KR100998276B1

KR100998276B1 - Ｎｉｎｊｕｒｉｎ１ 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100998276B1
Application number: KR1020080124555A
Authority: KR
Inventors: 김규원; 이효종
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2008-12-09
Filing date: 2008-12-09
Publication date: 2010-12-03
Also published as: EP2373327B1; US20110123538A1; EP2373327A4; WO2010067915A1; EP2373327A1; KR20100065953A

Abstract

본 발명은 Ninjurin1 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 Ninjurin1 단백질이 혈관 주변의 대식세포(macrophage)에서 특이적으로 발현하고, 세포-세포 간 및 세포-기질 간의 결합을 증가시키며, Wnt7b(Wingless-type MMTV integration site family, member 7B) 및 Ang2(angiopoietin-2)의 발현을 증가시키고 Ang1(angiopoietin-1) 발현을 감소시켜 혈관내피세포(Vascular Endothelial cells, VECs)의 세포사멸을 촉진시킬 뿐만 아니라, 염증이 유발된 환경에서 Ninjurin1 단백질은 발현이 증가하고 iNOS의 발현을 증가시키며 NO의 생성을 증가시키므로 상기 Ninjurin1 단백질의 발현 또는 활성의 억제제를 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.

Ninjurin1, Wnt7b, Ang1, Ang2, 대식세포, 혈관감소, 염증.

Description

Ｎｉｎｊｕｒｉｎ１ 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising expression or activity inhibitors of Ninjurin１ for the prevention and treatment of inflammatory disease}

본 발명은 Ninjurin1 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 혈관 주변의 대식세포에서 특이적으로 발현하는 Ninjurin1 단백질은 혈관내피세포와 상호작용하여 Wnt7b-Ang 신호전달체계를 통해 혈관내피세포의 사멸을 유도하며, iNOS의 발현을 증가시키고 NO의 생성을 증가시켜 염증을 유도함으로써 Ninjurin1 발현 또는 활성 억제제를 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 이용하는 용도에 관한 것이다.

Ninjurin1은 1996년 Toshiyuki Araki 등이 처음으로 보고 하였다(Araki, T. & Milbrandt, J., Neuron 17, 353-361, 1996). 좌골 신경(sciatic nerve)의 원위부를 절단(transection)하거나 압착(crush)하여 손상을 일으킨 후 신경 섬유초 세포(Schwann cell)에서 발현이 증가하는 유전자(gene)를 찾는 과정에서 발견되었다.

GenBank에 알려져 있는 단백질 정보를 이용하여 Ninjurin과 상동성(homology)을 가지는 단백질을 찾아 계통수(phylogenetic tree)가 보고되었다(Zhang, S. et al., Genes & development 20, 1899-1910, 2006). 척추동물(Verterbrate)에서는 Ninjurin1과 Ninjurin2라는 두 가지의 Ninjurin 단백질이 알려져 있다. 상기 Ninjurin1과 Ninjurin2는 인간, 마우스 및 랫트 등의 척추 동물에서 발견된 바 있다. 그리고 무척추동물(invertebrate)의 경우 A, B, C 의 세 종류로 나눌 수 있고 초파리 및 모기 등에서 발견되었다. 인간 Ninjurin1과 마우스 Ninjurin1 단백질은 90%가 일치하고(Chadwick, B.P. et al., Genomics 47, 58-63, 1998), 인간 Ninjurin 1과 인간 ninjurin2 사이에는 55%의 동일성을 지닌다(Araki, T. & Milbrandt, J., J Neurosci 20, 187-195, 2000).

인간 Ninjruin1은 염색체(chromosome) 9q22에 위치하고 있으며 152개의 아미노산으로 구성되어 있다. 마우스 Ninjurin1의 경우는 염색체 13에 위치하고 있으며 152개의 아미노산으로 구성되어 있다. Ninjurin1의 아미노산 서열(sequence) 에서 두 곳의 막 통과 영역(transmembrane domain)을 예측할 수 있다. 그리고 실험을 통하여 Ninjrurin1이 세포막에 위치한 단백질임이 알려져 있다(Araki, T. & Milbrandt, J., Neuron 17, 353-361, 1996). 이러한 사실을 통해 Ninjrurin1의 N-말단(terminal) 영역이 길게 세포 밖으로 뻗어 나와 있을 것으로 추측할 수 있다.

Ninjurin1은 다양한 조직에서 발현되고 있다. 예를 들어, RNA 단계에서는 심장(heart), 뇌(brain), 태반(placenta), 폐(lung), 간(liver), 골격근(sk.Muscle), 콩팥(kidney), 이자(pancreas), 비장(spleen), 흉선(thymus), 전립 선(prostate), 고환(testis), 난소(ovary), 소장(sm.int.), 대장(colon), 혈액(blood), 부신(adrenal gland) 및 후근절(Dorsal Root Ganglia, DRG)에서 발현되고, 단백질 단계에서는 간, 콩팥, 흉선, 자궁(uterus), 부신, 망막(retina) 및 후근절에서 발현되는 것이 보고된 바 있다(Araki, T. et al., The Journal of biological chemistry 272, 21373-21380, 1997).

지금까지 알려진 Ninjurin1의 기능으로는 1) 세포 결합(cell adhesion), 2) 신경 증식(neurite outgrowth), 3) 세포 노화(cellular senescence) 및 4) 암 관련성 등이 있다.

구체적으로, 1) 세포 결합으로는 Jurkat T cell leukemia 세포를 이용한 세포 응집(cell aggregation) 실험에서 Ninjurin1이 세포 사이의 응집(aggregation)을 증가시키는 것이 보고되었다(Araki, T. & Milbrandt, J., Neuron 17, 353-361, 1996). 이러한 결합은 액틴 섬유(Actin filament)의 중합(polymerization), 산화적 인산화(Oxidative phosphorylation), 2가 양이온(Divalent cation) 및 적정 pH(pH 7 ~ 11) 등의 조건이 필요하다(Araki, T. et al., The Journal of biological chemistry 272, 21373-21380, 1997). 반면에, 초파리를 이용한 연구에서 단백분해 효소인 MMP1(matrix metalloproteinase 1)에 의해 잘려진 NinjurinA 단백질이 신호 분자로 작용하여 세포결합을 억제한다는 것이 보고되었다(Zhang, S. et al., Genes & development 20, 1899-1910, 2006).

2) 신경 증식으로는 CHO 세포를 단일 층으로 배양한 후 그 위에 DRG 신경 세포를 배양하는 실험에서 Ninjurin1이 과발현된 CHO 세포를 사용한 경우 신경세포의 증식이 증가한다는 것이 보고되었다(Araki, T. & Milbrandt, J., Neuron 17, 353-361, 1996). 이는 Ninjurin1 단백질 중 26 ~ 37번째 아미노산 서열을 바꾼 단백질에서는 신경 증식 증가가 일어나지 않는 것으로 확인되었다(Zhang, S. et al., Genes & development 20, 1899-1910, 2006). 또한, DRG 신경세포와 피부 섬유아세포 유사 세포(skin-derived fibroblast-like cells, FLCs)를 함께 배양한 실험에서 신경세포가 증식할 때에 Ninjurin1이 발현되고, Ninjurin1의 기능을 항체로 억제할 경우 증식이 억제되는 것이 보고되었다(Jerregard, H. et al., Journal of neurocytology 30, 327-336, 2001).

3) 세포 노화로는 Ninjurin1이 과발현된 경우 p21^WAF1/Cip1의 전사 후 발현증가 과정을 통해 G1 단계에서 세포주기가 멈추게 되어 강한 세포증식 억제 작용이 나타나는 것으로 보고되었다. 또한, Ninjurin1 과발현시 세포 노화의 특징인 노화 관련 베타-갈락토시다제(senescence-associated β-galactosidase) 활성 및 자사형광 색소(autofluorescence pigment)가 증가하는 것으로 보고되었다. 이와 함께 Ninjurin1의 발현이 간세포성 암(hepatocellular carcinoma) 조직에서 증가하므로 암화과정에서 항암치료 표적이 되는 세포 노화에 관계되어 있을 것으로 예측되고 있다(Toyama, T. et al., Journal of hepatology 41, 637-643, 2004).

4) 암 관련성으로는 Ninjurin1의 발현이 바이러스 감염이나 간경화(cirrhosis)가 같이 있는 간세포성 암에서 증가되는 것으로 보고되었다(Kim, J.W. et al., Molecules and cells 11, 151-157, 2001). 또한, Ninjurin1의 발현 이 급성림프구성 백혈병(Acute Lymphocytic Leukemia)에서 증가되는 것으로 보고되었다. 또한, Ninjurin1의 발현은 마이크로어레이(Microarray)를 이용한 암 억제 단백질인 p53에 의해 조절되는 유전자 탐색에서 직접적으로 증가하는 것으로 보고되었다(Kannan, K. et al., Oncogene 20, 2225-2234, 2001).

그러나, Ninjurin1의 대식세포(macrophage)에 대한 관련성, 혈관 감소 및 염증 유발에 관한 보고는 없다.

이에, 본 발명자들은 Ninjurin1의 대식세포와의 관련성 및 이로 인한 작용 기전을 연구하던 중, Ninjurin1이 혈관주변 대식세포에서 특이적으로 발현하고, 세포-기질 간 및 세포-세포 간의 결합을 증가시키며, Wnt7b(Wingless-type MMTV integration site family, member 7B) 및 Ang2(angiopoietin-2)의 발현을 증가시키고 Ang1(angiopoietin-1) 발현을 감소시켜 혈관내피세포(Vascular Endothelial cells, VECs)의 세포사멸을 촉진시키는 것을 확인하였으며, 상기 Ninjurin1이 생체 내(in vivo) 및 시험관(in vitro)에서 LPS에 의해 유발된 염증상황에서 발현이 증가하고 iNOS 발현을 증가시키고 NO의 생성을 증가시키는 것을 확인함으로써 Ninjurin1이 대식세포의 활성을 증가시켜 염증을 유발하고 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 Ninjurin1 단백질의 발현 또는 활성을 억제하여 대식세포의 과도한 활성에 의해 야기되는 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Ninjurin1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 조성물을 염증성 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환 예방 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) Ninjurin1 단백질의 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포주의 Ninjurin1 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 Ninjurin1 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 예방 및 치료물질 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 Ninjurin1 단백질은 혈관주변 대식세포에서 특이적으로 발현되어 대식세포와 혈관내피세포의 직접적인 상호작용을 매개하여 Wnt-Ang 경로를 활성화시켜 세포사멸을 유도하며, iNOS의 발현 및 NO의 생성을 증가시켜 염증 유발에 직접적으로관여하므로 상기 Ninjurin1 단백질의 발현 또는 활성의 억제제를 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 Ninjurin1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기 Ninjurin1 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 Ninjurin1 단백질의 발현 억제제는 Ninjurin1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 Ninjurin1 단백질의 활성 억제제는 Ninjurin1 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어 느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 염증성 질환은 류마틱성 관절염, 염증성 창자병, 강직 척추염, 건선, 죽상동맥경화증의 심화 및 다발성경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며 대식세포의 과도한 활성에 의해 유발되는 염증성 질환은 모두 포함된다.

본 발명에서는 Ninjurin1의 대식세포와의 관련성을 알아보기 위해, 다양한 생후 일령의 마우스들의 안구에서 면역형광염색 현미경 및 웨스턴 블랏을 이용하여 안구의 발달 과정에서 Ninjurin1 단백질의 발현 정도 및 발현 위치를 확인하였다. 그 결과, Ninjurin1은 초기 안구 발달에 많이 발현되었고, 혈관주변 대식세포에서 특이적으로 발현되었다(도 1 내지 도 4 참조). 따라서 Ninjurin1이 대식세포에서 특이적으로 발현하여 상기 대식세포의 혈관세포에 대한 상호작용에 관여하는 것을 알 수 있다.

본 발명에서는 Ninjurin1의 혈관내피세포에 미치는 영향을 알아보기 위해, 특정 생후 일령의 마우스의 안구, 및 Ninjurin1 항체로 중화시킨 마우스의 안구에서 면역형광염색 현미경을 이용하여 Ninjurin1을 발현하는 대식세포 및 혈관내피세포의 위치 및 양을 확인하였다. 그 결과, Ninjurin1을 발현하는 대식세포가 세포사멸이 일어나는 혈관내피세포에 붙어 있으며, Ninjurin1 항체로 중화시킨 마우스가 대조군에 비해 유리체 혈관내피세포가 많이 존재하였다(도 5 및 도 6 참조). 따라서 Ninjurin1을 발현하는 대식세포가 유리체 혈관내피세포의 세포사멸에 참여 하는 것을 알 수 있다.

본 발명에서는 Ninjurin1의 세포-세포 및 세포-기질 간의 결합에 미치는 영향을 알아보기 위해, Ninjruin1으로 형질전환된 세포 및 형질전환되지 않은 세포를 이용하여 다양한 기질에 대한 부착 정도와 응집체 형성 정도를 분석하였다. 그 결과, Ninjurin1의 과발현이 혈관내피세포에 대한 대식세포의 결합을 증가시키고, 그 외 콜라겐, 피브로넥틴 및 비트로넥틴의 기질들에 대한 결합력을 증가시켰으며, 혈관세포 주변에서 응집체 형성을 증가시켰다(도 7 및 도 8 참조). 따라서 Ninjurin1이 세포-세포 간, 및 세포-기질 간의 결합에 참여하는 것을 알 수 있다.

본 발명에서는 Ninjurin1의 Wnt-Ang 신호전달계에 미치는 영향을 알아보기 위해, Ninjruin1 과발현 세포 및 Ninjruin1 발현을 억제시킨 세포를 이용하여 Ninjurin1의 발현량 변화에 따른 Wnt7b, p38, MAPK(p44/p42), JNK(p54/46), Ang1 및 Ang2의 발현량 변화를 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 및 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 이용하여 확인하였다. 그 결과, Ninjurin1 발현의 증가가 Wnt7b 발현을 증가시켰고, 인산화된 p38, MAPK(p44/p42) 및 JNK(p54/46)의 발현이 증가시켰다(도 9 내지 도 13 참조). 또한, Wnt7b 및 Ninjurin1의 Ang1 및 Ang2와의 관련성을 알아보기 위해, 다양한 농도의 Ang1 또는 Ang2가 있는 조건에서 세포내 Wnt7b 및 Ninjurin1의 농도 변화를 확인하였다. 그 결과, Wnt7b의 발현은 Ang1의 농도 증가에 의존적으로 감소하였고, Ang2의 농도 증가에 의존적으로 증가하였다(도 14 참조). 아울러, Ninjurin1이 Ang2에 의해 세포사멸에 미치는 영향을 알아보기 위해, Ang2가 있는 조건에서 Ninjurin1이 과발현된 세포 배양액을 처리한 혈관주변세포를 이용하여 caspase3 절단 및 세포사멸의 정도를 확인하였다. 그 결과, Ninjurin1의 발현 증가가 caspase3 절단 및 세포사멸을 증가시켰다(도 15 참조). 따라서, Ninjruin1이 Wnt7b 및 Ang2의 발현을 증가시키고 Ang1의 발현을 감소시키는 등의 Wnt-Ang 신호전달계를 조절하여 유리체 혈관내피세포의 세포사멸을 야기하는 것을 알 수 있다.

즉, Ninjurin1은 혈관주변 대식세포에서 특이적으로 발현되어 대식세포와 혈관내피세포의 직접적인 상호작용을 매개하여 Wnt-Ang 경로를 활성화시켜 세포사멸을 유도하고 이는 혈관의 감소를 야기하므로 Ninjurin1의 발현 또는 활성을 억제하여 혈관 등의 세포사멸을 억제할 수 있다.

본 발명에서는 Ninjurin1의 염증 반응과의 관련성을 알아보기 위해, 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)를 랫드(rat)에 복강주사하여 염증을 유발시킨 후 안구를 적출하여 면역형광염색을 이용하여 관찰하였다. 그 결과, LPS의 투여에 의해 Ninjurin1을 발현하는 대식세포 수가 증가하였다(도 16 참조).

본 발명에서는 세포에 LPS를 처리하여 염증 상황을 유도한 후 Ninjurin1의 발현 및 염증의 지표인 iNOS의 발현 정도를 확인하였고, Ninjurin1 발현 변화에 따른 iNOS의 발현 및 염증성 매개 인자인 산화질소(Nitric oxide, NO)의 생성 변화를 확인하였다. 그 결과, LPS의 처리 농도가 증가할수록 Ninjurin1 발현의 농도가 증가하였고, Ninjurin1 발현의 농도가 증가할수록 iNOS의 발현량 및 NO의 생성량이 증가하였다(도 17 내지 도 20 참조). 따라서, Ninjurin1은 염증 유발 상황에서 발 현이 증가하고 Ninjurin1 발현의 증가는 iNOS의 발현 및 NO의 생성을 증가시키므로 염증 유발에 관여하는 것을 알 수 있다.

즉, Ninjurin1은 iNOS 및 NO의 생성을 증가시켜 염증 유발에 관여하므로 상기 Ninjurin1의 발현 또는 활성을 억제함으로써 염증을 억제할 수 있다.

이상의 실험에서 Ninjurin1이 대식세포의 활성을 증가시키고, 대식세포의 과도한 활성은 류마틱성 관절염, 염증성 창자병, 강직 척추염, 건선(Morand, E.F. et al., Intern Med J 35, 419-426, 2005), 죽상동맥경화증의 심화(Choudhury, R.P., et al., Nat Clin Pract Cardiovasc Med 2, 309-315, 2005), 다발성경화증(Minagar, A. et al., J Neurol Sci 202, 13-23, 2002) 등 여러 질병에 관여하고 있다. 그러므로 Ninjurin1의 발현 또는 활성을 억제하여 대식세포의 과도한 활성으로 인해 야기되는 질환, 특히 염증성 질환의 예방 및 치료에 이용될 수 있다.

본 발명의 Ninjruin1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 조성물은 상기 Ninjruin1 단백질의 발현 또는 활성 억제제에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 뉴클레오티드 또는 핵산은, 경구, 국소, 비경구, 비 내, 정맥 내, 근육 내, 피하, 안 내, 경피 등의 투여를 목적으로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 핵산 또는 벡터가 주사가능한 형태로 사용된다. 이에 따라서 특히 처리될 영역으로는 직접적인 주입을 위하여 주사 가능한 조성물을 위한 임의의 약학적으로 허용되는 매개체와 혼합될 수 있다. 본 발명의 조성물은 특히 등장 멸균 용액 또는 멸균수 또는 적절한 생리 식염수의 첨가에 따라 주사 가능한 용액의 조성을 가능케 하는 동결건조 조성물을 포함할 수 있다. 환자의 종양으로의 핵산의 직접적인 주입은 치료 효율을 감염된 조직에 집중시키도록 하므로 유리하다. 사용되는 핵산의 투여량은 다양한 파라미터, 특히 유전자, 벡터, 사용되는 투여 방식, 문제시되는 질병 또는 대안적으로 요구되는 치료기간에 의해 조절될 수 있다. 또 한, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

상기 조성물은 Ninjruin1 단백질의 발현 또는 활성 억제제에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 Ninjruin1 단백질의 발현 또는 활성 억제제의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

아울러, 본 발명은

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 Ninjurin1 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 RT-PCR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 상기 염증성 질환은 류마틱성 관절염, 염증성 창자병, 강직 척추염, 건선, 죽상동맥경화증의 심화 및 다발성경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 실험 동물의 준비 및 조건

㈜ 샘타코 바이오 코리아에서 구입한 특정 병원성 미생물 부재(Specific pathogen-free; SPF) 임신한 Sprague-Dawley(SD) 랫트(rat)와 수컷 ICR 마우스(mouse)/SD 랫트(rat)를 실험기간 동안 국립 서울대학교 약학대학 동물시설에서 무균 상태로 유지하였다. 모든 동물실험은 국립 서울대학교 약학대학 실험동물의 사용과 관리 의원회(http://ilar.snu.ac.kr)의 인가를 받았다.

<실시예 2> 세포 배양, 세포 용해물 및 세포 배양액의 준비 및 조건

초대 배양한 인간 뇌 미세혈관 주변세포(primary human microvascular pericye)(Applied Cell Biology Research Institute)는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM); Raw 264.7 세포(TIB-71^TM)와 BV2 세포는 DMEM 배지; HUVEC 세포는 20%의 FBS(Invitrogen, Grand Island, NY)를 첨가한 M199 배지를 사용하여 각각 배양하였다. 상기 세포들은 95% 산소, 5% 이산화탄소를 조성으로 하는 습윤한 공기와 37℃의 온도를 유지하여 배양하였다. Raw 세포와 BV2 세포는 Lipofectamine Plus Reagent(Invitrogen)을 이용하여 형질전환하였다. 세포 용해물(lysate)은 lysis buffer(40 mM Tris-Cl pH 8.4, 10 mM EDTA, 120 mM NaCl, 0.1% NP-40)를 사용하여 제조하였다. 인간유래 혈관주변세포에 처리하기 위한 배양액은 형질전환한 대식세포(macrophage)를 FBS를 첨가하지 않은 DMEM에서 24시간 배양한 것으로 구멍 크기가 0.22 ㎛인 여과지(Millipore)로 거른 후 원심분리 여과튜브(Millipore)를 이용하여 10배 농축하였다. 화학물질 처리를 위하여 세포는 60 ~ 70%의 밀도로 배양하였으며, 14 ~ 16시간 동안 혈청(serum)을 고갈시킨 상태에서 Ang1, Ang2(500 ~ 1000 ng/ml)를 단독 또는 배양액과 함께 처리하였다. 신호전달경로를 밝히기 위한 실험에서 세포는 Mock 또는 Ninjurin1 cDNA로 형질전환하였고 14 ~ 16시간 동안 혈청을 고갈시킨 후 p38 단백질 저해제인 SB203580(Sigma)을 24시간 동안 처리하였다.

<실시예 3> Ninjurin1 단백질 발현 벡터의 제조

NIH-3T3 섬유모세포에서 RT-PCR(역전사 중합효소 연쇄반응)을 통하여 야생형(wild-type) mouse Ninjurin1 cDNA 전부분을 만들었다. 이때, 프라이머(primer)로서 5'-GGGAATTCCATGGAGTCGGGCACTGAGGA-3'(서열번호: 2)(EcoRⅠ 효소 절단 부위를 가진 앞쪽방향)과 5'-CTCCTCGAGTTCTACTGCCGGGGCGCCACGT-3'(서열번호: 3)(XhoⅠ 효소 절단 부위를 가진 뒤쪽방향)가 사용되었다. 상기 cDNA를 포유동물 세포에서 발현시키기 위해 pCS2+ 벡터(vector)(Myc 표지)에 삽입하였다.

<실험예 1> 안구 발달 과정에서 시간에 따른 Ninjurin1의 발현 측정

본 발명자들은 상기 <실시예 1>의 마우스들 중 생후 2일령(P2), 3일령(P3), 5일령(P5), 8일령(P8), 14일령(P14) 및 성체(Adult) 마우스를 각각 희생시켜 안구를 적출한 후, GS-렉틴(GS-lectin)을 면역염색한 다음, 형광현미경을 이용하여 유리체 및 초기망막혈관의 발달 정도를 관찰하였다.

구체적으로, 면역염색은 하기와 같이 수행하였다: 사용된 항체는 Ninjurin1(1:500, Dr.J.Milbrandt로부터 받음), VE-카드헤린(VE-cadherin)(1:500, Santa Cruz), GS-렉틴(GS-lectin)(1:1000, Molecular Probes), Iba-1(1:500, Wako), NG2(1:300, Chemicon) 및 cleaved-caspase3(1:500, Cell signaling)이었다. 핵은 DAPI와 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)(Molecular Probes)를 이용하여 염색하였다. 조직과 세포는 상기 일차 항체와 반응시킨 후 이차 항체로 Alexa488이 결합된 IgG 또는 Alexa546이 결합된 IgG(Molecular Probes)가 사용되었 다. 이미지는 Axiovert M200 현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany)로 얻었고 이미지 분석 프로그램(NIH-Image J)으로 분석하였다. 이하, 면역염색은 이와 동일한 조건으로 수행하였다.

또한, 상기 각 연령대의 안구들로부터 웨스턴 블랏(Western Blot)을 이용하여 Ninjurin1 단백질 발현 정도를 확인하였다.

구체적으로, 웨스턴 블랏은 하기와 같이 수행하였다: Ninjurin1(BD pharminogen), c-Myc(Santa Cruz), α-tubulin(BioGenex), caspase-3(Cell signaling), iNOS(Santa Cruz) 단백질에 특이적인 일차 항체를 사용하였다. 항 mouse/rabbit horseradish peroxidase 결합 이차 항체는 Pierce Chemical Co.에서 구입하였다. 항체는 ECL Plus reagent(Amersham Biosciences)로 발색하였고 LAS-3000(Fujifilm)을 이용하여 검출하였다. 재조합 Ang1과 Ang2 단백질은 R&D systems INC.에서 구입하였다. Ponceau S 용액은 Sigma에서 구입하였다. 이하, 웨스턴 블랏은 이와 동일한 조건으로 수행하였다.

결과 분석 및 통계 처리는 하기와 같이 수행하였다: 밴드의 강도 정량은 ImageJ(http://rsb.info.nih.gov/ij/)를 사용하여 분석하였고, gapdh, 알파-튜블린(α-tubulin) 또는 ponceau S 염색 밴드의 강도를 기준으로 삼았다. 결과는 상대적 백분율로 환산하여 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 가장 강도가 높은 단백질의 값을 100%로 설정하였다. 두 군간의 통계비교는 Student's t-test를 이용하였다. P<0.05일 경우 통계적으로 유의하다고 간주하였다. 이하, 결과 분석 및 통계 처리는 이와 동일한 조건으로 수행하였다.

또한, 생후 1일령(P1), 5일령(P5) 및 14일령(P14) 마우스에서 적출한 안구를 펼친(Cross-section) 안구에서 Ninjurin1과 프로피디움 요오드화물(propidium iodide; PI)을 이중염색하고, 5일령(P5) 마우스의 안구를 Ninjurin1과 VE-카드헤린(VE-cadherin)을 이중면역염색한 다음, 각각 형광현미경을 이용하여 안구를 관찰하였다.

그 결과, 도 1 및 도 2에서 보는 바와 같이 안구 발달이 진행될수록 혈관의 밀도는 감소하였으며, Ninjurin1 단백질의 발현은 5일령까지 차츰 증가하였고, 생후 3일령 및 5일령 일때 가장 많은 Ninjurin1 단백질을 발현하였으며, 그 이후부터 차츰 감소하였다(도 1 및 도 2). 따라서 Ninjurin1 단백질은 안구발달 초기에 발현이 많이 된다는 것을 알 수 있다.

<실험예 2> 혈관 주변의 대식세포(macrophage)에서 Ninjurin1의 특이적 발현 확인

본 발명자들은 생후 5일령(P5) 마우스의 펼친(Cross-section) 안구에서 GS-렉틴(GS-lectin)과 Ninjurin1을, Ninjurin1과 ConA를, Ninjurin1과 F4/80를, Ninjurin1과 Iba-1을, 및 Ninjurin1과 NG2을 각각 이중면역염색한 다음, 형광현미경을 이용하여 상기 단백질들의 발현을 관찰하였다.

또한, 상기 안구에서 5% 젤라틴(gelatin)을 이용하여 유리체 혈관(hyaloid vessels)과 구조물을 제거한 후 whole-mount한 안구를 GS-렉틴(GS-lectin)과 Ninjurin1으로 면역염색한 다음, 형광현미경을 이용하여 상기 단백질들의 발현을 관찰하였다.

그 결과, 도 3 및 도 4에서 보는 바와 같이 Ninjruin1은 혈관 주변 대식세포에서 발현되었으나 유조직의 미세아교세포(parenchymal microglia)에서는 발현되지 않았다(도 3 및 도 4). 따라서 Ninjurin1 단백질은 혈관 주변 대식세포에서만 특이적으로 발현이 된다는 것을 알 수 있다.

<실험예 3> Ninjurin1의 혈관내피세포의 세포사멸에 미치는 영향 확인

본 발명자들은 생후 8일령(P8) 마우스의 유리체에서 GS-렉틴(GS-lectin)과 Ninjurin1을 염색한 다음, 형광현미경을 이용하여 상기 유리체를 관찰하였다.

또한, 대조군으로서 생후 6일령(P6) 및 11일령(P11) 마우스의 유리체와, 실험군으로서 Ninjurin1 항체로 중화시킨 생후 6일령(P6) 및 11일령(P11) 마우스의 안구를 면역형광염색 현미경법을 이용하여 확인하였다.

구체적으로, 항체를 이용한 Ninjurin1의 차단은 생후 1일령(P1) 실험동물에 1 mg/kg의 Ninjurin1(BD) 마우스 중화 항체 또는 1 mg/kg의 마우스 동형 대조 항체(Santa Cruz)를 복강내 주사한 후, 생후 6일령(P6) 및 11일령(P11)에 안락사하였다. 안구의 혈관과 대식세포(macrophage)는 GS-렉틴을 이용하여 염색하였다.

그 결과, 도 5 및 도 6에서 보는 바와 같이 Ninjurin1을 발현하는 대식세포가 TUNEL 양성인(세포사멸이 일어난) 혈관내피세포에 붙어 있었으며, Ninjurin1 항체로 중화시킨 마우스가 대조군에 비해 유리체 혈관내피세포의 양의 많이 나타났다(도 5 및 도 6). 따라서, Ninjurin1이 유리체 혈관내피세포의 세포사멸에 영향을 미치고, Ninjurin1 항체에 의한 중화가 유리체 혈관내피세포의 감소를 지연시키 는 것을 알 수 있다.

<실험예 4> Ninjurin1의 세포-세포 및 세포-기질 간의 결합에 미치는 영향 확인

본 발명자들은 pCS2+-Ninjurin1 또는 pCS2+-Mock을 형질전환시킨 BV2 세포를 이용하여 세포 부착 조사를 수행하였다.

구체적으로, 세포-세포 간 부착 실험은 BV2 세포를 Hoechst(H33342)로 10분간 염색한 후 DMEM으로 씻어낸 후, trypsin/EDTA를 사용하여 세포를 떼어내고 떼어낸 세포는 마우스 뇌 미세혈관 혈관 혈관내피 세포가 단일층으로 깔려있는 검고 평편한 바닥의 96 웰 프레이트에 중화 항체와 함께 더해 주었다. 0.2% NP-40으로 용해시킨 후, 용해물의 형광을 ELISA를 이용하여 340 nm에서 측정하였다. 세포-기질 간 부착 실험은 피브로넥틴(fibronectin; FN)(Invitrogen), type Ⅰ/Ⅳ 콜라겐(collagen; col.Ⅰ/col.Ⅳ)(BD), 젤라틴(gelatin)(Sigma) 및 비트로넥틴(vitronectin; Vit)(Invitrogen)의 기질이 코팅된 웰(well)에 BV2 세포를 더해 주었다. 15분간 반응시킨 후, BV2 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 부착되어있는 세포는 크리스탈 바이올렛(Crystal violet)으로 염색하고 다시 2회 세척하였다. 0.2% NP-40으로 용해시킨 후, 용해물의 흡광도를 ELISA를 이용하여 590 nm에서 측정하였다. 마지막으로, Ninjruin1으로 형질전환된 세포 및 형질전환되지 않은 세포를 각각 혼합하여 공지된 방법(Araki T, et al., Neuron. 1996 Aug; 17(2): 353-61)으로 응집체 형성을 조사하였다.

그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 Ninjurin1의 발현이 혈관내피세포에 대식 세포의 결합을 증가시키고, Ninjurin1 발현 BV2 세포가 mock 발현 BV2 세포에 비해 기질들에 대한 결합력이 높게 나타났고, Ninjurin1 항체로 중화시킨 경우에는 BV2 세포의 기질에 대한 결합력이 감소하는 것으로 나타났다(도 7). 또한, 도 8에서 보는 바와 같이 Ninjurin1 발현 BV2 세포는 혈관 세포 주변에서 응집체를 형성하고, 배양시 응집체를 형성하면서 자라는 것을 확인하였다(도 8).

따라서, Ninjurin1이 세포-세포 간의 응칩체 형성을 야기하고, 세포-기질 간의 결합을 촉진시키는 것을 알 수 있다.

<실험예 5> Ninjurin1의 Wnt-Ang 신호전달계에 미치는 영향 확인

본 발명자들은 Myc-mock 또는 Myc-Ninjruin1이 표지된 DNA를 형질전환시킨 BV2 세포에서 Wnt7b의 발현, 및 작은 간섭 RNA(siRNA) 삽입으로 Ninjurin1의 발현을 억제시킨 세포에서 Wnt7b의 발현을 각각 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 및 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 이용하여 확인하였다.

구체적으로, 상기 RT-PCR 및 Real-time PCR은 하기의 조건으로 수행하였다: 형질전환된 BV2 세포를 1% 혈청(serum)이 들어간 DMEM에서 2일간 배양한 후, RNA를 Trizol reagent(Invitrogen)을 이용하여 분리하였다. RT-PCR을 위하여 하기의 프라이머를 사용하였다: Gapdh: 포워드(forward) 프라이머 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'(서열번호: 4), 리버스(reverse) 프라이머 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(서열번호: 5); Ninjurin1: 포워드 프라이머 5'-GAGTCGGGCACTGAGGA-3'(서열번호: 6), 리버스 프라이머: 5'-GTTGCAGGGGTCTGGTCA-3'(서열번호: 7); Ang1: 포워드 프라이머 5'- AGGCTTGGTTTCTCGTCAGA-3'(서열번호: 8), 리버스 프라이머: 5'-TCTGCACAGTCTCGAAATGG-3'(서열번호: 9); Ang2: 포워드 프라이머 5'-GCTGCTGGTTTATTACTGAAGAA-3'(서열번호: 10), 리버스 프라이머: 5'-TCAGGTGGACTGGGATGTTTAG-3'(서열번호: 11); Wnt7b: 포워드 프라이머 5'-AAGAACTCCGAGTAGGGAGTCG-3'(서열번호: 12), 리버스 프라이머: 5'-TGCGTTGTACTTCTCCTTGAGC-3'(서열번호: 13); Wnt7b: 2^nd round 포워드 프라이머 5'-CCGAGTAGGGAGTCGAGAGG-3'(서열번호: 14), 리버스 프라이머: 5'-CACACCGTGACACTTACATTCC-3'(서열번호: 15). PCR 결과물은 EtBr(ethidium bromide)가 함유된 1.2% 아가로즈 젤을 이용하여 분리하고 디지털 이미지로 분석하였다. Real-Time PCR을 위하여 하기의 프라이머를 사용하였다: Ang2: 포워드 프라이머 5'-TGTGATCTTGTCTTGGCCGC-3'(서열번호: 16), 리버스 프라이머: 5'-AGAGGGAGTGTTCCAAGAAGC-3'(서열번호: 17); Gapdh, Ang1 및 Wnt7는 상기 RT-PCR과 동일한 프라이머를 사용하였다. 이하, RT-PCR 및 Real-time PCR의 조건은 이와 동일하게 수행하였다.

또한, Myc-mock 또는 Myc-Ninjruin1이 표지된 DNA를 형질전환시킨 BV2 세포에서 Wnt7b 발현을 면역형광염색 현미경법으로 확인하였다.

그 결과, 도 9 및 도 10에서 보는 바와 같이 mock 발현 BV2 세포에 비해 Ninjurin1 발현 BV2 세포에서 Wnt7b의 발현이 증가하였고, Ninjurin1 발현의 억제가 Wnt7b의 발현을 감소시켰다(도 9 및 도 10).

또한, Ninjurin1이 p38, MAPK(p44/p42) 및 JNK(p54/46)의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, Myc-mock 또는 Myc-Ninjruin1이 표지된 DNA를 형질전환시킨 BV2 세포의 용해물(lysate)을 이용하여 웨스턴 블랏하였고, 상기 Myc-mock 또는 Myc-Ninjruin1이 표지된 DNA를 형질전환시킨 BV2 세포에 각각 p38 저해제인 SB203580를 농도별(0, 10 및 30 uM)로 처리한 후 Wnt7b의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 11에서 보는 바와 같이 mock 발현 BV2 세포에 비해 Ninjurin1 발현 BV2 세포에서 인산화된 p38, MAPK(p44/p42) 및 JNK(p54/46)의 발현이 증가하였고(도 11), 도 12에서 보는 바와 같이 Ninjurin1이 촉진하는 Wnt7b 발현이 p38 저해제에 의해 농도의존적으로 감소하였다(도 12).

또한, Ninjurin1이 Ang1 및 Ang2의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, Myc-mock 또는 Myc-Ninjruin1이 표지된 DNA를 형질전환시킨 BV2 세포의 배양액을 사람에서 유래한 혈관주변세포(pericyte)에 처리하여 앤지오포이에틴-1(Angiopoietin-1; Ang1), 앤지오포이에틴-2(Angiopoietin-2; Ang2)의 발현을 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 및 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)을 이용하여 확인하였다.

그 결과, 도 13에서 보는 바와 같이 mock 발현 BV2 세포 배양액을 처리한 세포에 비해 Ninjurin1 발현 BV2 세포 배양액을 처리한 세포가 Ang1의 발현이 감소하고 Ang2의 발현이 증가하였다(도 13).

또한, Wnt7b 및 Ninjurin1의 Ang1 및 Ang2와의 관련성을 알아보기 위하여, 설치류에서 유래한 대식세포주(Raw264.7, BV2)에서 재조합 인간(recombinant human Ang1)(rh-Ang1)과 rh-Ang2가 농도별(0, 1 및 2.5 ug/ml)로 존재할 때 Wnt7b와 Ninjurin1을 RT-PCR로 확인하였다.

그 결과, 도 14에서 보는 바와 같이 Wnt7b 및 Ninjurin1의 발현은 rh-Ang1의 농도 증가에 의존적으로 감소하였고, rh-Ang2의 농도 증가에 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 14).

또한, Myc-mock 또는 Myc-Ninjruin1이 표지된 DNA를 형질전환시킨 BV2 세포의 배양액을 rh-Ang2가 있는 조건에서 24시간 처리하였을 때 사람에서 유래한 혈관내피세포(HUVEC)의 caspase3 절단을 웨스턴블랏으로 확인하였고, 상기 caspase3 절단 및 TUNEL을 면역형광염색으로 확인하였다.

그 결과, 도 15에서 보는 바와 같이 rh-Ang2가 있는 조건에서 mock 발현 세포 배양액을 처리한 세포에 비해 Ninjurin1 발현 세포 배양액을 처리한 세포에서 caspase3 절단이 증가하였고 세포사멸이 증가하였다(도 15).

따라서, Ninjruin1의 발현이 Wnt7b의 발현을 촉진하고, Ang1의 발현을 감소시키고 Ang2의 발현을 증가시키며, p38, MAPK(p44/p42) 및 JNK(p54/46)를 활성화시키는 것을 알 수 있다. 즉, Ninjruin1이 Wnt-Ang 신호전달계를 조절하고, 혈관내피세포의 Ang2에 의한 세포사멸을 야기하는 것을 알 수 있다.

<실험예 6> LPS에 의해 유도된 염증상황에서 Ninjurin1의 발현 변화 확인

본 발명자들은 생체 내(in vivo)에서 염증 상황을 유도하기 위하여 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)(Lipopolysaccharides from Escherichia coli 0111:B4, Sigma)를 Sprague-Dawley (SD)계 SPF 랫드(rat)에 복강주사한 후, 안구를 적출하여 면역형광염색 현미경법(Ninjurin1 및 Iba-1를 염색)을 이용하여 Ninjurin1의 발현(Ninjurin1 염색), 대식세포와 미세아교세포의 유입과 활성(Iba-1 염색)을 확인하였다.

그 결과, 도 16에서 보는 바와 같이 LPS의 투여에 의해 유리체 내에 Ninjurin1을 발현하는 세포가 나타났고, 난형의 대식세포 유입을 촉진시키고, 가지를 뻗은 미세아교세포를 활성화된 미세아교세포로 변환시켰다. 또한, LPS의 투여에 의해 대식세포와 미세아교세포의 유입과 활성이 증가하고, Ninjurin1을 발현하는 구형의 대식세포가 망막에서 나타났다(도 16).

따라서, LPS에 의한 염증 유발에 의해 Ninjurin1을 발현하는 대식세포의 수가 증가하며, Ninjurin1의 발현이 증가하는 것을 알 수 있다.

<실험예 7> Ninjurin1의 발현량에 따른 염증 관련 단백질의 변화 확인

본 발명자들은 시험관 내(in vitro)에서 염증 상황을 유도하기 위하여 BV2 세포에 다양한 농도(0, 1 및 2.5 ug/ml)의 LPS를 처리한 후, 웨스턴 블랏 및 RT-PCR을 이용하여 염증의 지표인 iNOS의 발현 정도, 및 Ninjurin1의 발현 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 17에서 보는 바와 같이 LPS 투여에 의해 iNOS가 증가하였으며, LPS의 처리 농도가 증가할수록 Ninjurin1 발현의 농도가 증가하였다(도 17).

또한, Ninjurin1의 발현이 iNOS의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, Myc-mock 또는 Myc-Ninjruin1이 표지된 DNA를 형질전환시킨 BV2 세포에서 iNOS의 발현량을 웨스턴 블랏 및 RT-PCR을 이용하여 확인하였다.

그 결과, 도 18에서 보는 바와 같이 mock 발현 BV2 세포에 비해 Ninjurin1 과발현 BV2 세포에서 iNOS의 발현이 증가하였고, Ninjurin1 발현량이 증가할수록 iNOS의 발현량도 증가하였다(도 18).

또한, Ninjurin1의 발현이 염증성 매개 인자인 산화질소(Nitric oxide, NO)의 생성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, Myc-mock 또는 Myc-Ninjruin1이 표지된 DNA를 형질전환시킨 BV2 세포에서 NO의 생성량을 측정하였다.

구체적으로, NO 생성량은 세포 배양액 중에 존재하는 NO의 안정한 반응물인 질산염(nitrite)을 그리스 시약(Griess reagent)을 이용하여 측정하였다. 100 μl 세포 배양액을 100 μl 그리스 시약[30% 아세트산염(acetate)에 녹인 1% 술파닐아미드(sulfanilamide)와 60% 아세트산염에 녹인 0.1% N-1-나프틸 에틸렌디아민(N-(1-naphthyl)ehylenediamine)을 1 : 1로 혼합]과 혼합하였다. 10분 후 ELISA를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다(Ebert S, et al., J Neuroimmunol. 2005 Feb; 159(1-2): 87-96). 상기 아세트산염, 술파닐아미드, 및 N-1-나프틸 에틸렌디아민는 Sigma로부터 구입하였다.

그 결과, 도 19에서 보는 바와 같이 mock 발현 BV2 세포에 비해 Ninjurin1 과발현 BV2 세포에서 NO의 생성량이 증가하였다(도 19).

또한, Ninjurin1의 발현 억제가 iNOS의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, siRNA 및 shRNA를 각각 벡터로 삽입하여 Ninjruin1 발현을 억제시킨 BV2 세포 에서 Ninjurin1 및 iNOS의 발현량을 웨스턴 블랏 및 RT-PCR을 이용하여 확인하였다.

그 결과, 도 20에서 보는 바와 같이 siRNA 및 shRNA에 의해 Ninjurin1 발현이 억제하였고, iNOS의 발현량도 감소하였다(도 20).

따라서, Ninjurin1의 과발현에 의해 염증의 지표인 iNOS의 발현량이 증가하고 염증성 매개 인자인 NO의 생성량을 증가하며, Ninjurin1의 발현 억제에 의해 iNOS의 발현량이 감소하는 것을 알 수 있다. 즉, Ninjurin1이 염증에 있어서 높은 관련성이 있음을 알 수 있다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 예시한다.

<제조예> : 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

클루베라마이세스 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

클루베라마이세스 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

클루베라마이세스 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

4. 환의 제조

클루베라마이세스 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

5. 과립의 제조

클루베라마이세스 150 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30 % 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

본 발명은 Ninjurin1을 과발현하는 대식세포의 과도한 활성에 의해 유발되는 류마틱성 관절염, 염증성 창자병, 강직 척추염, 건선, 죽상동맥경화증의 심화 또는 다발성경화증 등의 여러 질환에 대한 약제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 마우스의 시간에 따른 안구 발달 과정 및 Ninjurin1의 발현 변화를 보여주는 그림이다: (a)는 생후 2일령(P2), 3일령(P3), 5일령(P5), 8일령(P8), 14일령(P14) 및 성체(Adult) 마우스의 안구에서 GS-렉틴(GS-lectin)(녹색)으로 염색된 유리체 및 초기망막혈관을 보여주는 그림이고, (b)는 상기 마우스들의 안구에서 웨스턴 블랏(Western Blot)으로 Ninjurin1 단백질 발현 정도를 나타내는 그래프이며, (C)는 상기 마우스들의 안구 발달에 따른 혈관의 밀도(▲)와 Ninjurin1(●) 발현을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다(P1 에서의 값을 100%로 기준하여 나타냈다).

도 2는 마우스의 안구 내 Ninjurin1의 발현 및 위치를 보여주는 그림이다: (a)는 생후 1일령(P1), 5일령(P5) 및 14일령(P14) 마우스의 펼친(Cross-section) 안구에서 Ninjurin1(녹색)을 염색하고 세포 핵을 프로피디움 요오드화물(propidium iodide; PI)(빨강)으로 염색하여 안구에서 Ninjruin1이 발현되는 세포의 위치를 나타내는 그림이고[V(vitreous): 유리체; R(retina): 망막; 흰화살표: Ninjruin1이 발현되는 세포], (b)는 상기 펼친 안구에서 Ninjurin1(빨강)을 염색한 후, DIC 현미경 이미지로 관찰한 결과를 나타낸 그림이며, (C)는 상기 생후 5일령(P5) 마우스의 펼친 안구에서 Ninjurin1(빨강)과 VE-카드헤린(VE-cadherin)(녹색)을 이중면역염색하여 관찰한 결과를 나타낸 그림이다.

도 3은 마우스의 안구에서 혈관 주변 Ninjurin1의 발현 위치를 보여주는 그림이다: (a)는 생후 5일령(P5) 마우스의 펼친 안구에서 GS-렉틴(GS-lectin)(녹색) 과 Ninjurin1(빨강)(겹치는 경우 노란색)를 이중면역염색한 다음 형광현미경을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 그림이고, (b)는 상기 안구에서 Ninjurin1(빨강)과 ConA(녹색)(겹치는 경우 노란색)를, Ninjurin1(빨강)과 F4/80(녹색)(겹치는 경우 노란색)을, 및 Ninjurin1(빨강)과 Iba-1(녹색)(겹치는 경우 노란색)을 각각 이중면역염색한 다음 형광현미경을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 그림이고, (c)는 상기 안구에서 Ninjurin1(녹색)과 NG2(빨강)(겹치는 경우 노란색)을 이중면역염색한 다음 형광현미경을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 그림이다.

도 4는 마우스의 안구에서 혈관 주변 대식세포 및 Ninjurin1의 발현 위치를 보여주는 그림이다: (a)는 생후 5일령(P5) 안구에서 5% 젤라틴(gelatin)을 이용하여 유리체 혈관(hyaloid vessels)과 구조물을 제거한 후 펼친 안구를 GS-렉틴(GS-lectin)(녹색)과 Ninjurin1(빨강)으로 면역염색한 다음, 형광현미경을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 그림이고, (b)는 펼친 망막(retina)에서 Ninjurin1(빨강)과 유조직 미세아교세포(parenchymal microglia)(녹색)을 각각 이중면역염색한 다음 형광현미경을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 그림이다[횐색 화살표머리: 망막 혈관(retinal vessel); 노란색 화살표: 가지를 뻗은 유조직 미세아교세포)].

도 5는 마우스의 유리체에서 Ninjurin1의 발현량에 따른 혈관내피세포의 변화를 보여주는 그림이다: (a)는 생후 8일령(P8) 마우스의 유리체에서 Ninjurin1을 발현하는 대식세포가 세포자멸이 일어나는 혈관내피세포에 붙어있음을 면역형광염색 현미경을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 그림이고, (b)는 Ninjurin1 항체로 중화시킨 생후 6일령(P6) 마우스의 유리체를 GS-렉틴(GS-lectin)(녹색)으로 염색한 다음 형광현미경을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 그림이다[노란색 화살표: 혈관이 갈라진 점].

도 6은 대조군인 생후 6일령(P6) 마우스의 안구, 및 Ninjurin1 항체로 중화시킨 생후 6일령(P6) 마우스의 안구를 각각 GS-렉틴(GS-lectin)(녹색)으로 염색한 다음 형광현미경을 이용하여 관찰함으로써, Ninjurin1의 발현량의 변화에 따른 혈관 밀도의 변화를 보여주는 그림이다.

도 7은 Ninjurin1의 발현량에 따른 세포와 기질 간의 결합 정도를 보여주는 그림이다: (a)는 생후 6일령(P6) 마우스의 유리체에서 Type Ⅳ collage(빨강)과 GS-렉틴(녹색), 및 Ninjurin1(빨강)과 피브로넥틴(fibronectin)(녹색)를 각각 이중염색한 다음 형광현미경을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 그림이고, (b)는 pCS2+-Ninjurin1을 형질전환시킨 BV2 세포, 및 pCS2+-Mock을 형질전환시킨 BV2 세포에서 Ninjurin1 항체 및 control IgG로 각각 중화시킨 경우에서 기질에 대한 결합력을 보여주는 그래프이며, (c)는 pCS2+-Ninjurin1을 형질전환시킨 BV2 세포, 및 pCS2+-Mock을 형질전환시킨 BV2 세포의 다양한 기질에 대한 결합력을 보여주는 그래프이다[FN(fibronectin): 피브로넥틴; Col.Ⅰ(type Ⅰ collagen): 제 1형 콜라겐; Vit(vitronectin): 비트로넥틴; Col.Ⅳ(type Ⅳ collagen): 제 4형 콜라겐].

도 8은 Ninjurin1의 발현량에 따른 세포와 세포 간의 결합 정도를 보여주는 그림이다: (a)는 생후 3일령(P3) 마우스의 유리체에서 Ninjurin1(빨강)을 염색한 다음 형광현미경을 이용하여 관찰한 결과를 나타낸 그림이고, (b)는 야생형(wild type) BV2 세포와 Ninjurin1을 지속적으로 발현하는 BV2 세포(Ninj1-stable BV2)를 2일 동안 배양한 후 응집체 형성 여부를 보여주는 그림이며, (c)는 Mock과 Ninjurin1 발현 세포를 혼합하여 배양한 후 응집체 형성 정도를 나타내는 그래프이다.

도 9는 Ninjurin1의 발현량 변화에 따른 Wnt7b의 발현량을 보여주는 그림이다: (a)는 Myc-mock 발현 BV2 세포 및 Myc-Ninjruin1 발현 BV2 세포에서 Wnt7b의 발현 정도를 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)으로 확인한 결과를 나타내는 그림이고, (b)는 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)으로 확인한 결과를 나타내는 그림이며, (c)는 c-Myc(빨강)과 Wnt7b(녹색)의 발현을 면역염색으로 확인한 결과를 나타낸 그림이다.

도 10은 Ninjurin1의 발현량 변화에 따른 Wnt7b의 발현량을 보여주는 그림이다: (a)는 Myc-Ninjruin1 발현 BV2 세포에 Ninjurin1 항체를 처리하여 중화시킨 다음 Wnt7b의 발현 정도를 RT-PCR으로 확인한 결과를 나타낸 그림이고, (b)는 siRNA 삽입으로 Ninjurin1을 억제킨 BV2 세포에서 Wnt7b의 발현 정도를 RT-PCR으로 확인한 결과를 나타낸 그림이다.

도 11은 Ninjurin1의 발현량 변화에 따른 p38, MAPK(p44/p42) 및 JNK(p54/46)의 발현량을 보여주는 그림으로서, Myc-mock 발현 BV2 세포 및 Myc-Ninjruin1 발현 BV2 세포에서의 용해물(lysate)을 웨스턴 블랏한 결과를 나타낸 그림이다.

도 12는 p38 발현 저해에 따른 Wnt7b 발현 정도를 보여주는 그림으로서, Myc-mock 발현 BV2 세포 및 Myc-Ninjruin1 발현 BV2 세포에 p38 저해제인 SB203580 를 농도별로 처리한 후 Wnt7b의 발현 정도를 RT-PCR으로 확인한 결과를 나타낸 그림이다.

도 13은 Ninjurin1의 발현량 변화에 따른 Ang1 및 Ang2의 발현 정도를 보여주는 그림으로서, Myc-mock 발현 BV2 세포 및 Myc-Ninjruin1 발현 BV2 세포 배양액을 혈관주변세포(pericyte)에 처리한 후, Ang1 및 Ang2의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과(왼쪽), 및 Real-time PCR을 이용하여 확인한 결과(오른쪽)를 나타낸 그림이다.

도 14는 설치류 유래 대식세포주(Raw264.7, BV2) 및 BV2 세포에서 각각 Ang1 및 Ang2의 농도에 따른 Wnt7b 및 Ninjurin1의 양을 보여주는 그림으로서, 재조합 인간(recombinant human Ang1)(rh-Ang1)의 농도별로 Wnt7b 및 Ninjurin1의 양을 RT-PCR로 확인한 결과(왼쪽), 및 rh-Ang2의 농도별로 Wnt7b 및 Ninjurin1의 양을 RT-PCR로 확인한 결과(오른쪽)를 나타낸 그림이다.

도 15는 사람 유래 혈관내피세포(HUVEC 세포)에서 rh-Ang2가 있는 조건에서 Ninjurin1의 caspase3 절단 및 세포사멸 정도를 보여주는 그림이다: (a)는 Myc-mock 발현 BV2 세포 및 Myc-Ninjruin1 발현 BV2 세포 배양액을 HUVEC 세포에 처리한 다음 caspase3 절단을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 보여주는 그림이고, (b)는 Myc-mock 발현 BV2 세포 및 Myc-Ninjruin1 발현 BV2 세포 배양액을 HUVEC 세포에 처리한 후, caspase3(빨강), TUNEL(녹색) 및 핵(파랑)을 면역염색으로 확인한 결과를 나타낸 그림이다.

도 16은 Sprague-Dawley(SD)계 SPF 랫드(rat)에 LPS를 복강주사하여 염증이 유도된 상황에서 Ninjurin1의 발현 정도를 보여주는 그림이다: (a)는 LPS를 투여하여 전신적인 염증을 유도한 랫트(rat)의 안구를 Iba-1 염색(녹색)을 이용한 면역염색으로 확인한 결과를 나타낸 그림이고, (b)는 상기 안구의 유리체를 Iba-1 및 Ninjurin1 염색(빨강)을 이용한 면역염색으로 확인한 결과를 나타낸 그림이다.

도 17은 BV2 세포에 LPS를 처리한 경우에 염증의 지표인 iNOS 발현 및 Ninjurin1 발현 정도를 보여주는 그림이다: (a)는 BV2 세포에 다양한 농도의 LPS를 처리한 후 웨스턴 블랏을 이용하여 iNOS의 발현 정도를 나타낸 그림이고, (b)는 BV2 세포에 다양한 농도의 LPS를 처리한 후 웨스턴 블랏과 RT-PCR을 이용하여 Ninjurin1의 발현 정도를 나타낸 그림이다.

도 18은 Ninjurin1의 발현량 변화에 따른 iNOS의 발현 정도를 보여주는 그림이다: (a)는 Myc-mock 발현 BV2 세포 및 Myc-Ninjruin1 발현 BV2 세포에서 iNOS의 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 그림이고, (b)는 Myc-mock 발현 BV2 세포 및 Myc-Ninjruin1 발현 BV2 세포에서 iNOS의 발현량을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 그림이다.

도 19는 Ninjurin1의 발현량 변화에 따른 염증성 매개 인자인 NO의 생성 정도를 보여주는 그림으로서, Myc-mock 발현 BV2 세포 및 Myc-Ninjruin1 발현 BV2 세포에서 NO의 양을 그리스 시약(Griess reagent)으로 확인한 결과를 그래프로 나타낸 그림이다.

도 20은 Ninjurin1의 발현 감소에 따른 iNOS의 발현 정도를 보여주는 그림이다: (a)는 Ninjruin1 발현 BV2 세포에 siRNA를 삽입하여 Ninjurin1 단백질 발현을 억제한 경우에 iNOS의 발현 정도를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 그림이고, (b)는 Ninjruin1 발현 BV2 세포에 shRNA를 삽입하여 Ninjurin1 단백질 발현을 억제한 경우에 iNOS의 발현 정도를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 그림이다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Composition comprising expression or activity inhibitors of Ninjurin1 for the prevention and treatment of inflammatory disease <130> 8p-10-64 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 152 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Ser Gly Thr Glu Glu Tyr Glu Leu Asn Gly Gly Leu Pro Pro 1 5 10 15 Gly Thr Pro Gly Ser Pro Asp Ala Ser Pro Ala Arg Trp Gly Trp Arg 20 25 30 His Gly Pro Ile Asn Val Asn His Tyr Ala Ser Lys Lys Ser Ala Ala 35 40 45 Glu Ser Met Leu Asp Ile Ala Leu Leu Met Ala Asn Ala Ser Gln Leu 50 55 60 Lys Ala Val Val Glu Gln Gly Pro Ser Phe Ala Phe Tyr Val Pro Leu 65 70 75 80 Val Val Leu Ile Ser Ile Ser Leu Val Leu Gln Ile Gly Val Gly Val 85 90 95 Leu Leu Ile Phe Leu Val Lys Tyr Asp Leu Asn Asn Pro Asp Lys His 100 105 110 Ala Lys Leu Asp Phe Leu Asn Asn Leu Ala Thr Gly Leu Val Phe Ile 115 120 125 Ile Val Val Val Asn Ile Phe Ile Thr Ala Phe Gly Val Gln Lys Pro 130 135 140 Leu Met Asp Met Ala Pro Gln Gln 145 150 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 of mouse Ninjurin1 cDNA <400> 2 gggaattcca tggagtcggg cactgagga 29 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 of mouse Ninjurin1 cDNA <400> 3 ctcctcgagt tctactgccg gggcgccacg t 31 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Gapdh <400> 4 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of Gapdh <400> 5 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Ninjurin1 <400> 6 gagtcgggca ctgagga 17 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of Ninjurin1 <400> 7 gttgcagggg tctggtca 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Ang1 <400> 8 aggcttggtt tctcgtcaga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of Ang1 <400> 9 tctgcacagt ctcgaaatgg 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Ang2 <400> 10 gctgctggtt tattactgaa gaa 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of Ang2 <400> 11 tcaggtggac tgggatgttt ag 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Wnt7b <400> 12 aagaactccg agtagggagt cg 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of Wnt7b <400> 13 tgcgttgtac ttctccttga gc 22 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Wnt7b 2nd round <400> 14 ccgagtaggg agtcgagagg 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of Wnt7b 2nd round <400> 15 cacaccgtga cacttacatt cc 22 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Ang2 <400> 16 tgtgatcttg tcttggccgc 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of Ang2 <400> 17 agagggagtg ttccaagaag c 21

Claims

Ninjurin1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나, 및 Ninjurin1 단백질에 결합하는 항체를 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, Ninjurin1 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물.
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제 1항에 있어서, 염증성 질환은 류마틱성 관절염, 염증성 창자병, 강직 척추염, 건선, 죽상동맥경화증의 심화 및 다발성경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물.
약학적으로 유효한 양의 제 1항의 조성물을 염증성 질환에 걸린 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환 치료 방법.
약학적으로 유효한 양의 제 1항의 조성물을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환 예방 방법.
제 6항 또는 제 7항에 있어서, 염증성 질환은 류마틱성 관절염, 염증성 창자병, 강직 척추염, 건선, 죽상동맥경화증의 심화 및 다발성경화증으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 치료 방법.
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