CN114134226B - 心绞痛相关的标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子诊断技术领域，尤其是涉及心绞痛相关的标志物及其应用。所述标志物包括来自血浆的外泌体hsa_circ_0075269、外泌体hsa_circ_0000284中的一种或两种；所述外泌体hsa_circ_0075269的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述外泌体hsa_circ_0000284的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。外泌体hsa_circ_0075269、外泌体hsa_circ_0000284中的一种或两种联合作为心绞痛检测的生物标志物，比传统的生物标志物灵敏度更高、特异性更高，检测更加快捷简单，成本更低。

Description

心绞痛相关的标志物及其应用
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域，尤其是涉及心绞痛相关的标志物及其应用。
背景技术
冠状动脉疾病(CAD)仍然是世界范围内发病率和死亡率的主要原因，尽管血运重建和最佳的二级预防治疗已被发现。心绞痛(AP)是一种由心肌短暂缺血缺氧引起的临床综合征，决定冠心病患者的生活质量和预后。因此，有必要为AP的早期诊断和预后确定合适的新生物标志物，因为这些可能有助于CAD新的有益治疗。
早期发现和干预冠状动脉粥样硬化病对于减少心血管病事件具有重要的意义。越来越多的证据提示，应用一些反映特定病理生理特征的生物标志物，如氧化应急血管炎症、血小板激活、斑块去稳定和破裂等，以及坏死标记物，可能提高对冠脉病变的识别和危险分层。肌钙蛋白作为一种心肌坏死标志物用于心肌梗死的诊断，其地位和价值已得到充分证明。但是目前在心绞痛中还没有发现这样的理想标志物：如早期在血液中增高，高度敏感又特异，检测简便又廉价。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种血浆外泌体标志物在制备心绞痛检测标志物中的应用，该标志物与传统检测心绞痛的标志物相比更加敏感，特异性更高，检测更加快捷方便，成本更低。本发明还提供了一种血浆外泌体标志物在制备心绞痛的诊断产品中的应用。
本发明提供一种血浆外泌体标志物在制备心绞痛检测标志物中的应用，所述标志物包括来自血浆的外泌体hsa_circ_0075269、外泌体hsa_circ_0000284中的一种或两种；所述外泌体hsa_circ_0075269的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述外泌体hsa_circ_0000284的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选地，所述标志物为外泌体hsa_circ_0075269和外泌体hsa_circ_0000284。
优选地，所述标志物为外泌体hsa_circ_0075269、外泌体hsa_circ_0000284和甘油三酯。
本发明提供一种血浆外泌体标志物在制备心绞痛的诊断产品中的应用，所述标志物包括来自血浆的外泌体hsa_circ_0075269、外泌体hsa_circ_0000284中的一种或两种；所述外泌体hsa_circ_0075269的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述外泌体hsa_circ_0000284的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选地，所述诊断产品为芯片、制剂或试剂盒。
经研究发现，外泌体hsa_circ_0075269在AP患者中具有很高的表达水平，是NCCP(非心源性胸痛)组的3.98倍，其诊断AP的ROC曲线下面积为0.761；外泌体hsa_circ_0000284同时也具有很高的表达水平，是NCCP组的2.5倍，其诊断AP的ROC曲线下面积为0.623；外泌体hsa_circ_0075269和外泌体hsa_circ_0000284联合诊断AP的ROC曲线下面积为能达到0.818；外泌体hsa_circ_0075269和外泌体hsa_circ_0000284联合TG(甘油三酯)诊断AP的ROC曲线下面积能达到0.838。
综上所述，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供的外泌体hsa_circ_0075269相较于外泌体hsa_circ_0006577、外泌体hsa_circ_0018886、外泌体hsa_circ_0092019在AP患者中的表达水平明更高，在心绞痛诊断中更加灵敏、特异性更强。
(2)本发明提供的标志物外泌体hsa_circ_0075269和外泌体hsa_circ_0000284联合诊断AP时，同样具有很高的表达水平，灵敏度高，特异性强。
附图说明：
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中从血浆中提取的外泌体(bar，200nm)的TEM图像；
图2为本发明实施例中血浆外泌体的粒径分布图；
图3为本发明实施例中外泌体标志蛋白CD63和HSP70的Western blot分析图；
图4为本发明实施例中差异表达circRNAs的火山图和柱状图；
图5为本发明实施例中小样本量验证结果图；
图6为本发明实施例中大样本量验证结果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
一、实验主要试剂与厂家名称如下：
Trizol购于Lnvitrogen公司；Transcriptor First Strand cDNA synthesis kit(第一链cDNA合成试剂盒)购于Roche；Select SYBR master mix购于ABI公司；PBS购于Biolegend公司；10％SDS(十二烷基磺酸钠)、10％过硫酸铵、1.0MTris-HCl(pH＝6.8)、30％丙烯酰胺、10X封闭洗涤缓冲液、10X电泳缓冲液、10X电转移缓冲液购于北京普利莱基因技术有限公司；DEPC水、1.5MTris-HCl(pH＝8.8)、Western蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生技术有限公司；TEMED(四甲基乙二胺)购于Scienctific ResearchSpecial；NC膜购于Hyclone；DifcoTM Skim Milk购于BD；CD63抗体、HSP70抗体、GAPDH抗体购于abcam公司；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗购于北京力高泰科技公司；外泌体提取试剂盒(货号217184)、外泌体RNA提取试剂盒(货号为76064)购于QIAGEN；逆转录试剂盒购于Promega；荧光定量PCR试剂盒购于Thermo Fisher；18S RNA购于奥科鼎盛生物科技有限公司。
二、实验方法
2.1患者标本收集
选取2016年10月至2018年3月首都医科大学附属北京朝阳医院住院的患者218例，其中AMI(心绞痛)患者135例、NCCP(非心源性胸痛)患者83例。记录入患者性别、年龄、吸烟史、饮酒史、SBP(收缩压)、DBP(舒张压)、TC(总胆固醇)、TG(甘油三酯)、HDL(高密度脂蛋白)、LDL(低密度脂蛋白)等临床资料。
入选标准：心绞痛的诊断依据冠状动脉各节段狭窄的百分比，其中至少有一个冠状动脉狭窄超过50％(左冠状动脉主干、前降支、回旋动脉、右冠状动脉)。对照组为冠脉造影显示冠状动脉无狭窄的非心源性胸痛患者。
排除标准：心肌梗死(TNI/TNT或CK-MB升高)、甲状腺功能减退、支气管哮喘、慢性肾病、恶性肿瘤等。
2.2采血、分离血浆
用采血针和抗凝管(含EDTA)采集病人入院次日早晨的空腹静脉血20mL,混匀后在4℃下静置3-4h。在3000rpm、4℃下离心10min，上清液即为血浆，用0.2μm滤器过滤，1mL/管分装后在-80℃保存。
2.3血浆提取外泌体
使用外泌体提取试剂盒从血浆中分离外泌体，方法如下：
(1)从-80℃冰箱中取出冻存血浆，在37℃金属浴中融化，在10000g下离心15min取上清液，取4mL血浆到新的15mL离心管中；
(2)加入1倍体积的XBP缓冲液轻轻颠倒管子5次，室温孵育；再将混合液放进柱子里500g离心1min，倒掉废液将柱子重新放回离心管中；
(3)加入10mLXWP缓冲液在3000g离心5min，将柱子重新转移到一个新的离心管中；
(4)最后加1mLXE缓冲洗脱液到柱子里，孵育1min，在500g离心5min后收集滤液，重新加到柱子上，再次孵育1min，在3000g离心5min；
(5)收集滤液(即外泌体)到一个新的无RNA酶EP管中，在-80℃保存。
2.4外泌体粒径分析
外泌体原液中加入1ml磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)，混匀。使用纳米颗粒跟踪分析仪Zeta View-Particle Metrix进行测量，将样品注入样品池。打开软件调节亮度和焦距，调整视野，进行观测，使用软件根据颗粒运动轨迹的时间与位移分析其粒径。
2.5外泌体透射电镜分析
(1)向提取的外泌体中加入50-100μL 2％多聚甲醛溶液，得到外泌体溶液；
(2)取5-10μL外泌体溶液滴于Formvar-carbon载样铜网上，室温下放置10min；
(3)然后使用PBS缓冲液清洗1次；
(4)先在铜网上使用50μL 1％戊二醛液滴5min，再用100μL重蒸水洗8次每次2min；
(5)用50μL草酸双氧铀液滴(pH为7.0)处理5min；
(6)再将铜网放在冰上用50μL甲基纤维素液滴10min，空气干燥5-10min；
(7)将铜网放在样品盒里，80kV下调节合适的焦距及亮度并拍照。
2.6外泌体蛋白的提取与定量
向分离得到的外泌体中加入100μL含蛋白酶抑制剂的裂解液(Radio-Immunoprecipitation Assay，RIPA)，冰上裂解5min，在13000rpm、4℃下离心5min，弃去沉淀。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒提取细胞总蛋白并测定蛋白浓度，本实验蛋白样品为3次独立重复外泌体实验收取完成。详细操作步骤如下：
(1)取0.8mL蛋白标准配制液加入蛋白标准品(20mg BSA)中，充分混合溶解后配置成25mg/mL的蛋白标准溶液；
(2)取20μL蛋白标准溶液，加入980μL稀释液中即可配制成0.5mg/mL蛋白标准液；
(3)根据样品数量，按50:1的体积将BCA试剂A加入BCA试剂B中配置成适量BCA工作液体，充分混合；
(4)将标准品按照0μL、1μL、2μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL加入到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足至20μL；
(5)分别加入10μL待测样品到96孔板的样品孔中，加入标准品稀释液至20μL，各孔中加入200μL BCA工作液，室温放置2h；
(6)在560nm波长处测定样品的吸光度值，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
待蛋白定量后，加入5X SDS凝胶加样缓冲液，100℃煮沸5min使蛋白变性，完成蛋白提取步骤，置于-80℃超低温冰箱保存样品。
2.7蛋白印迹(Western Blot)
2.7.1SDS聚丙烯酰胺分离胶和基层胶的配制如下：
分离胶(浓度10％)的组成：超纯水4.0mL、30％丙烯酰胺3.3mL、1.5MTris-HCl(pH＝8.8)2.5mL、10％SDS 0.1mL、10％过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL；
积层胶(浓度5％)的组成：超纯水4.1mL、30％丙烯酰胺1.0mL、1.0MTris-HCl(pH＝6.8)0.75mL、10％SDS 0.06mL、10％过硫酸铵0.06mL、TEMED 0.006mL。
2.7.2蛋白印迹
(1)向上清液(血浆)中加入1/5体积5×上样缓冲液，95℃煮5min；
(2)煮后取20μL加入到10％SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳；
(3)电泳结束后将蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上；
(4)5％BSA封闭1h；
(5)加入CD63抗体(abcam公司，1：1000)，HSP70抗体(abcam公司，1：3000)或GAPDH抗体(abcam公司，1：5000)，4℃孵育过夜，TBST(Tris盐洗膜缓冲液)洗涤3次，每次10min；
(6)之后加入羊抗兔二抗(北京力高泰科技公司，1:15000)或羊抗鼠二抗(北京力高泰科技公司，1:15000)，温室孵育1h，TBST洗涤3次，每次10min，曝光。
2.8外泌体总RNA提取
使用外泌体提取试剂盒提取外泌体RNA，步骤如下：
(1)向提取出的外泌体原液中加入600μL裂解液，室温孵育2min，3000g离心5min，取上清液；
(2)加入氯仿，分层，取上层水相加入1.5倍体积的100％乙醇，用移液器上下混匀；
(3)混匀后分批加到试剂盒提供的柱子里，8000g离心15s，倒掉废液，回收柱子；
(4)加入试剂盒的缓冲液到柱子上，离心洗涤柱子，再加80％乙醇到柱子上8000g离心2min；
(5)离心后把柱子转移到一个新的无RNA酶的EP管中，晾干柱子上的过滤膜；
(6)然后加入14μL洗脱液，8000g离心1min后，扔掉柱子，收集滤液，储存至-80℃冰箱；
(7)用Nano Drop 2000(Thermo Scientific，USA)测定RNA浓度，RNA量>4μg；RNA浓度为50ng/μL-500ng/μL；RNA吸光度260/280在1.8-2.1之间。
2.9高通量测序
首先对外泌体RNA经纯化等前期处理，然反转录形成cDNA，末端修复加接头，PCR扩增等步骤建库，质检合格后上机测序。获得原始数据之后，首先要对数据进行过滤，去除接头序列以及低质量读长进行处理，再对测序质量进行评估，获得高质量的数据，并对高质量的数据及参考数据进行比对，获得BAM文件。
2.10逆转录
RNA的逆转录用逆转录试剂盒采用两步法进行，具体操做步骤如下：
(1)RNA(100ng)xμL、OligoT15(0.5μg)1μL、DEPC·H2O 9-xμL，总体积为10μL；
(2)70℃反应5min，打开RNA二级结构；立即置于冰上，然后加入5×AMV Buffer 4μL、10mM dNTP mixture 2μL、Mg2+2μL、RNasin(40U/μL)1μL、AMV 1μL，总体积为10μL，42℃反应60min，99℃反应2min，4℃恒温，产物-20℃保存。
2.11实时定量PCR
使用PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix荧光定量试剂盒和ABI7500PCR仪检测circRNA的水平。取4μL以10倍稀释的cDNA作为模板，每个样品设置3个平行孔，18S RNA作为内参基因。
(1)反应体系如下：2X Master Mix 10μL、H2O 4μL、Primer F(10μM)1μL、Primer R(10μM)1μL、cDNA 4μL。
(2)反应条件如下：
Figure GDA0003696467370000101
(3)qRT-PCR引物序列，信息如下表1所示。
表1 qRT-PCR引物序列表
Figure GDA0003696467370000102
(4)结果分析：
PCR结束后，根据溶解曲线确定引物是否特异。记录三个副孔的循环数(Ct值)，均值为样本Ct值。利用2-ΔΔCt的方法计算各样本circRNA的表达情况，其中ΔCt为目的基因和内参照基因(18S)Ct值的差值，ΔΔCt＝ΔCt(目的基因)-ΔCt(对照基因)。
2.12统计分析方法
应用SPSS17.0软件进行统计分析，正态分布数据用均数±标准差(X±S)表示，非正态分布数据用中位数(P25，P75)表示。正态分布数据两组间比较釆用t检验，非正态分布数据两组间比较采用非参数检验，两组数据率的比较采用卡方检验。circRNA水平的差异由Mann-Whitney U检验确定。为了评估选定circRNA对心绞痛的预测价值，我们使用ROC曲线，以P值<0.05为差异具有统计学意义。
三、试验结果
1、外泌体鉴定
1.1透射电镜观察提取的外泌体
透射电镜下观察到提取的囊泡大小不均，呈圆形或类圆形，具有脂质双层膜，直径在30-200nm之间，符合外泌体的形态特征，如图1所示。
1.2外泌体粒径分析
提取到的囊泡颗粒粒径大小在30-200nm，主峰在100nm左右，如图2所示。
1.3 Western blot测定外泌体特异性分子标志
免疫印迹实验结果显示，AP患者和NCCP患者血浆外泌体表达特异性标志蛋白CD63和HSP70，而不表达GAPDH，如图3所示，进一步证明提取的囊泡为外泌体。
2、高通量测序
为了明确AP患者血浆外泌体中circRNA的表达情况，我们用高通量测序的方法对15例NCCP和15例AP(测序队列)的标本进行了筛选。
2.1测序队列临床特征
本队列人群中AP患者与NCCP患者组的临床特征如表2所示，年龄、性别、身高、体重等和实验室检测的数据在两组的差异均无统计学意义(P>0.05)。
表2患者基本临床资料
Figure GDA0003696467370000121
2.2高通量测序结果
通过高通量测序检测15例AP患者和15例NCCP患者(对照组)中的circRNA差异表达，以AP血浆外泌体中cirRNA表达升高倍数大于2或小于0.5、q-value<0.001为标准，筛选出血浆外泌体中差异表达的circRNAs共276个，表达上调103个，表达下调173个(如图4中的A图所示)，其中在circBase中有注释的circRNA有59条，见表3。
表3 circBase中有注释的AMI中差异表达circRNA
Figure GDA0003696467370000131
Figure GDA0003696467370000141
Figure GDA0003696467370000151
Figure GDA0003696467370000161
Figure GDA0003696467370000171
2.3小样本量验证差异表达的circRNAs
为了验证测序得到的结果，我们在上调表达的circRNA中挑选了在circBase数据库中有注释、差异倍数明显、表达量较高的5个circRNA(外泌体hsa_circ_0006577、外泌体hsa_circ_001888、外泌体hsa_circ_009201、外泌体hsa_circ_0075269和外泌体hsa_circ_0000284)，如图4中的B图所示。用RT-PCR的方法在20例NCCP和20例AP患者中进行了验证。
2.3.1小样本队列人群临床特征
本队列人群中AP患者与NCCP患者组的临床特征如表4所示，AP组高血脂的比例高于NCCP组，差异具有统计学意义(P≤0.05)，而其它基础数据如年龄、性别、身高、体重等和实验室检测的数据在两组的差异均无统计学意义(P>0.05)。
表4小样本队列研究人群的临床特征
Figure GDA0003696467370000172
Figure GDA0003696467370000181
Figure GDA0003696467370000191
2.3.2小样本队列验证结果
RT-PCR的结果显示，在小样本队列中验证的5个circRNAs中，外泌体hsa_circ_0018886表达量低，用qRT-PCR的方法在多数样本中检测不到；外泌体hsa_circ_0006577和外泌体hsa_circ_0092019和AP患者和NCCP患者两组之间的表达没有差异；外泌体hsa_circ_0075269和外泌体hsa_circ_00 00284在AP患者中的表达与测序结果一致。
外泌体hsa_circ_0075269在AP患者中的相对表达水平(9.23(4.14,19.84))较NCCP组(2.83(1.69,5.59))显著升高(P<0.01)，为NCCP组的3.26倍(如图5中的A图所示)，其诊断AP的ROC曲线下面积为0.805(如图5中的C图所示)。
外泌体hsa_circ_0000284在AP患者中的相对表达水平(5.085(3.233,8.488))较NCCP组(2.47(1.378,5.735))显著升高(P<0.01)，为NCCP组的2.06倍(如图5中的B图所示)，其诊断AP的ROC曲线下面积为0.713(如图5中的D图所示)。
接下来我们还计算了在本队列人群中外泌体hsa_circ_0075269和外泌体hsa_circ_0000284联合诊断AP以及二者联合TG诊断AP的效能是否优于单个circRNA的诊断效能。结果显示，外泌体hsa_circ_0075269和外泌体hsa_circ_0000284联合诊断AP的ROC曲线下面积为0.818(如图5中的E图所示)；外泌体hsa_circ_0075269和外泌体hsa_circ_0000284联合TG诊断AP的ROC曲线下面积为0.838，(如图5中的F图所示)。
其中图5中的A图为外泌体hsa_circ_0075269在AP和NCCP中的相对表达图；B图为外泌体hsa_circ_0000284在AP和NCCP中的相对表达图；C图为外泌体hsa_circ_0075269诊断AP的ROC曲线图；D图为外泌体hsa_circ_0000284诊断AP的ROC曲线图；E图为外泌体hsa_circ_0075269和外泌体hsa_circ_0000284联合诊断AP的ROC曲线图；F图为外泌体hsa_circ_0075269、外泌体hsa_circ_0000284、TG三者联合诊断AP的ROC曲线。*P<0.05，**P<0.01。
2.4大样本量验证差异表达的外泌体circRNAs
为了进一步确定外泌体hsa_circ_0075269和外泌体hsa_circ_0000284在AP患者血浆外泌体中的表达变化，我们用RT-PCR的方法在更大样本量队列(NCCP 48例，AP100例)中进行了验证。
2.4.1大样本队列人群的临床信息
本队列NCCP和AP人群的临床信息见表5，AP组的年龄及高血压、高血脂、冠心病家族史的比例在AP组较高；实验室检验数据中WBC、LDL、HDL、TG、ALT、K+、D-D的水平在AP组高于NCCP组，Na+的水平在AP组低于NCCP组。
表5大样本队列研究人群的临床特征
Figure GDA0003696467370000211
Figure GDA0003696467370000221
2.4.2大样本量验证结果
RT-PCR的结果显示，血浆外泌体中hsa_circ_007526和hsa_circ_0000284在大样本量验证的结果与小样本量验证结果一致。
血浆外泌体中hsa_circ_0075269在AP患者中的相对表达水平(14.78(7.96,38.06))较NCCP组(3.71(1.35,12.55))显著升高(P<0.01)，为NCCP组的3.98倍(如图6中的A图所示)；其诊断AP的ROC曲线下面积为0.761(如图6中的C图所示)。
外泌体hsa_circ_0000284在AP患者中的相对表达水平(2.52(1.14,7.53))较NCCP组(1.01(0.49,33.59))显著升高(P<0.05)，为NCCP组的2.50倍(如图6中的B图所示)；其诊断AP的ROC曲线下面积为0.623(如图6中的D图所示)。
在本队列人群中，外泌体hsa_circ_0075269和外泌体hsa_circ_0000284联合诊断AP的ROC曲线下面积为0.741(如图6中的E图所示)；外泌体hsa_circ_0075269和外泌体hsa_circ_0000284联合TG(甘油三酯)诊断AP的ROC曲线下面积为0.730(如图6中的F图所示)。
其中图6中的A图为外泌体hsa_circ_0075269在AP和NCCP中的相对表达水平图；B图为外泌体hsa_circ_0000284在AP和NCCP中的相对表达水平图；C图为外泌体hsa_circ_0075269诊断AP的ROC曲线；D图为外泌体hsa_circ_0000284诊断AP的ROC曲线；E图为外泌体hsa_circ_0075269和外泌体hsa_circ_0000284联合诊断AP的ROC曲线；F图为外泌体hsa_circ_0075269、外泌体hsa_circ_0000284和TG联合诊断AP的ROC曲线。*P<0.05，**P<0.01。
冠心病是威胁人类生命与健康的头号杀手，并有逐年增长的趋势。早期发现和干预冠状动脉粥样硬化病对于减少心血管病事件具有重要的意义。越来越多的证据提示，应用一些反映特定病理生理特征的生物标志物，如氧化应急、血管炎症、血小板激活、斑块去稳定和破裂等，以及坏死标记物，可能提高对冠脉病变的识别和危险分层。肌钙蛋白作为一种心肌坏死标志物用于心肌梗死的诊断，其地位和价值已得到充分证明。但是目前在心绞痛中还没有发现这样的理想标志物：如早期在血液中增高，高度敏感又特异，检测简便又廉价。
circRNA是近年来的研究热点，由外显子或内含子序列组成的环形RNA分子。circRNA没有5’和3’端，不易被RNA酶降解，因此比线性RNA更稳定。circRNA大量存在于真核细胞的细胞质中，具有组织、时序和疾病特异性。
本研究首先通过高通量测序筛选了心绞痛患者血浆外泌体中差异表达的circRNA，发现心绞痛患者血浆外泌体中circRNA的表达谱与对照组相比明显不同，以心绞痛血浆外泌体中cirRNA表达升高倍数大于2或小于0.5、q-value<0.001为标准，筛选出血浆外泌体中差异表达的circRNAs共276个，表达上调103个，表达下调173个(图4A)，其中在circBase中有注释的circRNA有59个(表3)，说明心绞痛时血浆外泌体对circRNA的包装具有选择性，差异表达的circRNA能够作为心绞痛诊断生物标志物。
由于高通量测序的样本一般较少，且存在假阳性和假阴性的可能，因此需要通过传统RT-PCR的方法扩大样本量进一步验证。考虑到作为生物标志物的可行性，我们挑选了5个在circBase数据库中有注释、表达量高、升高倍数明显的circRNA首先在小样本量标本中进行了验证。小样本验证的结果显示，血浆外泌体hsa_circ_0075269和外泌体hsa_circ_0000284在心绞痛患者中的表达与测序结果一致，均在心绞痛组较对照组显著升高。
接下来，我们在更大样本量中对血浆外泌体hsa_circ_0075269和外泌体hsa_circ_0000284在心绞痛患者中的表达进行了验证。结果与小样本量验证的结果一致，外泌体hsa_circ_0075269和外泌体hsa_circ_0000284在AP患者中的表达均显著升高。但是外泌体hsa_circ_0075269在AP患者外泌体中表达升高的倍数更加明显，诊断AP的ROC曲线下面积更大(0.761)。在大样本队列人群中，外泌体hsa_circ_0075269和外泌体hsa_circ_0000284联合以及二者联合TG诊断AP的ROC曲线下面积较外泌体hsa_circ_0075269单独诊断AP的ROC曲线下面积均略低，说明外泌体hsa_circ_0075269单独诊断AP的效能更好。外泌体hsa_circ_0075269位于5号染色体上，长288nt，外泌体hsa_circ_0000284位于11号染色体上，长1099nt，在肿瘤的生长、迁移、侵袭、和血管生成中具有重要的作用。
心绞痛患者循环外泌体中circRNA的表达谱与对照相比显著不同，外泌体hsa_circ_0075269、外泌体hsa_circ_0000284能够作为AP诊断生物标志物。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京朝阳医院
<120> 心绞痛相关的标志物及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211>288
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 1
gacagctgtg ggaagaggcc gagcgtggct ttatcttgca ctcatgcaaa agaaactggc 60
agattatctg aaagtgctta tagacaataa acatctctta agcgagttct atgagcctga 120
ggctttaatg atggaggaag aagggatggt gattgttggt ctgctggtgg gactcaatgt 180
tctcgatgcc aatctctgct tgaaaggaga agacttggat tctcaggttg gagtaataga 240
tttttccctc taccttaagg atgtgcagga tcttgatggt ggcaagga 288
<210> 2
<211>1099
<212> DNA
<213> 人工序列(Artficial Sequence)
<400> 2
gtatggcctc acaagtcttg gtctacccac catatgttta tcaaactcag tcaagtgcct 60
tttgtagtgt gaagaaactc aaagtagagc caagcagttg tgtattccag gaaagaaact 120
atccacggac ctatgtgaat ggtagaaact ttggaaattc tcatcctccc actaagggta 180
gtgcttttca gacaaagata ccatttaata gacctcgagg acacaacttt tcattgcaga 240
caagtgctgt tgttttgaaa aacactgcag gtgctacaaa ggtcatagca gctcaggcac 300
agcaagctca cgtgcaggca cctcagattg gggcgtggcg aaacagattg catttcctag 360
aaggccccca gcgatgtgga ttgaagcgca agagtgagga gttggataat catagcagcg 420
caatgcagat tgtcgatgaa ttgtccatac ttcctgcaat gttgcaaacc aacatgggaa 480
atccagtgac agttgtgaca gctaccacag gatcaaaaca gaattgtacc actggagaag 540
gtgactatca gttagtacag catgaagtct tatgctccat gaaaaatact tacgaagtcc 600
ttgattttct tggtcgaggc acgtttggcc aggtagttaa atgctggaaa agagggacaa 660
atgaaattgt agcaatcaaa attttgaaga atcatccttc ttatgcccgt caaggtcaaa 720
tagaagtgag catattagca aggctcagta ctgaaaatgc tgatgaatat aactttgtac 780
gagcttatga atgctttcag caccgtaacc atacttgttt agtctttgag atgctggaac 840
aaaacttgta tgactttctg aaacaaaata aatttagtcc cctgccacta aaagtgattc 900
ggcccattct tcaacaagtg gccactgcac tgaaaaaatt gaaaagtctt ggtttaattc 960
atgctgatct caagccagag aatattatgt tggtggatcc tgttcggcag ccttacaggg 1020
ttaaagtaat agactttggg tcggccagtc atgtatcaaa gactgtttgt tcaacatatc 1080
tacaatctcg gtactacag 1099

Claims (3)

1.一种检测血浆外泌体标志物的试剂在制备心绞痛的诊断产品中的应用，其特征在于，所述标志物为外泌体hsa_circ_0075269和外泌体hsa_circ_0000284，所述外泌体hsa_circ_0075269的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述外泌体hsa_circ_0000284的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的检测血浆外泌体标志物的试剂在制备心绞痛的诊断产品中的应用，其特征在于，所述标志物为外泌体 hsa_circ_0075269、外泌体 hsa_circ_0000284和甘油三酯。
3.根据权利要求2所述的检测血浆外泌体标志物的试剂在制备心绞痛的诊断产品中的应用，其特征在于，所述诊断产品为制剂或试剂盒。
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