CN105861728A - 循环miRNA作为年龄相关黄斑变性诊断标志物中的应用 - Google Patents

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CN105861728A CN201610405838.8A CN201610405838A CN105861728A CN 105861728 A CN105861728 A CN 105861728A CN 201610405838 A CN201610405838 A CN 201610405838A CN 105861728 A CN105861728 A CN 105861728A
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吴岩
任成达
何梦梅
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Abstract

本发明涉及循环miRNA作为年龄相关黄斑变性诊断标志物中的应用。通过miRNA表达芯片检测新生血管性AMD患者、白内障患者之间miRNA的表达差异，从所有差异表达的miRNA中选取10个进行验证，然后扩大样本，通过荧光定量PCR的方法进行特异miRNA的表达，比较差异miRNA在AMD患者及对照组中的含量，验证其作为诊断标志物的可行性。ROC曲线分析显示：miR‑27a‑3p，miR‑29b‑3p和miR‑195‑5p的AUC分别为79.1％、72.7％和70.7％。这说明miR‑27a‑3p，miR‑29b‑3p及miR‑195‑5p可以作为年龄相关黄斑变性诊断标志物。

Description

循环miRNA作为年龄相关黄斑变性诊断标志物中的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学及医学的临床诊断技术领域，具体地说，是循环miRNA作为年龄相关黄斑变性诊断标志物中的应用。
背景技术
年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)是导致50岁以上老年人不可逆失明的最重要原因之一。美国调查显示，超过40岁人群中AMD患病率为9％。而在中国邯郸及北京进行的流行病学调查显示，老年人中AMD患病率分别为3.1％及5.5％。年龄的增长、种族差异、遗传及吸烟史是AMD发生相关的危险因素，其他因素如肥胖、心脏疾病与AMD发病关系报道不一致。尽管有饮食及生活方式干预，以及应用抗氧化药物、玻璃体内药物注射、激光光凝及光动力治疗等手段，目前对AMD的治疗尚无有效的治愈手段。
AMD最早的病理变化是出现玻璃体疣，这是AMD的标志性改变，即多形态的无细胞碎片在视网膜色素上层细胞(retinal pigment epithelium,RPE)及Bruch's膜之间的病灶沉积。玻璃体疣根据大小分为小(<63μm)、中(63-124μm)、大(>124μm)三种；根据玻璃体疣边缘形态还分为硬性及软性玻璃体疣。RPE细胞的损伤及慢性炎症反应异常可导致大片区域的视网膜萎缩或新生血管因子如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的异常，且二者可同时出现。在部分患者中，在Bruch's膜、外层视网膜及脉络膜中胶原蛋白或弹性蛋白的异常也是AMD的病理改变。脉络膜新生血管的发展与血管渗透率及脆性增加相关，而CNV与视网膜下出血、液体渗出、脂质沉积、RPE及脉络膜脱离密切相关。AMD分为干性AMD及湿性AMD，脉络膜新生血管是湿性AMD的重要标志。目前认为，AMD是基因遗传因素与环境因素共同作用的，炎症反应、细胞凋亡、胆固醇代谢改变、血管新生及氧化应激反应相互影响的复杂过程。
目前，AMD的分型及分期仍通过眼底检查结果：根据有无渗出分为干性、湿性AMD；根据玻璃体疣情况分为早期及晚期AMD。然而，一旦发现，即使为早期AMD，目前仍无确切的干预手段来阻止疾病的进展。因此，临床上迫切需要寻找有效敏感且特异的生物标志物，即一种客观的、早于临床表现的指标，将高危人群分离出来，及早给予干预。然而，疾病分子标志物的验证研究是一个复杂过程，一般通常包括五个阶段：首先是临床前期的发现和验证；其次是临床实验验证；第三是在一个完整的临床实验中评价其敏感性和特异性；第四是前瞻性评估典型疾病的大小样本分析，判定其假阳性率；最后是在疾病控制方面，发现分子标志物对疾病发生或减轻所做的贡献。疾病的生物标志物的获得通常经过漫长的过程。
微小核苷核酸(micro ribonucleic acids,miRNA)是长度为21-25个核苷酸的非编码核苷酸(ribonucleic acid,RNA)，它通过结合在靶信使核苷核酸(message ribonucleic acid,mRNA)3'非翻译区(3'untranslated region,3'UTR)诱导mRNA降解或阻止其翻译进行，从而对基因表达进行调控。研究表明，miRNAs在炎症反应、氧化应激反应、血管发生、肿瘤生长等过程中起着重要作用，部分miRNAs是重要的癌基因或抑癌基因。血清中miRNA-21及miRNA-221、miRNA-376c和miRNA-744可分别作为肝癌及胃癌的生物标志物，而在肿瘤及心血管疾病中，miRNAs作为新的治疗靶点而受到关注。miR-27a，是一个位于19p13.13的miRNA，它在肿瘤形成，细胞增殖，细胞凋亡及分化中起着重要的作用。有报道称miR-27a可以通过抑制凋亡蛋白酶激活因子(apoptotic protease activatingfactor-1，APAF-1)，调控脑部细胞对凋亡的敏感性，从而影响脑部的发育。miR-29b-3p及miR-195-5p分别位于18及17号染色体，二者在细胞分化，肿瘤形成中起着重要作用，二者还是多种疾病的诊断及预后的重要因素。
中国专利2010101627286提供了检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，包括任选的用于检测CFH基因9号外显子的rs1061170变异、15号内含子的rs1329428变异、2号外显子的rs800292变异和/或5`非编码区的rs3753394变异用于AMD筛选诊断的相关试剂。通过检测以上位点是否存在变异，检测老年黄斑变性疾病的患病风险，与AMD的关联度高。可用于早期监控和检测AMD高危人群，实施早期预防和治疗，减少其视力损害。中国专利2007101628662提供了检测老年黄斑变性疾病的试剂盒，可用于早期监控和检测AMD高危人群，实施早期预防和治疗，减少其视力损害。以HTRA1基因512G→A突变及其相关位点/基因为目标，与AMD的关联度高，协同CHF基因突变的分析，更可提高检测的准确性。然而关于本发明的循环miRNA作为新生血管性年龄相关黄斑变性诊断标志物中的应用，目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种年龄相关黄斑变性早期诊断的标志物。
本发明的再一的目的是，提供如上所述miRNA标志物的用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种年龄相关黄斑变性早期诊断的标志物，所述标志物为循环miRNA标志物，选自以下miRNA中的任意一种或多种：hsa-miR-195-5p、hsa-miR-27a-3p或has-miR-29b-3p。
所述hsa-miR-195-5p的序列为uagcagcacagaaauauuggc，所述hsa-miR-27a-3p的序列为uucacaguggcuaaguuccgc，所述has-miR-29b-3p的序列为uagcaccauuugaaaucaguguu。所述hsa-miR-195-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述hsa-miR-27a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述has-miR-29b-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。
所述年龄相关黄斑变性为干性老年黄斑变性或湿性老年黄斑变性。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的miRNA标志物的用途，用于制备检测年龄相关黄斑变性早期诊断试剂或试剂盒。
所述miRNA标志物选自以下miRNA中的一种或多种：hsa-miR-195-5p、hsa-miR-27a-3p或has-miR-29b-3p。
所述检测为血浆检测。
所述hsa-miR-195-5p的序列为uagcagcacagaaauauuggc，所述hsa-miR-27a-3p的序列为uucacaguggcuaaguuccgc，所述has-miR-29b-3p的序列为uagcaccauuugaaaucaguguu。所述hsa-miR-195-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述hsa-miR-27a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述has-miR-29b-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。
所述诊断试剂或试剂盒包括：对hsa-miR-195-5p、hsa-miR-27a-3p、has-miR-29b-3p中的一种或两种以上具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。所述hsa-miR-195-5p定量PCR引物序列如SEQ ID NO.4-5所示；所述hsa-miR-27a-3p定量PCR引物序列如SEQ ID NO.6-7所示；所述has-miR-29b-3p定量PCR引物序列如SEQ ID NO.8-9所示。
所述年龄相关黄斑变性为干性老年黄斑变性或湿性老年黄斑变性。
本发明优点在于：
本发明通过miRNA表达芯片检测新生血管性AMD患者、白内障患者之间miRNA的表达差异，从所有差异表达的miRNA中选取10个进行验证，然后扩大样本，通过荧光定量PCR的方法进行特异miRNA的表达，比较差异miRNA在AMD患者及对照组中的含量，验证其作为诊断标志物的可行性。ROC曲线分析显示：miR-27a-3p，miR-29b-3p和miR-195-5p的AUC分别为79.1％、72.7％和70.7％。这说明miR-27a-3p，miR-29b-3p及miR-195-5p可以作为年龄相关黄斑变性诊断标志物。
附图说明
附图1为CNV性AMD的眼底照，OCT及FFA结果。
附图2为凝胶电泳检测样本RNA提取质量。
附图3为相关miRNA表达聚类分析。
附图4为芯片结果GO分析结果。
附图5为AMD发病相关主要信号通路。
附图6为miRNA靶基因关系图。
附图7为miR-27a-3p的靶基因。miR-27a-3p主要与细胞分化，凋亡，增殖，迁移及侵袭相关。miR-27a-3p重要的靶基因包括Apaf-1，Hsp110，Hsp90，sFRP等基因，在诸多疾病的发展中产生作用。
附图8为miR-29a-3p的靶基因。miR-29b-3p主要与细胞凋亡，增殖，血管形成及纤维化相关。miR29b-3p重要的靶基因包括Smad3，MCL-1，VEGFA，ELN，FBN1，COL1A1，COL1A2，COL3A1等基因，在诸多疾病的发展中产生作用。VEGFA与血管形成显著相关，而COL1A1，COL1A2则与纤维化及细胞外基质形成密切联系。
附图9为miR-195-3p的靶基因。miR-195-3p主要与细胞周期，肿瘤的生长及侵袭密切相关。miR-195-3p重要的靶基因包括Bcl-w，pRb636，BDNF等基因，在诸多疾病的发展中产生作用。
附图10为干性AMD的眼底照，OCT及FFA结果。
附图11为AMD组与对照组各miRNA差异。
附图12为不同类型AMD差异表达的miRNA差异。
附图13为miR-27a-3p、miR-29b-3p和miR-195-5p的ROC曲线，ROC曲线下面积AUC分别为79.1％(95％CI＝71.4％-86.8％)，72.7％(95％CI＝64.1％-80.0％)和70.7％(95％CI＝61.7％-79.7％)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1 CNV性AMD患者循环miRNA表达谱芯片分析
一、材料与方法
1.研究对象
所有的研究对象均来自2012年6月-2012年7月于同济大学附属第十人民医院眼科就诊的患者，所有入选患者签署知情同意书。
1.1实验组(CNV性AMD患者)
1.1.1入选标准
通过眼底照相(funds photography,FP)，光学相干断层扫描(optical coherencetomography,OCT)，荧光血管造影((fluorescein fundus angiography,FFA)检查，结合视力改变，诊断为CNV性年龄相关黄斑变性的患者。
CNV性AMD诊断标准：
(1)矫正视力<0.5，可有视物变形，眼前有注视性暗影。
(2)眼底照相：有融合的边界不清的玻璃疣，黄斑区视网膜下出血。
(3)OCT：表现为视网膜色素上皮/脉络膜毛细血管层的红色反射光带，局限性增厚。CNV是较大范围的不规则增厚，同时伴有视网膜色素上皮/脉络膜毛细血管层的变形，境界清楚。
(4)眼底荧光血管造影(FFA):呈现透见荧光时，表现视网膜色素上皮萎缩，色素沉着处可有遮蔽荧光，后期有荧光素渗漏。
图1为CNV性AMD的眼底照(A)，OCT(B)及FFA(C)结果。
1.1.2排除标准
(1)眼前节的炎症，如活动性结膜炎、角膜炎、葡萄膜炎等；
(2)患有AMD以外的眼底病变，如黄斑裂孔、黄斑水肿、高度近视、视网膜血管阻塞、中心性浆液性脉络膜视网膜病变等眼底疾病；
(3)全身疾病糖尿病、恶性肿瘤、阿兹海默病、脑卒中以及自身免疫系统疾病等器质性疾病；
(4)其他原因的无法完成相关检查和研究的。
1.2对照组
1.2.1纳入标准
(1)来医就诊的白内障摘除术后患者。
(2)年龄、性别与实验组患者匹配。
1.2.2排除标准
(1)眼前节的炎症，如活动性结膜炎、角膜炎、葡萄膜炎等；
(2)患有AMD以外的眼底病变，如黄斑裂孔、黄斑水肿、高度近视、视网膜血管阻塞、中心性浆液性脉络膜视网膜病变等眼底疾病；
(3)全身疾病糖尿病、恶性肿瘤、阿兹海默病、脑卒中以及自身免疫系统疾病等器质性疾病；
(4)其他原因的无法完成相关检查和研究的。
1.3纳入对象一般情况
实验组及对照组各有6位患者，在年龄及性别上午统计学差异(P>0.05)。具体情况见下表。
实验组 对照组 P
N 6 6
眼(人) 6 6
男/女 4/2 4/2 0.727
年龄 68.5±7.8 65.7±6.9 0.525
2.主要实验设备与试剂
3.研究方法
3.1标本采集，存储及运输
研究对象抽取全血2ml，置于5ml EDTA抗凝真空管内保存。样本分装，400～500ul/管。短期保存，放入-80℃冰箱。运输过程使用足量干冰保证始终低温。
3.2RNA分离和鉴定
采用TRIZOL从全血中抽提RNA，具体步骤如下：
1、加入0.2ml全血到0.75ml TRI Reagent BD，每0.2ml全血或血浆添加20ul 5N醋酸，充分混匀。
2、将裂解液室温放置5min，使得核蛋白复合物充分解离。接下来，每0.75ml裂解液中添加0.1ml溴氯丙烷或者0.2ml氯仿，盖紧盖子，剧烈晃动15s。混合液室温放置2～5min，12,000g，4℃离心15min。离心后，混合物分为下部褐色的酚-氯仿相、中间相和上部无色的水相。RNA保留在水相中，DNA和蛋白分别在中间相和有机相中。
3、RNA沉淀：将水相层转移到新的离心管中，中间相和有机相储存在4℃以备后续实验用。向水相中加入异丙醇混匀，沉淀RNA。每0.75ml TRI ReagentBD分离得到的水相中加入0.5ml异丙醇。室温放置5-10min，12,000g，4～25℃离心8min。RNA沉淀在管底呈现为胶状或白色沉淀块。
4、清洗RNA：吸掉上清，加入75％乙醇，涡旋振荡重悬RNA沉淀。每0.75mlTRIreagent BD试剂抽提得到的RNA用1ml75％乙醇清洗。若前面的分离步骤在大离心管(>2ml)中进行的话，则将RNA-乙醇悬液转移到小离心管中。转移时使用口径处减掉2～3mm的1ml枪头7,500g，4～25℃离心5min。如果RNA沉淀在管壁上或者不能贴壁，那么使用12,000g离心。
5、溶解RNA：吸掉乙醇，将RNA沉淀自然风干5min。注意避免RNA彻底干燥，否则会降低RNA的可溶性。同时避免采用真空装置离心干燥RNA。用FORMAzol(cat.no.FO121)、水或者用枪头吹打混匀配制而成的0.5％SDS溶液溶解RNA，55～60℃温育10～15min。用于溶解RNA的水或者SDS溶液必须先用DEPC处理。
6、RNA质控：用EB染琼脂糖凝胶电泳分离的RNA，或者用亚甲基兰染转移到杂交膜上的RNA，可以看到两条主带，分别为2kb和5kb的rRNA，另外还有一条0.1～0.3kb的小分子量的RNA。提取总RNA之后质量检测标准：A260/A230值为大于2.0，A260/A280值为介于1.8-2.0之间提示RNA质量好。
3.3miRNA表达谱研究
3.3.1表达谱操作及数据分析
通过miRCURYTMHy3TM/Hy5TM标记试剂盒将经过质量检测的12例样本全血总RNA进行靶标制备，与miRCURYTM锁核苷酸芯片(v.18.0)进行芯片杂交，芯片清洗染色后通过Axon GenePix 4000B微阵列扫描仪扫描后，应用miRNA芯片分析系统(GenePix Pro 6.0软件，Axon)筛选出在两组循环中表达有差异的miRNA。我们选取一批次实验中在每张芯片上修正值都≥30的非control探针做标准化，以这部分探针中值(median)作为标准化因子对整张芯片的点做标准化处理，即各个miRNA修正值/median＝Normalized Data(标准值)。
我们采用Differentially Expressed miRNAs(Pass Volcano Plot)的miRNA的标准值进行聚类分析(hierarchical clustering)，关系近的样本或miRNA会聚到一起。相关系数R(Correlation coefficient R-value)表明重复样本之间相关性的高低或者是不同组的样本间的差别大小，重复性越好R值越大，差异越大R值越小。Scatter plot以图形方式，表明了两样本之间miRNA表达差别。两样本差异越大，其散点图距离X＝Y这条直线越远，分散程度越大。
3.3.2生物信息学分析
(1)预测数据来源和策略
采用mirbase,miranda和targetscan三个数据库的预测信息。预测最终结果取其中的重叠部分，通常情况下取3个数据预测结果的重叠部分。
(2)数据库信息
Microcosm:http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/
Miranda:http://www.microrna.org/microrna/home.do
Targetscan:the taregetscan version 6.2(http://www.targetscan.org/vert_60/)
hg19,mm9,RN34的靶基因信息来自这三个
4.统计学处理
根据实验设计分别采取两独立样本t检验(Independent sample t test)、单因素方差分析(one-way ANOVA)，卡方分析(chi-square analysis)进行统计学分析，LSD、SNK法进行组间差异比较，利用SPSS19.0软件进行上述统计学分析。P<0.05被认为具有统计学意义。每组实验重复三次，取平均值进行计算处理。
5.结果
5.1RNA提取质量检测及鉴定
共计12个样本用于循环miRNA表达谱分析，所有的样本均通过Trizol提取，并通过检测RNA溶液的吸光度及RNA的凝胶电泳来检测RNA的完整性及质量。从表1的结果可以发现，所以样本OD260/A280均在1.82至1.91之间，而OD260/230都超过1.8，提示RNA提取质量好，可以用于进一步的实验。各种RNA提取浓度在200ng/μl，也适合进一步实验。凝胶电泳(图2)显示8S和18S条带明亮、清晰、条带锐利，条带的边缘清晰，可以认为RNA的质量较好。
表1吸光度检测样本RNA提取质量
5.2差异表达miRNA分析
图3显示了芯片结果提供的聚类分析结果。经过处理背景信号、平衡芯片之间差异后，检测结果显示，从循环miRNA中共检测到216种差异表达的miRNAs(其中，表达增高有111种，表达降低有105种)。
因为差异表达miRNAs数量较大，我们对候选miRNAs组间差异P值<0.05，标准化信号强度差异变化幅度≥2倍以上者作为进一步研究的候选miRNAs。共检测到35种miRNAs，其中表达上调(倍数>2.0)有15种，表达下调(倍数<0.5)有20种，见表2。
表2芯片分析显示上调及下调的各miRNAs
5.3.生物信息学分析
5.3.1 GO分类
GO分析结果显示，AMD患者的miRNAs的GO分类中，前三位分别是细胞进程(cellular process,656)、生物调节(biological regulation,498)，代谢进程(metabotic process,490)的相关基因改变较显著(图4)。
5.3.2与miRNAs相关靶基因基因在信号通路分布
为了解与miRNAs相关靶基因基因在信号通路分布情况，我们对信号通路进行信息学分析，结果显示，涉及到AMD进展的前3位的信号通路为细胞周期(Cell cycle)相关通路，其次为细胞外基质受体相互关系(ECM-receptorinteraction)及肿瘤信号通路(Pathways in cancer)改变(图5)。由此可见，细胞周期改变在AMD发生及进展机制中起重要作用，具体内容需本研究进一步进行。
5.3.3靶基因预测
考虑到候选miRNAs可能的靶基因较多，我们将miRNAs预测出的靶基因及其相互关系作图，得出了10个最重要节点，其相应miRNAs分别为：miR-152，miR-27a-3p，miR-28-5p，miR-195-5p，miR-559，miR-328，miR-25-3p，miR-29b-3p，has-let-7c，miR-584-5p。图6显示了miRNA靶基因的关系图，各miRNA均在图中标示。图7-9显示了miR-27a-3p，miR-29b-3p及miR-195-5p的靶基因。
实施例2差异循环miRNA的验证研究
一、材料与方法
1.研究方法
所有的研究对象均来自2012年6月-2012年9月于同济大学附属第十人民医院眼科就诊的患者，均签署知情同意书。
1.1临床样本选择
1.1.1实验组
纳入标准：通过眼底照相(funds photography,FP)，光学相干断层扫描(optical coherence tomography,OCT)，荧光血管造影((fluorescein fundusangiography,FFA)检查，结合视力改变，诊断为CNV性年龄相关黄斑变性的患者。新生血管性AMD纳入标准同实施例1，干性AMD入选标准如下：
(1)视力无显著影响，所有患者中心视力均>0.4。
(2)眼底表现：可见黄斑区色素紊乱，中心凹反光不清，有散在的玻璃疣。
(3)OCT：可见小丘状中强反射隆起的病灶，伴有或不伴有RPE反射带和视网膜内外节发射带异常。
(4)眼底荧光血管造影：呈现透见荧光时，表现视网膜色素上皮萎缩，色素沉着处可有遮蔽荧光，有花边状或网状新生血管。
图10为干性AMD的眼底照(A)，OCT(B)及FFA(C)结果。
排除标准同实施例1。
1.1.2对照组纳入标准及排除标准同实施例1。
1.2纳入对象一般情况
在扩大样本的对照研究中，共125位参与者(65例实验组及60例对照组样本，包括芯片表达谱样本)纳入了研究。二组之间年龄及性别无统计学差异(P>0.05)。实验组中，干性AMD42人，湿性AMD23人。对照组以老年性白内障病人为主。
实验组 对照组 P
N 65 60
眼(人) 72(65) 60
男/女 38/27 36/24 0.503
年龄 56.5±9.8 53.7±8.6 0.09
2.主要实验设备与试剂
3.研究方法
3.1标本采集，存储及运输
研究对象抽取全血2ml，置于5ml EDTA抗凝真空管内保存，混匀，防止凝血。将样本分装，400～500ul/管，放入-80℃冰箱。
3.2RNA分离和鉴定
采用miRcute miRNA提取分离试剂盒(天根有限公司)进行RNA提取，用于扩大样本验证芯片结果，操作如下：
(1)样品处理：每200ul全血中加入等体积裂解液MZ，振荡器振荡混匀30s。
(2)室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
(3)室温12,000rpm(～13,400×g)离心10min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。
(4)加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置5min。
(5)室温12,000rpm(～13,400×g)离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
(6)量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积1/3体积的无水乙醇，混匀。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRspin，室温放置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30s，离心后弃掉吸附柱miRspin，保留流出液。
(7)量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积2/3体积的无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute，室温放置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30s，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRelute。
(8)向吸附柱miRelute中加入500μl去蛋白液MRD，室温静置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30s，弃废液。
(9)向吸附柱miRelute中加入600μl漂洗液RW，室温静置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30s，弃废液。重复一次。
(10)将吸附柱miRelute放入2ml收集管中，室温12,000rpm(～13,400×g)离心1min，去除残余液体。此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱miRelute在室温放置片刻，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验操作。
(11)将吸附柱miRelute转入一个新的1.5ml离心管中，加15–30μlRNase-free ddH2O，室温放置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心2min。
3.3质量检测
提取总RNA之后质量检测标准：A260/A230值为大于2.0，A260/A280值为介于1.8-2.0之间提示RNA质量好。
4.统计学处理
根据实验设计分别采取两独立样本t检验(Independent sample t test)、单因素方差分析(one-way ANOVA)，卡方分析(chi-square analysis)进行统计学分析，LSD、SNK法进行组间差异比较，利用SPSS19.0软件进行上述统计学分析，图中数据为平均值±标准差(mean±SD)，ROC(Receiver OperatingCharacteristic)用于特异度及敏感度的分析。P<0.05被认为具有统计学意义。每组实验重复三次，取平均值进行计算处理。
5.结果
5.1差异循环miRNA在AMD患者及对照组的表达
选取65例AMD患者(其中42例干性AMD及23例湿性AMD患者)及60例对照组。在所有的miRNA表达芯片筛选出的差异表达miRNA中，我们检测了共计10个筛选出的miRNA(其中上调的有8个：miR-152，miR-27a-3p，miR-28-5p，miR-195-5p，miR-559，miR-25-3p，miR-29b-3p，has-let-7c；下调的有2个：miR-328，miR-584-5p)。通过实时荧光定量PCR反应(hsa-miR-195-5p：F cgcagtagcagcacaga，R tccagtttttttttttttttgcca、hsa-miR-27a-3p：Fcagttcacagtggctaagttc，R cagtttttttttttttttgcggaa、has-miR-29b-3p：Fcagtagcaccatttgaaatcagt，R ggtccagtttttttttttttttaacact)，我们发现与对照组相比，miR-27a-3p，miR-29b-3p及miR-195-5p的表达显著增加，其增加倍数分别为2.76±1.78，3.04±1.97及4.13±4.00倍。而其他各miRNA的变化无显著差异(图11)。
5.2三种特异miRNA在不同类型AMD中的差异表达
通过分析验证得到的3个差异表达miRNA(miR-27a-3p，miR-29b-3p及miR-195-5p)在不同类型AMD患者全血中的表达情况，我们发现3种miRNA在干性AMD及湿性AMD中的表达均显著高于对照组含量，与之前结果一致。此外，我们发现对于miR-27a，与干性AMD患者相比，湿性AMD患者的含量更低(21.2±7.9vs 32.0±8.8，P＝0.009)，而miR-29b-3p及miR-195-5p在不同类型的AMD中则无显著的差异(P>0.05)(图12)。
5.3三种特异miRNA作为AMD分子标志物的检验效能分析
我们进一步通过ROC分析了三种差异表达的miRNA作为miRNA诊断标志物的可能性。经过ROC曲线分析，我们发现，3种miRNA均可以作为AMD的诊断标志物。结果显示miR-27a-3p(图13.A)，miR-29b-3p(图13.B)和miR-195-5p(图13.C)ROC曲线下面积(areas under curve，AUC)分别为79.1％(95％CI＝71.4％-86.8％)，72.7％(95％CI＝64.1％-80.0％)和70.7％(95％CI＝61.7％-79.7％)。当miR-27a-3p≥11.2，敏感度为83.7％，特异度为67.3％。当miR-29b-3p≥9.18，敏感度为62.1％，特异度为75.3％；当miR-195-5p≥8.32，敏感度为75.0％，特异度为53.9％。
6.讨论
miRNA表达谱芯片研究中，对循环miRNA患者及对照组直接循环miRNAs差异研究发现，以差异变化幅度≥2倍以上者作为标准发现，共检测到35种miRNAs(15种表达上调，20种表达下调)。这提示AMD患者中循环的miRNA含量的发生发展中产生了一定的变化。选取miRNA芯片确认的10个差异表达的miRNA(miR-152，miR-27a-3p，miR-28-5p，miR-195-5p，miR-559，miR-25-3p，miR-29b-3p，has-let-7c，miR-328及miR-584-5p)来进行进一步验证，结果发现与芯片结果一致，其中8个miRNA是上调的，而2个miRNA是下调的，也证明了芯片检测结果的可信性。在10个miRNA中，只有3个miRNA的变化有差异，miR-27a-3p，miR-29b-3p及miR-195-5p的分别增加了2.76，3.04及4.13倍。而在干性AMD与湿性AMD组之间，仅miR-27a-3p的含量有显著差异，湿性AMD患者的循环miR-27a-3p含量较干性AMD患者更高，提示了进一步研究miR-27a-3p作为AMD进展标志物的潜力。对3个miRNA的ROC曲线下面积均大于50％，说明这3种miRNA可作为AMD的诊断标志物。
本发明中，敏感度最好的为miR-27a-3p，为83.7％，而特异度最好的为miR-29b-3p，特异度为75.3％，特异性及敏感性之和最高的为miR-27a-3p，提示着将不同的miRNA联合使用，用于AMD的诊断，可以提高诊断的敏感度及特异度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种年龄相关黄斑变性早期诊断的标志物，其特征在于，所述标志物为循环miRNA标志物，选自如下miRNA中的任意一种或多种：hsa-miR-195-5p、hsa-miR-27a-3p或has-miR-29b-3p。
2.根据权利要求1所述的年龄相关黄斑变性早期诊断的标志物，其特征在于，所述hsa-miR-195-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述hsa-miR-27a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述has-miR-29b-3p的核苷酸序列如SEQID NO.3。
3.根据权利要求1所述的年龄相关黄斑变性早期诊断的标志物，其特征在于，所述年龄相关黄斑变性为干性老年黄斑变性。
4.根据权利要求1所述的年龄相关黄斑变性早期诊断的标志物，其特征在于，所述年龄相关黄斑变性为湿性老年黄斑变性。
5.权利要求1所述的miRNA标志物的用途，其特征在于，用于制备检测年龄相关黄斑变性早期诊断试剂或试剂盒。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述miRNA标志物选自如下miRNA中的一种或多种：hsa-miR-195-5p、hsa-miR-27a-3p或has-miR-29b-3p。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述检测为血浆检测。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述hsa-miR-195-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述hsa-miR-27a-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述has-miR-29b-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
9.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述诊断试剂或试剂盒包括：对hsa-miR-195-5p、hsa-miR-27a-3p、has-miR-29b-3p中的一种或两种以上具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物；所述hsa-miR-195-5p定量PCR引物序列如SEQ ID NO.4-5所示；所述hsa-miR-27a-3p定量PCR引物序列如SEQID NO.6-7所示；所述has-miR-29b-3p定量PCR引物序列如SEQ ID NO.8-9所示。
10.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述年龄相关黄斑变性为干性老年黄斑变性或湿性老年黄斑变性。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109632924A (zh) * 2018-12-17 2019-04-16 上海市第人民医院 人黄斑新生血管性疾病的血浆脂质标记物及其应用
CN110603592A (zh) * 2017-05-12 2019-12-20 国立研究开发法人科学技术振兴机构 生物标志物检测方法、疾病判断方法、生物标志物检测装置和生物标志物检测程序
CN113913508A (zh) * 2021-11-05 2022-01-11 宁夏医科大学 miR-195-3p检测试剂在制备诊断肝脏氧化应激损伤产品中的应用
CN113930428A (zh) * 2021-10-20 2022-01-14 中国人民解放军联勤保障部队第九〇四医院 一种用于治疗CNV的miRNA及其制备方法和应用
CN110603592B (zh) * 2017-05-12 2024-04-19 国立研究开发法人科学技术振兴机构 生物标志物检测方法、疾病判断方法、生物标志物检测装置和生物标志物检测程序

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011028550A1 (en) * 2009-08-24 2011-03-10 Merck Sharp & Dohme Corp. Segmented micro rna mimetics
EP2474617A1 (en) * 2011-01-11 2012-07-11 InteRNA Technologies BV Mir for treating neo-angiogenesis
US20120196925A1 (en) * 2009-06-05 2012-08-02 Centenary Institute Of Cancer Medicine And Cell Biology Therapeutic and Diagnostic Molecules
CN102858997A (zh) * 2009-11-02 2013-01-02 新加坡科技研究局 用于监测细胞状态和用于永生间充质干细胞的方法
CN103140582A (zh) * 2010-08-24 2013-06-05 默沙东公司 含有内部非核酸间隔子的单链RNAi试剂
WO2014013258A1 (en) * 2012-07-19 2014-01-23 Reneuron Limited Stem cell microparticles
CN104011210A (zh) * 2011-10-11 2014-08-27 布里格姆及妇女医院股份有限公司 神经退行性病症中的microRNA
CN104995300A (zh) * 2012-10-02 2015-10-21 百年癌症药物与细胞生物学研究所 Rna活性和血管通透性的调节
WO2015171510A2 (en) * 2014-05-05 2015-11-12 The Regents Of The University Of California Circulatory micrornas (mirnas) as biomarkers for diabetic retinopathy (dr) and age-related macular degeneration (amd)
WO2016027162A2 (en) * 2014-08-19 2016-02-25 Tataa Biocenter Ab Methods and compositions for nucleic acid detection

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120196925A1 (en) * 2009-06-05 2012-08-02 Centenary Institute Of Cancer Medicine And Cell Biology Therapeutic and Diagnostic Molecules
WO2011028550A1 (en) * 2009-08-24 2011-03-10 Merck Sharp & Dohme Corp. Segmented micro rna mimetics
CN102858997A (zh) * 2009-11-02 2013-01-02 新加坡科技研究局 用于监测细胞状态和用于永生间充质干细胞的方法
CN103140582A (zh) * 2010-08-24 2013-06-05 默沙东公司 含有内部非核酸间隔子的单链RNAi试剂
EP2474617A1 (en) * 2011-01-11 2012-07-11 InteRNA Technologies BV Mir for treating neo-angiogenesis
CN104011210A (zh) * 2011-10-11 2014-08-27 布里格姆及妇女医院股份有限公司 神经退行性病症中的microRNA
WO2014013258A1 (en) * 2012-07-19 2014-01-23 Reneuron Limited Stem cell microparticles
CN104995300A (zh) * 2012-10-02 2015-10-21 百年癌症药物与细胞生物学研究所 Rna活性和血管通透性的调节
WO2015171510A2 (en) * 2014-05-05 2015-11-12 The Regents Of The University Of California Circulatory micrornas (mirnas) as biomarkers for diabetic retinopathy (dr) and age-related macular degeneration (amd)
WO2016027162A2 (en) * 2014-08-19 2016-02-25 Tataa Biocenter Ab Methods and compositions for nucleic acid detection

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MACIEJ SZEMRAJ等: "Serum microRNAs as potential biomarkers of AMD", 《MED SCI MONIT》 *
梁厚成等: "视网膜色素上皮细胞氧化应激相关microＲNA 的鉴定", 《国际眼科杂志》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110603592A (zh) * 2017-05-12 2019-12-20 国立研究开发法人科学技术振兴机构 生物标志物检测方法、疾病判断方法、生物标志物检测装置和生物标志物检测程序
CN110603592B (zh) * 2017-05-12 2024-04-19 国立研究开发法人科学技术振兴机构 生物标志物检测方法、疾病判断方法、生物标志物检测装置和生物标志物检测程序
CN109632924A (zh) * 2018-12-17 2019-04-16 上海市第人民医院 人黄斑新生血管性疾病的血浆脂质标记物及其应用
CN109632924B (zh) * 2018-12-17 2022-02-08 上海市第一人民医院 人黄斑新生血管性疾病的血浆脂质标记物及其应用
CN113930428A (zh) * 2021-10-20 2022-01-14 中国人民解放军联勤保障部队第九〇四医院 一种用于治疗CNV的miRNA及其制备方法和应用
CN113930428B (zh) * 2021-10-20 2023-04-25 中国人民解放军联勤保障部队第九〇四医院 一种用于治疗CNV的miRNA及其制备方法和应用
CN113913508A (zh) * 2021-11-05 2022-01-11 宁夏医科大学 miR-195-3p检测试剂在制备诊断肝脏氧化应激损伤产品中的应用

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