в качестве (части) слитого

- 11 013469 белка, предлагаемого в изобретении.

Пригодные экспрессионные векторы могут состоять, например, из сегментов хромосомных, нехромосомных и синтетических последовательностей ДНК, таких как различные известные производные или фрагменты ОВ 40 (8У40), и известных бактериальных плазмид, например плазмид из Е. со11, включая со1Е1, рВК, рСЫ. рВЯ322, рМЬ9, рИС 19 и их производные, плазмид с широким спектром хозяев, например КР4, ДНКовых фагов, например многочисленных производных фага лямбда, например ΝΜ989, и других ДНКовых фагов, например М13, и нитчатых содержащих одноцепочечную ДНК фагов, плазмид на основе дрожжей, векторов, которые можно применять в эукариотических клетках, таких как векторы, пригодные для применения в клетках животных, и векторов, полученных на основе комбинаций плазмид и ДНКовых фагов, таких как плазмиды, модифицированные с целью использования ДНКовых фагов или других контролирующих экспрессию последовательностей. Методы экспрессии с использованием указанных выше экспрессионных векторов хорошо известны в данной области и описаны в целом, например, 8атЬгоок 1., Машайк Т., 1989, выше.

Пригодные клетки или клетки-хозяева, содержащие вышеуказанные вектор или нуклеиновую кислоту, например Ь-формы компонента (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, обладают способностью функционировать в качестве хозяина и экспрессионного носителя последовательности, предназначенной для экспрессии. Клетка-хозяин может представлять собой, например, прокариотическую, эукариотическую или археоклетку. Клетки-хозяева, содержащие (например, в результате трансформации, трансфекции или трансдукции) описанные выше вектор или нуклеиновую кислоту, включают (но не ограничиваясь ими) бактериальные клетки (например, Ктаппик, Е.сой, 8йер!отусек, Ркеийотопак, ВасШик, 8егга!1а тагсексепк, 8а1топе11а !урЫтипит), клетки грибов, включая дрожжи (например, 8ассйаготус1ек сеп^ые, РюЫа рак!опк), и плесневые грибы (например, АкрегдШик кр.), клетки насекомых (например, 8£9) или клетки млекопитающих (например, СО8, СНО). Предпочтительно клеткихозяева представляют собой клетки Е.со11. В целом, клетку-хозяина можно отбирать на основе модуляции экспрессии встроенных последовательностей, представляющих интерес, или модификации или процессирования экспрессируемых белков, кодируемых последовательностями определенным требуемым образом. Таким образом, можно отбирать соответствующие клетки или клеточные линии или системы хозяина, обеспечивающие осуществление требуемой модификации и процессирования чужеродного белка. Например, экспрессию белка в бактериальной системе можно использовать для получения негликозилированного корового белка, в то время как экспрессия в клетках млекопитающих обеспечивает нативное гликозилирование гетерологичного белка.

Эукариотические клетки-хозяева применяются не только в качестве эукариотических клетокхозяев. Разнообразные эукариотические клетки-хозяева можно получать, например, из депозитариев, таких как Американская коллекция типовых культур (АТСС), и их можно применять с описанными выше векторами. Выбор конкретной клетки-хозяина в определенной степени зависит от конкретного применяемого экспрессионного вектора. К эукариотическим клеткам-хозяевам относятся клетки млекопитающих, а также клетки дрожжей. Несовершенный гриб 8ассНаготусек сеге^'ыае представляет собой наиболее широко применяемый эукариотический микроорганизм, хотя обычно можно применять многие другие штаммы. Для экспрессии в 8асс11аготусек кр., как правило, применяют, например, плазмиду УКр7 (АТСС-40053) (см., например, 8йпсйсотЬ Ь. е! а1., №!иге, 282, 1979, р. 39; Ктдктап 1. е! а1., Сепе, 7, 1979, р. 141; 8. ТксНетрег е! а1., Сепе, 10, 1980, р. 157). Эта плазмида уже содержит ген !гр, который представляет собой селектируемый маркер для мутантного штамма дрожжей, у которого отсутствует способность расти в присутствии триптофана.

Приемлемые промоторные последовательности, которые можно использовать с дрожжевыми клетками-хозяевами, включают промоторы 3-фосфоглицераткиназы (присутствующие в плазмиде рАР12В0 (АТСС 53231) и описанные в И8 4935350, выданном 19 июня 1990 г., который включен в настоящее описание в качестве ссылки) или других гликолитических ферментов, таких как енолаза (присутствующая в плазмиде рАС1 (АТСС 39532)), глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (полученная из плазмиды рНсСАРС1 (АТСС 57090, 57091)), гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6фосфат-изомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа, а также гены алкогольдегидрогеназы и пируватдекарбоксилазы 2утотопак тоЬШк (И8 5000000, выданный 19 марта 1991 г., который включен в настоящее описание в качестве ссылки). Другими промоторами из дрожжей, представляющими собой индуцибельные промоторы, обладающие дополнительным преимуществом, которое заключается в том, что их транскрипцию можно контролировать путем изменения условий роста, являются промоторные области алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, расщепляющих ферментов, связанных с метаболизмом азота, металлотионеина (присутствующего в плазмидном векторе рСЬ28Х1юЬНВРУ (АТСС 39475) и описанном в и8 4840896, который включен в настоящее описание в качестве ссылки), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы (например, САЬ1, присутствующий в плазмиде рРУ121 (АТСС 37658)). Вместе с промоторами из дрожжей предпочтительно используют энхансеры из дрожжей, такие как ИА8 Са1 из 8ассЕаготусек сеге^'ыае (присутствующий в сочетании с промотором СУС1 в плазмиде УЕркес-Ы1Ье!а, АТСС 67024).

- 12 013469

Указанный выше вектор можно интродуцировать в клетку-хозяина любым пригодным методом (например, путем трансформации, электропорации, трансфекции с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, ДЭАЭ-декстрана или других субстанций, бомбардировки микрочастицами, липофекции, инфекции или трансдукции). Трансформация обозначает встраивание ДНК в организм таким образом, чтобы ДНК могла реплицироваться либо в качестве внехромосомного элемента, либо в результате интеграции в хромосому. Методы трансформации бактериальных и эукариотических хозяев хорошо известны в данной области. Обзор многочисленных методов, таких как инъекция в ядро, слияние с протопластом или обработка кальцием, приведен у 8атЬгоок 1., МашаОк Т., 1989, выше. Трансфекция относится к встраиванию вектора в клетку-хозяина независимо от того, происходит ли в действительности экспрессия каких-либо кодирующих последовательностей или нет. Как правило, трансфекция признается успешной в том случае, когда в клетке-хозяине обнаруживают какие-либо признаки наличия или функционирования рассматриваемого вектора.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения компонент (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении, соответствует не нативной Ь-форме или ее производному, а ретроинвертированной Ό-форме последовательности, состоящей из Ό-аминокислот, расположенных в обратном порядке. Эти последовательности Ό-формы компонента (II) (а также последовательность Ό-формы компонента (I)), как правило, нельзя изменять методами рекомбинации, и их предпочтительно синтезируют методом пептидного синтеза, например твердофазного синтеза с использованием Ό-аминокислот вместо Ь-аминокислот для получения Ό-аминокислотной последовательности. Однако следует отметить, что для осуществления синтеза порядок расположения аминокислот должен быть изменен на обратный (по сравнению с аналогом, имеющим Ь-форму).

Соответственно все аминокислотные последовательности, предлагаемые в изобретении (как последовательности Ό-, так и Ь-формы), можно конструировать химическими методами, хорошо известными в данной области, включая твердофазный синтез белков или методы рекомбинации. Оба метода описаны в И8 4617149, полное содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки. Принципы твердофазного химического синтеза слитых белков хорошо известны в данной области и описаны, например, Оидак Н. и Реппеу С, Вюогдашс СйетщБу, 1981, р. 54-92. Например, белки и пептиды можно синтезировать с помощью твердофазного метода с использованием пептидного синтезатора типа Аррйеб В1окук!етк 4З0А (поступающего в продажу от фирмы АррНеб Вюкук!етк, Фостер Сити, шт. Калифорния) и циклов синтеза, разработанных фирмой АррНеб Вюкук!етк. Защищенные аминокислоты, такие как защищенные трет-бутоксикарбонилом аминокислоты, и другие реагенты поступают в продажу от многих торговых фирм-поставщиков химической продукции. Для получения С-концевых карбоксамидов исходные параметилбензгидриламиновые смолы подвергают последовательной химической обработке с использованием трет-бутоксикарбонила согласно протоколам двойного азосочетания. Для получения С-концевых кислот применяют соответствующую пиридин-2-альдоксимметиодидную смолу. Аспарагин, глутамин и аргинин подвергают сочетанию с использованием предварительно полученных сложных гидроксибензотриазоловых эфиров. Для защиты боковых цепей можно применять следующие группы: Агд, тозил; Акр, циклогексил; С1и, циклогексил; 8ег, бензил; Тйг, бензил; Туг, 4-бромкарбобензоксигруппу. Удаление трет-бутоксикарбонильного фрагмента (удаление защитных групп) можно осуществлять с помощью трифторуксусной кислоты (ТФК) в метиленхлориде. После завершения синтеза можно удалять защитные группы у белков или пептидов и отщеплять их от смолы с помощью безводного фтористого водорода, содержащего 10% метакрезола. Отщепление защитных(ой) групп(ы) от боковых цепей и отщепление (слитого) белка от смолы осуществляют при 0°С или ниже, предпочтительно при -20°С в течение З0 мин, а затем в течение З0 мин при 0°С. После удаления фтористого водорода (слитый) белок/смолу промывают простым эфиром и (слитый) белок экстрагируют ледяной уксусной кислотой и затем лиофилизируют. Очистку осуществляют с помощью гель-фильтрации на 8ерйабех С-10 (фирма Рйатташа) колонке в 10%-ной уксусной кислоте. Как указано выше, пептиды, состоящие из Ь-аминокислот или Ό-аминокислот, синтезируют согласно такому же общему методу.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей слитый белок, предлагаемый в изобретении, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель, адъювант и/или наполнитель. Эта фармацевтическая композиция предназначена для лечения заболеваний, которые, по меньшей мере, частично обусловлены изменениями (например, вследствие мутаций) нормальной запрограммированной гибели клеток (апоптоза). Такие изменения, в частности, предупреждают (полностью или частично) нормальную запрограммированную гибель клеток (апоптоз). Предпочтительно эти заболевания включают, например, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, гистиоцитную лимфому, различные типы рака головного мозга (например, глиобластомы), яичника, мочеполового тракта, ободочной кишки, печени, колоректального тракта, поджелудочной железы, молочной железы, предстательной железы, лимфатической системы, желудка, гортани и легкого, включая аденокарциному легкого и мелкоклеточный рак легкого, и/или рак кожи, например меланому или немеланомный рак кожи, включая базально-клеточный рак и плоскоклеточный рак, а также псориаз, синдром Бехчета, пузырьчатку обыкновенную.

- 1З 013469

Понятие фармацевтически приемлемый носитель, адъювант или наполнитель в контексте изобретения относится к нетоксичному носителю, адъюванту или наполнителю, который не нарушает фармакологическую активность слитого белка, с которым его включают в состав препаративной формы. Фармацевтически приемлемые носители, адъюванты или наполнители, которые можно применять в композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, включают (но не ограничиваясь ими) ионообменники, окись алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, буферы, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смеси неполных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как сульфат протамина, вторичный кислый фосфат натрия, вторичный кислый фосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, субстанции на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, полиакрилаты, воски, блоксополимеры полиэтилена-полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и ланолин.

Фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить парентеральным или непарентеральным (например, оральным) путем.

В контексте настоящего описания понятие парентеральный включает методы подкожной, внутривенной, внутримышечной, интраартикулярной, внутрисуставной, надчревной, внутриоболочечной, внутрипеченочной, внутриочаговой и внутричерепной инъекции или инфузии. Предпочтительно фармацевтические композиции вводят орально, внутрибрюшинно или внутривенно. Стерильные инъецируемые формы фармацевтических композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, могут представлять собой водные или маслянистые суспензии. Эти суспензии можно приготавливать согласно методам, известным в данной области, с использованием пригодных диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный инъецируемый препарат может представлять собой также стерильный инъецируемый раствор или суспензию в нетоксичном пригодном для парентерального введения разбавителе или растворителе, например раствор в 1,3-бутандиоле. В число приемлемых наполнителей и растворителей, которые можно применять, входят вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно применяют стерильные нелетучие масла.

Для этой цели можно применять любое успокаивающее нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Для приготовления инъецируемых лекарственных средств можно применять жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицериды, а также природные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, прежде всего в виде их полиоксиэтилированных производных. Эти масляные растворы или суспензии могут содержать также разбавитель, представляющий собой спирт с длинной цепью, или диспергирующий агент, такой как карбоксиметилцеллюлоза, или аналогичные диспергирующие агенты, обычно применяемые при приготовлении фармацевтически приемлемых форм лекарственного средства, включая эмульсии и суспензии. Для целей приготовления препаративных форм можно использовать также другие обычно применяемые поверхностно-активные вещества, такие как агенты типа Твин, Спан или другие эмульгаторы или вещества, повышающие биологическую доступность, которые обычно применяют при приготовлении фармацевтически приемлемых твердых, жидких или иных форм лекарственного средства.

При оральном введении фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно вводить в виде любой приемлемой для орального введения форме лекарственного средства, включая (но не ограничиваясь ими) капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. В случае таблеток для орального применения обычно используемые носители представляют собой лактозу и кукурузный крахмал. Как правило, добавляют также замасливатели, такие как стеарат магния. Для орального введения в форме капсул пригодными разбавителями являются лактоза и сухой кукурузный крахмал. Если для орального применения требуются водные суспензии, то действующее вещество объединяют с эмульгаторами и суспендирующими агентами. При необходимости можно добавлять также определенные подслащивающие вещества, корригенты или красители. Кроме того, для контроля продолжительности действия можно применять стандартные фармацевтические методы. Такие формы известны в данной области и включают препараты с контролируемым высвобождением и могут включать соответствующие макромолекулы, например полимеры, сложные полиэфиры, полиаминокислоты, поливинилпирролидон, этиленвинилацетат, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу или сульфат протамина. Для контроля высвобождения можно регулировать концентрацию макромолекул, а также методы включения в композицию. Кроме того, агент можно встраивать в частицы полимерных материалов, таких как сложные полиэфиры, полиаминокислоты, гидрогели, поли(молочная кислота) или этиленвинилацетатные сополимеры. Помимо обеспечения встраивания эти агенты можно использовать также для удерживания соединения в микрокапсулах.

Другие формы введения представляют собой, например, введение с помощью ингаляционного спрея, местное, ректальное, назальное, буккальное, вагинальное введение или введение с помощью имплантированного резервуара, некоторые из которых описаны ниже более подробно.

Так, фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно вводить в форме суппозиториев для ректального введения. Их можно приготавливать путем смешения агента с

- 14 013469 пригодным, не вызывающим раздражение эксципиентом, который находится в твердом состоянии при комнатной температуре, но становится жидким при температуре прямой кишки и, следовательно, расплавляется в прямой кишке с высвобождением лекарственного средства. Такие материалы включают кокосовое масло, пчелиный воск и полиэтиленгликоли.

Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять также местно, особенно в том случае, когда мишень для лечения включает области или органы, легко доступные для местной обработки, в частности при заболеваниях глаза, кожи или нижнего отдела кишечного тракта. Для каждой из этих областей или органов можно легко приготавливать пригодные препаративные формы для местного применения. Местное введение в нижний отдел кишечного тракта можно осуществлять с помощью препаративной формы в виде ректального суппозитория (см. выше) или пригодной препаративной формы, вводимой с помощью клизмы. Можно использовать также трансдермальные бляшки для местного применения. Для местных применений можно приготавливать фармацевтические композиции в виде пригодных мазей, содержащих действующий компонент, суспендированный или растворенный в одном или большем количестве носителей. Носители для местного применения слитых белков, предлагаемых в настоящем изобретении, включают (но не ограничиваясь ими) минеральное масло, вазелиновое масло, белый вазелин, пропиленгликоль, полиоксиэтилен, производное полиоксипропилена, эмульгирующий воск и воду. В альтернативном варианте фармацевтические композиции можно приготавливать в виде пригодного лосьона или крема, содержащего активные слитые белки, суспендированные или растворенные в одном или большем количестве фармацевтически приемлемых носителей. Пригодные носители включают (но не ограничиваясь ими) минеральное масло, сорбитанмоностеарат, полисорбат 60, воск на основе сложных цетиловых эфиров, цетеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и воду.

Для применения в офтальмологии фармацевтические композиции можно приготавливать в виде мелкодисперсных суспензий в изотоническом стерильном соляном растворе с отрегулированым значением рН или предпочтительно в виде растворов в изотоническом стерильном соляном растворе с отрегулированым значением рН, либо содержащих консервант, такой как бензалконийхлорид, либо без него. В альтернативном варианте для применения в офтальмологии фармацевтические композиции можно включать в состав мази, такой как вазелин.

Фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно вводить также с помощью назального аэрозоля или путем ингаляции. Такие фармацевтические композиции приготавливают согласно методам, хорошо известным в области получения фармацевтических препаративных форм, и их можно приготавливать в виде растворов в солевом растворе с применением бензилового спирта или других приемлемых консервантов, усилителей абсорбции для повышения биологической доступности, фторурглеродов и/или других обычно применяемых солюбилизаторов или диспергирующих агентов.

Наиболее предпочтительно фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, приготавливают в виде препаративных форм для орального введения.

Количество слитого(ых) белка(ов), предлагаемого(ых) в настоящем изобретении, которое можно объединять с носителями, адъювантами и наполнителями для приготовления фармацевтической композиции в виде однократной стандартной дозы лекарственного средства, должно варьироваться в зависимости от хозяина, подлежащего лечению, конкретного пути введения. Предпочтительно фармацевтические композиции следует включать в препаративные формы таким образом, чтобы пациенту с помощью таких композиций можно было вводить дозу, составляющую от 0,01 до 100 мг ингибитора/кг веса тела/день. Предпочтительные дозы составляют от 0,1 до 5 мг/кг веса тела/день, еще более предпочтительны дозы, составляющие от 1 до 5 мг/кг веса тела/день.

Капсулы.

Капсулы приготавливают путем внесения в каждую, состоящую из двух частей твердую желатиновую капсульную оболочку по 100 мг порошкообразного действующего вещества, 175 мг лактозы, 24 мг талька и 6 мг стеарата магния.

Мягкие желатиновые капсулы.

Приготавливают смесь действующего вещества с соевым маслом и инъецируют с помощью поршневого насоса в желатин, получая мягкие желатиновые капсулы, содержащие по 100 мг действующего вещества. Затем капсулы промывают и сушат.

Таблетки.

Таблетки приготавливают с помощью стандартных методов так, чтобы стандартная доза содержала 100 мг действующего вещества, 0,2 мг коллоидного диоксида кремния, 5 мг стеарата магния, 275 мг микрокристаллической целлюлозы, 11 мг кукурузного крахмала и 98,8 мг лактозы. Для улучшения вкусовых качеств или замедления абсорбции можно наносить соответствующие покрытия.

Инъецируемое лекарственное средство.

Парентеральную композицию, пригодную для введения путем инъекции, приготавливают путем перемешивания 1,5 мас.% действующих веществ в 10 об.% пропиленгликоля и воде. Раствору придают изотоничность с помощью хлорида натрия и стерилизуют.

- 15 013469

Суспензия.

Водную суспензию для орального введения приготавливают таким образом, чтобы в каждых 5 мл содержалось по 100 мг тонкоизмельченного действующего вещества, 200 мг натрийкарбоксиметилцеллюлозы, 5 мг бензоата натрия, 1,0 г раствора сорбита И.8.Р. и 0,025 мл ванилина.

Следует отметить, что конкретная доза и схема введения лекарственного средства для каждого конкретного пациента должна зависеть от различных факторов, включая активность конкретного применяемого слитого белка, возраста, веса тела, общего состояния здоровья, пола, диеты, времени введения, скорости экскреции, комбинации лекарственных средств и решения лечащего врача и серьезности конкретного заболевания, подлежащего лечению. Количество слитого белка, предлагаемого в настоящем изобретении, в фармацевтической композиции также должно зависеть от конкретного слитого белка, входящего в композицию.

Другой вариант осуществления изобретения относится к применению слитого белка, предлагаемого в изобретении, для лечения или приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для лечения и/или профилактики заболеваний или терапевтическим методам лечения состояний, обусловленных нарушением апоптоза, рака, например лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, гистиоцитной лимфомы, различных типов рака головного мозга (глиобластомы), яичника, мочеполового тракта, ободочной кишки, печени, колоректального тракта, поджелудочной железы, молочной железы, предстательной железы, лимфатической системы, желудка, гортани и легкого, включая аденокарциному легкого и мелкоклеточный рак легкого, и/или рака кожи, например меланомы или немеланомного рака кожи, включая базально-клеточный рак и плоскоклеточный рак, а также псориаза, синдрома Бехчета, пузырьчатки обыкновенной.

Приведенные ниже чертежи и примеры служат для иллюстрации изобретения и не ограничивают объем изобретения. Все документы, процитированные в настоящем описании, полностью включены в него в качестве ссылки.

Описание чертежей

На чертежах показано:

фиг. 1А - аминокислотная последовательность основной области белка Та! в ее ретроинвертированной Ό-форме.

Таким образом, все приведенные аминокислоты представляют собой Ό-энантиомерные аминокислоты. Последовательность, представленная на фиг. 1А, является примером последовательности Ό-ТАТ (8ЕО ГО N0:1);

фиг. 1Б - аминокислотная последовательность родовой последовательности Ό-ТАТ (8ЕО ГО N0:2), соответствующая описанию фиг. 1А;

фиг. 2А - нативная Ь-аминокислотная последовательность В1б (вариант транскрипта 1, 8Е0 ГО N0:3), человеческая изоформа;

фиг. 2Б - нативная Ь-аминокислотная последовательность Ваб (8Е0 ГО N0:4); человеческая изоформа; домен ВН3 подчеркнут.

Домен ВН3 может содержать подчеркнутый фрагмент, а также две дополнительные аминокислоты на любом конце. Эти четыре дополнительные аминокислоты выделены жирным шрифтом;

фиг. 2В - нативная Ь-аминокислотная последовательность №ха (8Е0 ГО N0:5), человеческая изоформа;

фиг. 2Г - нативная Ь-аминокислотная последовательность Рита (8Е0 ГО N0:6), человеческая изоформа;

фиг. 2Д - нативная Ь-аминокислотная последовательность В1т (вариант транскрипта 1, 8Е0 ГО N0:7), человеческая изоформа;

фиг. 2Е - нативная Ь-аминокислотная последовательность В1к (8Е0 ГО N0:8); человеческая изоформа; домен ВН3 подчеркнут.

Домен ВН3 может содержать подчеркнутый фрагмент, а также две дополнительные аминокислоты на любом конце. Эти четыре дополнительные аминокислоты выделены жирным шрифтом;

фиг. ЗА - аминокислотная последовательность Э-ТАТ-В1б (вариант транскрипта 1, 8Е0 ГО N0:9) пример слитого белка, предлагаемого в изобретении, где полноразмерная последовательность В1б (согласно изобретению компонент (II) слитого белка, предлагаемого в изобретении) представлена в ее нативной Ь-форме (также как и последовательности белка ВНЗ-только на приведенных ниже фиг. ЗБ-ЗЕ), а компонент (I) - в его инвертированной форме, состоящей из Ό-аминокислот (Ό-Та!).

Для того чтобы изобразить слитый белок, предлагаемый в изобретении, в виде ретроинвертированной, содержащей только Ό-аминокислоты последовательности, компонент (II) должен быть инвертирован;

фиг. ЗБ - аминокислотная последовательность Ό-ТАТ-Ваб (8Е0 ГО N0:10); домен ВНЗ подчеркнут.

Домен ВН3 может содержать подчеркнутый фрагмент, а также две дополнительные аминокислоты на любом конце. Эти четыре дополнительные аминокислоты выделены жирным шрифтом;

фиг. ЗВ - аминокислотная последовательность Э-ТЛТ-№ха (8Е0 ГО N0:11);

фиг. ЗГ - аминокислотная последовательность Ό-ТАТ-Рита (8Е0 ГО N0:12):

- 16 013469 фиг. 3Д - аминокислотная последовательность Ό-ТАТ-Вип (вариант транскрипта 1, (8ЕО ГО N0:13); фиг. 3Е - аминокислотная последовательность Ό-ТАТ-ВП; (8Е0 ГО N0:14); домен ВН3 подчеркнут.

Домен ВН3 может содержать подчеркнутый фрагмент, а также две дополнительные аминокислоты на любом конце. Эти четыре дополнительные аминокислоты выделены жирным шрифтом;

фиг. - 4А - нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВН3 В1к (В1к ВН3); фиг. 4Б - нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВН3 Ваб (Ваб ВН3); фиг. 4В - нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВН3 В1б (В1б ВН3); фиг. 4Г - нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВН3 ВтГ(ВтГВН3); фиг. 4Д - нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВН3 ЭР5/Нгк (ЭР5/Нгк ВН3); фиг. 4Е - нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВН3 В1т (В1т ВН3);

фиг. 4Ж - нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВН3 №ха (№ха ВН3); фиг. 4З - нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВН3 РИМА (РИМА ВН3); фиг. 4И - нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВН3 Вах (Вах ВН3); фиг. 4К - нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВН3 Вак (Вак ВН3); фиг. 4Л - нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВН3 Вок (Вок ВН3);

фиг. 5 - график, иллюстрирующий результаты исследований индуцируемой ВН3 гибели клеток клеточной линии НеЬа.

Применявшиеся слитые пептиды, предлагаемые в изобретении, содержали в качестве первого компонента (I) транспортирующую последовательность Ό-ТАТ и в качестве второго компонента (II) последовательности домена ВН3 белков ВН3-только В1т, Вок, Вах, ΌΡ5 [Нгк], В1б, №ха, РИМА и Вак соответственно (как указано на фиг. 5). Слитые пептиды инкубировали в концентрациях 1, 10, 50 и 100 мкМ с клетками линии НеЬа в культуральной среде в течение 24 ч. Контроль содержал клетки линии НеЬа без обработки, т.е. без инкубации со слитыми пептидами, предлагаемыми в изобретении. Контроль инкубировали также с клетками линии РТС-3 в культуральной среде в течение 24 ч. Апоптозные клетки подсчитывали с использованием окрашивания Ноес11к1/Р! (Воппу е! а1., Ь Вю1. Сйет., 275, 2000, р. 1646616472). Уровень апоптозных клеток в процентах представлен на фиг. 5 по оси ординат в виде % гибели клеток. Как видно из фиг. 5, для слитых пептидов, содержащих В1т, Вок или Вах, получены наилучшие результаты, т.е. наиболее высокие уровни гибели клеток, составляющие примерно 98 и 68%, за ними следует слитый пептид, содержащий РИМА (уровень гибели клеток примерно 23%). Следует отметить, что использование слитого пептида, содержащего В1т, дало лучший результат, т.е. уровень гибели клеток составлял примерно 98% при концентрации пептида 50 мкМ, в то время как слитые пептиды, содержащие Вок или Вах, вызывали указанные уровни гибели клеток, составлявшие примерно 98 и примерно 68% при концентрации пептида 100 мкМ;

фиг. 6 - график, иллюстрирующий результаты исследований индуцируемой ВН3 гибели клеток клеточной линии вТС-3.

Применявшиеся слитые пептиды, предлагаемые в изобретении, содержали в качестве первого компонента (I) транспортирующую последовательность Ό-ТАТ и в качестве второго компонента (II) последовательности домена ВН3 белков ВН3-только Рита, №ха, Вак В1т, Вок, Вах и ЭР-5 соответственно (как указано на фиг. 6). Слитые пептиды инкубировали в концентрациях 1 мкМ и 10 мкМ соответственно (обозначены как Рита 1 для концентрации 1 мкМ и Рита 10 для концентрации 10 мкМ и т.д.) с клетками линии вТС-3 в культуральной среде в течение 24 ч. Один образец содержал транспортирующую последовательность Ь-Та! в концентрации 10 мкМ. Другой образец содержал субстанцию тапсигаргин для контроля токсичности. Контроль содержал клетки линии вТС-3 без обработки, т.е. без инкубации со слитыми пептидами, предлагаемыми в изобретении. Образец, содержащий Ь-ТаЕ и контроль инкубировали также с клетками линии вТС-3 в культуральной среде в течение 24 ч. Апоптозные клетки подсчитывали с использованием окрашивания Ноес11к(/Р! (см. выше). Уровень апоптозных клеток в процентах представлен на фиг. 5 по оси ординат в виде % гибели клеток.

Как видно из фиг. 6, для слитых пептидов, содержащих В1т, Вок в концентрациях 10 мкМ, получены наилучшие результаты, т.е. наиболее высокие уровни гибели клеток, составлявшие примерно 99 и примерно 86% соответственно, за ними следуют слитые пептиды, содержащие №ха и Вах в концентрациях 10 мкМ (гибель клеток составляла примерно 52 и примерно 43% соответственно).

Окрашивание Ноес11к1/РЕ указанное на фиг. 5 и 6, проводили согласно методу, описанному Воппу С. е! а1., ЬВ1 гебисек суЮкше-шбисеб арорЮкЬ оГ шкиНп-кесгебпд се11к, к Вю1. Скет., 275, 2000, р. 1646616472. Обе линии клеток, НеЬа (линия человеческих клеток рака шейки матки), фиг. 5, и вТС-3 (линия секретирующих инсулин клеток) (ЕГга1 8. е! а1., Ве!а-се11 1шек бепуеб Ггот 1гапкдешс писе ехргеккшд а 11уЬпб ткиНп депе-опсодепе, Ргос №11 Асаб 8с1 И8А, 85, 1988, р. 9037-9041), фиг. 6, культивировали в среде КРМЫ640, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ед./мл пенициллина, 1 ммоль/л пирувата натрия и 2 ммоль/л глутамина;

- 17 013469 фиг. 7 - результаты, полученные с использованием слитых пептидов, предлагаемых в изобретении, которые содержали только Ό-аминокислоты (Э-ВНЗ-Э-Та( из ВИ, Вах и Ваб).

Последовательности домена ВНЗ, состоящие из Ό аминокислот, соответствовали последовательностям, представленным на фиг. 4, но аминокислотная последовательность была инвертирована. Для всех вариантов, включая С18-Р1, использовали концентрацию 10 мкМ. Инкубацию клеток НеЬа (верхний ряд) и СЗЗА (нижний ряд) осуществляли в течение 48 ч. Применяли следующие условия: приготавливали среду КРМЫ640, дополненную 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ед./мл пенициллина, 1 ммоль/л пирувата натрия и 2 ммоль/л глутамина. Окрашивание осуществляли с использованием красителей НоееНЛ и йодида пропидия (Л) (см. выше) (1 мкг/мл каждого в течение 5 мин, после чего вручную осуществляли подсчет клеток с помощью флуоресцентного микроскопа или фотографировали). В этом анализе живые клетки окрашиваются в синий цвет, погибшие окрашиваются в темно-красный цвет (темный). Отчетливо видно, что все слитые пептиды, предлагаемые в изобретении, которые содержали только Ό-аминокислоты, вызывали апоптоз клеток.

Перечень последовательностей

<110>	КСИЖЕН С.А.
<120>	Слитый белок, содержащий домен ВНЗ белка «ВНЗ-только»
<130>	СХ01Р002ТО
<140>
<141>
<150>	ЕР 04028278.245
<151>	2004-11-29
<160>	25
<170>	РабепЫп уегз1оп 3.3
<210>	1
<211>	10
<212>	РКТ
<213>	Ното зартепв
<220>
<221>	М18С_РЕАТиЕЕ
<223>	описание последовательности: аминокислотная последовательность
	О-ТаЬ

<220>
¢2215	М18С-ГЕАТЦКЕ
<222>	(10) . . (10)
<223>	Хаа обозначает 01у или удалена

<220>

<221> ΜΟΏ_ΚΕ5 <222> (1)..(10) <223> аминокислоты с 1 по 10 представляют собой й-аминокислоты <400> 1

Агд Агд Агд 01п Агд Агд Ьуа Ьуа Агд Хаа

10

- 18 013469 <210> 2 <211> 9 <212> РЕТ <213> Ното заргепв <220>

<221> М13С_ГЕАТЦЕЕ <222> (1)..(9) <223> Хаа обозначает аргинин или лизин в положениях 1-3 и 5-9, и

Хаа обозначает любую неосн вную аминокислоту в положении 4 <220>

<221> Μ0Ώ-ΚΕ3 <222> (1)..(9) <223> аминокислоты с 1 по 9 представляют собой О-аминокислоты <400>2

Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа <2Ю>3 <211>241 <212> РЕТ <213> Ното зархепз <220>

<221> М13С РЕАТСГР.Е <223> описание последовательности: аминокислотная последовательность

Βίά (человеческого) (вариант транскрипта 1} <400> 3

Мее 1

Суз

Зег

<31у

А1а 5

01у

Уа1

Меб

МеЪ

А1а Агд 10

Тгр

А1а

А1а

Агд 15

О1у

Агд

А1а

61у

Тгр

Агд

Зег

ТЬг

Уа1

Агд

Не

Беи

Зег

Рго

Беи

С1у

ΗΪ3

20

25

30

Суз

С1и

Рго

С1у

Уа1

Зег

Агд

Зег

Суз

Агд

А1а

А1а

С1П

А1а

мее

Азр

35

40

45

Суз

61и

Уа1

Азп

Азп

<31у

Зег

Зег

Беи

Агд

Азр

<31и

Суз

11е

ТЬг

Азп

50

55

ео

- 19 013469

Беи 65

Беи

Уа1

РЬе

<31у

Р1хе 70

ьеи

С1П

Зег

Суз

Зег 75

Азр

Азп

Зег

РЬе

Агд 80

Агд

61и

Беи

Азр

А1а

Беи

С1у

ΗΪΒ

(31и

Беи

Рго

Уа1

Беи

А1а

Рго

31п

85

90

95

Тгр

<31и

31у

Туг

Азр

С1и

Беи

<31п

Т11Г

Азр

61у

Азп

Агд

Зег

Зег

Ηίβ

100

105

110

Зег

Агд

Беи

<31у

Агд

Не

<31и

А1а

Авр

Зег

С1и

Зег

С1п

О1и

Азр

Не

115

120

125

Не

Агд

Азп

Не

А1а

Агд

Н±з

Беи

А1а

βΐη

Уа1

О1у

Азр

Зег

МеЬ

Азр

130

135

140

Агд

Зег

Не

Рго

Рго

в1у

Беи

Уа1

Азп

<31у

Беи

А1а

Беи

51п

Беи

Агд

145

150

155

160

Азп

ТЬг

Зег

Агд

Зег

<31и

С1и

Азр

Агд

Азп

Агд

Азр

Беи

А1а

ТЬг

А1а

165

170

175

Беи

С1и

61п

Беи

Беи

<31п

А1а

Туг

Рго

Агд

Азр

МеЬ

С1и

Буз

<31и

Вуз

180

185

190

ТЬг

Μβϋ

Беи

Уа1

Беи

А1а

Беи

Беи

Беи

А1а

Бу 8

Буз

Уа1

А1а

Зег

Н13

195

200

205

ТЬг

Рго

Зег

Беи

Беи

Агд

Азр

17а 1

РЬе

ΗΪ8

ТЬг

Ткг

Уа1

Азп

РЬе

Не

210

215

220

Азп

<31п

Азп

Беи

Агд

ТЬг

Туг

Уа1

Агд

Зег

Беи

А1а

Агд

Азп

(31у

МеЪ

225

230

235

240

Азр <210> 4 <211> 168 <212> РЙТ <213 > Ното зархепз <220>

<221? М13С_РЕАТЩ?.Е <223> описание последовательности: аминокислотная последовательность

Вас! (человеческого)

- 20 013469 <400> 4

Мес 1

РЬе 31п

Не

Рго 5

<31и Рке

<31и

Рго

Зег <31и 10

(31П <31и

Авр

Зег 15

Зег

Зег

А. 1а

С1и

Агд

<31у

Ьеи

61у

Рго

Зег

Рго

А1а

О1у

Авр

<31у

Рго

Зег

20

25

30

С1у

Зег

<31у

Ьув

ΗΪΒ

ΗΪΒ

Агд

<31п

А1а

РГО

<31у

Ьеи

Ьеи

Тгр

Авр

А1а

35

40

45

Зег

ΗΪ3

С1п

С1п

С1и

<31п

Рго

ТЬг

Зег

Зег

Зег

ΗΪ3

ΗΪ8

<31у

<31у

А1а

50

55

60

<31у

А1а

Уа1

<31и

11е

Агд

Зег

Агд

ΗΪ8

Зег

Зег

Туг

Рго

А1а

О1у

ТЬг

65

70

75

80

<3111

Авр

Авр

<31и

<31у

Ме£

<31у

<Э1и

<31и

Рго

Зег

Рго

Рке

Агд

01у

Агд

85

90

95

Зег

Агд

Зег

А1а

Рго

Рго

АВП

Ьеи

Тгр

А1а

А1а

<31п

Агд

Туг

<31у

Агд

100

105

110

<31и

Ьеи

Агд

Агд

МеЪ

Зег

Авр

<31и

Р11е

Йа1

Авр

Зег

РИе

ьув

Ьув

<31у

115

120

125

Ьеи

Рго

Агд

Рго

Ьув

Зег

А1а

С1у

ТИг

А1а

Т11Г

О1п

Ме£

Агд

<31п

Зег

130

135

140

Зег

Зег

Тгр

Ткг

Агд

Уа1

Рке

<3111

Зег

Тгр

Тгр

Авр

Агд

Аз η

Ьеи

<31у

145

150

155

160

Агд <31у Зег Зег А1а Рго Зег С1п 165 <210> 5 <211> 483 <212> РКТ <213> Ното зархепз <220>

<221> т£зс_£еабиге <223> описание последовательности: аминокислотная последовательность

Иоха! (человеческого)

- 21 013469 <400> 5

мес 1

А1а

Зег

Ьеи

(31у Агр 5

Ьеи

Уа1

Агд А1а 10

тгр

Ηίε

Ьеи

(31у

А1а 15

<31п

А1а

νβΐ

Аар

Агд

<31у

Аар

Тгр

А1а

Агд

А1а

Ьеи

Ηίε

Ьеи

РЬе

Зег

<31у

20

25

30

Уа1

Рго

А1а

РГО

РГО

А1а

Агд

Ьеи

су»

РЬе

Азп

А1а

<31у

Суз

Уа1

Ηίε

35

40

45

Ьеи

Ьеи

А1а

С1у

Азр

Рго

С1и

А1а

А1а

Ьеи

Агд

А1а

РЬе

Агр

<31 п

А1а

50

55

60

Уа1

ТЬг

Ьуз

Азр

ТЬг

Суз

Мее

А1а

Уа1

<Э1у

РЬе

РЬе

<31 η

Агд

(31 у

Уа1

65

70

75

80

А. 1а

Аг η

РЬе

<51п

Ьеи

А1а

Агд

РЬе

61п

<31и

А1а

Ьеи

Зег

Аар

РЬе

Тгр

85

90

95

Ьеи

А1а

Ьеи

<31и

С1п

Ьеи

Агд

<31у

ΗΪ3

А1а

А1а

11е

Агр

Туг

ТЬг

<31п

100

105

110

Ьеи

01у

Ьеи

Агд

РЬе

Ьуз

Ьеи

σΐη

А1а

Тгр

С1и

Уа1

ьеи

ΗΪ3

Агп

Уа1

115

120

125

А1а

8ег

А1а

01П

Суз

О1П

Ьеи

<31у

Ьеи

Тгр

тЬг

<31и

А1а

А1а

Зег

Зег

130

135

140

Ьеи

А г-д-

<31и

А1а

МеЕ

Зег

ьуз

Тгр

Рго

(31и

61у

Зег

Ьеи

Азп

<31у

Ьеи

145

150

155

160

Аар

Зет

А1а

Ьеи

Агр

С1п

Уа1

61п

Агд

Агд

<31у

Зег

Ьеи

Рго

Рго

Агд

165

170

175

01П

Уа1

Рго

Агд

<31у

С1и

Уа1

РЬе

Агд

Рго

Н1й

Агд

Тгр

Н18

ьеи

Ьуз

180

185

190

Ηίε

Ьеи

<31и

Рго

Уа1

Агр

РЬе

Ьеи

61у

Ьуз

А1а

Ьуг

Уа1

Уа1

А1а

Зег

195

200

205

А1а

Не

Рга

Агр

Агр

<31п

<31у

Тгр

<31у

Уа1

Агд

Рго

<31п

61п

Рго

<31п

210

215

220

81у

Рго

01У

А1а

Агп

Ηίε

Азр

А1а

Агд

Зег

Ьеи

11е

МеЬ

Агр

Зег

Рго

225

230

235

240

- 22 013469

Агд

А1а

С1у

ΤΪ1Γ

Н1з 245

С1п <31у

РГО

Беи

Авр 250

А1а

С1и

Т11Г

С1и

Уа1 255

01у

А1а

Авр

Агд

Суз

ткг

Зег

ТЬг

А1а

Туг

01п

О1и

С1П

Агд

Рго

О1П

Уа1

260

265

270

С1и

(31п

Уа1

01у

Ьуз

(31П

А1а

Рго

Беи

Зег

Рго

01у

Беи

Рго

А1а

Мес

275

200

205

01у

01у

Рго

С1у

Рго

С1у

Рго

Су в

01и

Авр

Рго

А1а

О1у

А1а

01у

01у

290

295

300

А1а

С1у

А1а

С1у

О1у

Зег

С1и

Рго

Беи

Уа1

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

01п

Сув

305

310

315

320

А1а

Рйе

ТЬг

Уа1

А1а

Беи

Агд

А1а

Агд

Агд

01у

А1а

Авр

Беи

Зег

Зег

325

330

335

Беи

Агд

А1а

Беи

Беи

01у

01п

А1а

Беи

Рго

Ηίε

01п

А1а

01П

Беи

01у

340

345

350

<31п

Беи

Зег

Туг

Беи

А1а

Рго

01 у

01и

Авр

01у

Ига

Тгр

Уа1

Рго

Не

355

360

365

Рго

<31X1

01и

01и

Зег

Беи

01п

Агд

А1а

Тгр

01п

Авр

А1а

А1а

А1а

Сув

370

375

360

Рго

Агд

С1у

Беи

Θ1Π

Беи

С1П

Сув

Агд

С1у

А1а

01у

О1у

Агд

Рго

Уа1

385

390

395

400

Беи

Туг

С1п

Уа1

Уа1

А1а

01п

ΗΪ3

Зег

Туг

Зег

А1а

Θΐη

01у

РГО

01и

405

410

415

Авр

Беи

О1у

РЬе

Агд

<31п

<31у

Авр

ТЬг

Уа1

Авр

Уа1

Беи

Суз

01и

О1и

420

425

430

Рго

Авр

Уа1

Рго

Беи

А1а

Уа1

Авр

01П

А1а

Тгр

Беи

С1и

01у

ΗίΒ

Сув

435

440

445

Аар

01 у

Агд

Не

01у

11е

РИе

РГО

Буе

Сув

РЬе

Уа1

Уа1

Рго

А1а

01у

450

455

460

Рго

Агд

Мег

Вег

01у

А1а

Рго

01у

Агд

Беи

Рго

Агд1

Зег

С1П

О1п

01у

465

470

475

480

Аар С1п Рго

- 23 013469 <210> б <211> 193 <212> РКТ <213> Ното зар1епз <220>

<221> М13С_РЕАТЦКЕ

<223>

описание последовательности:

аминокислотная ι

последовательность

Риша

(человеческого)

<400>

6

МеЬ

А1а

Агд

А1а

Агд

<31п

01и

31у

Зег

Зег

Рго

С1и

Рго

Уа1

(31и

61у

1

5

10

15

Ьеи

А1а

Агд

Азр

61у

Рго

Агд

Рго

РЬе

Рго

Ьеи

С1у

Агд

ьеи

Уа1

Рго

20

25

30

Зег

А1а

Уа1

Зег

Суз

С1у

Ьеи

Суз

61и

Рго

С1у

Ьеи

А1а

А1а

А1а

Рго

35

40

45

А1а

А1а

Рго

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Рго

А1а

А1а

Туг

Ьеи

Суз

А1а

Рго

ТНх

А1а

50

55

60

Рго

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Ьеи

е1у

С1у

Зег

Агд

Тгр

Рго

<31у

С1у

65

70

75

80

Рго

Агд

Зег

Агд

Рго

Агд

С1у

Рго

Агд

Рго

Азр

<31у

Рго

С1П

Рго

Зег

85

90

95

ьеи

Зег

Ьеи

А1а

<31и

<31п

ΗίΒ

ьеи

<31и

Зег

Рго

Уа1

РГО

Зех

А1а

Рхо

100

105

110

<31у

А1а

Ьеи

А1а

<31у

<31у

Рго

ТЬг

<31п

А1а

А1а

Рго

01у

Уа1

Ахд

<31у

115

120

125

<31и

С1и

<31и

<31п

Тгр

А1а

Агд

С1и

Не

31у

А1а

01п

Ьеи

Агд

Агд

МеЬ

130

135

140

А1а

Азр

Аар

ьеи

Аеп

А1а

<31п

Туг

<31и

Агд

Агд

Агд

ΰΐη

61и

Θΐυ

<31п

145

150

155

160

С1п

Агд

ΗΪ3

Агд

Рго

Зег

Рго

Тгр

Агд

νβΐ

Ьеи

Туг

Азп

Ьеи

11е

мее

165

170

175

01у Ьеи Ьеи Рго Ьеи Рго Агд О1у ΗΪ3 Агд А1а Рго <31и МеД С1и Рго

180 185190

Азп <210>7 <211>198 <212> РАТ <213> Ното вар1епз <220>

<221> М13С_РЕАТНЕЕ <223> описание последовательности: аминокислотная последовательность

Βίιη (человеческого) (вариант транскрипта 1) <400> 7

МеД А1а 1

Ьуз

С1п

Рго 5

Зег

Азр Уа1

Зег

8ег О1и Суз Азр Агд 10

01и 15

01у

Агд

О1п

ьеи

О1п

Рго

А1а

<31и

Агд

Рго

Рго

С1п

Ьеи

Агд

Рго

01у

А1а

20

25

30

Рго

Т11Г

Зег

Ьеи

Θΐη

тЬг

31и

Рго

Θ1Π

01у

Азп

Рго

О1и

01у

АЗП

Н15

35

40

45

О1у

О1у

С1и

01у

Азр

Зег

Суз

Рго

ΗΪ3

О1у

Зег

Рго

С1п

<Э1у

Рго

Ьеи

50

55

60

А1а

Рго

Рго

А1а

Зег

Рго

<31у

Рго

РЬе

А1а

ТЬг

Агд

Зег

Рго

Ьеи

РЬе

65

70

75

80

Не

РЬе

Мед

Агд

Агд

Зег

Зег

Ьеи

Ьеи

Зег

Агд

Зег

Зег

Зег

01у

Туг

85

90

95

РЬе

Зег

РЬе

Азр

ТЬг

Азр

Агд

Зег

Рго

А1а

Рго

МеД

Зег

Суз

Азр

Ьуз

100

105

110

Зег

ТЬг

01п

ТЬг

Рго

Зег

Рго

Рго

Суз

01п

А1а

РЬе

Азп

Н1з

Туг

Ьеи

115

120

125

Зег

А1а

Мед

А1а

Зег

МеД

Агд

01п

А1а

О1и

Рго

А1а

Азр

МеД

Агд

Рго

130

135

140

<31и 145

Не

Тгр

Не

А1а

(31п 150

Ии

Ьеи Агд

Агд

Не 155

<31у

Авр С1и

РЬе

Авп 160

А1а

Туг

Туг

А1а

Агд

Агд

Уа1

РЬе

Ьеи

Авп

Аз И

Туг

В1п

А1а

А1а

д1и

165

170

175

Авр

Н13

рхо

Агд

Мек

Уа1

Не

Ьеи

Агд

Ьеи

Ьеи

Агд

Туг

Не

Уа1

Агд

180

185

190

Ьеи Уа1 Тгр Агд Мек Ηϊβ

195 <210> 8 <211> 160 <212> РНТ <213> Ното вархепв <220>

<2 21> М13С_РЕАТиНЕ <223> описание последовательности: аминокислотная последовательность

В1к (человеческого)

<400>	8
мек 1	Бег	С1и	Уа1	Агд 5	РГО	Ьеи	Зег
Ьеи	Тух	О1и	Θ1Π 20	Ьеи	Ьеи	<Э1и	Рго
ТЬг	Авр	Зег 35	<31и	е1и	Авр	Ьеи	Авр 40
С1и	Сув 50	мек	С1и	С1у	Зег	Авр 55	А1а
С1у 65	Авр	С1и	Мек	Авр	Уа1 70	Зег	Ьеи
Зег	С1и	Уа1	А1а	Мек 85	Н1в	Зег	Ьеи
ТЬг	О1и	Авр	11е 100	Агд	Авр	Уа1	Ьеи

Агд	Авр 10	11е	Ьеи Мек	С1и	ТЬг 15	Ьеи
Рго 25	ТЬг	Мек	О1и	Уа1	Ьеи 30	С31у	Мек
Рго	Мек	О1и	Авр	РЬе 45	Авр	Зег	Ьеи
Ьеи	А1а	Ьеи	Агд 60	Ьеи	А1а	Сув	Не
Агд	А1а	Рго 75	Агд	Ьеи	А1а	01п	Ьеи 80
<Э1у	Ьеи 90	А1а	РЬе	Не	Тух	Авр 95	С1п
Агд 105	Зег	РЬе	Мек	Авр	<31у 110	₽ке	ТЬг

- 26 013469

ТЬг

Ьеи

Ьуз 115

С1и

Азп

Не

Мег

Агд 12 0

РЬе

тгр

Агд

Зег

Рго 125

Азп

Рго

С1у

Зег

Тгр

Уа1

Зег

Суз

<31и

Θ1Π

Уа1

ьеи

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Ьеи

130

135

140

А1а

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Рго

Ьеи

Ьеи

Зег

С1у

О1у

Ьеи

ΗΪ8

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Ьуз

145

150

155

160

<210> 9 <211> 251 <212> РКТ <213 > Ното зархепз <220>

<221> М13С_₽ЕАТиКЕ <223> описание последовательности: аминокислотная последовательность О-ТаЬ-Βϊά (человеческого) (вариант транскрипта 1) <220>

<221> М13С_РЕАТСР.Е

-у -» η Г л л \ /т Л 1 <223 > Хаа обозначает <31у или удалена <220>

<221> МОО_Р.ЕЗ <222> (1)..(10) <223> аминокислоты с 1 по 10 представляют собой ϋ-аминокислоты <400> 9

Агд 1

Агд

Агд

01п

Агд Агд Ьуз 5

Ьуз

Агд

Хаа МеЬ 10

Суз

Зег

С1у

А1а 15

(31у

Уа1

Мер

МеЬ

А1а

Агд

Тгр

А1а

А1а

Агд

<31у

Агд

А1а

О1у

Тгр

Агд

Зег

20

25

30

ТЬг

Уа1

Агд

11е

Ьеи

Зег

Рго

Ьеи

<31у

ΗΪ8

Суз

<31и

Рго

О1у

Уа1

Зег

35

40

45

Агд

Зег

Суз

Агд

А1а

А1а

С1п

А1а

Мер

Азр

Суз

<Э1и

Уа1

Азп

Азп

С1у

50

55

60

Зег

Зег

Ьеи

Агд

Азр

С1и

Суз

11е

ТЬг

Азп

Ьеи

Ьеи

Уа1

РЬе

С1у

РЬе

65

70

75

ео

- 27 013469

Ьеи

<31п

Зег

Сув

Зег 85

Авр

АВП

Зег

РЬе Агд 90

Агд

О1и

Ьеи

Авр

А1а 95

ьеи

(31у

ΗΪ3

01и

Ьеи

Рго

Уа1

ьеи

А1а

Рго

О1п

Тгр

<31и

С1у

Туг

АВр

О1и

100

105

110

Ьеи

С1п

ТЬг

Авр

О1у

Ав η

Агд

Зег

Зег

Н1в

Зег

Агд

Ьеи

<31у

Агд

11е

115

120

125

С1и

А1а

Авр

Зег

С1и

Зег

С1п

С1и

Авр

Не

11е

Агд

Авп

11е

А1а

Агд

130

135

140

Н18

Ьеи

А1а

Θΐη

Уа1

О1у

Азр

Зег

Меи

Авр

Агд

Зег

11е

Рго

Рго

О1у

145

150

155

160

Ьеи

Уа1

Авп

<31у

Ьеи

А1а

Ьеи

αΐη

Ьеи

Агд

Авп

ТЬг

Зег

Агд

Зег

<31и

165

170

175

О1и

Αερ

Агд

Авп

Агд

Авр

Ьеи

А1а

ТЬг

А1а

Ьеи

С1и

С1п

Ьеи

Ьеи

<Э1п

180

185

190

А1а

туг

Рго

Агд

Авр

мег

01и

Ьув

<31и

Ьуз

ТЬг

меи

Ьеи

Уа1

ьеи

А1а

195

200

205

Ьеи

Ьеи

Ьеи

А1а

Ьув

Ьув

Уа1

А1а

Зег

ΗΪ8

ТЬГ

Рго

Зег

Ьеи

Ьеи

Агд

210

215

220

Авр

Уа1

РЬе

ΗίΒ

ТЬг

ТЬг

Уа1

АВП

РЬе

11е

Авп

αΐη

Авп

Ьеи

Агд

ТЬг

225

230

235

240

Туг

Уа1

Агд

Зег

Ьеи

А1а

Агд

Авп

С1у

Меи

АВр

245

250

<210> 10 <211> 178 <212> РКТ <213> Ното варгепв <220>

<221> М13С_РЕАТЦКЕ <223> описание последовательности: аминокислотная последовательность ь-таи-вай (человеческого) <220>

<221> МГЕСРЕАТиР.Е

- 28 013469 <222> ΐ10 > . . (10) <223> Хаа обозначает С1у или удалена <220>

<221> МОБ_КЕЗ <222> (1)..(10) <223> аминокислоты с 1 по 10 представляют собой Б-аминокислоты <400> 10

Агд Агд Агд <31 η Агд

Агд Буз Буз

Агд

С1у 10

Меб

РЬе

<31п

11е

Рго 15

<Э1и

1

5

РЪе

51и

Рго

Зег

<31и

С1п

С1и

Азр

Зег

Зег

Зег

А1а

О1и

Агд

Шу

Беи

20

25

30

С1у

Рго

Зег

Рго

А1а

<31у

Азр

<31у

Рго

Зег

<Э1у

Зег

<31у

Буз

Н1з

Н1з

35

40

45

Агд

С1П

А1а

Рго

®1у

Беи

Беи

Тгр

Азр

А1а

Зег

ΗΪ3

С1п

С1п

С1и

от

50

55

60

Рго

ТЬг

Зег

Зег

Зег

Ηίε

Н18

<31у

01у

А1а

<31у

А1а

V»!

<31и

Не

Агд

65

70

75

80

Зег

Агд

Н±3

Зег

Зег

Туг

Рго

А1а

<31у

ТЬг

е1и

Азр

Азр

<31и

61у

Мее

85

90

95

О1у

С1и

С1и

Рго

Зег

Рго

РЪе

Агд

О1у

Агд

зег

Агд

Зег

А1а

Рго

Рго

100

105

110

Азл

Беи

Тгр

А1а

А1а

<31п

Агд

Туг

<31у

Агд

<31и

Беи

Агд

Агд

Меб

Зег

115

120

125

Азр

<31и

Ρΐιβ

Уа1

Азр

Зег

РЬ.е

Буз

Буз

С1у

Беи

Рго

Агд

Рго

Буз

Зег

130

135

140

А1а

С1у

ТИг

А1а

тЬг

С1П

Мер

Агд

61п

Зег

Зег

Зег

Тгр

ТЬг

Агд

ν&1

145

150

155

160

РЬе

<31п

Зег

Тгр

Тгр

Азр

Агд

Аги

Беи

О1у

Агд

О1у

Зег

Зег

А1а

Рго

165

170

175

зег а1п <210> 11 <211> 493 <212> РЕТ <213 > Ното зар£епв <220>

<221> Ш1ас_£еабиге <223> описание последовательности: аминокислотная последовательнс

Ь-ТаЬ Моха! (человеческого) <220>

<221> т1зс_£еариге <222> (10)..(10) <223> Хаа обозначает О1у или удалена <220>

<221> ΜΟϋ_ΚΕ8 <222> (1)..(10) <223> аминокислоты с 1 по 10 представляют собой Ь-аминокислоты <400> 11

Агд 1

Агд

Агд βΐη

Агд Агд Ьуя 5

Ьуз

Агд <31у Мер А1а 10

5ег Ьеи

С1у 15

Азр

Ьеи

Уа1

Агд

А1а

Тгр

ΗΪΒ

Ьеи

С1у

А1а

О1п

А1а

Уа1

Азр

Агд

С1у

Азр

20

25

30

Тгр

А1а

Агд

А1а

Ьеи

ΗΪ3

Ьеи

РЬе

бег

<31у

Уа1

Рго

А1а

Рго

Рго

А1а

35

40

45

Агд

Ьеи

Суз

РКе

Аз η

А1а

С1у

Суз

Уа1

Н1з

Ьеи

Ьеи

А1а

<31у

АЗр

Рго

50

55

60

<31и

А1а

А1а

Ьеи

Агд

А1а

РЬе

Азр

С1п

А1а

Уа1

ТЬг

Ьуз

Азр

ТЬг

Суз

65

70

75

ВО

Ме£

А1а

Уа1

<31у

РНе

РЪе

С1п

Агд

С1у

Уа1

А1а

Азл

РЬе

Θ1Π

Ьеи

А1а

В5

90

95

Агд

РИе

ΰΐη

С1и

А1а

Ьеи

8ег

Азр

РЬе

Тгр

Ьеи

А1а

Ьеи

<31и

<31п

Ьеи

100

105

110

Агд

01у

ΗΪ3

А1а

А1а

Не

Авр

Туг

ТЬг

С1п

Ьеи

<31у

Ьеи

Агд

РЬе

Ьуз

- З0 013469

115 120 125

Беи

<31п 130

А1а

Тгр

С1и Уа1

Беи 135

Н1з Азп Уа1

А1а

Зег 140

А1а

С1п

Суз

61п

Беи

<31у

Беи

Тгр

ТЬг

<31и

А1а

А1а

Зег

Зег

Беи

Агд

<31и

А1а

мее

Зег

145

150

155

160

Вуз

Тгр

Рго

01и

<31у

Зег

Беи

Азп

61У

Беи

Азр

Зег

А1а

Беи

Азр

С1п

165

170

175

Уа1

С1п

Агд

Агд

<31у

Зег

Беи

Рго

Рго

Агд

С1п

Уа1

Рго

Агд

С1у

<31и

180

185

190

Уа1

РЬе

Агд

Рго

Ηίε

Агд

Тгр

ΗΪ8

Беи

Буз

ΗΪ3

Беи

С1и

Рго

Уа1

Азр

195

200

205

РЬе

Беи

31у

Буз

А1а

Буз

Уа1

Уа1

А1а

Зег

А1а

11е

Рго

Азр

Азр

С1п

210

215

220

С1у

Тгр

С1у

Уа1

Агд

Рго

(31 и

С1п

Рго

<31п

О1у

РГО

<Э1у

А1а

Азп

ΗΪ8

225

230

235

240

Азр

А1а

Агд

Зег

Беи

11е

Мее

Авр

Зег

Рго

Агд

А1а

31у

ТЬг

Н13

61п

245

250

255

б1у

Рго

Беи

Азр

А1а

С1и

ТЬг

С1и

Уа1

С1у

А1а

Азр

Агд

Суз

ТЬг

Зег

260

265

270

ТЬг

А1а

Туг

<31п

<31и

<31п

Агд

Рго

Й1п

Уа1

С1и

<31п

Уа1

С1у

Буз

С1п

275

280

285

А1а

Рго

Беи

Зег

Рго

61у

Беи

РГО

А1а

Мее

С1у

С1у

Рго

Й1у

Рго

О1у

290

295

300

Рго

Суз

<31и

Азр

Рго

А1а

С1у

А1а

01у

О1у

А1а

в1у

А1а

01у

О1у

Зег

305

310

315

320

С1и

Рго

Беи

Уа1

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

<31п

Суз

А1а

РЬе

ТЬг

Уа1

А1а

Беи

325

330

335

Агд

А1а

Агд

Агд

<31у

А1а

Азр

Беи

Зег

Зег

Беи

Агд

А1а

Беи

Беи

61у

340

345

350

<Э1п

А1а

Беи

Рго

ΗΪ3

61п

А1а

С1п

Беи

(31у

С1п

Беи

Зег

Туг

Беи

А1а

35Б 360 365

- З1 013469

Рго <31у 370

(31и

Азр

<31у Ηίε

Тгр Уа1 375

Рго

Не

Рго

С1и 380

О1и

С1и

Зег

Ьеи

61п

Агд

А1а

Тгр

О1п

Азр

А1а

А1а

А1а

Суз

Рго

Агд

<31у

Ьеи

О1п

Ьеи

ЗВ5

390

395

400

С1п

Суз

Агд

<31у

А1а

С1у

<31у

Агд

Рго

Уа1

Ьеи

Туг

<31п

Уа1

Уа1

А1а

405

410

415

С1п

Н1з

Зег

Туг

Зег

А1а

01»

О1у

РГО

<31и

Азр

Ьеи

61у

РЪе

Агд

<31п

420

425

430

<31у

Азр

ТЪг

Уа1

Азр

Уа1

Ьеи

Суз

С1и

С1и

Рго

Азр

Уа1

Рго

Ьеи

А1а

435

440

445

Уа1

Авр

<31п

А1а

тгр

Ьеи

О1и

<31у

ΗΪ8

Суз

Азр

С1у

Агд

Не

С1у

Не

450

455

460

РЪе

Рго

Ьуз

Суз

Рйе

Уа1

Уа1

Рго

А1а

<31у

Рго

Агд

меб

Зег

61у

А1а

465

470

475

480

Рго

61у

Агд

Беи

Рго

Агд

Зег

<Э1п

αΐη

<31у

Азр

О1п

Рго

435

490

<210> 12 <211> 203 <212> РКТ <213> Ното зархепз <220>

<221> М13С_ГЕАТиПЕ <223> описание последовательности: аминокислотная последовательность

П-ТаЬ-Рита (человеческого) <220>

<221> М18С_РЕАТЦКЕ <222> (10)..(10) <223 > Хаа обозначает С1у или удалена <220>

<221> МОЬЕЕЗ <222> (1)..(10) <223> аминокислоты с 1 по 10 представляют собой ϋ-аминокислоты

- 32 013469 <400> 12

Агд Агд 1

Агд

61п Агд 5

Агд Буз

Буз Агд С1у 10

Мер А1а Агд

А1а

Агд 15

01п

61и

<31у

Зег

Зег

Рго

61и

Рго

Уа1

61и

61у

Беи

А1а

Агд

Азр

61у

РГО

20

25

30

Агд

Рго

РЬе

Рго

Беи

61у

Агд

Беи

Уа1

Рго

Зег

А1а

Уа1

Зег

Суг

61у

35

40

45

Беи

Суз

б1и

Рго

61у

Беи

А1а

А1а

А1а

Рго

А1а

А1а

Рго

ТЬг

Беи

Беи

50

55

60

Рго

А1а

А1а

туг

Беи

Суз

А1а

Рго

Ткг

А1а

Рго

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

А1а

65

70

75

80

А1а

Беи

С1у

С1у

Зег

Агд

Тгр

Рго

61у

С1у

Рго

Агд

Зег

Агд

Рго

Агд

85

90

95

61 у

Рго

Агд

Рго

Агр

61у

Рго

61п

Рго

Зег

Беи

Зег

Беи

А1а

61и

С1п

100

105

110

Ηίδ

Беи

б1и

Зег

Рго

Ча1

Рго

Зег

А1а

Рго

С1у

А1а

Беи

А1а

С1у

61у

115

120

125

Рго

ТЬг

61п

А1а

А1а

Рго

б1у

Уа1

Агд

61у

61и

01и

61и

61п

Тгр

А1а

130

135

140

Агд

61и

Не

61у

А1а

<31п

Беи

Агд

Агд

МеЬ

А1а

Азр

Азр

Беи

Агп

А1а

145

150

155

160

С1п

Туг

С1и

Агд

Агд

Агд

61п

61и

61и

С1п

61п

Агд

ΗΪΞ

Агд

Рго

Бег

165

170

175

Рго

Тгр

Агд

Уа1

Беи

Туг

Азп

Беи

11е

Мек

С1у

Беи

Беи

Рго

Беи

Рго

130

185

190

Агд

61у

ΗΪ8

Агд

А1а

Рго

61 и

МеЬ

С1и

Рго

Аг η

195

200

<210>	13
<211>	208
<212>	РЕТ
<213>	Ното зар1епз

- 33 013469 <220>

<221> М13С_ГЕАТиЕЕ <223> описание последовательности: аминокислотная последовательность

Б-ТаЪ-Βϊιη (человеческого) (вариант транскрипта 1) <220>

<221> М1£С_ЕЕАТи₽,Е <222> (10)..(10) <223> Хаа обозначает О1у или удалена <220>

<221> МОО_Р.ЕЗ <222> (1)..(10) <223> аминокислоты с 1 по 10 представляют собой Ь-аминокислоты <400> 13

Агд 1

Агд

Агд С1п

Агд Агд 5

Ьуз

Ьуз

Агд

<31у 10

МеС

А1а

ьуз

01П

Рго 15

Зег

Аар

Уа1

Зег

Зег

Й1и

Суз

Азр

Агд

С1и

С1у

Агд

<Э1П

Ьеи

αΐη

Рго

А1а

20

25

30

С1и

Агд

Рго

Рго

Й1п

Ьеи

Агд

Рго

<Э1у

А1а

Рго

ТЪг

Зег

Ьеи

С1п

ТЬг

35

40

45

О1и

Рго

С1п

<31у

Авп

Рго

О1и

С1у

Азп

н±з

С1у

Й1у

<31и

<31у

Азр

Зег

50

55

60

Суз

Рго

Ηίε

01у

Зег

Рго

Й1п

С1у

Рго

Ьеи

А1а

Рго

Рго

А1а

Зег

Рго

65

70

75

80

С1у

Рго

РЬе

А1а

ТНг

Агд

Зег

Рго

Ьеи

РЬе

Не

Р11е

МеС

Агд

Агд

Зег

85

90

95

Зег

Ьеи

Ьеи

Зег

Агд

Зег

Зег

Зег

<31у

Туг

РЪе

Зег

РЪе

Азр

Т1»г

Азр

100

105

110

Агд

Зег

Рго

А1а

Рго

МеС

Зег

Суз

Авр

Ьуа

Зег

Т11Г

<31п

Т11Г

РГО

Зег

115

120

125

Рго

Рго

Суз

01п

А1а

РИе

Аз η

Н13

Туг

Ьеи

Зег

А1а

Меб

А1а

Зег

Мес

110

135

140

Агд

<31п

А1а

С1и

Рго

А1а

Азр

МеС

Агд

Рго

(31и

Не

Тгр

Не

А 1а

С1п

145

150

155

160

- 34 013469

<31и Беи Агд

Агд

Не 165

®1у Авр

01и

РЬе

Азп А1а Туг Туг А1а Агд

Агд

170

175

Уа1

РЬе

Беи

Аги

Агп

Туг

<31П

А1а

А1а

<31и

Азр

Н1з

Рго

Агд

Мес

Уа1

180

185

190

Не

Беи

Агд

Беи

Беи

Агд

Туг

Не

Уа1

Агд

Беи

Уа1

Тгр

Агд

МеС

ΗίΒ

195

200

205

<210> 14 <211> 170 <212> РЙТ <213> Ното зараепв <220>

<221> М13С_РЕАТийЕ <223> описание последовательности; аминокислотная последовательностьи

Б-ТаС-В1к (человеческого) <220>

<221> М13С_ГЕАТийЕ <222> (10)..(10) <223> Хаа обозначает (31у или удалена <220>

<221> МОБ__РЕ5 <222> (1)..(10) <223> аминокислоты с 1 по 10 представляют собой Б-аминокислоты <400> 14

Агд 1

Агд

Агд <31п

Агд 5

Агд

Буз

Буз

Агд <31у МеС 10

Зег С1и

Уа1

Агд 15

Рго

Беи

Зег

Агд

Азр

Не

Беи

МеС

О1и

ТЬг

Беи

Беи

Туг

О1и

<31п

Беи

Беи

20

25

30

61и

Рго

Рго

ТЬг

МеС

<31и

Уа1

Беи

01у

МеС

ТЬг

Авр

5ег

О1и

О1и

Азр

35

40

45

Беи

Авр

Рго

Мес

О1и

Авр

РЬе

Авр

Зег

Беи

01и

Суз

МеС

61и

01у

Зег

50

55

60

Авр

А1а

Беи

А1а

Беи

Агд

Беи

А1а

Сув

Не

е1у

Авр

С1и

МеС

Авр

Уа1

- З5 013469

65

70

75

80

Зег

Ьеи

Агд

А1а

Рго

Агд

Ьеи

А1а

<31п

Ьеи

Зег

01и

Уа1

А1а

МеД

ΗΪ3

85

90

95

Зег

Ьеи

01у

Ьеи

А1а

РЬе

11е

Туг

Азр

αΐη

ТЬг

<31и

Азр

11е

Агд

Азр

100

105

110

Уа1

Ьеи

Агд

Зег

РЬе

МеД

Азр

О1у

РЬе

ТЬг

ТЬг

Ьеи

Ьуз

С1и

Азп

11е

115

120

125

МеД

Агд

РЬе

Тгр

Агд

Зег

Рго

АЗП

Рго

(31у

Зег

Тгр

Уа1

Зег

Суз

01и

130

135

140

<31п

Уа1

Ьеи

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Рго

Ьеи

145

150

155

160

Ьеи

Зег

С1у

<31 у

Ьеи

Ηίβ

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Ьуз

165

170

<210> 15 <211> 18 . ·Ί -I Л- ТХП СП

4.Ζ. Х^^* ГЧЧ.Х <213> Ното зарЬепз <220>

<221> га1зс_£еаДиге <223> описание последовательности: нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВНЗ В1к (ВИЗ Вхк) <400> 15

А1а Ьеи А1а Ьеи Агд Ьеи А1а Сув Не О1у Авр <31и МеД Азр Уа1 Зег

10 15

Ьеи Агд

<210>	16
<211>	18
<212>	РКТ
<213>	Ното зардепз

- 36 013469 <220>

<221> т!вс_£еаЬиге <223> описание последовательности: нативная ь-аминокислотная последовательность домена виз ВаЗ (виз Ваб) <400>16

Агд Туг <31у Агд <31и Ьеи Агд Агд МеЬ Зег Авр <31и Рйе Уа1 Азр Зег

1015

РЬе Ьуз

<210>	17
<211?	13
<212>	РКТ
<213>	Ното вархепв

<220>

<221>	т1зс_£еаЬиге
<223>	описание последовательности: нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВНЗ Βίά (ΒΗ3 Βϊά)

<400>17

Авп Не А1а Агд Ηϊε Ьеи А1а С1п Уа1 <31у Азр Зег МеС Авр Агд Зег

1015

11е Рго

<210?	13
; <211>	13
<212>	РКТ
<213?	Ното вархепв

<220>

<221>	т1зс_£еаСиге
<223>	описание последовательности: нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВНЗ Вт£ (ВНЗ Вт£)

- 37 013469 <400>18 αΐη 11е А1а Агд ьув Ьеи С1п Сув 11е А1а Авр С1п РЬе Шз Агд Ьеи

1015

Нхз Уа1 <210>19 <211> 18 <212> РКТ <213> Ното вархепв <220>

<221> т1вс_£еакиге <223> описание последовательности: нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВНЗ СР5/Нгк (ВНЗ ЬРБНгк)

<400> 19
Ьеи ТЬг А1а А1а	Агд Ьеи Ьуа А1а	11е <31у Авр	С1и Ьеи Ηϊβ С1п
1	5	10	15
ТЬг Мек

<210>	20
<211>	18
<212>	РКТ
<213>	Ното варίвиз
<220>
<221>	т!вс_£еасиге
<223>	списание последовательности:	нативная Ь-аминокислотная
	последовательность домена ВНЗ	Ваш (ВНЗ Βίιη)
<400>	20

Тгр Не А1а (31п <31и Ьеи Агд Агд 11е (31у Авр <31и РЬе Азп А1а Туг

10 15

- 38 013469

Туг А1а <210> 21 <211> 16 <212> РЕТ <213 > Ното зартепз <220>

<221> т1зс_£еаЬиге <223> описание последовательности: нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВИЗ Моха (ВНЗ Ноха) <400> 21

С1и Суз А1а ТЬг <31п Ьеи Агд Агд РЬе <Э1у Азр Ьуз Ьеи Азп РЬе Агд

10 15 <31п Ьуз <210> 22 <211> 18 <212> РЕТ <213> Ното зараепз <220>

<221> т±зс_£еаЬиге <223> описание последовательности: нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВНЗ РЦМА (ВНЗ РИМА) <400> 22

31и Не О1у А1а <31п Ьеи Агд Агд МеД А1а Азр Авр Ьеи Авп А1а <31п

10 15

Туг (31 и

- 39 013469

<210>	23
<211>	18
<212>	РКТ
<213>	Ното зарЬепз

<220>

<221>	т1зс_£еаСиге
<223>	описание последовательности: нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВНЗ Вах (ВНЗ Вах)

<400>23

Ьуз Ьеи Зег С1и Суз Ьеи Ьуз Агд 11е <31у Азр (Э1и Ьеи Азр Зег Азп

1015

МеС С1и <210>24 <211> 18 <2125- РКТ <213> Ното зархепэ <220>

<221> т1зс_£еаСиге <223> описание последовательности: нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВНЗ Вак (ВНЗ Вак) <400>24

С1п Уа1 <31у Агд С1п Ьеи А1а Не 11е <31у Азр Азр 11е Азп Агд Агд

1015

Туг Азр

<210>	25
<211>	18
<212>	РКТ
<213>	Ното зархепз

<220=·

<221?·	т1зс_£еакиге
<223>	описание последовательности: нативная Ь-аминокислотная последовательность домена ВНЗ Вок (ВНЗ Вок)

<400=·25 <31и Уа1 Суз ТЬг Уа1 Ьеи Ьеи Агд Ьеи С1у Азр С1и Ьеи Й1и С1п 11е

1015

Агд Рго

- 40 013469

Claims (14)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Слитый белок, включающий по меньшей мере один первый компонент (I), который содержит транспортирующую последовательность, и по меньшей мере один второй компонент (II), который содержит частичную или полноразмерную последовательность домена ВН3 белка ВН3-только Вок, где слитый белок содержит в своем компоненте (I) Ό-энантиомерные аминокислоты в ретроинвертированном порядке.
2. 2. Слитый белок по п.1, в котором по меньшей мере один первый компонент (I) и по меньшей мере один второй компонент (II) связаны ковалентной связью.
3. 3. Слитый белок по одному из пп.1 или 2, в котором компонент (I) содержит транспортирующую последовательность, направляющую слитый белок в определенное место в клетке.
4. 4. Слитый белок по одному из пп.1-3, в котором компонент (I) содержит транспортирующую последовательность, усиливающую включение клеткой слитого белка, прежде всего вследствие повышения способности проникать в клетку.
5. 5. Слитый белок по пп.1-4, в котором компонент (I) содержит транспортирующую последовательность, представляющую собой последовательность Ό-ТАТ белка ТАТ вируса иммунодефицита человека.
6. 6. Слитый белок по одному из пп.1-5, в котором компонент (I) содержит аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 1А (аминокислотная последовательность Ό-ТАТ: КККОКККККС) или на фиг. 1Б (родовая аминокислотная последовательность Ό-ТАТ: Хп- КККрККККК-Хп).
7. 7. Слитый белок по одному из пп.1-6, где компонент (II) которого содержит аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 4Л.
8. 8. Слитый белок по одному из пп.1-7, где частичная или полноразмерная последовательность домена ВН3 обладает способностью индуцировать апоптоз.
9. 9. Слитый белок по одному из пп.1-7, где частичная или полноразмерная последовательность домена ВН3 обладает способностью взаимодействовать по меньшей мере с одним белком семейства Вс1-2.
10. 10. Слитый белок по одному из пп.1-7, где частичная или полноразмерная последовательность домена ВН3 обладает способностью активировать или сенсибилизировать по меньшей мере один проапоптозный представитель семейства Вс1-2.
11. 11. Слитый белок по одному из пп.1-10, где частичная или полноразмерная последовательность домена ВН3 содержится в ее нативной форме, состоящей из Ь-аминокислот, или в ее инвертированной форме, состоящей из Ό-аминокислот.
12. 12. Фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок по одному из пп.1-11 и необязательно фармацевтически приемлемый носитель, адъювант и/или наполнитель.
13. 13. Применение слитого белка по одному из пп.1-11 для лечения и/или профилактики заболеваний, обусловленных нарушением апоптоза, рака, например лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, гистиоцитной лимфомы, различных типов рака головного мозга (глиобластомы), яичника, мочеполового тракта, ободочной кишки, печени, колоректального тракта, поджелудочной железы, молочной железы, предстательной железы, лимфатической системы, желудка, гортани и легкого, включая аденокарциному легкого и мелкоклеточный рак легкого, и/или рака кожи, например меланомы или немеланомного рака кожи, включая базально-клеточный рак и плоскоклеточный рак, а также псориаза, синдрома Бехчета, пузырчатки обыкновенной.
14. 14. Применение слитого белка по одному из пп.1-11 для приготовления фармацевтической композиции, предназначенной для лечения и/или профилактики заболеваний, обусловленных нарушением апоптоза, рака, например лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, гистиоцитной лимфомы, различных типов рака головного мозга (глиобластомы), яичника, мочеполового тракта, ободочной кишки, печени, колоректального тракта, поджелудочной железы, молочной железы, предстательной железы, лимфатической системы, желудка, гортани и легкого, включая аденокарциному легкого и мелкоклеточный рак легкого, и/или рака кожи, например меланомы или немеланомного рака кожи, включая базально-клеточный рак и плоскоклеточный рак, а также псориаза, синдрома Бехчета, пузырчатки обыкновенной.