KR101818809B1 - Bad 발현 촉진제를 포함하는 엡스타인-바 바이러스 감염증 치료용 조성물 - Google Patents

Bad 발현 촉진제를 포함하는 엡스타인-바 바이러스 감염증 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 BAD 발현 촉진제를 유효성분으로 포함하는 엡스타인-바 바이러스 감염증 치료용 조성물 및 BAD 발현 수준을 측정하여 엡스타인-바 바이러스 감염증 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 엡스타인-바 바이러스 감염 세포의 성장을 감소시키고 사멸을 증가시키는 동시에 항암제 감수성을 증가시킬 수 있다. 따라서 각종 암을 비롯한 EBV 감염으로 유발되는 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다. 또한 본 발명의 방법을 이용하면 효과적으로 엡스타인-바 바이러스 치료제를 스크리닝할 수 있다.

Description

BAD 발현 촉진제를 포함하는 엡스타인-바 바이러스 감염증 치료용 조성물{Composition for treating Epstein-Barr virus infection comprising a BAD expression promoter}
본 발명은 BAD 발현 촉진제를 포함하는 엡스타인-바 바이러스 감염증 치료용 조성물 및 BAD 발현 수준을 측정하여 엡스타인-바 바이러스 감염증 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus, 이하 EBV)는 인간의 감마-허피스 바이러스의 일종으로서 선열(granular fever)을 유발하며, 그 외에도 에이즈 감염 환자에서 나타나는 모상 백반증의 원인이 되며, 다발성 근염 및 피부근염, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염 등의 자가면역질환을 촉발시키는 것으로 알려져 있다. 또한 EBV는 버킷 림프종, 호지킨병, 비인두암, 비강 자연살해세포/T-세포 림프종 및 위암을 포함하는 다양한 악성종양을 유발하는 것으로도 알려져 있다.
EBV에 감염된 세포는 세포 성장이 증가하고 세포 사멸이 감소한다. 또한 EBV에 감염된 세포는 항암제에 내성을 나타낸다. 이러한 작용은 EBV가 감염 세포의 단백질 발현을 조절함으로써 발생하는 것으로 보고된 바 있으나, 구체적으로 EBV가 어떻게 해서 이러한 작용을 하는지에 대해서는 밝혀진 바 없다.
Aron R. Marquitz et al., Virology 412 (2011) 392-400, The Epstein-Barr Virus BART microRNAs target the pro-apoptotic protein Bim
본 발명은 BAD 발현 촉진제를 포함하는 엡스타인-바 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 조성물을 제공함을 목적으로 한다. 본 발명은 BAD 발현 수준을 측정하여 엡스타인-바 바이러스 감염증 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공함을 목적으로 한다. 본 발명은 miR-BART20-5p를 이용하여 엡스타인-바 바이러스 감염증 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공함을 목적으로 한다.
상기 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 BAD 발현 촉진제를 포함하는 엡스타인-바 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 엡스타인-바 바이러스 감염증은 선열, 모상 백반증, 다발성 근염 및 피부근염, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절, 암일 수 있다. 바람직하게는 상기 엡스타인-바 바이러스 감염증은 암일 수 있다. 상기 암은 엡스타인-바 바이러스 양성 버킷 림프종, 호지킨성 림프종, 비인두암, 비강 자연살해세포/T-세포 림프종 및 위암일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 암은 엡스타인-바 바이러스 양성 위암일 수 있다. 그러나 질환의 종류는 이에 제한되지 않으며, 엡스타인-바 바이러스 감염에 의해 촉발되는 질환은 모두 포함된다.
BAD는 세포사멸 조절 유전자(apoptotic regulator)인 Bcl-2 패밀리 중 프로아폽토틱 유전자(pro-apoptotic gene)인 BH3-only 그룹에 속하는 유전자이다. BH3-only 그룹에 속하는 유전자들과 엡스타인-바 바이러스 양성 암의 관계에 대해 보고된 바 있으나, BAD의 역할에 대해서 구체적으로 개시된 바 없을 뿐 아니라, 일부 문헌에서는 BAD는 엡스타인-바 바이러스 양성 암과 무관하다고 일관되게 기술하고 있었다. 본 발명자들은 엡스타인-바 바이러스 양성 위암에서 BAD의 발현이 억제되며, BAD 발현을 촉진시키면 세포 성장이 감소하고 세포 사멸이 증가하며 항암제 감수성이 증가한다는 것을 규명하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 BAD 발현 촉진제는 EBV가 생산하는 마이크로 RNA 중 하나인 miR-BART20-5p에 상보적으로 결합하여 miR-BART20-5p의 활성을 저해하는 핵산이 될 수 있다. 본 발명의 일 구현예로서, 상기 miR-BART20-5p 저해제는 5' nnnnnnnnnnnnnGCCUGCUn 3'(서열번호 1)을 포함하며 총 18 내지 28개, 예를 들어 21개 내지 25개의 핵산으로 이루어진 서열로서, miR-BART20-5p 저해 활성을 갖는 것이 될 수 있다. 서열번호 1에서 'GCCUGCU' 부분은 miR-BART20-5p에서 BAD 3' UTR에 결합하여 miR-BART20-5p의 활성을 나타내게 하는 핵심서열에 상보적인 부분에 해당한다. 또한 상기 miR-BART20-5p 저해제는 5' nnnnnnnAGnCnnGCCUGCUn 3'(서열번호 2)가 될 수 있다. 상기 서열번호 1 및 서열번호 2에서 n은 A, U, G, C 중 임의의 염기가 될 수 있다. 본 발명에서 U와 T는 서로 대체 가능(interchangeable)하게 사용된다. 바람직하게는 상기 miR-BART20-5p 저해제는 5' GGAAUGAAGACAUGCCUGCUA 3'(서열번호 3)으로 기재되는 miR-BART20-5p 안티센스 RNA일 수 있다. 본 발명의 miR-BART20-5p 저해제에는 친화력 및 안정성을 높이기 위한 다양한 변형이 부가될 수 있으며, 예를 들어 잠금핵산(Locked Nucleic Acid), 2' fluroro, 2'-O-methoxyethyl, 2'-O-methyl과 같은 당 변형, 또는 morpholino, phosphorothioate 결합과 같은 백본의 변형이 부가될 수 있다. 바람직하게는 잠금핵산 변형이 miR-BART20-5p 저해제에 이루어질 수 있다. 그러나 이러한 핵산의 변형은 당업계에 잘 알려져 있으며(예컨대 Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides, Jan Stenvang et al., Silence 2012, 3:1, 도 2 참조) 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 그러나 BAD 발현 촉진제의 종류는 이에 제한되지 않으며 BAD의 발현을 촉진하는 어떤 물질도 BAD 발현 촉진제가 될 수 있다.
또한 본 발명은 BAD 단백질을 유효성분으로 포함하는 엡스타인-바 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 BAD 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 7(5' mfqipefepseqedsssaerglgpspagdgpsgsgkhhrqapgllwdashqqeqptssshhggagaveirsrhssypagteddegmgeepspfrgrsrsappnlwaaqrygrelrrmsdefvdsfkkglprpksagtatqmrqssswtrvfqswwdrnlgrgssapsq 3')로 기재된다.
본 발명의 약학적 조성물은, 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 제제 형태는 액제, 현탁제, 유제, 점적제, 분산액, 에멀젼, 분말, 시럽, 즙, 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 크림, 로션, 연고, 겔, 패취, 분무제, 반창고 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.
본 발명의 조성물 중 상기 유효성분은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 내지 10 중량%로 함유되는 것이 바람직하다. 그러나 함량은 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물 또는 유효성분은 목적에 따라 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 피하, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로 등을 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 정맥내, 피하, 경피로 투여될 수 있다. 그러나 투여 경로는 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물에 있어서, 유효성분의 투여량은 체중 60 kg 성인기준으로 0.00001 mg/kg~50 mg/kg의 범위 내에서 조절할 수 있다. 다만, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 조성물 또는 유효성분을 치료학적으로 유효한 양으로 투여하여 엡스타인-바 바이러스 감염증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
여기에서 사용된 "치료학적으로 유효한 양"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 활성 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다.
본 발명은
1) 후보물질을 엡스타인-바 바이러스 양성 세포에 처리하는 단계;및
2) 상기 세포에서 BAD 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 엡스타인-바 바이러스 감염증 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 '엡스타인-바 바이러스 양성 세포'란 엡스타인-바 바이러스에 감염되어 있는 세포를 의미한다. 엡스타인-바 바이러스 양성 세포는 엡스타인-바 바이러스가 생산하는 miR-BART20-5p에 의해 세포의 BAD 발현이 저해되어 있으며, 이로 인하여 세포 성장이 증가하고 세포 사멸이 감소하며 항암제 감수성이 떨어져 항암제에 대해 내성을 보이는 특성이 있다. 따라서 본 발명의 스크리닝 방법에서 후보물질이 miR-BART20-5p의 효과를 억제 또는 상쇄하거나 기타 기전에 의하여 BAD 발현을 증가시키는 경우 그 후보물질을 엡스타인-바 바이러스 감염증 치료제로서 도출할 수 있다.
상기 2) 단계에서 BAD 발현 수준 측정은 BAD의 mRNA 수준을 측정하거나 BAD의 단백질 수준을 측정하는 것일 수 있다. BAD의 mRNA 수준은 cDNA 합성 후 정량적 PCR을 수행하여 측정할 수 있고, 정량적 역전사 PCR을 수행하여 측정할 수도 있고, 노던 블롯(northern blot)으로 측정할 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다. BAD의 단백질 수준은 웨스턴 블롯(western blot) 또는 ELISA를 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명은
1) 서열번호 4로 기재되는 miR-BART20-5p, 또는 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 기재되는 miR-BART20-5p 유사체를 세포에 처리하는 단계;
2) 후보물질을 상기 세포에 처리하는 단계;및
3) 상기 세포에서 BAD 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 엡스타인-바 바이러스 감염증 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 방법의 1) 단계에서, 상기 세포는 엡스타인-바 바이러스 양성 세포 또는 엡스타인-바 바이러스 음성 세포 모두 될 수 있다. 엡스타인-바 바이러스 양성 세포는 miR-BART20-5p을 내인적으로 생산하지만 추가적인 miR-BART20-5p 또는 그 유사체 처리에 의하여 BAD 발현이 더욱 억제될 수 있다. 엡스타인-바 바이러스 음성 세포는 miR-BART20-5p 또는 그 유사체 처리에 의하여 BAD 발현이 억제되어 본 발명의 스크리닝 방법에서 사용할 수 있다.
본 발명에서 'miR-BART20-5p'는 EBV가 생산하는 것 및 인공적으로 합성된 것을 포함하며 서열번호 4로 기재된다. 인공적으로 합성된 miR-BART20-5p로서 EBV가 생산하는 것과 완전히 동일한 서열을 갖는 것을 'miR-BART20-5p 모방체'라 한다. 또한 miR-BART20-5p와 같이 BAD 발현 억제 활성을 갖는 것으로서 5' nAGCAGGCnnGnCUnnnnnnn 3' (서열번호 5) 또는 5' nAGCAGGCnnnnnnnnnnnnn 3' (서열번호 6)의 서열을 갖는 것을 'miR-BART20-5p 유사체'라고 한다. 상기 서열번호 5와 6에서 n은 A, U, G, C 중 임의의 염기가 될 수 있다. 본 발명에서 U와 T는 서로 대체 가능(interchangeable)하게 사용된다. 상기 5' AGCAGGC 3'는 miR-BART20-5p의 5' 부분에 위치한 서열로서 BAD 3' UTR에 결합하여 miR-BART20-5p의 활성을 나타내게 하는 핵심서열이다. 따라서 이 서열을 포함하는 서열번호 6으로 기재되는 서열도 miR-BART20-5p와 마찬가지로 본 발명에서 사용될 수 있다.
본 발명은
1) 서열번호 8로 기재되는 BAD 3' UTR을 발현하는 세포에 miR-BART20-5p, 또는 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 기재되는 miR-BART20-5p 유사체를 처리하는 단계;
2) 상기 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및
3) 상기 세포에서 BAD 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 엡스타인-바 바이러스 감염증 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 1) 단계에서 BAD 3' UTR을 발현하는 세포는 상기 BAD 3' UTR에 리포터 유전자를 융합시킨 벡터를 전달시킨 세포주가 될 수 있다. 상기 BAD 3' UTR은 서열번호 8(5' UUCCCCCAGGCGCCUGCG 3')로 기재되는 서열일 수 있다. 그러나 서열번호 8 전체가 아니라 그 일부에 해당하는 5' GCCUGC 3'을 1 copy 이상 포함하는 서열만을 리포터 유전자에 융합시킨 벡터를 전달시킨 세포주 역시 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다.
상기 3) 단계에서 BAD 3' UTR이 발현되는지 여부는 BAD 3' UTR과 융합되어 있는 리포터 유전자의 발현 여부를 확인함으로써 알 수 있다. 상기 리포터 유전자는 레닐라 루시퍼라제를 비롯한 각종 루시퍼라제, GFP, RFP를 비롯한 각종 형광단백질 유전자, 페리틴 유전자, 트랜스페린 수용체 유전자 등이 될 수 있다. 그러나 리포터 유전자의 종류는 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 BAD 발현 촉진제를 유효성분으로 포함하는 엡스타인-바 바이러스의 항암제에 대한 내성(resistance) 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서 상기 BAD 발현 촉진제는 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3으로 기재되는 핵산일 수 있다. 그러나 BAD 발현 촉진제의 종류는 이에 제한되지 않으며, BAD 발현 촉진제가 될 수 있다.
본 발명은 BAD 단백질을 유효성분으로 포함하는 엡스타인-바 바이러스의 항암제에 대한 내성(resistance) 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 EBV의 항암제에 대한 감수성을 증가시켜 항암제에 의해 EBV 감염 세포가 사멸되는 것을 증가시킨다.
본 발명의 BAD 발현 촉진제를 유효성분으로 포함하는 엡스타인-바 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 조성물은 엡스타인-바 바이러스 감염 세포의 성장을 감소시키고 사멸을 증가시키는 동시에 항암제 감수성을 증가시킬 수 있다. 따라서 각종 암을 비롯한 EBV 감염으로 유발되는 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다. 또한 본 발명의 방법을 이용하면 효과적으로 엡스타인-바 바이러스 치료제를 스크리닝할 수 있다.
도 1은 마이크로어레이를 이용하여 AGS 세포주 및 AGS-EBV 세포주의 BAD mRNA 발현을 비교한 도이다.
도 2는 AGS 세포주 및 AGS-EBV 세포주의 BAD mRNA 수준을 real-time RT-PCR로 측정하여 비교한 도이다.
도 3은 EBV 음성 세포주들 및 EBV 양성 세포주들에서의 BAD 단백질 수준을 측정하여 비교한 도이다.
도 4의 상단은 BAD 유전자의 구조를 나타낸 모식도이며, target site는 miR-BART20-5p가 결합하는 BAD 3' UTR을 가리킨다. 도 4의 하단은 miR-BART20-5p에서 BAD 3' UTR 또는 돌연변이 BAD 3' UTR(BADm)과 seed match하는 부분을 표시한 도이다.
도 5는 miR-BART20-5p 또는 돌연변이 miR-BART20-5p(miR-BART20-5pm)이 BAD 3' UTR 또는 돌연변이 BAD 3' UTR(BADm)과 융합된 루시퍼라제를 전달한 HEK293 세포에서 루시퍼라제의 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 6은 miR-BART20-5p에 대한 안티센스 RNA(LNA-miR-BART20-5p(i)) 또는 control LNA가 BAD 3' UTR 또는 BADm과 융합된 루시퍼라제를 전달한 AGS-EBV 세포주에서 루시퍼라제의 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 7은 AGS 세포주에서 miR-BART20-5p, miR-BART20-5pm, 또는 siBAD가 BAD mRNA 수준에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 8은 AGS 세포주에서 miR-BART20-5p, miR-BART20-5pm, 또는 siBAD가 BAD 단백질 수준에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 9는 AGS 세포주에서 miR-BART20-5p, miR-BART20-5pm, 또는 siBAD가 세포 성장에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 10은 AGS 세포주에서 miR-BART20-5p, miR-BART20-5pm, 또는 siBAD가 세포 사멸에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 11은 LNA-miR-BART20-5p(i)가 EBV 양성 세포주들에서 BAD mRNA 수준에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 12는 LNA-miR-BART20-5p(i)가 EBV 양성 세포주들에서 BAD 단백질 수준에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 13은 AGS-EBV 세포주에 LNA-miR-BART20-5p(i)를 단독으로 또는 siBAD와 함께 전달했을 때 BAD mRNA 수준에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 14는 AGS-EBV 세포주에 LNA-miR-BART20-5p(i)를 단독으로 또는 siBAD와 함께 전달했을 때 BAD 단백질 수준에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 15는 AGS-EBV 세포주에 LNA-miR-BART20-5p(i)를 단독으로 또는 siBAD와 함께 전달했을 때 세포 성장에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 16은 AGS-EBV 세포주에 LNA-miR-BART20-5p(i)를 단독으로 또는 siBAD와 함께 전달했을 때 세포 사멸에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 17은 AGS 세포주에 miR-BART20-5p, miR-BART20-5pm, 또는 siBAD를 항암제인 5-FU와 함께 처리했을 때 세포 사멸에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 18은 AGS-EBV 세포주에 LNA-miR-BART20-5p(i) 또는 control LNA를 항암제인 5-FU와 함께 처리했을 때 세포 사멸에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 19는 AGS-EBV 세포주에 control LNA, LNA-miR-BART20-5p(i), 또는 LNA-miR-BART20-5p(i)와 siBAD를 전달한 경우 BRLF1, BZLF1 및 BAD 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 20은 siBRLF1/BZLF1가 BRLF1 및 BZLF1에 결합하는 부위를 나타낸 모식도이다.
도 21은 siBAD, siBRLF1/BZLF1이 각각 BAD, BRLF1, 및 BZLF1의 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 22는 BAD의 CDS를 포함하는 벡터 또는 BAD의 CDS와 3' UTR을 포함하는 벡터를 AGS-EBV 세포주에 전달한 경우 BAD, BRLF1, 및 BZLF1의 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 23의 A, B, C는 siBAD 및 siBRLF1/BZLF1가 각각 절단된 PARP 및 카스파제 3 발현에 미치는 영향을 확인한 도이고, 도 23의 D, E, F는 control LNA, LNA-miR-BART20-5p(i), 또는 LNA-miR-BART20-5p(i)와 siBAD를 각각 전달한 경우 절단된 PARP 및 카스파제 3 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 24의 A는 siCASP3가 BRLF1 및 BZLF1의 발현에 미치는 영향을 확인한 도이고, 도 24의 B는 LNA-miR-BART20-5p(i), 또는 LNA-miR-BART20-5p(i)와 siCASP3를 각각 전달한 경우 카스파제 3, BRLF1 및 BZLF1의 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 25의 A 및 C는 siBAD, siBRLF1/BZLF1, 또는 siBAD와 siBRLF1/BZLF1가 EBV의 자손 바이러스 생산에 미치는 영향을 확인한 도이고, 도 25의 B 및 D는 LNA-miR-BART20-5p(i), 또는 LNA-miR-BART20-5p(i)와 siBAD가 EBV의 자손 바이러스 생산에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 26은 miR-BART20-5p에 의한 BAD, 카스파제 3, BRLF1, BZLF1과 EBV의 용균성 생활사 유도의 조절 기전을 요약하여 나타낸 모식도이다.
이하에서 언급된 시약 및 용매는 특별한 언급이 없는 한 Sigma Aldrich® 로부터 구입한 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
제조예 . miR - BART20 -5p 및 안티센스 RNA 제작
제놀루션 사(서울, 대한민국)에 의뢰하여 EBV의 miR-BART-20-5p의 모방체(mimic)를 제작하였다. 또한 Exiqon 사(California, USA)에 의뢰하여 miR-BART-20-5p에 대한 안티센스 RNA를 제작하였다(이하 실시예 및 도면에서 'LNA-miR-BART20-5p(i)'라 지칭). 각각의 서열은 하기 표 1에 표시하였다.
[표 1]
Figure 112015071346179-pat00001
실시예 1. EBV 감염에 의한 BAD 발현 감소 확인
1-1. 마이크로어레이를 이용한 mRNA 발현 분석
(1) 세포주의 준비
EBV 음성 위암세포주인 AGS 세포주를 준비하고 소태아혈청(fetal bovine serum)을 10% 첨가한 RPMI1640(Gibco) 배지에 배양하였다. 또한 EBV를 감염시킨 AGS 세포주인 AGS-EBV 세포주를 소태아혈청(fetal bovine serum) 10%와 G418를 첨가한 RPMI1640(Gibco) 배지에 배양하여 준비하였다. 이하 AGS 세포주 및 AGS-EBV 세포주는 모두 이와 같은 방법으로 준비하였다.
(2) AGS - EBV 세포주에서의 BAD 발현 감소 확인
AGS 세포주 및 AGS-EBV 세포주에서 RNA를 추출하고 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통해 증폭하였다. 상기 증폭된 cDNA를 마이크로어레이(microarray)로 분석하여 상대적 강도를 확인하였다. mRNA 마이크로어레이 분석 결과는 도 1에서 그래프로 나타내었다. 도 1에서 AGS 세포주에서보다 AGS-EBV 세포주에서 BAD의 발현이 유의적으로 감소한 것을 알 수 있다.
1-2. 정량적 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 분석
상기 1-1의 결과가 EBV 감염에 의하여 나타난 것인지 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
(1) AGS - EBV 세포주에서의 BAD 발현 감소 확인
AGS 세포주 및 AGS-EBV 세포주를 준비하고, 각 세포주에서 RNA를 추출한 후 Moloney murine leukemia virus (M-MLV) reverse transcriptase (Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하고, 정량적 실시간 PCR(Quantitive Real Time-PCR)을 이용해 증폭하여 BAD의 mRNA 수준을 측정하였다. BAD의 mRNA 수준은 BAD CDS에 대한 하기 프라이머 서열을 이용하여 수행하였다.
[표 2]
Figure 112015071346179-pat00002
결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에서 AGS-EBV 세포주에서 AGS 세포주에서보다 BAD mRNA 수준이 약 60% 감소한 것을 확인할 수 있다.
(2) 기타 EBV 양성 위암 세포주에서의 BAD 발현 감소 확인
EBV 양성 위암 세포주들(AGS-EBV, SNU-719(한국세포주은행. 한국인의 위암 조직에서 분리한 세포주), YCCEL1)과 EBV 음성 위암 세포주들(MKN-1, MKN-45, SNU-484(한국세포주은행), AGS)을 준비하였다.
상기 세포주들로부터 단백질을 추출하고 웨스턴 블롯으로 단백질 수준을 측정하였다.
웨스턴 블롯 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에서 EBV 양성 위암 세포주들에서 EBV 음성 위암 세포주들과 비교하여 BAD 단백질 수준이 전반적으로 낮음을 확인할 수 있다.
상기 결과들로부터 EBV 감염에 의해 BAD의 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다.
실시예 2. miR - BART20 -5p가 BAD와 seed match 하는 부분 확인
EBV 감염 세포에서 BAD의 발현을 억제하는 물질로서 EBV가 생산하는 마이크로 RNA 중 하나인 miR-BART20-5p를 선발하였다.
그리고 miR-BART20-5p가 BAD의 어느 부분에 상보적으로 결합하는지 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
2-1. miR - BART20 -5p와 BAD 3' UTR의 seed match 부위 분석
BAD는 총 1240개 염기로 이루어진 유전자로서, miR-BART20-5p는 BAD의 3' UTR과 하기와 같이 seed match할 것으로 분석하였다. BAD 유전자의 구조 및 miR-BART20-5p의 target site인 BAD의 3' UTR에 대한 모식도는 도 4의 상단에 나타내었다.
miR-BART20-5p는 BAD의 3' UTR과 하기와 같이 seed match 할 것으로 분석하였다.
Figure 112015071346179-pat00003
2-2. 돌연변이 miR - BART20 -5p 제작
miR-BART20-5p의 5' 말단에서 4번째 내지 6번째 뉴클레오티드에 해당하는 부분이 달라지면 BAD와 결합하지 못할 것으로 예상하였다. 따라서 이 부분의 서열을 5' CAG 3'에서 5' GUC 3'으로 변형(하기 표에서 진한 글씨 및 밑줄로 표시)한 돌연변이 마이크로 RNA를 제작하고 miR-BART20-5pm으로 명명하였다. miR-BART20-5pm의 서열은 하기 표 3과 같다.
[표 3]
Figure 112015071346179-pat00004
miR-BART20-5p의 서열과 miR-BART20-5pm의 서열을 비교하면 하기와 같다.
Figure 112015071346179-pat00005
2-3. 루시퍼라제 리포터 어세이를 이용한 seed match 부분 확인
(1) BAD 3' UTR을 포함하는 플라스미드 제작
BAD 3' UTR에 해당하는 서열을 프라이머 쌍을 이용하여 증폭하였다.
증폭된 BAD 3' UTR을 루시퍼라제 리포터 벡터인 psiCHECK-2 플라스미드(Promega)의 레닐라 루시퍼라제 암호화 서열(Renilla luciferase coding sequence)과 poly(A) 테일 사이에 있는 XhoⅠ/NotⅠ사이에 클로닝하여 psiC-BAD 플라스미드로 명명하였다.
사용한 프라이머의 서열은 하기 표 4와 같다.
[표 4]
Figure 112015071346179-pat00006
(2) 돌연변이 BAD 3' UTR 서열 제작
BAD 3' UTR(서열번호 8)에서 5' 말단에서 14번째 및 17 내지 19번째 염기에 돌연변이를 일으키면 miR-BART20-5p와의 결합이 저해될 것으로 분석하였다. 따라서 EZchange™ 위치지정 돌연변이 키트(Enzynomics)를 사용하여 상기 (1)에서 제작한 psiC-BAD 플라스미드를 template로 하여 BAD 3' UTR에서 5' 말단에서 14번째 및 17 내지 19번째 염기에 돌연변이를 일으킨 BAD 3' UTR(서열번호 14, 5' UUCCCCCAGGC C CC ACG G 3', 이하 BADm)를 포함하는 플라스미드(psic-BADm 플라스미드)를 합성하였다.
miR-BART20-5p와 BAD 3' UTR 및 BADm의 seed match 모식도에 대해서는 도 4 하단에 나타내었다.
사용한 프라이머의 서열은 하기 표 5와 같다.
[표 5]
Figure 112015071346179-pat00007
(3) 루시퍼라제 어세이를 이용한 seed match 부분 확인
인체배아신장세포주인 HEK293T 세포주를 소태아혈청(fetal bovine serum) 10%를 첨가한 DMEM(Gibco) 배지에 배양하여 준비하였다.
miR-BART20-5p 모방체, miR-BART20-5pm, 또는 scrambled control(서열번호 17, 5' ACGUGACACGUUCGGAGAAUU 3', 제놀루션 사에서 구입. 이하 scrambled control은 모두 동일함)과 함께, psiC-BAD 플라스미드, psiC-BADm 플라스미드, 또는 psiCHECK 플라스미드(유전자를 삽입하지 않은 psiCHEK-2 플라스미드)를 상기 HEK293세포주에 공동 전달시켰다. 세포주를 48시간 동안 배양한 후에 Dual-Glo 루시퍼라제 리포터 어세이(Promega)를 사용해서 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
결과는 도 5에 나타내었다. 도 5의 검은색 막대 그래프들로부터 miR-BART20-5p 모방체가 루시퍼라제 활성을 억제하나 돌연변이 루시퍼라제 활성을 억제하지 못하는 것을 알 수 있다. 또한 도 5의 회색 막대 그래프들로부터 miR-BART20-5pm이 루시퍼라제 활성을 억제하지 못하는 것을 알 수 있다.
상기 결과로부터 miR-BART20-5p는 BAD 유전자의 3' UTR에 결합하며, miR-BART20-5p에서 5' 말단에서 4번째 내지 6번째 뉴클레오티드에 해당하는 5' CAG 3'가 BAD 3' UTR과의 결합에 필수적으로 요구되는 부분임을 확인하였다.
(4) 루시퍼라제 어세이를 이용한 내인적으로 발현되는 miR - BART20 -5p의 효과 확인
EBV 양성 위암 세포주인 AGS-EBV 세포주를 준비하였다. AGS-EBV 세포주에서는 내인적으로 miR-BART20-5p가 발현되므로, 내인적으로 발현되는 miR-BART20-5p가 seed match하는 부분을 확인하고자 하였다. 한편, LNA-miR-BART20-5p(i)에 의해 내인적으로 발현되는 miR-BART20-5p의 BAD에 대한 결합이 저해되는지 여부도 확인하고자 하였다. LNA-miR-BART20-5p(i)에 대한 대조군으로는 control LNA(서열번호 18, TAACACGTCTATACGCCCA, Exiqon)를 사용하였다.
상기 psiC-BAD 플라스미드, psiC-BADm 플라스미드, 또는 psiCHECK 플라스미드를 LNA-miR-BART20-5p(i) 또는 control LNA와 함께 AGS-EBV 세포주에 전달하였다. 세포주를 48시간 동안 배양한 후에 Dual-Glo 루시퍼라제 리포터 어세이(Promega)를 사용해서 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
결과는 도 6에 나타내었다. 도 6에서 control LNA가 함께 전달된 경우 psic-BAD의 루시퍼라제 활성은 감소되나 psiC-BADm의 루시퍼라제 활성은 감소되지 않는 것을 알 수 있는데, 이로부터 AGS-EBV 세포주에서 내인적으로 발현되는 miR-BART20-5p가 BAD의 3' UTR에 결합하나 BADm에는 결합하지 못함을 알 수 있다.
반면 도 6에서 LNA-miR-BART20-5p(i)가 함께 전달된 경우 psic-BAD의 루시퍼라제 활성도 감소되지 않는 것을 알 수 있다. 이로부터 LNA-miR-BART20-5p(i)가 miR-BART20-5p가 BAD의 3' UTR에 결합하는 것을 저해함을 알 수 있다.
실시예 3. miR - BART20 -5p가 BAD 발현, 세포 성장 및 사멸에 미치는 영향 확 인
miR-BART20-5p가 BAD 발현, 세포 성장 또는 세포 사멸에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다. miR-BART20-5p의 효과와 비교하기 위하여 BAD에 대한 siRNA(이하 siBAD)(서열번호 19, 5' GUACUUCCCUCAGGCCUAU 3', Genolution Pharmaceuticals에서 구입)를 사용하였다. 한편 대조군으로 scrambled control을 사용하였다.
3-1. miR - BART20 -5p가 BAD의 발현에 미치는 영향 확인
(1) BAD mRNA 감소 확인
AGS 세포주에 miR-BART20-5p 모방체, miR-BART20-5pm, siBAD 또는 scrambled control을 각각 30 nM씩 Lipofectamin 2000 (Invitrogen)으로 전달하였다. 48시간 동안 배양한 후 RNA를 추출하고 Moloney murine leukemia virus (M-MLV) reverse transcriptase (Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하고, 정량적 실시간 PCR로 증폭하여 mRNA 수준을 측정하였다.
결과는 도 7에 나타내었다. 도 7에서 miR-BART20-5p 모방체 또는 siBAD를 처리한 경우에는 BAD mRNA 수준이 감소하나, miR-BART20-5pm을 처리한 경우에는 이러한 효과가 나타나지 않는 것을 알 수 있다.
(2) BAD 단백질 감소 확인
AGS 세포주에 miR-BART20-5p 모방체, miR-BART20-5pm, siBAD, 또는 scrambled control을 각각 30 nM씩 Lipofectamin 2000 (Invitrogen)으로 전달하였다. 48시간 동안 배양한 후 단백질을 추출하고 웨스턴 블롯으로 단백질 수준을 측정하였다.
웨스턴 블롯 결과는 도 8의 A에 나타내었고, 이를 도 8의 B에 그래프로 나타내었다. 도 8에서 miR-BART20-5p 모방체 또는 siBAD를 처리한 경우에는 BAD 단백질 수준이 감소하나, miR-BART20-5pm을 처리한 경우에는 이러한 효과가 나타나지 않는 것을 알 수 있다.
3-2. miR - BART20 -5p가 세포 성장에 미치는 영향 확인
AGS 세포주에 miR-BART20-5p 모방체, miR-BART20-5pm, siBAD, 또는 scrambled control을 각각 30 nM씩 Lipofectamin 2000으로 전달하였다. 전달 후 24시간마다 CCK-8(Dojindo Molecular Technologies)으로 세포 성장을 측정하였다.
결과는 도 9에 나타내었다. 도 9에서 miR-BART20-5p 모방체 또는 siBAD를 처리한 경우 miR-BART20-5pm 또는 scrambled control을 처리한 경우보다 O.D 값이 높게 나타나는 것을 알 수 있다. 즉, miR-BART20-5p 또는 siBAD에 의해 BAD 발현이 억제되어 세포 성장이 증가함을 알 수 있다.
3-3. miR - BART20 -5p가 세포 사멸( apoptosis )에 미치는 영향 확인
AGS 세포주에 miR-BART20-5p 모방체, miR-BART20-5pm, siBAD, 또는 scrambled control을 각각 30 nM씩 Lipofectamin 2000 (Invitrogen)으로 전달하였다. 48시간 동안 배양한 후 Annexin V로 염색하고 유세포 분석기로 분석하였다.
결과는 도 10A에 나타내고, 이를 도 10B에 그래프로 나타내었다. 도 10A 및 B에서 miR-BART20-5p 모방체 또는 siBAD를 처리한 경우 miR-BART20-5pm 또는 scrambled control을 처리한 경우보다 사멸 세포의 수가 감소하였음을 알 수 있다.
상기 결과로부터 miR-BART20-5p는 BAD 발현을 억제하여 BAD mRNA 수준 및 BAD 단백질 수준을 감소시키며, 세포 성장을 증가시킬 뿐 아니라 이와 동시에 세포 사멸도 억제시킴을 확인할 수 있다. 또한 miR-BART20-5pm은 이러한 효과를 갖지 않는 것으로부터 miR-BART20-5p에서 5' 말단에서 4번째 내지 6번째 뉴클레오티드에 해당하는 5' CAG 3'가 이러한 작용에 필수적임을 유추할 수 있다.
실시예 4. LNA- miR - BART20 -5p(i)가 BAD 발현, 세포 성장 및 사멸에 미치는 영향 확인
4-1. LNA- miR - BART20 -5p(i)가 BAD의 발현에 미치는 영향 확인
miR-BART20-5p에 대한 안티센스 RNA인 LNA-miR-BART20-5p(i)에 의하여 BAD 발현이 증가될 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. LNA-miR-BART20-5p(i)에 대한 대조군으로 control LNA를 사용하였다.
(1) BAD mRNA 증가 확인
EBV 양성 위암 세포주인 AGS-EBV 세포주, 및 한국인의 위암 조직에서 분리한 위암 세포주인 SNU-719 세포주 및 YCCEL1 세포주를 준비하였다. 각 세포주에 LNA-miR-BART20-5p(i) 또는 control LNA를 각각 50 nM씩 전달하고 48시간 동안 배양한 후, RNA를 추출하고 Moloney murine leukemia virus (M-MLV) reverse transcriptase (Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 합성하고, 정량적 실시간 PCR로 증폭하여 mRNA 수준을 측정하였다.
결과는 도 11에 나타내었다. 도 11에서 AGS-EBV 세포주 및 SNU-719, YCCEL1 세포주 모두에서 LNA-miR-BART20-5p(i)를 처리한 경우 control LNA를 처리한 경우보다 약 80% 이상 mRNA 수준이 증가한 것을 알 수 있다.
상기 결과로부터 LNA-miR-BART20-5p(i)가 EBV 감염 세포주에서 BAD mRNA를 증가시킴을 알 수 있다.
(2) BAD 단백질 증가 확인
EBV 양성 위암 세포주인 AGS-EBV 세포주 및 SNU-719, YCCEL1 세포주를 준비하였다. 각 세포주에 LNA-miR-BART20-5p(i) 또는 control LNA를 각각 50 nM씩 전달하고 48시간 동안 배양한 후, 단백질을 추출하고 웨스턴 블롯으로 BAD 단백질의 양을 측정하였다.
웨스턴 블롯 결과는 도 12A에 나타내었고, 이를 도 12B에서 그래프로 나타내었다. 도 12A 및 B에서 에서 AGS-EBV 세포주에 LNA-miR-BART20-5p(i)를 처리한 경우 control LNA를 처리한 경우보다 약 120% BAD 단백질 수준이 증가하고, SNU-719 세포주에 LNA-miR-BART20-5p(i)를 처리한 경우 control LNA를 처리한 경우보다 약 80% BAD 단백질 수준이 증가함을 알 수 있다. YCCEL1 세포주에 LNA-miR-BART20-5p(i)를 처리한 경우 control LNA를 처리한 경우보다 약 120% BAD 단백질 수준이 증가하는 결과를 보였다.
상기 결과로부터 LNA-miR-BART20-5p(i)가 EBV 감염 세포주에서 BAD 발현을 증가시킴을 알 수 있다.
4-2. siBAD에 의한 LNA- miR - BART20 -5p(i)의 BAD 발현 촉진 효과 저해 확인
상기 4-1에서 확인한 LNA-miR-BART20-5p(i)의 BAD 발현 촉진 효과가 siBAD에 의해 저해되는지 여부를 확인하였다.
AGS-EBV 세포주에 LNA-miR-BART20-5p(i) 50 nM과 siBAD 30 nM을 co-transfection하고, 상기 4-1과 동일한 방법으로 BAD mRNA 및 BAD 단백질 수준을 측정하였다.
결과는 도 13 및 도 14에 나타내었다. 도 13에서 LNA-miR-BART20-5p(i)의 BAD mRNA 증가 효과가 siBAD에 의해 상쇄된 것을 알 수 있다. 또한 도 14에서 LNA-miR-BART20-5p(i)의 BAD 단백질 증가 효과가 siBAD에 의해 상쇄된 것을 알 수 있다.
4-3. LNA- miR - BART20 -5p(i)가 세포 성장에 미치는 영향 확인
AGS-EBV 세포주에 LNA-miR-BART20-5p(i), 또는 control LNA를 각각 50 nM씩 Lipofectamin 2000 (Invitrogen)으로 전달하였다. 또한 다른 그룹의 AGS-EBV 세포주에 LNA-miR-BART20-5p(i) 50 nM과 siBAD 30 nM을 co-transfection 시켰다.
전달 후 24시간마다 후 CCK-8 (Dojindo Molecular Technologies)로 세포 성장을 측정하였다.
결과는 도 15에 나타내었다. 도 15에서 LNA-miR-BART20-5p(i)를 처리한 경우 control LNA를 처리한 경우보다 유의하게 세포 성장이 감소하나, control LNA를 처리한 경우에는 이러한 효과가 나타나지 않음을 알 수 있다. LNA-miR-BART20-5p(i)와 siBAD를 co-transfection한 경우에는 세포 성장이 감소되지 않았다.
상기 결과로부터 LNA-miR-BART20-5p(i)가 AGS-EBV 세포주에서 생산되는 miR-BART20-5p의 작용을 억제하여 세포 성장을 감소시킴을 확인할 수 있다. 또한 siBAD에 의해 LNA-miR-BART20-5p(i)의 효과가 상쇄된 것으로부터 LNA-miR-BART20-5p(i)는 BAD 발현을 촉진함으로써 세포 성장을 감소시킴을 알 수 있다.
4-4. LNA- miR - BART20 -5p(i)가 세포 사멸에 미치는 영향 확인
AGS-EBV 세포주에 LNA-miR-BART20-5p(i) 또는 control LNA를 각각 50 nM씩 Lipofectamin 2000(Invitrogen)으로 전달하였다. 또한 다른 그룹의 AGS-EBV 세포주에 LNA-miR-BART20-5p(i) 50 nM과 siBAD 30 nM을 co-transfection 시켰다.
48시간 동안 배양한 후 Annexin V로 염색하고 유세포 분석기로 분석하였다.
결과는 도 16A에 나타내고, 이를 도 16B에 그래프로 나타내었다. 도 16A 및 B에서 LNA-miR-BART20-5p(i)를 전달한 세포에서 사멸 세포의 수가 유의하게 증가하나, control LNA를 처리한 경우에는 이러한 효과가 나타나지 않음을 알 수 있다.
또한 LNA-miR-BART20-5p(i)와 siBAD를 co-transfection 한 경우에는 사멸 세포의 수가 증가되지 않았다.
상기 결과로부터 LNA-miR-BART20-5p(i)가 AGS-EBV 세포주에서 생산되는 miR-BART20-5p의 작용을 억제하여 세포 성장을 감소시킬 뿐 아니라 세포 사멸을 증가시킴을 확인할 수 있다. 또한 siBAD에 의해 LNA-miR-BART20-5p(i)의 효과가 상쇄된 것으로부터 LNA-miR-BART20-5p(i)는 BAD 발현을 촉진함으로써 세포 사멸을 증가시킴을 알 수 있다.
실시예 5. miR - BART20 -5p가 항암제 내성에 미치는 영향 확인
직경 100mm 세포배양 용기에 키운 AGS 세포주에 miR-BART20-5p 모방체, scrambled control, miR-BART20-5pm, 또는 siBAD를 각각 30 nM씩 Lipofectamin 2000를 이용하여 전달한 후, 37℃ 세포 배양기에서 24시간 배양하였다. DMSO에 100 mM이 되도록 녹인 항암제인 5-FU (Sigma-Aldrich) 0.1 μl를 10 ml 세포배양액에서 키운 상기 세포들에 처리하여 5-FU의 최종 농도가 1 μM이 되도록 한 다음 48시간 동안 37℃ 세포 배양기에서 배양하였다. 비교를 위하여 10 ml 세포배양액에서 키운 상기 세포들에 DMSO 만 0.1 ul씩 처리한 후 상기와 동일하게 배양하여 대조군으로 사용하였다. PE Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences)를 이용하여, 상기 각 세포들을 Annexin V로 염색한 후 유세포 분석기로 분석하였다.
결과는 도 17A 및 도 17B에 나타내었다. 도 17에서 scrambled control을 처리한 경우 및 miR-BART20-5pm을 처리한 경우에는 DMSO를 처리한 경우보다 5-FU를 처리한 경우 사멸 세포의 수가 크게 증가하여 5-FU가 세포 사멸을 유발하며 이러한 작용에 scrambled control을 처리한 경우 및 miR-BART20-5pm은 영향을 주지 못함을 알 수 있다. 그러나 siBAD를 처리한 경우에는 5-FU를 처리했음에도 불구하고 사멸 세포의 수가 DMSO를 처리한 것과 비슷한 수준으로 나타났으므로 BAD의 발현이 억제되면 항암제에 대한 내성이 유발됨을 알 수 있다. miR-BART20-5p 모방체를 처리한 경우에도 siBAD를 처리한 경우와 마찬가지로 5-FU를 처리했음에도 불구하고 사멸 세포의 수가 DMSO를 처리한 것과 비슷한 수준으로 나타났는데, 상기 결과로부터 miR-BART20-5p 모방체가 siBAD와 마찬가지로 BAD의 발현을 억제하여 항암제에 대한 내성을 유발함을 알 수 있다.
실시예 6. LNA- miR - BART20 -5p(i)가 항암제 내성에 미치는 영향 확인
AGS-EBV 세포주에 LNA-miR-BART20-5p(i) 또는 control LNA를 각각 50 nM씩 Lipofectamin 2000 (Invitrogen)를 이용하여 전달한 후, 37℃ 세포 배양기에서 배양하였다. 24시간 후 상기 각 세포들에 DMSO 또는 항암제인 5-FU (Sigma-Aldrich)를 DMSO에 5-FU의 최종 농도가 1 μM이 되도록 희석한 용액 10ml을 처리하고 48시간 동안 37℃ 세포 배양기에서 배양하였다. PE Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences)를 이용하여, 상기 각 세포들을 Annexin V로 염색한 후 유세포 분석기로 분석하였다.
결과는 도 18A 및 도 18B에 나타내었다. 도 18에서 DMSO를 처리한 경우보다 5-FU를 처리한 경우 사멸 세포의 수가 증가하며, control LNA를 처리한 경우보다 LNA-miR-BART20-5p(i)를 처리한 경우 사멸 세포의 수가 더욱 유의하게 증가함을 알 수 있다.
상기 결과로부터 LNA-miR-BART20-5p(i)가 EBV 감염 세포에서 항암제에 대한 감수성을 증가시킴을 알 수 있다.
실시예 7. BRLF1 , BZLF1 및 BAD 발현 간의 관계
7-1. 용균성 생활사가 유도된 경우 LNA- miR - BART20 -5p(i)가 BRLF1 , BZLF1 및 BAD 발현에 미치는 영향
BRLF1 및 BZLF1은 EBV의 용균성 생활사의 유도에 결정적인 역할을 하는 즉시 초기 유전자(immediate early gene)이다. miR-BART20-5p는 BRLF1 및 BZLF1의 3' UTR에 결합하여 BRLF1 및 BZLF1의 발현을 억제하여 EBV를 잠복성 생활사에 머무르게 한다. BRLF1, BZLF1 및 BAD 발현 간의 관계를 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
AGS-EBV 세포주를 3개 군으로 나누고 각각에 control LNA, LNA-miR-BART20-5p(i), 또는 LNA-miR-BART20-5p(i)와 siBAD를 각각 50 nM씩 Lipofectamin 2000으로 전달하였다. 그 후 공지의 용균성 생활사 유도 물질인 TPA(12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate)를 5 nM 농도로 48시간 동안 처리하여 용균성 생활사를 유도하고, RNA와 단백질을 추출하여, 가장 초기에 발현되는 용균성 유전자인 BRLF1 및 BZLF1, 그리고 아폽토시스를 유도하는 단백질인 BAD의 발현을 정량적 실시간 PCR 및 웨스턴 블롯을 이용하여 관찰하였다.
결과는 도 19의 A 내지 C에 나타내었다. 도 19의 A 내지 C에서 control LNA를 처리한 경우보다 LNA-miR-BART20-5p(i)를 처리한 경우 BRLF1, BZLF1 및 BAD의 mRNA 및 단백질 발현 수준이 증가하나, siBAD를 함께 처리한 경우 BAD 뿐 아니라 BRLF1 및 BZLF1의 mRNA 및 단백질 발현 수준 역시 Control LNA를 처리한 경우와 같은 수준으로 현저히 감소함을 확인할 수 있다.
상기 결과는 EBV의 용균성 생활사에서 BRLF1 및 BZLF1의 발현은 BAD의 발현을 전제로 하거나 또는 BAD에 의해 매개됨을 암시한다.
7-2. BAD 발현과 BRLF1 및 BZLF1 발현의 선후관계 확인
BRLF1 및 BZLF1의 발현과 BAD의 발현의 선후관계를 확인하기 위해 하기 실험을 수행하였다.
도 20에 나타난 바와 같이, BZLF1 및 BRLF1에 모두 결합하여 두 유전자의 발현을 모두 억제할 수 있는 siRNA(이하 siBZLF1/BRLF1)(5'-CGACATAACCCAGAATCAACA-3')를 제조하였다.
먼저, AGS-EBV 세포주에 DMSO 또는 TPA를 처리하고 BRLF1, BZLF1, BAD의 mRNA 및 단백질 수준을 정량적 실시간 PCR 및 웨스턴 블롯으로 각각 확인하였다(도 21의 A, B, C 각각의 좌측 도). 그 결과 TPA 처리에 의해 용균성 생활사가 유도되어 BRLF1 및 BZLF1의 mRNA 및 단백질 수준이 증가함을 크게 증가함을 확인하였고, BAD의 mRNA 및 단백질 수준이 감소함을 확인하였다. BAD가 감소한 것은 용균성 생활사 유도시 miR-BART20-5p의 발현이 증가하게 되어 miR-BART20-5p의 타겟 유전자인 BAD가 감소하기 때문인 것으로 보인다.
또한 AGS-EBV 세포주를 4개 군으로 나누어, 1개 군에는 scrambled control을 전달하고, 1개 군에는 siBAD를 전달하고, 1개 군에는 siBRLF1/BZLF1를 전달하고, 1개 군에는 siBAD와 siBRLF1/BZLF1를 함께 전달하였다. 그 후 각 군에 TPA를 처리하여 용균성 생활사를 유도하였다. 그리고 RNA를 추출하여 정량적 실시간 PCR로 확인하고, 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯을 한 결과, 도 21의 A, B, C 각각의 우측 도에 나타난 바와 같이, siBRLF1/BZLF1를 전달한 경우 BRLF1 및 BZLF1의 mRNA 및 단백질 발현은 감소하지만 BAD의 발현은 감소하지 않는데, siBAD를 전달한 경우, BAD는 물론 BRLF1 및 BZLF1의 mRNA 및 단백질 발현도 감소함을 알 수 있었다. 상기 결과로부터 BAD의 발현이 억제되면 BRLF1 및 BZLF1의 발현도 억제되지만, BRLF1 및 BZLF1의 발현 억제가 BAD의 발현을 억제시키지는 않음을 확인하였다.
7-3. BAD 과발현시 BRLF1 및 BZLF1 발현에 미치는 영향 확인
상기 결과를 보다 구체적으로 확인하기 위하여, BAD가 과발현되었을 때 BRLF1 및 BZLF1의 발현에 어떤 영향이 있는지 확인하였다.
먼저, BAD 유전자의 코딩 서열(CDS)을 포함하는 벡터(이하 pCEP4-BAD-CDS 벡터), 및 BAD 유전자의 코딩 서열과 3'-UTR을 포함하는 벡터(이하 pCEP4-BAD-CDS+3'-UTR 벡터)를 각각 제작하였다. 대조군으로 pCEP4 벡터를 제조하였다. 벡터가 잘 제작되었는지 확인하기 위해, 상기 벡터를 각각 AGS-EBV 세포주에 전달한 후, RNA와 단백질을 추출하여, BRLF1, BZLF1, BAD의 발현을 정량적 실시간 PCR 및 웨스턴 블롯을 이용하여 관찰하였다. 그 결과, 예상했던 바와 같이 pCEP4-BAD-CDS 벡터를 전달한 세포에서 pCEP4 벡터를 전달한 경우보다 BAD의 mRNA 및 단백질 발현이 모두 유의하게 증가하고, pCEP4-BAD-CDS+3'-UTR 벡터를 전달한 경우 pCEP4-BAD 벡터를 전달한 경우보다는 BAD의 mRNA 및 단백질 발현이 증가하지만 pCEP4-BAD-CDS 벡터를 전달한 경우보다는 증가 정도가 낮은 것을 확인하였다(도 20의 A). 이는 pCEP4-BAD-CDS+3'-UTR 벡터의 경우 pCEP4-BAD-CDS 벡터와는 달리 BAD의 3' UTR 부분을 가지고 있어 AGS-EBV 세포주에서 발현되는 miR-BART20-5p에 의한 발현 억제를 받기 때문인 것으로 생각된다. 또한 각 세포의 성장을 O.D를 관찰하여 확인한 결과, pCEP4-BAD-CDS 벡터를 전달한 경우 BAD의 작용에 의해 pCEP4 벡터를 전달한 대조군보다 세포 성장이 감소하고, pCEP4-BAD-CDS+3'-UTR 벡터를 전달한 경우 pCEP4 벡터를 전달한 대조군보다 세포 성장이 감소하지만 pCEP4-BAD-CDS 벡터를 전달한 대조군보다는 감소하지 않은 것을 확인하였다(도 20의 B). 따라서 각 벡터가 잘 제작되었음을 알 수 있었다.
상기 각 세포주에 TPA를 처리하여 용균성 생활사 상태를 유도한 후, RNA 및 단백질을 추출하여 정량적 실시간 PCR 및 웨스턴 블롯으로 BRLF1, BZLF1, 및 BAD의 mRNA 및 단백질 발현을 관찰한 결과, pCEP4-BAD-CDS 벡터를 전달한 경우, BAD는 물론 BRLF1 및 BZLF1 역시 mRNA 및 단백질 발현이 pCEP4 벡터를 전달한 대조군보다 증가하고, pCEP4-BAD-CDS+3'-UTR 벡터를 전달한 경우 pCEP4 벡터를 전달한 대조군보다는 증가하지만 pCEP4-BAD-CDS 벡터를 전달한 경우보다는 증가하지 않음을 확인하였다(도 22의 C, D, E). 상기 결과로부터 BAD 발현이 증가되면 BRLF1과 BZLF1의 발현 역시 증가함을 알 수 있었다.
7-4. BAD 발현이 BRLF1 및 BZLF1 발현을 조절하는 기전 확인
AGS-EBV 세포주를 준비하고, 4개 군으로 나누어 Lipofectamin 2000으로 1개 군에는 scrambled control을 전달하고, 1개 군에는 siBAD를 전달하고, 1개 군에는 siBZLF1/BRLF1을 전달하고, 1개 군에는 siBAD와 siBZLF1/BRLF1을 전달하였다. 그 후 48시간 동안 TPA를 처리하여 용균성 생활사를 유도한 후, 단백질을 추출하고, 웨스턴 블롯으로 세포사멸(apoptosis)과 관련된 유전자인 PARP, 절단된 PARP(cleaved PARP)와, PARP의 4개 도메인 중 DNA-결합 도메인인 caspase-cleaved domain을 절단하여 PARP를 활성화시키는 효소인 카스파제 3(Caspase 3)을 확인하였다.
그 결과, siBAD가 전달된 세포는 scrambled control이 전달된 세포보다 절단된 PARP 및 카스파제 3가 감소되나, siBZLF1/BRLF1를 전달한 경우 절단된 PARP 및 카스파제 3의 발현에 영향을 주지 않는 것으로 확인하였다(도 23의 A, B, C). 상기 결과로부터 절단된 PARP 및 카스파제 3의 발현은 BRLF1과 BZLF1의 발현에 의해 직접적으로 조절되는 것이 아님을 알 수 있었다.
또한 AGS-EBV 세포주를 3개 군으로 나누고 Lipofectamin 2000으로 1개 군에는 control LNA, 1개 군에는 LNA-miR-BART20-5p(i), 또는 LNA-miR-BART20-5p(i)와 siBAD를 전달하고, 48시간 동안 TPA를 처리하여 용균성 생활사를 유도한 경우, LNA-miR-BART20-5p(i)가 control LNA와 비교하여 절단된 PARP와 카스파제 3의 단백질 수준을 증가시켰다. 그러나 siBAD를 LNA-miR-BART20-5p(i)와 함께 전달한 경우 이러한 효과가 나타나지 않았는데, 이는 siBAD가 LNA-miR-BART20-5p(i)의 작용을 상쇄하기 때문으로 생각되었다(도 23의 D, E, F).
상기 결과를 확인하기 위하여, AGS-EBV 세포주에 scrambled control 또는 카스파제 3에 대한 siRNA(이하 siCASP3)를 전달한 후에 48시간 동안 TPA를 처리하여 용균성 생활사를 유도하였다. 그 후 RNA를 추출하여 정량적 실시간 PCR로 카스파제 3, BRLF1, BZLF1의 발현을 확인한 결과, 카스파제 3 발현이 억제되면 BRLF1 및 BZLF1 발현이 감소함을 알 수 있었다(도 24의 A). 또한 AGS-EBV 세포주를 3개 군으로 나누고 Lipofectamin 2000으로 1개 군에는 control LNA, 1개 군에는 LNA-miR-BART20-5p(i), 또는 LNA-miR-BART20-5p(i)와 siCASP3를 전달하고, 48시간 동안 TPA를 처리하여 용균성 생활사를 유도한 경우, LNA-miR-BART20-5p(i)가 control LNA와 비교하여 카스파제 3, BRLF1, BZLF1의 mRNA 수준을 증가시켰다. 그러나 siCASP3를 LNA-miR-BART20-5p(i)와 함께 전달한 경우 이러한 효과가 나타나지 않았다 (도 24의 B). 이로부터 BRLF1 및 BZLF1 발현은 카스파제 3의 발현에 영향을 받음을 알 수 있었다.
7-5. BAD 발현이 EBV의 자손 바이러스 생산에 미치는 영향 확인
AGS-EBV 세포주를 4개 군으로 나누어, 1개 군에는 scrambled control을 전달하고, 1개 군에는 siBAD를 전달하고, 1개 군에는 siBZLF1/BRLF1를 전달하고, 1개 군에는 siBAD와 siBZLF1/BRLF1를 모두 전달하였다. 그 후 72시간 동안 TPA를 처리하여 용균성 생활사를 유도한 후, 세포배양액으로 방출된 바이러스를 초원심분리기로 모아 DNA를 추출하고, EBV 게놈의 양(바이러스 산물(viral product), 즉 자손 바이러스)을 실시간 정량적 PCR로 확인하였다. 그 결과 siBAD와 siBZLF1/BRLF1 모두 바이러스 산물의 생산을 감소시키는 것을 알 수 있었다(도 25의 A 및 C).
AGS-EBV 세포주를 3개 군으로 나누어 1개 군에는 control LNA, 1개 군에는 LNA-miR-BART20-5p(i), 1개 군에는 LNA-miR-BART20-5p(i)와 siBAD를 전달하고, 72시간 동안 TPA를 처리하여 용균성 생활사를 유도하였다. 그 후 72시간 동안 TPA를 처리하여 용균성 생활사를 유도한 후, 세포배양액으로 방출된 바이러스를 초원심분리기로 모아 DNA를 추출하고, EBV 게놈의 양(바이러스 산물)을 Droplet Digital PCR로 확인하였다. 그 결과 LNA-miR-BART20-5p(i)만을 전달한 군에서는 바이러스 산물 생산이 증가되었으나, siBAD를 LNA-miR-BART20-5p(i)와 함께 전달한 경우 바이러스 산물 생산이 증가되지 않았다(도 25의 B 및 D). 이는 siBAD에 의해 LNA-miR-BART20-5p(i)의 효과가 상쇄되기 때문으로 생각되었다. 이로부터 miR-BART20-5p에 의한 자손 바이러스 생산 감소는 BAD에 의해 조절받는다는 것을 알 수 있었다.
한편 상기에서 확인한 사실들을 종합한 결과, miR-BART20-5p는 BAD의 발현과 BRLF1 및 BZLF1의 발현을 모두 타겟으로 하여 감소시키며, BAD의 발현은 카스파제 3의 발현을 증가시켜서 카스파제 3 의존성 아폽토시스를 유발하며, 활성화 형태인 절단 카스파제 3의 증가는 다시 BRLF1 및 BZLF1의 발현 증가를 유발하여 EBV의 용균성 생활사를 더욱 유도함을 알 수 있었다(도 26).
<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for treating Epstein-Barr virus infection comprising a BAD expression promoter <130> P14-053-REA-CTU <150> KR 10-2014-0093854 <151> 2014-07-24 <160> 19 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-BART20-5p inhibitor <400> 1 nnnnnnnnnn nnngccugcu n 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-BART20-5p inhibitor <400> 2 nnnnnnnagn cnngccugcu n 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LNA-miR-BART-20-5pi <400> 3 ggaaugaaga caugccugcu a 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-BART20-5p <400> 4 uagcaggcau gucuucauuc c 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-BART20-5p analogue <400> 5 nagcaggcnn gncunnnnnn n 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-BART20-5p analogue <400> 6 nagcaggcnn nnnnnnnnnn n 21 <210> 7 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BAD protein <400> 7 Met Phe Gln Ile Pro Glu Phe Glu Pro Ser Glu Gln Glu Asp Ser Ser 1 5 10 15 Ser Ala Glu Arg Gly Leu Gly Pro Ser Pro Ala Gly Asp Gly Pro Ser 20 25 30 Gly Ser Gly Lys His His Arg Gln Ala Pro Gly Leu Leu Trp Asp Ala 35 40 45 Ser His Gln Gln Glu Gln Pro Thr Ser Ser Ser His His Gly Gly Ala 50 55 60 Gly Ala Val Glu Ile Arg Ser Arg His Ser Ser Tyr Pro Ala Gly Thr 65 70 75 80 Glu Asp Asp Glu Gly Met Gly Glu Glu Pro Ser Pro Phe Arg Gly Arg 85 90 95 Ser Arg Ser Ala Pro Pro Asn Leu Trp Ala Ala Gln Arg Tyr Gly Arg 100 105 110 Glu Leu Arg Arg Met Ser Asp Glu Phe Val Asp Ser Phe Lys Lys Gly 115 120 125 Leu Pro Arg Pro Lys Ser Ala Gly Thr Ala Thr Gln Met Arg Gln Ser 130 135 140 Ser Ser Trp Thr Arg Val Phe Gln Ser Trp Trp Asp Arg Asn Leu Gly 145 150 155 160 Arg Gly Ser Ser Ala Pro Ser Gln 165 <210> 8 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAD 3' UTR <400> 8 uucccccagg cgccugcg 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAD CDS forward primer <400> 9 gctccggcaa gcatcatc 18 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAD CDS reverse primer <400> 10 ggtaggagct gtggcgact 19 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-BART20-5pm <400> 11 uaggucgcau gucuucauuc c 21 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> psiC-BAD forward primer <400> 12 tcgactcgag cggaggatga gtgacgagtt 30 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> psiC-BAD reverse primer <400> 13 ggccgcggcc gccagacgcg ggctttatta ac 32 <210> 14 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BADm <400> 14 uucccccagg ccccacgg 18 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> psiC-BADm forward primer <400> 15 ctaagtcgcg agccaggttt aaccgttgcg tca 33 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> psiC-BADm reverse primer <400> 16 ccgtggggcc tgggggaaag cccggagcc 29 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scrambled control <400> 17 acgugacacg uucggagaau u 21 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control LNA <400> 18 taacacgtct atacgccca 19 <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAD siRNA <400> 19 guacuucccu caggccuau 19

Claims (11)

  1. 서열번호 1, 서열번호 2, 및 서열번호 3으로 기재되는 핵산 중 선택되는 어느 하나인 BAD 발현 촉진제를 유효성분으로 포함하는 엡스타인-바 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 엡스타인-바 바이러스 감염증은 선열, 모상 백반증, 다발성 근염 및 피부근염, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 암은 엡스타인-바 바이러스 양성 버킷 림프종, 호지킨성 림프종, 비인두암, 비강 자연살해세포/T-세포 림프종 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 1) 서열번호 4로 기재되는 miR-BART20-5p, 또는 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 기재되는 miR-BART20-5p 유사체를 시험관상에서 세포에 처리하는 단계;
    2) 후보물질을 시험관상에서 상기 세포에 처리하는 단계계;및
    3) 상기 세포에서 BAD 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 엡스타인-바 바이러스 감염증 치료제 스크리닝 방법.
  8. 1) 서열번호 8로 기재되는 BAD 3' UTR을 발현하는 세포에 서열번호 4로 기재되는 miR-BART20-5p, 또는 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 기재되는 miR-BART20-5p 유사체를 시험관상에서 세포에 처리하는 단계;
    2) 시험관상에서 상기 세포에 후보물질을 처리하는 단계; 및
    3) 상기 세포에서 BAD 3' UTR 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 엡스타인-바 바이러스 감염증 치료제 스크리닝 방법.
  9. 서열번호 1, 서열번호 2, 및 서열번호 3으로 기재되는 핵산 중 선택되는 어느 하나인 BAD 발현 촉진제를 유효성분으로 포함하는 엡스타인-바 바이러스의 항암제에 대한 내성(resistance) 억제용 약학적 조성물.
  10. 삭제
  11. BAD 단백질을 유효성분으로 포함하는 엡스타인-바 바이러스의 항암제에 대한 내성(resistance) 억제용 약학적 조성물.
KR1020150103900A 2014-07-24 2015-07-22 Bad 발현 촉진제를 포함하는 엡스타인-바 바이러스 감염증 치료용 조성물 KR101818809B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

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GenBank: M80517.1 (1996년 공개)*
Yj-jin Jung et al., Vol.88, No.16, J. Virol., 9027-9037면 (2014.06.04. 온라인 공개)*

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