JP6430945B2 - Rna活性及び血管透過性の調節 - Google Patents
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Description
第一世代のアンチセンスオリゴヌクレオチドは標的mRNAの活性に影響を及ぼすように意図された。そのようなオリゴヌクレオチドへの興味の理由の1つは特異的な塩基対合のために達成することができる精緻で予測可能な特異性についての潜在力である。mRNAのような所与の核酸について高度に特異的であるオリゴヌクレオチドを設計することは理論上非常に簡単である。しかしながら、単純な塩基対合は所与の標的mRNAの調節を達成するには十分ではない。すなわち、所与の標的mRNAに対して相補性のオリゴヌクレオチドは標的mRNAの活性に必ずしも影響を及ぼすわけではない。オリゴヌクレオチドがmRNAのオープンリーディングフレームを標的とするのであれば、それは、たとえば、翻訳装置が翻訳の間にオリゴヌクレオチドを単に置き換えるということであり得る。従って、標的mRNAのRNA分解酵素H切断を活性化することができるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの調節活性を改善する手段が開発された。しかしながら、そのようなオリゴヌクレオチドの短所の1つは、それらが意図した標的mRNA以外のRNAの切断に介在して的外れの効果を生じ得ることである。それにもかかわらず、RNA分解酵素H切断を介して作用する幾つかのオリゴヌクレオチドが種々の疾患の治療のための臨床試験に入っている。
マイクロRNA(miRNA)は、siRNAのようなRNAi機構を介して機能する内在性RNA分子の一部類である。miRNAは、miRNAのいわゆるシード配列又はシード領域を介したmiRNAの5’末端との塩基対合を介して標的遺伝子の3’UTRに結合するその能力を少なくとも部分的に介してmRNAの分解及び翻訳の双方を調節する低分子一本鎖の非コーディングRNAである。
血管透過性の厳格な制御は、血管の内膜の主な機能の1つである。内皮のこのバリア機能の喪失は、腫瘍血管の漏出、種々の呼吸窮迫症候群、化学療法の合併症と同様に急性過敏症反応を含む多数の一般的な及び臓器特異的な疾患過程の根底にある。血管透過性の制御は一般に2つのクラスに分類され;一方は漏出を誘導するトロンビン、ヒスタミン、血管内皮増殖因子(VEGF)のような刺激である。他方は、現状を持続することに対して強壮効果を発揮するアンギオポエチン−1のような分子のクラスである。最終的にこれら2つの影響は、結合構造を調節するVEカドヘリン及びPECAMのような細胞/細胞結合分子にて集中する。
本発明のオリゴヌクレオチドは通常、配列番号2で示される配列又は1、2若しくは3の置換を含む配列番号2の配列の少なくとも約9の連続する塩基、少なくとも約10の連続する塩基、少なくとも約11の連続する塩基、少なくとも約12の連続する塩基、少なくとも約13の連続する塩基、少なくとも約14の連続する塩基、少なくとも約15の連続する塩基、少なくとも約16の連続する塩基、少なくとも約17の連続する塩基、少なくとも約18の連続する塩基、少なくとも約19の連続する塩基、少なくとも約20の連続する塩基、少なくとも約22の連続する塩基、少なくとも約25の連続する塩基、少なくとも約30の連続する塩基、及び少なくとも約35の連続する塩基から成る群から選択される配列に対して相補性の連続する配列を含む。
miR−27a、その変異体又は配列UCACAGを含むシード領域を含むmiRNAの標的RNAへの結合を阻害する本発明のオリゴヌクレオチドの能力のお蔭で、本発明の態様は、細胞においてVE−カドヘリンの活性を調節する方法を提供するが、該方法は有効量の本発明のオリゴヌクレオチドに細胞を接触させ、それによってVE−カドヘリンの活性を調節することを含む。
本明細書で開示される実施形態に従って医薬組成物の形態で本発明のオリゴヌクレオチドが投与されてもよく、組成物は1以上の薬学上許容可能なキャリア、賦形剤又は希釈剤を含んでもよい。そのような組成物は、たとえば、非経口(たとえば、皮下、動脈内、静脈内、筋肉内)、経口(舌下を含む)、鼻内、又は局所の経路のような従来の又は好適な経路によって投与され得る。適当な濃度のオリゴヌクレオチドが治療される生体の部位に直接送達されることが必要とされる状況では、投与は全身性ではなく限局性であり得る。限局性の投与は、必要とされる部位への非常に高い局所濃度のオリゴヌクレオチドを送達する能力を提供するので、所望の治療効果又は予防効果を達成するのに好適である一方で、生体の他の臓器の化合物への暴露を回避し、それによって潜在的に副作用を軽減する。
以下の実施例は本発明の説明に役立つものであり、本明細書の全体を通した記載の開示の一般的性質を限定するとは決して解釈されるべきではない。
細胞培養
以前記載された(Litwin et al., 1997)とおりにHUVECを単離し、培養し、継代2〜4の間で使用した。HEK293T細胞及びHeLa細胞は10%FBSで補完したDMEM(Gibco)にて維持した。
ヒトのmiR−27aのマイクロRNA(Miridian)模倣体はDharmaconによって合成された。miR−27aのLNA阻害剤(LNA−27a)はExiqonによって設計され、合成された。ブロックミールはすべてMirrXによって設計され、合成された。ステルスRNAi(商標)siRNA標的化ヒトVE−カドヘリンmRNAはInvitrogenによって設計され、合成された。以下の実施例で記載される実験で使用したオリゴヌクレオチドの配列は表1及び本明細書の最後に現れる配列表にて提供する。
PsiCHECK VE−カドヘリンの3’UTR(WT)は、Renillaルシフェラーゼレポーター遺伝子のすぐ下流のプラスミドPsiCHECK−2(Promega)にヒトVE−カドヘリン遺伝子に由来する3’UTR全体をクローニングすることによって調製した。このプラスミドは、ルシフェラーゼ活性の内部基準化として作用するホタルルシフェラーゼ発現カセットを含有する。PsiCHECK mut−VE−カドヘリンの3’UTR(Mut)は、プラスミドPsiCHECK VE−カドヘリンの3’UTRにおけるVE−カドヘリンの3’UTRのmiR−27a結合部位を変異させることによって調製した。
製造元の指示書に従って、HiPerFect形質移入試薬(Qiagen)を用いてT25フラスコにてHUVEC細胞の形質移入を行った。フラスコ当たり4×105個の細胞で細胞を播き、24時間インキュベートした後、15nMの最終濃度でのマイクロRNA模倣体、又は30nMの最終濃度でのLNA、ブロックミール又はVE−カドヘリンsiRNAによって形質移入した。形質移入の24時間後、ルシフェラーゼ活性について細胞をアッセイした。VE−カドヘリンの再構成実験については、製造元の指示書に従って、Amaxa(登録商標)HUVEC Nucleofector(登録商標)キット(Lonza)を用いて、1μgの適当なプラスミドを15nMの最終濃度でのmiRNA模倣体と共に同時形質移入した。
以前記載された(Thomson et al., 2004)とおりにアレイを行った。各時点でプールされたこれらの生物複製物に由来するデータと共に2つの別々のHUVEC細胞株の実験に由来するRNAを用いて競合ハイブリッド形成を行った。GenePixPro 4.0(Molecular Devices)によって駆動されるGenePix 4000Bスキャナーを用いてアレイを走査した。自由に利用可能な統計的なプログラミング及びグラフィック環境R(http://cran.r−project.org)を用いて解析を行った。差次的に発現されるmiRNAは、差次的発現の大きさと一貫性の組み合わせにて遺伝子をランク付けする経験的ベイズ法(Smyth, 2004)を用いて特定した。
Limma(マイクロアレイデータの線形モデル)パッケージの中での基準化ツールを用いてアレイから生成されたSPOT出力ファイルを読み取り、基準化した。一般に、二色アレイについてのマイクロアレイの基準化には、プリントチップ群の変動のために生じ得る各アレイ内で対数比の値(M値)を基準化すること(アレイ内の基準化)と、アレイ間でのチャンネル強度(A値)を基準化することとが関与する。ここで使用されるアレイでは、プリントチップ群当たりのスポットの数が少ないために、グローバルレス法(関数「NormalizeWithinArrays」による)を用いてアレイ内基準化を行った。関数(「NormalizeWithinArrays」)による初期設定五分位数法をアレイ間基準化に用いた。
平均対数倍数変化(M):各時点対比(たとえば、3時間対0時間)での反復にわたっての各miRNAの平均log2の倍数変化を表す。
管理されたt−統計:管理されたt−統計は、標準誤差が遺伝子にわたって管理されている、すなわち、単純ベイズモデルを用いて共通の値に圧縮されていることを除いて普通のt−統計と同じ解釈を有する。
P値:所与の時点でのその遺伝子についての倍数変化の有意性を表す。これは複数の検定について調整されて調整されたp−統計を提供することができる。ベンジャミニ/ホフバーグの補正を調整に使用した。
B−統計:発現の確率対非発現の確率の対数(基本実験)オッズを表す。
製造元の指示書に従って、Trizol抽出(Invitrogen)によってHUVECから全RNAを単離した。高能力cDNA逆転写キット(Applied Biosystems)を用いて1μgのDNA分解酵素処理した全RNAから相補性のDNAをランダムプライムした。miRNA発現の解析については、製造元の指示書に従って(Applied Biosystems)TaqMan(登録商標)マイクロRNAアッセイを用いたTaqMan(登録商標)マイクロRNA逆転写キット(Applied Biosystems)を用いてcDNA合成を行った。
以前記載された(Gamble et al., 1993)ようにマトリゲルアッセイを行った。手短には、製造元の指示書に従って、マトリゲル(Becton Dickinson)を融解し、100μlのマトリゲルを平底96穴プレートに加え、37℃で1時間重合させた。次いでHUVECをHUVEC培地中ウェル当たり3.6×104個でプレートに入れた。24時間にわたって規則的な間隔で写真を撮影した。
以前記載された(Gamble et al., 2000)ように透過性アッセイを行った。手短には、形質移入の24時間後、HUVEC培地にてトランスウェル当たり1×105個でHUVEC細胞を24時間プレートに入れ、次いでさらに24時間、2%FCSのHUVEC培地に入れた。FITCを結合したデキストラン(2μg)をウェルすべての上側チャンバーに加えた。485nmの励起波長及び530nmの放射波長でLS50B発光分光計(PerkinElmer)を用いてトランスウェルの下側チャンバーにおけるFITCデキストランの量を測定した。透過性は、上側チャンバーから下側チャンバーに通過するFITCデキストランの量として得られる。形質移入処置の24時間後、miR−27aを過剰発現しているHUVECをトランスウェルに入れ、対照模倣体で形質移入した細胞と同じ方法で処理した。
氷冷した溶解緩衝液(1%のNP−40、5MのNaCl、200mMのEGTA,500mMのNaF、100mMのNa4P2O7及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを伴った1MのTris.HCl、pH7.5)にてHUVECを溶解した。Bradford試薬(BioRad)用いてタンパク質濃度を測定した。等量のタンパク質をアクリルアミドゲル上に負荷し、SDS−PAGEによって分離し、PVDF膜に移し、PBS−Tにおける5%脱脂粉乳でブロックし、VE−カドヘリン一次抗体(C−19、Santa Cruz)で探査し、その後、適当な二次抗体で探査した。洗浄後、化学発光(Amersham 8 Pharmacia Biotech)によって反応性バンドを検出した。膜を洗浄し、負荷対照としての抗β−アクチンモノクローナル抗体(Sigma)を用いて再探査した。
LabTekスライド(試験管内の技法)に48時間載せた細胞を用いて、記載された(Li et al., 2009)ように局在試験を行った。フルオレセイン用の励起フィルターを装着し、Digital Sight冷却カラーデジタルカメラ(ニコン)に捕捉されたニコンEclipseTi−U倒立顕微鏡(ニコン)上の40倍の対物レンズを用いてVE−カドヘリンの局在を観察した。NIS−AR先端研究ソフトウエア(ニコン)を用いて明度及び明暗差について画像を調整した。
以前記載された(Gamble et al., 1993)ようにコラーゲン毛細管形成アッセイを行った。20ng/mlの酢酸ミリスチン酸ホルボール(PMA)及び複合体多細胞管の形成を促進するα2β1−インテグリン(AC11)に対する抗体の添加によって毛細管形成を刺激した。
以前記載された(Zhang et al., 2006)ようにマトリゲルプラグアッセイを行った。6〜8週齢のメスC57BL/6マウスにFGF−2(0.5μg、(Sigma,MI)、90μgの対照又はmiR−27a模倣体又は模倣体なし(ビヒクル)及びFuGENE6(2.5μl)を含有する500μlのマトリゲルを皮下注射した(右脇腹)。14日後、プラグを切除し、10%パラホルムアルデヒドで固定した。5μmの断面切片をヘマトキシリン/エオシンで染色した。プラグにおける赤血球を含有する血管を100倍拡大のもとで光学顕微鏡によって定量し、3つの無作為な視野の平均値として表した。DPCコントローラ3.1.1.267ソフトウエアを用いたDP70カメラに繋いだBX51顕微鏡上にてパネルAについてはUplanFl 20X/0.50対物レンズを、パネルBについてはUPlanFl 40X/0.77対物レンズを用いて、室温にて画像を取得した。データの取得に続いて、ImageJ(NIH)を用いて明度と明暗差の調整を行った。2つの異なるバッチのmiRNA模倣体を用いて2つの別々の日に実験を行った。
Arcturus PixCell He機器を用いて小静脈及び新しい新生血管からの内皮細胞の切除を達成した。レーザーの直径を7.5μmに設定し、レーザーのパルスを0.2秒に設定した。内皮細胞をCapSure Macro LCMカップに移した。2つの内皮細胞の集団について患者当たりおよそ5〜10のLCMカップを回収した。Arcturus PixCell IIe顕微鏡(Molecular Devices)上のUPlanFl 4x/0.13、UPlanFl 10x/0.30、LCPlanFl 20x/0.40の対物レンズを用いて室温にて画像を取得し、日立1/2インチの単一チップCCDカラーカメラ(日立)に捕捉した。LCMバージョン2.0のソフトウエアを用いて明度と明暗差について画像を調整した。
以前記載された(Li et al., 2008)ように本質的に生体内透過性のモデルとしてマイルスアッセイを行った。8週齢のC57BL/6J−Tyrc−2J/Jマウスにて4μgの対照LNA又はmiR−27aLNAを背部に皮内注射した。翌日、100μlの5%エバンスブルー色素を静脈内注射し、次いで15分後、PBS又は10μgのVEGFをLNAと同じ部位に皮内注射し、30分後マウスを屠殺した。透過性は、注射部位からの青色色素の潅流として測定した。定量については、冒された領域の生検を採取し、色素を56℃で一晩ホルムアミドに溶出させ、吸光度を620nmで読み取った。合計9匹のマウスを用いた。実験は異なる2日に行った。
左の大腿の動脈及び静脈全体を結紮し、野生型のC57BL/6マウスから外科的に摘出した(Egami et al., 2006)。体重のkg当たり30mgの用量で尾静脈を介してブロックミールを全身性に注射した。高画質レーザードップラー撮像装置(英国、Moor Instruments)を用いて後肢の血流を測定した。左右両方の後肢にて様々な時点(手術前、0、1、2、3、7及び10日目)にてレーザードップラー血流(LDBF)測定を行った。レーザー走査の間、メトキシフルランでマウスを麻酔し、加熱したパッド(37℃)上に置き、体温による変動をできるだけ抑えた。最低3回の反復走査で後肢を走査した。偽手術した(右)後肢の血流に対する虚血(左)の比率を算出し、平均した。
各群8匹の動物にて、手術及びブロックミールによる処理の24時間後、0.5%のエバンスブルー(200μl)を静脈注射した。色素を30分間循環させた後、マウスを屠殺した。内転筋群の筋肉を摘出し、秤量した。組織中のエバンスブルーを55℃にて24時間ホルムアミドで抽出し、LabSystem Multiskan及びMultiSoftプレートリーダーを用いて620nmでのその蛍光を測定した。血管透過性は、筋肉のグラム重量当たりの吸光度での色素の漏出のレベルとして表した。
メトキシフルランでマウスを麻酔し、心臓穿刺によって心臓からおよそ1mLの血液を採取した。次に、頸椎脱臼にてマウスを安楽死させた。虚血四肢及び非虚血四肢の大腿内側内転筋を回収し、8μmの厚さの凍結切片として処理した。氷冷アセトンで10分間、切片を固定し、ラット抗マウスラミニン(1:1000、Abcam)、フィトエリスリンに結合させた抗CD31(1:200、Abcam)及びFITCに結合させた抗平滑筋アクチン(1:500、Abcam)を含む抗体のカクテルで染色した。切片を洗浄し、Alexa Fluor色素350(1:2000、Invitrogen Molecular Probes)に結合させた二次抗体抗ラットによって染色した。オリンパスIX71顕微鏡及びオリンパスDP71カメラ用いて各動物から、200倍拡大で(オリンパスLUCPLFLN、20倍対物レンズ、NA0.45)10の異なる無作為な顕微鏡視野を得た。取得ソフトウエアは双方ともオリンパスに由来するDPコントローラ(バージョン3.1.1.267)及びDPマネージャー(3.1.1.208)から成る。ImageJバージョン1.46aソフトウエアを用いて画像を解析した。毛細血管密度は筋細胞の数当たりの毛細血管の数として表した。
特に言及されない限り、T検定を実施した。
ヒトの倫理的な認可はオーストラリア、シドニーのRoyal Prince Alfred病院から得、動物の倫理的な認可はシドニー大学又はNSW大学のいずれかの動物倫理委員会から得た。
miRNAのマイクロアレイを用いて毛細管形成の間に調節されているマイクロRNAを特定した。結果は、正のB値及びM値に基づいて、処理の間、33の上方調節されたmiRNA及び69の下方調節されたmiRNAを明らかにした。TargetScan、PicTar及びmiRandaを含むWebに基づいた標的予測アルゴリズムを用いて透過性の調節に関与する最も調節された可能性が高いmiRNAの潜在的な標的を検討した。特に関心があるのは、固形腫瘍における細胞/細胞の相互作用及び接着に関与し、且つVEGFが介在するシグナル伝達に関与する内皮細胞特異的なカルシウム依存性の接着分子であるVE−カドヘリンを標的とすると予測されたmiR−27aだった。VE−カドヘリンの3’UTRは、後に「A」が続く成熟miRNAの2〜8位で正確に一致するmiR−27aについての単一の予測された8量体部位を含有する(シード領域+8位)。miR−27a、及びこのmiRNA群の他の2つのメンバー、miR−23a及びmiR−24のmiRNAマイクロアレイの発現プロファイルを、さらに3つの独立したHUVEC細胞株のプールを用いたqRT−PCRによって確認した(データは示さず)。
miR−27aがVE−カドヘリンの発現を調節するかどうかを判定するために、miR−27a模倣体で形質移入した細胞にてVE−カドヘリンタンパク質のレベルを測定した。VE−カドヘリンタンパク質の発現には有意な低下(25%±4%、n=5)があり(図1A及び1B)、フローサイトメトリーによって解析された細胞表面の発現(図1C)及びmRNA(31%±7%、n=5)(図1D)にて同様の大きさの低下があった。逆に、ロックド核酸(LNA)(LNA−27a;配列番号8)を含有する抗miR−27aアンチマーを用いたmiR−27のノックダウンは、VE−カドヘリンタンパク質発現の(図1E及び1F)の上方調節(22%±4%)及び細胞表面の発現(図1G)の上方調節を生じた。
上述のデータは、限定された血管形成応答を受けている血管における内皮細胞が、成熟した非血管形成性の血管における内皮細胞に比べて低下したレベルのmiR−27aを有するはずであることを示唆している。この仮説を調べるために、本発明者らは、血管形成が生じることは分かっているが、腫瘍増殖に関連しない疾患の患者に由来する血管におけるmiR−27aの発現を検討した。3人の肝硬変患者からパラフィン包埋した肝臓の切片を得た。再生結節を取り囲む線維性の領域は血管形成を介して新しい血管が形成する(新生血管)状況であることが知られ、正常な肝臓のこの領域はそのような新生血管を含まれない(Medina et al., 2004)。レーサー捕捉マイクロダイセクション(LCM)によって小静脈及び新生血管(図4A)から内皮細胞を採取し、試料からRNAを単離した。Taqman低密度アレイ(TLDA)用いて解析したmiRNAの特性は、患者間で検出されたmiRNAの数には変動があったが、3人の患者のそれぞれで新生血管と同様の数のmiRNAが小静脈で検出されることを示していた。検出されたmiRNAについての平均Ctは群間及び患者間の双方で類似していた。当初のアレイスクリーンでは、miR−520d*が高度に安定であることが見いだされたので、qRT−PCRの基準化対照として使用した。LCM試料の細胞性の純度に対処するには、捕捉された物質の量の限界のために内皮細胞又は肝細胞に特異的なmRNAのレベルを検討することはできなかった。しかしながら、肝臓のmiRNA全集団の70%を占め、他の組織では検出できない高度に豊富で肝臓特異的なmiRNAであるmiR−122(Lagos−Quintana et al., 2002))が試料のいずれでも検出されなかったということは、捕捉された細胞には肝細胞が有意には混入しなかったことを示唆している。
miRNAは、少なくとも部分的に、標的結合で使用される高度に保存されたシード配列のために複数の遺伝子を標的とすることができる。従ってmiRNAに直接結合する拮抗剤を用いてmiRNAの活性を調節することは、調節解除される複数の標的遺伝子につながり、(miRNAの)所与の機能についてどの標的が決定的であるのかを示さない。miR−27aのどの標的が透過性及び血管形成のmiR−27aの調節に決定的であるのかをさらに良く理解するために、ブロックミールを使用した。ブロックミールは、標的RNAにおける特定のmiRNA結合部位に結合し、それによって標的部位へのmiRNAの結合を妨げる立体的なアンチセンスオリゴヌクレオチド遮断剤である。本試験で使用されたブロックミールは、VE−カドヘリンのmRNAにおけるmiR−27a結合部位に相補性の15量体のLNA/2’−O−メチルオリゴヌクレオチドとして設計され、CD5−1(配列番号5)、CD5−2(配列番号6)及びCD5−3(配列番号7)と呼ばれた。
本発明者らはまた、マウスにおける後肢虚血に続く回復に対するCD5−2ブロックミールの効果も検討した。miR−27aは傷害後、最初の2日以内に迅速に下方調節され、その後、正常レベル又はやや高いレベルに戻る。虚血の誘導の直後、0日目に単回全身注射としてブロックミールCD5−2を与えた。ブロックミールは7日目に測定したとき、血流の有意な改善をもたらした(図6A)。さらに、虚血からの回復は24時間以内に明らかだった(図6B)。ブロックミールCD5−2は最初の24時間以内に虚血筋肉における浮腫の減少を生じた(図6C)。さらにCD5−2はCD31の染色で評価されたように血管形成を刺激した(図6D)。ブロックミールのmiR−27−VE−カドヘリンへの標的化に一致して、虚血筋肉の中でのCD31陽性の血管におけるVE−カドヘリンの発現で上昇があった(データは示さず)。非虚血筋肉における毛管現象に対するCD5−2の効果はなかった(データは示さず)。虚血の回復には浮腫の制限及び血管形成の程度が影響するので、これらの結果はブロックミールがこれらの態様の双方に影響していることを示している。要約すると、ブロックミールCD5−2は、虚血性傷害の時点での単回のボーラス静脈注射として送達されても虚血後の回復を向上させた。回復に関連するのは浮腫の抑制及び血管形成応答の向上だった。
VE−カドヘリンに対するブロックミールの上述の効果を考えて、本発明者らは、生体内でのこれらブロックミールの投与の腫瘍増殖に対する効果を検討した。200μlのPBS中の同系のB16F10細胞(4×105)をC57BL/6メスマウス(8週齢)の背部右脇腹領域にて皮下注射した。腫瘍が眼に見えると(B16F10細胞注射の6日後)、ブロックミールCD5−2又はスクランブル対照をマウス(1群3匹)に静脈注射した。式V=JI×[d2×D]/6を用いてノギスによって毎日、腫瘍容積を測定したが、式中、dは腫瘍の短径であり、Dは腫瘍の長径だった。図8に示すように、ブロックミールCD5−2を投与したマウスでは、スクランブル対照ブロックミールを投与したマウスよりも実質的に遅い速度で腫瘍容積が増大した。
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Claims (21)
- 配列番号1を含むRNA配列の少なくとも8の連続する塩基に対して相補性である連続する配列を含むオリゴヌクレオチドであって、
前記RNA配列は配列番号2を含み、
前記オリゴヌクレオチドが、miR−27a又は配列UCACAGを含むシード領域を含むmiRNAの前記RNAへの結合を阻害するものであり、
前記オリゴヌクレオチドが1以上の修飾された核酸塩基を含むものである、オリゴヌクレオチド。 - miR−27a miRNAが配列番号11で示されるヌクレオチド配列を含むhsa−miR−27aである請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号2の少なくとも9の塩基、少なくとも10の塩基、少なくとも11の塩基、少なくとも12の塩基、13の塩基、少なくとも14の塩基、少なくとも15の塩基、少なくとも16の塩基、少なくとも17の塩基、少なくとも18の塩基、少なくとも19の塩基、少なくとも20の塩基、少なくとも22の塩基、少なくとも25の塩基、少なくとも30の塩基、又は少なくとも35の塩基の配列に対して相補性の連続する配列を含む請求項1又は2に記載のオリゴヌクレオチド。
- オリゴヌクレオチドが配列番号2の22〜27位に結合する請求項1〜3のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- オリゴヌクレオチドと配列番号2との間での塩基対合には、配列番号2の8〜28位、8〜27位、9〜27位、10〜27位、11〜27位、12〜27位、13〜27位、14〜27位、15〜27位、16〜27位、17〜27位、18〜27位、19〜27位、20〜27位、21〜27位、9〜28位、10〜28位、11〜28位、12〜28位、13〜28位、14〜28位、15〜28位、16〜28位、17〜28位、18〜28位、19〜28位、20〜28位又は21〜28位が含まれる請求項1〜4のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- オリゴヌクレオチドが配列番号3又は配列番号4で示される配列を含む請求項1〜5のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 修飾された核酸塩基が、LNA核酸塩基、UNA核酸塩基、又は2’−O−メチル核酸塩基である請求項1〜6のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号5、配列番号6又は配列番号7で示される配列を含む請求項1〜7のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- さらに、1以上の薬学的に許容され得る担体、賦形剤又は希釈剤を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを含む組成物。
- 血管もしくは対象物における血管透過性を抑制もしくは軽減する、又は
血管透過性に関連する疾患もしくは状態を処置もしくは予防する、薬品の製造のための請求項1〜8のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。 - 血管透過性に関連する疾患又は状態が、浮腫、循環器疾患、心筋梗塞、末梢血管疾患、虚血、卒中、癌、アテローム性硬化症、乾癬、糖尿病、自己免疫疾患、血小板減少症、高山病、気圧障害、医原性疾患、細菌感染、ウイルス感染、血管漏出に関連する眼の状態から選択される請求項10に記載の使用。
- 前記自己免疫疾患が、関節リウマチである請求項11に記載の使用。
- 前記血管漏出に関連する眼の状態が、非増殖性及び増殖性の網膜症、黄斑浮腫、緑内障及び黄斑変性症から選択される請求項11に記載の使用。
- 浮腫の治療もしくは予防する、
腫瘍の増殖を抑制する、
虚血性傷害の治療及び/もしくは虚血性傷害からの回復を向上する、
手術創傷を治療するための、又は
術後回復を促進する、薬品の製造のための請求項1〜8のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。 - 浮腫が、心臓性浮腫、肺水腫、腎臓浮腫、黄斑浮腫、脳水腫、栄養不良性浮腫、リンパ浮腫、又は手術処置から生じる浮腫から選択される請求項14に記載の使用。
- 対象の細胞又は組織にて血管形成を促進する又は誘導する薬品の製造のための請求項1〜8のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- 血管形成の促進又は誘導が創傷治癒、組織修復、組織再生又は組織工学のためである請求項16に記載の使用。
- 創傷が手術創傷であり、血管形成が術後血管形成である請求項17に記載の使用。
- 手術創傷が、歯科手術、心臓手術、臓器移植手術、膝及び腰の置換手術並びに四肢の切断手術の結果生じる又はそれらに関連する請求項14又は18に記載の使用。
- VE−カドヘリンの活性を調節するために薬物を製造するための請求項1〜8のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
- VE−カドヘリンの活性を調節することが、血管透過性を抑制する若しくは軽減する、血管透過性に関連する疾患又は状態を治療する若しくは予防する、腫瘍の増殖を抑制する、虚血性傷害を治療する、虚血性傷害からの回復を向上させる、又は血管形成を促進する若しくは誘導する請求項20に記載の使用。
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