CN111850112B

CN111850112B - 一种眼底血管性疾病检测生物标记物、检测试剂盒及应用

Info

Publication number: CN111850112B
Application number: CN202010820583.8A
Authority: CN
Inventors: 颜标; 蒋沁; 刘明
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-08-14
Filing date: 2020-08-14
Publication date: 2021-04-23
Anticipated expiration: 2040-08-14
Also published as: CN111850112A

Abstract

本发明属于生物医学检测技术领域，尤其涉及一种眼底血管性疾病检测生物标记物、检测试剂盒及应用。该试剂盒主要包括RNA提取体系、反转录体系和PCR反应体系。本发明试剂盒采用荧光定量PCR技术，对2个环状RNA，即hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284进行表达水平及表达差异情况的检测，为眼底血管性疾病提供了新的检测标记物和预后评估方法，本发明提供的试剂盒具有创伤性小和操作简单等特点。

Description

一种眼底血管性疾病检测生物标记物、检测试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物医学检测技术领域，尤其涉及一种眼底血管性疾病检测生物标记物、检测试剂盒及应用。

背景技术

眼底血管性疾病是一类以眼底血管病变为特征的疾病，发病率逐年增高，已经成为全球公共卫生问题和社会经济负担。眼底血管性疾病包括增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)、湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、早产儿视网膜病变(ROP)等。此类疾病已经成为从婴幼儿到老年人各个年龄阶段致盲和视力障碍的最主要原因，严重影响了患者的生活质量。该类疾病的重要病理特征为：视网膜无灌注、血管通透性增加和视网膜新生血管形成，其病程多累及黄斑、视盘，造成视力的严重损害甚至失明。目前，局部药物干预手段包括糖皮质激素治疗和玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子；手术治疗包括玻璃体切割、激光光凝和光动力学疗法。目前现有的治疗方法具有一定的局限性和较多的副作用。因此，寻找眼底血管性疾病的生物标志物，有助于探索底血管性疾病的发病机制、辅助诊断和判断疾病的进程，评估治疗效果。

环状RNA(circRNA)在真核细胞质中大量存在，是一类不具有5’末端帽子和3’末端poly尾巴以共价键形成环形结构的非编码RNA。与传统线性RNA相比，具有表达稳定性和序列高保守性等特征。circRNA参与生物体内多种生理过程的调控，包括细胞增殖、细胞分化、细胞周期和基因组印记等。circRNAs表达异常与许多疾病的发生发展(如肿瘤、心血管疾病和神经疾病等)密切相关。鉴于circRNA的特征及其疾病相关性，其有望成为诊断标志物和潜在药物靶点。

房水属于眼内部物，由睫状体产生，经过瞳孔、小梁网等最终进入血液，且处于动态循环之中，其构成成分与眼部的局部生理及其病理环境密切相关。房水中含有大量的外泌体，外泌体作为机体内至关重要的细胞间相互交流的中介物质，包含circRNA、蛋白质、mRNA及其脂质等。房水中的circRNAs等分子可以通过外泌体形式进行细胞间的信息交流。针对房水中circRNA的表达检测，可以反映疾病的状态。迄今为止关于circRNA作为眼底血管性疾病诊断标志物的研究较少。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种眼底血管性疾病检测生物标记物、检测试剂盒及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种眼底血管性疾病检测生物标记物，所述标记物为hsa_circ_0000615和/或hsa_circ_0000284，所述hsa_circ_0000615的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述hsa_circ_0000284的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述标记物为房水中的circRNA。

进一步地，所述hsa_circ_0000615的检测引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；所述hsa_circ_0000284的检测引物如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

一种眼底血管性疾病检测实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR扩增体系，所述PCR扩增体系包括SYBR Premix Ex Taq 2×(包括Ex Taq酶，dNTP Mixture，Mg2+，TliRNaseH，TB Green)100μL，hsa_circ_0000615或hsa_circ_0000284特异性的qRT-PCR上游引物，hsa_circ_0000615或hsa_circ_0000284特异性的qRT-PCR下游引物，GAPDH定量PCR上游引物，GAPDH定量PCR下游引物；，引物各1管，10μM，100μL/管。

进一步地，所述hsa_circ_0000615或hsa_circ_0000284的特异性qRT-PCR引物序列如权利要求2所示；所述GAPDH定量PCR上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如SEQ ID NO:4所示。

进一步地，所述试剂盒还包括反转录反应体系，所述反转录反应体系包括总RNA反转录引物(包括Oligo dT和Random 6mers)，1管，浓度：50μM，50μL/管，反转录酶(200U/μL)50μL，dNTP Mixture(10mM each)50μL，反转录buffer 50μL。

进一步地，所述试剂盒还包括RNA抽提体系，所述RNA抽提体系包括Trizolreagent，1管，2000μL/管；氯仿，1管，500μL/管；无水乙醇，1管，8000μL/管；DEPC ddH₂O，1管，1000μL/管；ddH₂O，1管，2000μL/管；异丙醇，8000μL/管。

如上述的生物标记物在制备眼底血管性疾病诊断试剂中的应用，特别是在制备基于实时荧光定量PCR技术检测眼底血管性疾病诊断试剂中的应用。

如上述的生物标记物在制备眼底血管性疾病治疗后的预后评估试剂中的应用，特别是在制备基于实时荧光定量PCR技术进行眼底血管性疾病治疗后的预后评估试剂中的应用。

进一步地，所述眼底血管性疾病包括糖尿病视网膜病变、黄斑变性伴发脉络膜新生血中的至少一种。

本发明中确定hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284作为眼底血管性疾病的诊断标记物包括如下步骤：

第一步：样本准备：收集白内障病人的房水标本(对照组)、增殖性糖尿病视网膜病变(实验组)、湿性老年黄斑变性(实验组)，RNA采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取，并保存于-80℃备用。

第二步：采用反转录试剂盒进行total RNA的逆转录；

第三步：采用定量PCR验证芯片分析的实验结果，验证靶点hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284在不同房水样本中的表达差异。

本发明的另一目的在于分析hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284作为眼底血管性疾病的预后效果评估的可行性。实验步骤包括：

第一步：样本准备：收集增殖性糖尿病视网膜病变(实验组)和湿性老年黄斑变性(实验组)病人治疗前后的房水标本，RNA采用TRIzol(Invitrogen)试剂提取，并保存于-80℃备用。

第二步：采用反转录试剂盒进行total RNA的逆转录；

第三步：采用定量PCR验证芯片分析的实验结果，验证靶点hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284在不同房水样本中的表达差异情况。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明提供了环状RNA hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284的新用途，可作为诊断试剂用于眼底血管性疾病的诊断，特别是增殖性糖尿病视网膜病变和湿性老年黄斑变性中的诊断和预后评估，可根据个体的circRNA表达水平进行眼底血管性疾病的诊断和病情发展的判断。

本发明证明通过定量PCR技术，检测患者房水中hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284的表达来实现眼底血管性疾病的早期诊断是完全可行的。

本发明的试剂盒还适用于早期筛查：根据患者年龄、病史以及局部体征初步怀疑为眼底血管性疾病的患者。

用本发明的试剂盒分别检测若干已知的眼底血管性疾病患者及若干的正常患者房水中hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284含量，以此作为标准。再用相同的方法测定未知患者房水hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284含量，对照上述标准数据，以此可以初步判断患者是否患有眼底血管性疾病，以便进一步确诊。

本发明的试剂盒是首次利用定量PCR方法，通过检测房水中hsa_circ_0000615和/或hsa_circ_0000284含量，以辅助眼底血管性疾病的诊断和预后评估，具有创伤性小和操作性强的特点。hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284有望成为眼底血管性疾病发生和患者预后判断的生物标记物。

附图说明

图1是实施例1眼底血管性疾病的房水中定量PCR检测结果；横坐标代表不同患者房水标本，纵坐标代表hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284的表达水平；

图2是实施例2眼底血管性疾病的治疗前后，房水标本的定量PCR检测结果，横坐标代表眼底血管性疾病房水标本，纵坐标代表hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284的表达水平。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明披露了一种眼底血管性疾病检测生物标记物、检测试剂盒及应用，具体如下各实施例所示。本发明中的RNA提取及逆转录等过程可参照市场购买的试剂盒操作。

实施例1hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284在眼底血管性疾病诊断中的应用

房水样本及处理：收集200例糖尿病性视网膜病变患者(PDR)患者的房水，200例老年黄斑变性(AMD)患者伴发脉络膜新生血管(CNV)患者的房水，同时收集200例白内障(不伴有眼底病变)患者的房水匹配作为对照。

实验过程

步骤一、获得待检房水样本

样本为眼底血管性疾病和白内障患者的房水样本。

步骤二、从待检房水样本中提取RNA

a)取0.03ml房水样本移至离心管中，加1ml Trizol，用移液枪上下反复吸打直至细胞完全裂解。

b)加入氯仿(样品液+Trizol Reagent体积总量的1/5体积量)盖紧离心管盖，剧烈振荡15sec，室温静置3-5min；

c)4℃离心，12,000g×15min，从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)；

d)向上清液中加入等体积的遇冷的异丙醇，涡旋充分混匀；

e)4℃离心，12,000g×10min，一般在离心后，试管底部会出现沉淀，弃上清。

f)加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，弃去上清；

g)加入1ml无水乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，弃去上清；

h)室温晾干加入适量的DEPC H₂O溶解(65℃促溶10-15min)，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀。

i)BioDrop紫外可见分光光度计测量RNA的纯度及浓度。

步骤三、将获得的RNA逆转录成cDNA

采用TaKaRa公司PrimeScript^TM RT reagent Kit，按照试剂盒提供的体系(25μL)配置如下：5×PrimeScript^TM Buffer 4μL，PrimeScript^TM RT Enzyme Mix I 1μL、OligodT Primer(50μM)1μL、Random 6mers(100μM)4μL，total RNA 2μL，RNase free ddH₂O 13μL。按下面程序反转为cDNA：37℃ 15min，85℃ 5sec，得到的cDNA放于-20℃中保存。

步骤四、实时荧光定量PCR

取本发明所述试剂盒的PCR反应体系(50μL)，采用TaKaRa公司SYBR Premix ExTaq，按照说明书提供的体系配置如下：SYBR Premix Ex Taq 25μL，特异性的qRT-PCR上游引物、下游引物各1μL(特异性识别hsa_circ_0000615或hsa_circ_0000284或GAPDH)，待测样品cDNA 2μL，RNase free ddH₂O补足至50μL。

PCR条件：92℃5min；92℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30sec，40个循环；72℃，5min。

本申请中hsa_circ_0000615的检测引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；hsa_circ_0000284的检测引物如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；GAPDH定量PCR上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如SEQ ID NO:4所示。

五、数据分析

对同一样本分别进行目标RNA和内参RNA实时荧光定量PCR检测，以内参的表达量为基准，对目标RNA进行归一化处理，随后对目标RNA的相对表达量采用本领域通用的DeltaCt法分析：将所有房水样本的目的基因hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284的Ct值减去自身内参基因GAPDH的Ct值，得到所有房水样本的Delta Ct值(ΔCt)，公式表达为ΔCt＝Ct(目的基因)-Ct(内参基因GAPDH)。实验重复三次，对结果进行统计分析，通过比较糖尿病视网膜病变患者的房水样本、老年黄斑变性(AMD)患者伴发脉络膜新生血管(CNV)患者的房水样本和白内障(不伴有眼底病变)患者的房水样本中的hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284的表达差异，判断待测病人的疾病易感性。

六、结果判断

图1为实时荧光定量PCR分析hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284在糖尿病视网膜病变患者(PDR)、老年黄斑变性(AMD)患者伴发脉络膜新生血管(CNV)患者和白内障(不伴有眼底病变)患者房水中的相对表达差异(各从200例中选取的50例典型病例)。通过实时荧光定量PCR的方法检测靶点hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284在所有病例中的表达水平并得出各组样本的ΔCt范围如表1所示。

表1：各组样本的ΔCt范围

根据上述结果，分别收取经临床影像学诊断确诊的200例眼底血管性疾病(包括PDR、AMD伴发CNV)和200例非眼底血管性疾病患者血清样本，分别进行hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284血清含量分析。评价基于检测hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284血清含量的准确度和灵敏度，结果如表2所示。表明hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284可作为眼底血管性疾病诊断的生物学标记物用于眼底血管性疾病的诊断。

表2：基于hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284方法检测的准确率

实施例2hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284作为预后评估标记的可行性应用

步骤一、获得待检房水样本

收集抗新生血管治疗前后的200例糖尿病性视网膜病变患者(PDR)患者的房水和200例老年黄斑变性(AMD)患者伴发脉络膜新生血管(CNV)患者治疗前后的房水标本。

步骤二、从待检房水样本中提取RNA

b)加入氯仿(样品液+Trizol Reagent体积量的1/5体积量)盖紧离心管盖，剧烈振荡15sec，室温静置5min；

d)向上清液中加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；

i)BioDrop紫外可见分光光度计测量RNA的纯度及浓度。

步骤三、将获得的RNA逆转录成cDNA

采用TaKaRa公司PrimeScript^TM RT reagent Kit，按照试剂盒提供的体系(25μL)配置如下：5×PrimeScript^TM Buffer 4μL，PrimeScript^TM RT Enzyme Mix I 1μL、OligodT Primer(50μM)1μL、Random 6mers(100μM)4μL，total RNA 2μL，RNase free ddH₂O 13μL。按下面程序反转为cDNA：37℃15min，85℃5sec，得到的cDNA放于-20℃中保存。

步骤四、实时荧光定量PCR

PCR条件：92℃ 5min；92℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30sec，40个循环；72℃，5min。

五、数据分析

基因表达值用Delta Ct的方法计算，假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100％且相对偏差不超过1Ct；ΔCt＝目的基因Ct均数-参照基因Ct均数，其中参照基因选择GAPDH；分别确定正常人和眼底血管病变病人的ΔCt范围。

六、结果判断

计算出待测样本的ΔCt，分析其在抗新生血管治疗前后的变化情况。结果如图2所示：收集抗新生血管治疗前后的糖尿病性视网膜病变患者(PDR)患者和老年黄斑变性(AMD)患者伴发脉络膜新生血(CNV)患者抗新生血管治疗前后的房水标本；采用Trizol试剂提取总RNA，通过反转录PCR的方法得到总RNA的cDNA；通过实时荧光定量PCR的方法分别检测靶点hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284的表达水平(各从200例中选取的50例典型病例，如图2所示)。图2为实时荧光定量PCR分析hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284在抗新生血管治疗前后PDR患者和AMD伴发CNV患者房水中的表达差异，结果表明hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284在接受抗新生血管治疗后的PDR患者和AMD伴发CNV患者房水中表达明显下调，说明hsa_circ_0000615和hsa_circ_0000284有望成为评估抗新生血管治疗疗效及预后情况的靶标。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 蒋沁

<120> 一种眼底血管性疾病检测生物标记物、检测试剂盒及应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 874

<212> DNA

<213> hsa_circ_0000615

<400> 1

caatgatgtt gtccactggg catgtactga ccaatgtggc aggtctgaga acatagctga 60

agctgaaaat aggaaagctg ggggcaagga agagccttga atcttgaggt gggacgttga 120

ctctaagatg tccttgagca gtggagcctc cggagggaaa ggagtggatg caaacccggt 180

tgagacatac gacagtgggg atgaatggga cattggagta gggaatctca tcattgacct 240

ggacgccgat ctggaaaagg accagcagaa actggaaatg tcaggctcaa aggaggtggg 300

gataccggct cccaatgctg tggccacact accagacaac atcaagtttg tgaccccagt 360

gccaggtcct caagggaagg aaggcaaatc aaaatccaaa aggagtaaga gtggcaaaga 420

cactagcaaa cccactccag ggacttccct gttcactcca agtgaggggg cagctagcaa 480

gaaagaggtg caggggcgct caggagatgg tgccaatgct ggaggcctgg ttgctgctat 540

tgctcccaag ggctcagaga aggcggctaa ggcatcccgc agtgtagccg gttccaaaaa 600

ggagaaggag aacagctcat ctaagagcaa gaaggagaga agcgaaggag tggggacttg 660

ttcagaaaag gatcctgggg tcctccagcc agttcccttg ggaggacggg gtggtcagta 720

tgatggaagt gcaggggtgg atacaggagc tgtggagcca cttgggagta tagctattga 780

gcctggggca gcgctcaatc ctttgggaac taaaccggag ccagaggaag gggagaatga 840

gtgtcgcctg ctaaagaaag tcaagtctga aaag 874

<210> 2

<211> 1099

<212> DNA

<213> hsa_circ_0000284

<400> 2

gtatggcctc acaagtcttg gtctacccac catatgttta tcaaactcag tcaagtgcct 60

tttgtagtgt gaagaaactc aaagtagagc caagcagttg tgtattccag gaaagaaact 120

atccacggac ctatgtgaat ggtagaaact ttggaaattc tcatcctccc actaagggta 180

gtgcttttca gacaaagata ccatttaata gacctcgagg acacaacttt tcattgcaga 240

caagtgctgt tgttttgaaa aacactgcag gtgctacaaa ggtcatagca gctcaggcac 300

agcaagctca cgtgcaggca cctcagattg gggcgtggcg aaacagattg catttcctag 360

aaggccccca gcgatgtgga ttgaagcgca agagtgagga gttggataat catagcagcg 420

caatgcagat tgtcgatgaa ttgtccatac ttcctgcaat gttgcaaacc aacatgggaa 480

atccagtgac agttgtgaca gctaccacag gatcaaaaca gaattgtacc actggagaag 540

gtgactatca gttagtacag catgaagtct tatgctccat gaaaaatact tacgaagtcc 600

ttgattttct tggtcgaggc acgtttggcc aggtagttaa atgctggaaa agagggacaa 660

atgaaattgt agcaatcaaa attttgaaga atcatccttc ttatgcccgt caaggtcaaa 720

tagaagtgag catattagca aggctcagta ctgaaaatgc tgatgaatat aactttgtac 780

gagcttatga atgctttcag caccgtaacc atacttgttt agtctttgag atgctggaac 840

aaaacttgta tgactttctg aaacaaaata aatttagtcc cctgccacta aaagtgattc 900

ggcccattct tcaacaagtg gccactgcac tgaaaaaatt gaaaagtctt ggtttaattc 960

atgctgatct caagccagag aatattatgt tggtggatcc tgttcggcag ccttacaggg 1020

ttaaagtaat agactttggg tcggccagtc atgtatcaaa gactgtttgt tcaacatatc 1080

tacaatctcg gtactacag 1099

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtaagacccc tggaccacca 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caaggggtct acatggcaac t 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcaagtctg aaaagcaatg 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aggacatctt agagtcaacg t 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caatctcggt actacaggta tg 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcacataggt ccgtggatag 20

Claims

1.检测房水中的hsa_circ_0000615或hsa_circ_0000284的qRT-PCR引物在制备眼底血管性疾病诊断试剂中的应用，所述眼底血管性疾病为老年黄斑变性伴发脉络膜新生血管，所述hsa_circ_0000615的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述hsa_circ_0000284的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。