JPWO2006062127A1 - 免疫システム異常疾患の診断支援情報出力装置及び診断支援情報出力プログラム - Google Patents

Abstract

【課題】 ＳＩＲＳ等の急激に症状が変化し得る免疫システム異常疾患を適切に治療すべく、診断のための試料採取から、治療方法の決定、処置に至るまでの時間差を加味した上で、適切な治療方法を示唆できる免疫システム異常疾患の診断支援方法及び診断支援情報出力装置を提供する。生物学的試料における炎症性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインに特異的な活性型転写制御因子を測定することにより、将来の炎症の進行状態に関する診断支援情報を出力する。【選択図】 図８

Description

本発明は、敗血症などの全身性炎症反応症候群（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＳＩＲＳ））、抗炎症反応症候群（Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＣＡＲＳ））等の免疫システム異常疾患の診断支援方法及び診断支援情報出力装置に関し、原因となるサイトカインの発現を転写段階で予測することにより数時間後に現れるであろう症状に関する診断支援情報を出力する診断支援方法及び診断支援情報出力装置に関する。

主に感染症が進展して全身所見を呈した状態をいう敗血症は、初期には高熱、過呼吸がみられ、皮膚は温かく、血圧はやや低下し、頻脈を呈する高心拍出量状態で、心拍出量は増加し、末梢血管抵抗は低下している。この時期に適切な治療が行なわれないと、呼吸障害や腎、肝、血液などの障害が進行してくる。治療は、感染源の除去、抗生物質の投与、肺腎、肝の管理、ＤＩＣのコントロールなど多岐にわたるが、適切な治療が行なわれないと、種々の臓器障害（多臓器不全）が進展し、死亡することになる。集中治療管理が進歩したにもかかわらず、このような重症敗血症患者の死亡率は３０〜５０％と高い。

敗血症を含む全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）では、病態重篤性の診断や病態変化に応じた適切な検査、治療が確立されていないことから、救命率の低さや集中治療室占拠率の高さ（７０％）の原因となっていることが報告されている。

ＳＩＲＳは、１９９２年にＢｅｒｎａｒｄらによって提唱され、病態を反映する４項目、体温、心拍数、呼吸数、末梢血白血球数のうち、２項目以上に異常のある状態とされる。ＳＩＲＳは、侵襲の種類（手術、重傷外傷、熱傷、感染等）にかかわらず、種々の内因性メディエータにより惹起される非特異的全身炎症性反応であり、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）の他、非感染性、非特異的全身性炎症反応という病態も有する。

このようなＳＩＲＳの治療は、現在のところ、症状から判断して経験に基づく治療、処置が行なわれている。具体的にはステロイドの大量投与、抗炎症剤の大量投与といった治療がなされる。しかしながら、高熱、過呼吸といったＳＩＲＳの症状は、炎症性サイトカインによる炎症性反応が亢進されている状態（免疫過剰亢進状態）だけからではなく、抗炎症性サイトカインによる抗炎症性反応亢進状態（免疫抑制状態）でも似た症状を示すことから、症状把握を間違うと、全く逆の治療をしてしまうことになる。例えば、ステロイドの長期使用や免疫抑制剤使用により免疫能が低下した状態では、臓器障害が進展し、死亡に至ることもある。

１９９６年にＢｏｎｅらによって行なわれた敗血症患者に対する炎症性サイトカイン抑制療法の臨床試験がすべて失敗に終わった理由は、生体内では、炎症反応−抗炎症反応の両者がバランスをとったため、免疫抑制の長期処方が危険ではないかと提唱している。

免疫システム異常による疾患の多くは、血液中の好中球、リンパ球、マクロファージといった担当細胞から分泌される生理活性物質、サイトカインによって、その病態が複雑に変化し、また病態が急激に変化することが知られている。このため、適切な薬物選択や投薬タイミング等の治療スケジュールが非常に複雑かつ困難である。急激な病態変化に対応するため、集中治療室で監視したりしているが、これが集中治療室の占拠率の高い原因となっているばかりか、それでも治療が手遅れになることがある。

このようなことから、特許文献１では、全身性炎症状態の危険にある患者の同定及び監視方法として、患者から選択された生理的パラメータを測定し、患者の全身性仲介因子−関連反応試験プロフィルを得て、対照プロフィルと比較する方法を提案している。ここで生理的パラメータとしては、物理的検査、生命に関する徴候、血液動力学的測定値、臨床検査室試験、急性炎症反応仲介因子濃度、血小板と顆粒球との凝集測定及び内毒素レベルが挙げられている。具体的には、ロイコトリエン、プロスタグランジン、サイトカイン、血小板活性化因子、好中球エラスターゼをＥＬＩＳＡで測定したり、補体成分Ｃ３αをラジオイムノアッセイで測定したり、血漿内毒素レベルを測定したり、顆粒球凝集の測定などが挙げられている。

しかしながら、いずれの生理的パラメータも、患者から採取した血液などの試料に含まれる蛋白質や増殖因子を測定したものであり、測定対象となる蛋白質は細胞からの分泌物で、採取時点の細胞の状態を表していたとしても、その後、採取時点における状態が維持されているとは限らない。つまり、免疫システム疾患の治療方法の確立が困難な原因として、病態の急激な変化、すなわち症状の原因となるサイトカインが時々刻々と変化していくことがある。このため、例えば、採取した試料中のサイトカインの発現を測定し、サイトカインの有意な発現が認められた場合であっても、試料を採取してから測定結果が得られるまでの間にサイトカインの発現の状態が変化することから、測定されたサイトカインを抑制する治療が必ずしも適切とは限らない。

特表平１０−５００２１０

本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、急激に症状が変化し得る免疫システム異常疾患の治療に際して、適切な診断支援情報を示唆することができる免疫システム異常疾患の診断支援方法を提供することにある。また、本発明の他の目的は、適切な診断支援情報を出力することができる診断支援情報出力装置を提供することである。

本発明の免疫システム異常疾患の診断支援方法は、患者から採取した生物学的試料に含まれ、炎症性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインからなる群より選択されるサイトカインに特異的な活性型転写制御因子の存在量を測定する工程；及び
測定された活性型転写制御因子の存在量に基づいて、将来の炎症の進行状態に関する情報を含む診断支援情報を出力する工程を備えている。

前記炎症の進行状態に関する情報が、炎症性反応が亢進するか否かの情報、および抗炎症性反応が亢進するか否かの情報からなる群から選択される情報を含むものであってもよいし、あるいは炎症性サイトカインの発現量が増加するか否かの情報、および抗炎症性サイトカインの発現量が増加するか否かの情報からなる群から選択されるサイトカイン発現情報を含むものであってもよい。

前記診断支援情報は、さらに、治療方法の情報を含んでもよい。前記治療方法は、抗炎症剤の投与、血漿交換および顆粒球コロニー刺激因子の投与からなる群より選択されることが好ましい。

前記生物学的試料は、患者から採取した細胞の核抽出物であることが好ましい。

前記測定工程は、測定開始から測定結果が得られるまでの時間が１時間以内、好ましくは３０分以下である測定方法により実施されることが好ましく、表面プラズモン共鳴法、水晶振動子マイクロバランス法、及び１分子蛍光相関法からなる群より選択される１種により実施されることが好ましい。

前記測定工程は、２種以上の活性型転写制御因子を測定してもよい。

前記免疫システム異常疾患としては、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）が好適である。

本発明の免疫システム異常疾患の診断支援情報出力装置は、患者から採取した生物学的試料に含まれ、炎症性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインからなる群より選択されるサイトカインに特異的な活性型転写制御因子の存在量を測定して得られた転写制御因子情報を取得する情報取得手段；及び
取得した転写制御因子情報に基づいて、将来の炎症の進行状態に関する情報を含む診断支援情報を出力する診断支援情報出力手段を備えている。

前記炎症の進行状態に関する情報が、炎症性反応が亢進するか否かの情報および抗炎症性反応が亢進するか否かの情報からなる群から選択される情報を含むものであってもよいし、あるいは炎症性サイトカインの発現量が増加するか否かの情報および抗炎症性サイトカインの発現量が増加するか否かの情報からなる群から選択されるサイトカイン発現情報を含むものであってもよい。

前記診断支援情報は、治療方法の情報を含むことが好ましく、前記治療方法は、抗炎症剤の投与、血漿交換および顆粒球コロニー刺激因子の投与からなる群より選択されることが好ましい。

診断支援情報出力手段が、炎症性サイトカインに特異的な転写制御因子の情報を記憶する記憶手段と、情報取得手段により取得された転写制御因子情報と前記記憶手段に記憶された情報に基づいて、炎症性サイトカインの発現量が増加するか否かを予測する予測手段とを備え、予測手段の予測結果に基づいて診断支援情報を出力することが好ましい。前記記憶手段は、さらに抗炎症性サイトカインに特異的な転写制御因子の情報を記憶する手段であってもよい。

あるいは診断支援情報出力手段が、炎症性反応が亢進するか否かの情報を記憶する記憶手段と、情報取得手段により取得された転写制御因子情報と前記記憶手段に記憶された情報に基づいて、炎症性反応が亢進するか否かを予測する予測手段とを備え、予測手段の予測結果に基づいて診断支援情報を出力するものであってもよく、前記記憶手段は、さらに、抗炎症性反応が亢進するか否かの情報を記憶する手段であってもよい。

本明細書にいう「活性型転写制御因子」とは、細胞質内に複合体として存在している状態の転写制御因子とは区別して用いられ用語で、サイトカインの発現にあたり関係する遺伝子を転写するために複合体から離脱して核内に移行した転写制御因子をいう。

本発明の免疫システム異常疾患の診断支援方法によれば、症状が現れる原因となるサイトカインが発現する前の転写段階を制御している活性型転写制御因子に基づいて、サイトカインが分泌されるまでに起こりえる将来の炎症の進行状態に関する情報を含む診断支援情報を出力することが可能である。
本発明の診断支援情報出力装置は、症状が経時的に変化していくような免疫システムの異常疾患の患者から採取した試料に基づいて、数時間後におこる炎症の状態に関する診断支援情報を出力するので、好適な治療を施すことができ、また重篤な症状が現れる前に予防措置を採ることができる。

転写制御因子の結合部位を示すＤＮＡ配列の例である。 サイトカインに関与する転写制御因子の関係を示す模式図である。 表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）の測定原理を説明するための図である。 水晶振動子マイクロバランス法（ＱＣＭ）の測定原理を説明するための図である。 １分子蛍光相関法（ＦＣＳ）の測定原理を説明するための図である。 ＳＩＲＳ状態からＣＡＲＳ状態への変化例を説明するための図である。 本発明の診断支援情報出力装置の実施形態に係る免疫システム異常疾患の診断支援システムのハードウェアの構成を示すブロック図である。 診断支援情報出力処理の一実施形態のフローチャートを示す図である。 ＨｅＬａ細胞にリポポリサッカライドを与えなかったときの免疫染色結果を示す顕微鏡写真（４００倍）である。 ＨｅＬａ細胞にリポポリサッカライドを与えたときの免疫染色結果を示す顕微鏡写真（４００倍）である。 ゲルシフトアッセイの結果を示す写真である。 実施例で使用したヌクレオチドプローブの配列である。 ＨｅＬａ細胞のプローブへの結合の有無の測定結果を示すグラフである。 健常人リンパ球で調べたプローブへの結合の有無を調べたゲルシフトアッセイの結果を示す写真である。 ＮＦκＢの濃度とＮＦκＢ−プローブ複合体量の関係を示すＳＰＲ測定結果のグラフである。 ＮＦκＢの濃度とＮＦκＢ−プローブ複合体量の関係を示すＦＣＳ測定結果のグラフである。 ＮＦκＢの濃度とＮＦκＢ−プローブ複合体量の関係を示すＱＣＭ測定結果のグラフである。 ＳＰ−１の濃度とＳＰ−１プローブ複合体量の関係を示すＳＰＲ測定結果のグラフである。 ＡＰ−１の濃度とＡＰ−１プローブ複合体量の関係を示すＳＰＲ測定結果のグラフである。 ＩＬ６及びＧ−ＣＳＦのｍＲＮＡの発現解析結果（電気泳動）の写真である。 ＮＦκＢのゲルシフトアッセイの結果を示す写真である。

〔免疫システム異常疾患の診断支援方法〕
本発明の免疫システム異常疾患の診断支援方法は、患者から採取した生物学的試料に含まれ、炎症性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインからなる群より選択されるサイトカインに特異的な活性型転写制御因子の存在量を測定する工程；及び測定された活性型転写制御因子の存在量に基づいて、将来の炎症の進行状態に関する情報を含む診断支援情報を出力する工程を備えている。

本発明の診断支援方法が対象とする免疫システム異常疾患としては、敗血症などの全身性炎症反応症候群（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＳＩＲＳ））、抗炎症反応症候群（Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＣＡＲＳ））等が挙げられ、本発明の診断支援方法は、特にＳＩＲＳの診断支援に適している。

前記生物学的試料は、患者から採取された細胞を含む試料で、患者の血液、尿、細気管支肺胞洗浄、唾液、痰、脳骨髄液、関節液、浸潤液などが挙げられる。測定に供される試料としては、これらから採取した細胞の核抽出物であることが好ましい。測定対象である活性型転写制御因子は、これから発現しようとするサイトカインの転写に関与する転写制御因子で、核内に存在しているからである。尚、転写制御因子は、通常、細胞質内で複合体として存在するため、抗体等を用いた生体分子間相互作用に基づく測定方法で、転写制御因子の存在量を測定することは困難であるが、活性型転写制御因子は、所定の刺激によって複合体から離脱しているので、活性型でない転写制御因子と区別して、抗体等を用いた生体分子間相互作用に基づく測定方法でその存在量を測定することが可能である。

患者から採取した試料から核内抽出物を含む試料の調製方法は特に限定しないが、例えば、細胞を低張液で処理して膨張させ、ホモジナイザー又はシリンジを用いて、細胞膜を破壊し、遠心により核ペレットを単離し、これを高張液又は界面活性剤で処理することにより、核蛋白質を抽出し、遠心した後、上清を回収するといった方法が挙げられる。この上清には、核から抽出されたタンパク質が含有されている。

測定される活性型転写制御因子は、ターゲットとする炎症性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインをコードする遺伝子の発現を上昇させる働きをもつエンハンサー配列に特異的に結合して転写活性を調節する因子で、ターゲットとする炎症性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインの種類に応じて、適宜選択される。転写制御因子は、ＤＮＡ結合部位（ＤＢＤ）と転写活性化部位（ＴＡＤ）を有し、特有の配列を認識して結合する。エンハンサーに結合した転写制御因子がメディエータを介してプロモータ上の転写開始複合体を促進、あるいはその安定化を行なっている。

炎症性サイトカインとしては、例えばＴｕｍｏｒ Ｎｅｃｏｒｏｓｉｓ因子（ＴＮＦα）、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン６、インターロイキン１２、インターロイキン１８、Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ因子（ＰＡＦ）、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンγが挙げられる。

抗炎症性サイトカインとしては、例えば、インターロイキン４、インターロイキン１０，インターロイキン１３、インターロイキン１レセプター、可溶性ＴＮＦレセプター、ＴＧＦβが挙げられる。

これらのサイトカインの発現は、転写段階において、それぞれＤＮＡ特定位置（ＤＮＡ特定配列）で制御されている。サイトカインの発現を調節する転写調節領域、特にエンハンサーに活性型転写制御因子が結合し、プロモータにＲＮＡポリメラーゼが結合して、転写が活性化されて、転写が開始する。そして、生成されたｍＲＮＡが翻訳されて、コードされていたサイトカインを発現する。

サイトカイン発現に関与する転写制御因子は２０種類程度であり、それぞれの転写制御因子は、結合するＤＮＡ配列が決まっている。例えば、図１に示すような配列に特異的に結合する。図中、四角で囲んだ部分が結合領域である。

サイトカインの転写を調節する転写制御因子は、発現するサイトカインの種類により異なる。また転写制御因子は、通常、２種類以上の転写制御因子と共同して１種類のサイトカイン発現を調節している。例えば、図２に示すように、インターロイキン８（ＩＬ８）では、ＡＰ−１、Ｃ／ＥＢＰ、ＮＦκＢといった転写制御因子が関与している。インターロイキン６（ＩＬ６）では、ＡＰ−１、ＣＲＥＢ、Ｃ／ＥＢＰ、ＮＦκＢが関与している。インターロイキン２（ＩＬ２）では、ＮＦＡＴ、ＡＰ−１が関与し、ＴＮＦαでは、ＮＦκＢ、ＥＲＧ１、ＣＲＥ、ＡＰ−１、ＳＰ１、ＡＰ−２が関与している。尚、ＴＮＦαでは、転写調節領域中にＮＦκＢの結合部位が複数あり、結合部位が１つの場合のサイトカイン（例えばＩＬ８、ＩＬ６）よりもＮＦκＢの核内移行量が多くなると考えられる。また、インターロイキン４では、ＡＰ−１、Ｃ／ＥＢＰが関与している。インターロイキン１０では、ＣＲＥ１、ＣＲＥ３、ＣＲＥ４、ＴＡＴＡ、Ｃ／ＥＢＰ１、Ｃ／ＥＢＰ３、Ｃ／ＥＢＰ５が関与している。

測定する活性型転写制御因子は、炎症性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインの発現量を予測することができるものであればよく、炎症性サイトカインに共通な転写制御因子で抗炎症性サイトカインの発現に関与していない転写制御因子を１種類だけ測定してもよいし（炎症性サイトカインの発現を予測する場合）、抗炎症性サイトカインに共通な活性型転写制御因子で炎症性サイトカインの発現に関与していない転写制御因子を１種類だけ測定してもよいし（抗炎症性サイトカインの発現を予測する場合）、複数種類の活性型転写制御因子の量を測定してその存在比率から、個々のサイトカインの発現を予測できるように選択してもよい。例えば、ＳＩＲＳに特に関係するサイトカインはＩＬ８、ＩＬ６およびＴＮＦαであり、これらに共通する転写制御因子はＮＦκＢであることから、活性型ＮＦκＢの存在量を測定することによって、炎症性サイトカインの発現量が増加するか否かを予測することが可能である。

活性型転写制御因子の測定は、測定開始から測定結果が得られるまでの測定時間が１時間以内の方法で行なうことが好ましく、より好ましくは３０分以内の方法で行なう。測定結果が得られるまでにかかる時間が数時間以上必要とする測定方法では、転写開始から数時間後に発現されるサイトカインが、患者においてすでに発現され、ひどい場合には新たに別のサイトカインが発現していて、治療が手遅れ、あるいは誤るおそれがあるからである。

測定時間が３０分以内である測定方法としては、転写制御因子が結合する特定配列を有するヌクレオチドプローブを用いてヌクレオチドハイブリダイゼーションを検出する方法、生体分子間相互作用測定方法が好ましい。具体的には、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、水晶振動子マイクロバランス法（ＱＣＭ）、１分子蛍光相関法（ＦＣＳ）、Ｄｕａｌ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｍｅｔｅｒ−ＳＰＲ（二面偏波式干渉−ＳＰＲ）が挙げられる。

ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴法）とは、図３に示すように、プリズム表面に敷設された金属膜（金又は銀の薄層）に特定角度で入射される光が金属表面の電子を刺激して出てくる反射光により生じる表面プラズモン共鳴現象を利用した方法である。表面プラズモン共鳴と共鳴角度が反射インデックスに依存するので、金属膜表面のヌクレオチドハイブリッドの有無、すなわちＤＮＡプローブに結合した転写制御因子量を測定することができる。

ＱＣＭ（水晶振動子マイクロバランス法）は、図４に示すように、ヌクレオチドプローブが植設された金薄膜で被覆された水晶振動子を用いて、試料に含まれる転写制御因子がヌクレオチドプローブに結合することによる金薄膜の質量変化を振動数変化で検出する方法である。

ＦＣＳ（１分子蛍光相関法）は、図５に示すように、測定試料と蛍光標識したヌクレオチドプローブの混合物を共焦点領域を通過させ、転写制御因子−プローブ複合体とプローブ単体とは分子サイズの違いから共焦点領域通過時間が異なることを利用して、１分子が光るパルス数で、転写制御因子−プローブ複合体と未反応蛍光分子（プローブ単体）を分離して検出する方法である。

上記各方法において使用するヌクレオチドプローブは、検出しようとする転写制御因子が特異的に結合する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブであればよく、その全配列は天然に存在するワイルドタイプであってもよいし、人工的に合成したものであってもよい。また、使用するヌクレオチドプローブは１種類だけであってもよいし、予測しようとするサイトカインに関与する複数の転写制御因子に対応する数のヌクレオチドプローブが設けられていても良い。好ましくは、あらゆる転写制御因子に相当するヌクレオチドプローブが設けられているものである。複数の転写制御因子を一度に検出、定量することで、発現するサイトカインを予測できるからである。

生体分子間相互作用測定方法は、検出感度が１０ｎＭであり、１試料を１０分程度で定量することができる。従って、患者から細胞を採取して測定試料を調製し、測定開始から測定結果が得られるまで、１時間以内に行えることから、生物学的試料を患者から採取した時点から数時間後に発現してくるサイトカインを知ることができる。このことは、数時間後に起る症状が抗炎症性であるのか、炎症性であるのか、さらには、いかなるサイトカインが発現して、どのような症状が現れるのかを予測するのに便利である。この点、ＥＬＩＳＡやゲルシフトアッセイでは、３〜６時間かかかるため、予測結果が出る頃には、予測されたサイトカインと発現してくるサイトカインが異なっている可能性が高く、適切な治療ができないという問題があったが、このような迅速性ある測定方法を採用することにより、予測による適切な治療、処方の選択が可能となる。

測定された活性型転写制御因子の存在量に基づいて、診断支援情報を出力する。ここで、診断支援情報とは、将来の炎症の進行状態に関する情報で、炎症性反応が亢進するか否かの情報および抗炎症性反応が亢進するか否かの情報からなる群から選択される情報を含むものであってもよいし、炎症性サイトカインの発現量が増加するか否かの情報および抗炎症性サイトカインの発現量が増加するか否かの情報からなる群から選択されるサイトカイン発現情報を含むものであってもよい。

目的とするサイトカイン（炎症性サイトカイン又は抗炎症性サイトカイン）に関与する活性型転写制御因子の存在量を知ることで、これから発現しようとする炎症性サイトカイン又は抗炎症性サイトカインが増加するか否かを予測することができ、ひいては炎症反応が亢進するか否か、抗炎症反応が亢進するか否かといった将来の炎症の進行状態を予測することができ、これらを診断支援情報として出力することができる。

特に測定開始から測定結果が得られるまでの時間が３０分以下である測定方法を採用することにより、患者から試料を採取した時点から数時間後に発現してくるサイトカインを知ることができるので、数時間後に起る症状が抗炎症性反応の亢進であるのか、炎症性反応の亢進であるのかを予測することができる。

上記診断支援情報には、さらに、選択すべき治療方法の情報、治療方法の適否を示す情報（抗炎症剤の投与の適否を示す情報、血漿交換の適否を示す情報および顆粒球コロニー刺激因子の投与の適否を示す情報）が含まれていてもよい。迅速性ある測定方法を採用することにより、数時間後に起る症状が抗炎症性であるのか、炎症性であるのか、さらには、いかなるサイトカインが発現して、どのような症状が現れるのかを予測することができるので、予測による適切な治療、処方の選択を、診断支援情報として出力することが可能となる

例えば、図６に示すように、ＳＩＲＳ症状が後期に入ると、炎症性サイトカインの発現量が減少し、ＣＡＲＳ状態の抗炎症性サイトカイン発現量が増大しているような場合、サイトカインの測定検出による診断に基づく治療では、抗炎症剤を投与することになってしまう。一方、活性型転写制御因子の存在量に基づいて、ＳＩＲＳ前期の炎症性サイトカインの発現が増大している時期か、ＳＩＲＳ後期の炎症性サイトカインの発現が減少していく時期か、さらにはＣＡＲＳの抗炎症性サイトカイン発現が亢進している時期かを区別した情報を得ることができる。従って、本発明の方法により出力される診断支援情報に基づけば、ＳＩＲＳの炎症性サイトカインの発現が増大している時期には抗炎症剤の投与、ＣＡＲＳの抗炎症性サイトカイン発現が亢進している時期には、血漿交換や顆粒球コロニー刺激因子の投与といった治療方法を選択することができる。

〔免疫システム異常疾患の診断支援情報出力装置〕
本発明の免疫システム異常疾患の診断支援情報出力装置は、患者から採取した生物学的試料に含まれ、炎症性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインからなる群より選択されるサイトカインに特異的な活性型転写制御因子の存在量を測定して得られた転写制御因子情報を取得する情報取得手段；及び取得した転写制御因子情報に基づいて、将来の炎症の進行状態に関する情報を含む診断支援情報を出力する診断支援情報出力手段を備えている。

前記転写制御因子情報とは、測定される活性型転写制御因子の存在量であってもよいし、当該存在量を測定する測定装置で取得されるデジタル信号、例えば存在量に換算される前の蛍光強度や反射率等の光学的強度、放射線強度、又は振動数などに相当するデジタル信号であってもよい。

前記炎症の進行状態に関する情報は、炎症性反応が亢進するか否かの情報および抗炎症性反応が亢進するか否かの情報からなる群から選択される情報であってもよいし、炎症性サイトカインの発現量が増加するか否かの情報および抗炎症性サイトカインの発現量が増加するか否かの情報からなる群から選択されるサイトカイン発現情報を含むものであってもよい。

前記診断支援情報は、将来の炎症の進行状態に関する情報の他、さらに治療方法の情報を含むことが好ましく、当該治療方法としては、抗炎症剤の投与、血漿交換および顆粒球コロニー刺激因子の投与からなる群より選択されることが好ましい。

診断支援情報出力手段は、炎症性サイトカインに特異的な転写制御因子の情報を記憶する記憶手段；及び情報取得手段により取得された転写制御因子情報と前記記憶手段に記憶された情報とに基づいて炎症性サイトカインの発現量が増加するか否かを予測する予測手段を備え、予測手段の予測結果に基づいて診断支援情報を出力するものであることが好ましい。前記記憶手段は、さらに抗炎症性サイトカインに特異的な転写制御因子の情報を記憶する手段であることが好ましい。

あるいは診断支援情報出力手段は、炎症性反応が亢進するか否かの情報を記憶する記憶手段；及び情報取得手段により取得された転写制御因子情報と前記記憶手段に記憶された情報とに基づいて炎症性サイトカインの発現量が増加するか否かを予測する予測手段を備え、予測手段の予測結果に基づいて診断支援情報を出力するものであってもよい。また、前記記憶手段は、さらに抗炎症性反応が亢進するか否かの情報を記憶する記憶手段であってもよい。

本発明の診断支援情報出力装置の一実施形態について、図７のハードウェア構成例に基づいて説明する。

本実施の形態に係る診断支援出力装置を備えたシステム１００は、本体１１０と、ディスプレイ１２０と、入力デバイス１３０とから主として構成されたコンピュータ１００ａによって構成されている。本体１１０は、ＣＰＵ１１０ａと、ＲＯＭ１１０ｂと、ＲＡＭ１１０ｃと、ハードディスク１１０ｄと、読出装置１１０ｅと、入出力インタフェース１１０ｆと、通信インタフェース１１０ｇと、画像出力インタフェース１１０ｈとから主として構成されており、ＣＰＵ１１０ａ、ＲＯＭ１１０ｂ、ＲＡＭ１１０ｃ、ハードディスク１１０ｄ、読出装置１１０ｅ、入出力インタフェース１１０ｆ、および画像出力インタフェース１１０ｈは、バス１１０ｉによってデータ通信可能に接続されている。

図７に示す診断支援情報出力システムの構成において、入出力インターフェース１１０ｆが情報取得手段に該当し、本体１１０が診断支援情報出力手段に該当する。また、記憶手段は、ＲＯＭ１１０ｂ、ＲＡＭ１１０ｃ、ハードディスク１１０ｄが具体的に該当し、予測手段はＣＰＵ１１０ａが該当する。

入出力インタフェース１１０ｆは、例えばUSB，IEEE1394，RS-232C等のシリアルインタフェース、SCSI，IDE，IEEE1284等のパラレルインタフェース、およびＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器等からなるアナログインタフェース等から構成されている。入出力インタフェース１１０ｆには、キーボードおよびマウスからなる入力デバイス１３０が接続されており、ユーザが当該入力デバイス１３０を使用することにより、コンピュータ１００ａにデータを入力することが可能である。

入力デバイス１３０を介して測定データを含む転写制御因子情報をユーザーが入力してもよいし、活性型転写制御因子の存在量を測定する測定装置の出力部と入出力インターフェース１３０とを接続して、測定により得られたデジタル信号を、転写制御因子情報として直接入力されるようにしてもよい。

予測手段であるＣＰＵ１１０ａは、記憶手段としてのＲＯＭ１１０ｂに記憶されているコンピュータプログラムおよびＲＡＭ１１０ｃにロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。そして、後述するようなアプリケーションプログラム１４０ａを当該ＣＰＵ１１０ａが実行することにより、コンピュータ１００ａが診断支援システム１００として機能する。具体的には、情報取得手段から入力された活性型転写制御因子の情報に基づいて発現するサイトカインが炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの何れであるかを予測し、この予測結果に基づいて診断支援情報を出力する。あるいは記憶手段に記憶されている情報が炎症反応又は抗炎症反応の亢進の原因となる転写制御因子の情報である場合には、炎症反応が亢進するか否か、抗炎症反応が亢進するか否かを予測し、この予測結果に基づいて診断支援情報を出力する。

記憶手段には、情報取得手段が取得した転写制御因子情報に基づいて診断支援情報を出力するのに必要な情報、具体的には、炎症性サイトカイン若しくは抗炎症性サイトカインと転写制御因子との関係に関する情報、あるいは炎症反応又は抗炎症反応の亢進の原因となるサイトカインと転写制御因子の関係に関する情報が記憶される。さらに治療方法に関する情報を記憶させてもよく、これらの情報は、少なくともＲＯＭ１１０ｂ、ＲＡＭ１１０ｃ、ハードディスク１１０ｄのいずれか１つに記憶される。なお、サイトカインと転写制御因子の関係に関する情報には、例えば、転写制御因子に対応して発現するサイトカインの種類の情報、転写制御因子の存在量に対応するサイトカインの発現量の情報、転写制御因子の発現からサイトカインの発現に至る時間等が含まれる。

ＲＯＭ１１０ｂは、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ等によって構成されており、上記転写制御因子とサイトカインとの関係に関する情報や治療方法に関する情報の他、ＣＰＵ１１０ａに実行されるコンピュータプログラムおよびこれに用いるデータ等が記録されている。

ＲＡＭ１１０ｃは、ＳＲＡＭまたはＤＲＡＭ等によって構成されている。ＲＡＭ１１０ｃは、ＲＯＭ１１０ｂおよびハードディスク１１０ｄに記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ１１０ａの作業領域として利用される。入出力インターフェース１１０ｆから入力された転写制御因子情報を一時的に記憶してもよい。

ハードディスク１１０ｄには、サイトカインと転写制御因子との関係に関する情報の他、オペレーティングシステム（例えば米マイクロソフト社が製造販売するWindows（登録商標）等のグラフィカルユーザインタフェース環境を提供するオペレーティングシステム）およびアプリケーションプログラム等、ＣＰＵ１１０ａに実行させるための種々のコンピュータプログラムがインストールされている。後述するアプリケーションプログラム１４０ａも、このハードディスク１１０ｄにインストールされている。

読出装置１１０ｅは、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、またはＤＶＤ−ＲＯＭドライブ等によって構成されており、可搬型記録媒体１４０に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。また、可搬型記録媒体１４０には、コンピュータを本発明に係る診断支援システムとして機能させるためのアプリケーションプログラム１４０ａが格納されており、コンピュータ１００ａが当該可搬型記録媒体１４０から本発明に係るアプリケーションプログラム１４０ａを読み出し、当該アプリケーションプログラム１４０ａをハードディスク１１０ｄにインストールすることが可能である。

なお、前記アプリケーションプログラム１４０ａは、可搬型記録媒体１４０によって提供されるのみならず、電気通信回線（有線、無線を問わない）によってコンピュータ１００ａと通信可能に接続された外部の機器から前記電気通信回線を通じて提供することも可能である。例えば、前記アプリケーションプログラム１４０ａがインターネット上のサーバコンピュータのハードディスク内に格納されており、このサーバコンピュータにコンピュータ１００ａがアクセスして、当該コンピュータプログラムをダウンロードし、これをハードディスク１１０ｄにインストールすることも可能である。

画像出力インタフェース１１０ｈは、ＬＣＤまたはＣＲＴ等で構成されたディスプレイ１２０に接続されており、ＣＰＵ１１０ａから与えられた画像データに応じた映像信号をディスプレイ１２０に出力するようになっている。ディスプレイ１２０は、入力された映像信号にしたがって、画像（画面）を表示する。

次に、情報出力手段が行なう診断支援情報出力処理の一実施形態を、ＳＩＲＳの診断支援情報出力処理のフローチャートを示した図８に基づいて説明する。

まず、コンピュータ１００ａは、患者血液を測定して得られた活性型転写制御因子の測定データを取得する（Ｓ１）。この測定データの取得は、測定装置で測定された活性型転写制御因子の測定データを入力デバイス１３０により入力することにより行われる。また、試料の採取時刻、転写制御因子の測定に要した時間等も入力デバイス１３０により入力される。なお、コンピュータ１００ａと測定装置をＬＡＮ等のネットワークで接続することによりコンピュータ１００ａの入出力インタフェース１１０ｆを介してＬＡＮに接続された測定装置から活性型転写制御因子の測定データを取得することも可能である。

次に、ＣＰＵ１１０ａは取得した測定データに基づいて発現するサイトカインの予測を行う（Ｓ２）。発現するサイトカインの予測は、測定された活性型ＮＦκＢの発現量に基づいて行われる。ＮＦκＢはＳＩＲＳに関係する炎症性サイトカイン（ＩＬ８、ＩＬ６、ＴＮＦα）に特異的な転写制御因子である。従って、ＮＦκＢが所定以上発現している場合には、ＩＬ８、ＩＬ６およびＴＮＦαの何れかの炎症性サイトカインが数時間後に発現する旨の予測が可能である。

発現するサイトカインの予測に対応する診断支援情報を選択しディスプレイ１２０に表示する（Ｓ３）。この診断支援情報には、炎症性サイトカインの発現量が試料の採取時点より増加するか否かの予測結果、治療方法（抗炎症剤の投与）の適否の情報等が含まれる。

なお、この実施形態では、ＮＦκＢの測定データに基づいて発現するサイトカインの予測を行ったが、測定する転写制御因子の種類を増加させ、発現するサイトカインの種類を予測するようにしてもよい。ＩＬ８の発現予測を行う場合、転写因子の種類および量比（測定値、定量値等）はAP1:C/EBP:NFkB = 1 : 1 : 1である。ＩＬ６の発現予測を行う場合は、AP1:C/EBP:NFkB:CREB = 1 : 1 : 1 : 1である。ＩＬ２の発現予測を行う場合は、AP1:NFAT:Sp1 = 1 : 1 : 1である。ＴＮＦαの発現予測を行う場合は、AP1:NFkB:Sp1:EGR1:AP2:CRE1 = 1 : 3 : 1 : 1 :1 : 1である。ＩＬ４の発現予測を行う場合は、AP1:C/EBP = 1 : 2である。ＩＬ１０の発現予測を行う場合には、CRE1:CRE3:CRE4:TATA:C/EBP1:C/EBP3:C/EBP5 = 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1である。

なお、これらの量比は、個人、サンプル前処理工程による誤差を含むため、それぞれの転写因子量の誤差は± 0.5程度である。例えば、 AP1:C/EBP:NFkB:CREB = 1.2 : 0.6 : 0.9 : 1.3 の場合には ＩＬ６ と判定することができる。

〔核抽出物試料の調製方法〕
（１）ＨｅＬａ細胞の核抽出物試料の調製
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８３年、３月１１日発行、１１（５）、１４７５〜１４８９頁に記載の方法に準じて行なった。

具体的には、ＨｅＬａ細胞の培養液を４℃、２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、回収したＨｅＬａ細胞を５〜１０ｍｌの氷冷したリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で洗浄した（４℃、２０００ｒｐｍで１０分間遠心）後、バッファーＡ（最終濃度：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＤＤＴ）を５〜１０ｍｌ加えて懸濁し、１０分間静置した。このとき、実体顕微鏡で観察することにより、細胞の膨張を確認できた。その後、４℃、２０００ｒｐｍで１０分間遠心して、細胞を回収し、再び、１〜５ｍｌのバッファーＡで懸濁した。

Ｄｏｕｎｃｅ ホモゲナイザーで２０〜４０ストローク、又は２４Ｇ針を用いたシリンジングで２０〜４０ストロークすることにより、細胞を破壊した。実体顕微鏡で観察して細胞膜が崩壊し、裸核となっていることを確認した。

４℃、１５０００×ｇで２０分間遠心することにより、細胞粉砕物を回収した。これにバッファーＣ（最終濃度：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、２５ｖ／ｖ％グリセロール、０．４２Ｍ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、ＤＤＴ ０．５ｍＭ）１ｍｌを加えて懸濁し、Ｄｏｕｎｃｅ ホモゲナイザーで２０〜４０ストローク、又は２４Ｇ針を用いたシリンジングで２０〜４０ストロークすることにより、核を破壊した。４℃、１５０００×ｇで３０分間遠心し、上清を回収した。回収した上清は、液体窒素で凍結し、−８０℃で保存する。

尚、脱塩が必要な場合には、５０倍量のバッファーＤ（最終濃度：２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、２５ｖ／ｖ％グリセロール、０．１Ｍ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ ＤＤＴ）で５時間透析する。

〔転写制御因子が核内へ移行することの検証〕
（１）免疫染色による顕微鏡観察
ＨｅＬａ培養細胞を、蛍光標識した抗ＮＦκＢ抗体と反応させた後１２０分間静置して、蛍光顕微鏡で観察した。顕微鏡写真（倍率４００倍）を図９に示す。細胞核周辺が蛍光で染まっており、刺激を受けていないときには、ＮＦκＢが細胞質内に存在していることがわかる。

一方、ＨｅＬａ培養細胞に、リポポリサッカライド２．５ｍｇ／ｍｌを投与するとともに、ＨｅＬａ培養細胞を蛍光標識した抗ＮＦκＢ抗体と反応させた後１２０分間静置して、蛍光顕微鏡で観察した。顕微鏡写真（倍率４００倍）を図１０に示す。核内が蛍光で染まっており、リポポリサッカライド投与により、ＮＦκＢが核内に移行したことがわかる。

（２）ゲルシフトアッセイ
上記方法により調製したＨｅＬａ細胞の核抽出液（コントロール）、リポポリサッカライド２．５ｍｇ／ｍｌ投与直後のＨｅＬａ細胞の核抽出液、リポポリサッカライド投与６０分後、１２０分後の核抽出液を、ＮＦκＢ結合配列を有する合成オリゴヌクレオチドをプローブとして、ゲルシフトアッセイを行なった。結果を図１１に示す。

コントロール（−）、投与直後（０）では、ＮＦκＢのバンドは認められなかったが、６０分後、１２０分後となるにつれて、ＮＦκＢに該当する部分に濃いバンドが認められた。従って、リポポリサッカライドの投与により、ＮＦκＢが核内へ移行することがわかる。
以上の結果から、活性型転写制御因子の量は、核抽出物に存在する転写制御因子の量を測定すればよいことがわかる。

〔ヌクレオチドプローブの特異性の検証〕
（１）ＨｅＬａ細胞での確認
図１２（ａ）に示すような配列を有するワイルドタイプ（ＷＴ）のオリゴヌクレオチド（四角で囲んだ部分が転写制御因子結合部位である）、図１２（ｂ）に示すような配列を有する変異プローブ（変異部分をアンダーラインで示す）を用いた。

ＨｅＬａ培養細胞に、リポポリサッカライド２．５ｍｇ／ｍｌを投与した１２０分後に、上記核抽出物試料の調製方法に従って核抽出液を調製した。

ＷＴプローブを植設した金属膜及び変異プローブを植設した金属膜をそれぞれ用いたＳＰＲ装置に、核抽出液（０．２ｎｍｏｌ、１．０ｎｍｏｌ）を供して、測定した。コントロールとして、プローブを植設していない金属膜を用いたＳＰＲ装置に核抽出液を供して測定した。結果を図１３に示す。

図中、縦軸は、転写因子とプローブの複合体に係るＲｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔ（ＲＵ）を示している。０．２ｎｍｏｌ、１．０ｎｍｏｌいずれについても、変異プローブの場合はコントロールと同程度のＲＵを示し、ＷＴプローブの場合は、コントロールのＲＵよりも随分小さいＲＵを示した。このことから、核抽出液に含まれるＮＦκＢは、ＷＴプローブと結合しても、変異プローブとは結合しないことが確認できた。

（２）健常人リンパ球での確認
健常人のヒトリンパ球にリポポリサッカライドを投与し、上記核抽出物試料の調製方法により核抽出液を調製した。

図１２に示すＮＦκＢ結合配列を有する合成オリゴヌクレオチドプローブ又は変異プローブを用いて、ゲルシフトアッセイを行なった。結果を図１４に示す。

図１４中、１はＮＦκＢ結合配列を有する合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて核抽出液を供しなかった場合、２は変異プローブを用いて核抽出液を供した場合、３はＷＴプローブを用いて核抽出液を供した場合を示している。プローブとＮＦκＢとの複合体は、３の場合に強く表れた。従って、ＨｅＬａ細胞だけでなく、健常人においてもＷＴプローブは、ＮＦκＢの検出プローブとして有用であることがわかる。

〔転写制御因子の検出測定：ＮＦκＢ〕
１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を含む水溶液２０μｌ中、ＮＦκＢを４０ｎｇ、８０ｎｇ、１２０ｎｇ、１６０ｎｇ、２００ｎｇ含む測定用試料液を調製した。

この試料液を、ＷＴプローブを設けたＳＰＲ装置（ビアコア社製ＢＩＡＣＯＲＥ−Ｊ）で測定した。結果を図１５に示す。測定にかかった時間は１５分であった。信号強度は、ＮＦκＢの含有濃度に比例して大きくなった。

上記試料液について、ＷＴプローブを設けたＦＣＳ装置（浜松フォトニクス社製）、ＱＣＭ装置（イニシアム社製Ａｆｆｉｎｉｘ−Ｑ４）で、同様に測定した。それぞれの結果を図１６及び図１７に示す。いずれの方法もＮＦκＢの含有濃度に比例して信号強度に該当する拡散時間又は振動数変化が大きくなった。また、測定にかかった時間は、１０分であった。
いずれの方法もＮＦκＢの測定開始から測定結果が得られるまでの時間は１５分以内であり、数時間後に発現するサイトカインが実際に細胞から分泌されるときまでに知ることが可能である。

〔転写制御因子の検出測定：ＳＰ−１〕
１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を含む水溶液１１０μｌ中に、ＳＰ−１を２１５ｎｇ、４３０ｎｇ、６４５ｎｇ、１０７５ｎｇ含む測定用試料液を調製した。

この試料液を、ＷＴプローブ（５’−ＴＧＴＡＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＴＴＡＡＧＡＡ）、変異プローブ（５’−ＴＧＴＡＴＣＣＣＣＡＡＡＣＣＣＴＴＡＡＧＡＡ）をそれぞれ植設した金属膜を用いたＳＰＲ装置（ビアコア社製ＢＩＡＣＯＲＥ−Ｊ）で、ＮＦκＢの場合と同様にして測定した。結果を図１８に示す。

試料液中のＳＰ−１は、ＷＴプローブと結合しても、変異プローブとは結合しないことが確認できた。測定にかかった時間は１５分であった。また、図１８に示すように、信号強度（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｕｎｉｔ）は、ＳＰ−１の含有濃度に比例して大きくなった。

〔転写制御因子の検出測定：ＡＰ−１〕
１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を含む水溶液１１０μｌ中に、ＡＰ−１を６０ｎｇ、１５０ｎｇ、３００ｎｇ、６００ｎｇ含む測定用試料液を調製した。

この試料液を、ＷＴプローブ（５’−ＴＣＧＡＣＧＴＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＧＣＡＴＣＧＴＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＧＣ）、変異プローブ（５’−ＴＣＧＡＣＧＴＧＡＣＴＴＧＧＣＧＣＧＣＡＴＣＧＴＧＡＣＴＴＧＧＣＧＣＧＣ）をそれぞれ植設した金属膜を用いたＳＰＲ装置（ビアコア社製ＢＩＡＣＯＲＥ−Ｊ）で、ＮＦκＢの場合と同様にして測定した。結果を図１９に示す。

試料液中のＡＰ−１は、ＷＴプローブと結合しても、変異プローブとは結合しないことが確認できた。測定にかかった時間は１５分であった。また、図１９に示すように、信号強度（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｕｎｉｔ）は、ＡＰ−１の含有濃度に比例して大きくなった。

〔リウマチ患者関節液由来の線維芽細胞を用いたサイトカインの発現解析〕
（１）リウマチ患者関節液由来の線維芽細胞
リウマチ（ＲＡ）患者よりインフォームドコンセントを得た後、関節液を１０〜１５ｍｌ回収し、ＰＢＳで３回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）中で、３７℃、５％ＣＯ_２で培養を行ない５〜８回継代培養したものを、以下の実験に用いた。
（２）トロンビン刺激によるサイトカイン分泌
（１）のＲＡ患者由来線維芽細胞（２×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を刺激前４８時間、低血清（０．５％ＦＣＳ）条件下で培養した。この培養細胞液に、トロンビン（１０ｕｎｉｔ／ｍｌ）を添加し、トロンビン添加直後（０ｔｉｍｅ）、添加４時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後に培養上清を回収して、トロンビン刺激によって分泌されたサイトカイン（Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ６）量を測定した。培養液中のサイトカイン（Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ６）は、それぞれのＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、カリフォルニア州）を用いて測定した。測定結果を表１に示す。

表１からわかるように、ＲＡ患者関節液から培養した線維芽細胞からトロンビン刺激によって分泌されたサイトカインのうち、ＩＬ６は刺激後８時間で優位に分泌が亢進し、Ｇ−ＣＳＦでは刺激１２時間後に優位に分泌が亢進していた。一方、同じ炎症性サイトカイン群として知られているＩＬ２では、トロンビン刺激による優位な分泌亢進は認められなかった。

（３）トロンビン刺激によるサイトカインｍＲＮＡ発現解析
（１）のＲＡ患者由来線維芽細胞（２×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を刺激前４８時間、低血清（０．５％ＦＣＳ）条件下で培養した。この培養液に、トロンビン（１０ｕｎｉｔ／ｍｌ）を添加し、トロンビン添加直後、添加０．５時間後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、１２時間後、２４時間後ごとに細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡ試料に、逆転写酵素を加えてｃＤＮＡを合成し、下記サイトカイン測定用プライマーを用いてＰＣＲで増幅させた後、ＰＣＲ合成物をアガロースゲル電気泳動を行ない、目的とするｍＲＮＡを検出測定した。測定結果を図２０に示す。図２０において、βアクチンはコントロールである。

尚、ＲＴ−ＰＣＲ法で用いたプライマーは、下記の通りである。
ＩＬ６−１：５’−ＧＣＧＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＡＧＴＴＧＣＣＴＴＧＴＣ
ＩＬ６−２：５’−ＣＣＴＣＴＴＴＧＣＴＧＣＴＴＴＣＡＣＡＣＡＴＧ
Ｇ−ＣＳＦ−１：５’−ＡＣＡＧＴＧＣＡＣＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴ
Ｇ−ＣＳＦ−２：５’−ＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＴＧＴＧＴＣＣＡ

図２０からわかるように、ＩＬ６では刺激後４時間でＩＬ６のｍＲＮＡの発現が確認され、Ｇ−ＣＳＦでは刺激後４〜８時間でＧ−ＣＳＦのｍＲＮＡの発現が確認された。
（４）トロンビン刺激による活性型ＮＦκＢの測定
（４−１）核抽出液の調製
（１）のＲＡ患者由来線維芽細胞（２×１０^５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を刺激前４８時間、低血清（０．５％ＦＣＳ）条件下で培養した。この培養液に、トロンビン（１０ｕｎｉｔ／ｍｌ）を添加した直後、培養液から細胞を回収した。回収した細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心後、低張溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１％ ＮＰ−４０及びタンパク質分解酵素阻害剤（Ｓｉｇｍａ社製））を加え、氷冷しながら３０分間反応させ、細胞を可溶化した。細胞可溶化液を、４℃、２５００×ｇで１分間遠心し、沈殿（核分画）を回収した。回収した核分画に核可溶化溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、０．４２Ｍ ＫＣｌ及びタンパク質分解酵素阻害剤（Ｓｉｇｍａ社製））を加え、核の可溶化を行なった。核可溶化液を、４℃、１２０００×ｇで１５分間遠心し、上清を核抽出液として使用した。

（４−２）ゲルシフトアッセイ
１０ｍＭのＴｒｉｓ／塩酸（ｐＨ７．１）、５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、５％グリセロール、０．２５％のＮＰ−４０、及び１ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有した混合液に、（４−１）で調製した核抽出液（任意濃度）、１μｇ／ｍｌのＰｏｌｙ−ｄｌ／ｄＣ、及び２０ｆｍｏｌのＦＩＴＣ標識プローブ（５’−ＦＩＴＣ−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ（インビトロジェン社の特注品））を加えて、４℃で３０分間反応させた。反応後、２５％グリセロール及び青色色素（ブロモフェノールブルー）を適当量加え、予め通電（１５０Ｖ、９０分間）した５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動（１５０Ｖ、４℃、２〜４時間）を行なった。電気泳動終了後、ゲル内の蛍光色素をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＦＸ（ＢＩＯ Ｒａｄ社）を用いて可視化し、解析を行なった。結果を図２１に示す。

図２１から、活性型ＮＦκＢの量は、トロンビン刺激の３０分後から増加して４時間後にピークに達したことがわかる。

トロンビン刺激によるサイトカインの分泌（表１）、ｍＲＮＡの発現（図２０）、ゲルシフトアッセイ（図２１）の結果から、ＩＬ６及びＧ−ＣＳＦは、ＤＮＡ上で活性型ＮＦκＢ量の増大による発現制御を受けていると考えられる。一方、ＤＮＡ上にＮＦκＢ結合配列をもたないサイトカインであるＩＬ２については、トロンビン刺激により活性型ＮＦκＢの存在量が増加しても、ｍＲＮＡ発現量、分泌量の亢進は認められなかった。これらの結果から、ＲＡ患者関節液由来線維芽細胞（慢性的炎症患者）では、生理活性物質や炎症起因物質による活性型ＮＦκＢ量の増加に伴ってＩＬ６、Ｇ−ＣＳＦ発現が亢進され、ＮＦκＢ配列を持たないＩＬ２の発現調節は独自の転写制御因子配列（ＮＦＡＴ、ＡＰ−１）により行なわれていると考えられる。従って、ＲＡ患者について、ＩＬ６、Ｇ−ＣＳＦの発現による症状の発生の有無を前もって知りたい場合、これらに共通する転写制御因子であるＮＦκＢの核内の存在量（活性型ＮＦκＢの存在量）を、生検試料について測定すれば、炎症性反応が亢進するか否かの情報を得ることができると考えられる。

本発明の診断支援方法によれば、数時間後に発現されるサイトカインの予測結果に基づく情報が得られるので、症状や患者から採取した試料中に存在するサイトカインの測定といった従来の診断方法では適切な対処が困難であった、時事刻々と症状が変化する疾病、すなわち敗血症やＳＩＲＳ等の免疫システム異常疾患について、数時間後に起る症状を予測して治療にあたることが可能となる。
従って、本発明の診断支援情報出力装置を医療現場に設置しておくことにより、従来、正確な症状の原因把握が困難であった免疫システム異常疾患について、数時間後に起る症状に対する適切な治療方法の選択が可能となり、ひいては救命率の向上、ＩＣＵ滞在時間を短縮化することが可能となる。

本発明の免疫システム異常疾患の診断支援方法は、患者から採取した生物学的試料に含まれ、炎症性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインからなる群より選択されるサイトカインに特異的な活性型転写制御因子の存在量を、表面プラズモン共鳴法、水晶振動子マイクロバランス法、及び１分子蛍光相関法からなる群より選択される測定方法を用いて測定する工程；及び
測定された活性型転写制御因子の存在量に基づいて、将来の炎症の進行状態に関する情報を含む診断支援情報を出力する工程を備えている。

本発明の免疫システム異常疾患の診断支援情報出力装置は、患者から採取した生物学的試料に含まれ、炎症性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインからなる群より選択されるサイトカインに特異的な活性型転写制御因子の存在量を、表面プラズモン共鳴法、水晶振動子マイクロバランス法、及び１分子蛍光相関法からなる群より選択される測定方法を用いて測定して得られた活性型転写制御因子情報を取得する情報取得手段；及び
取得した転写制御因子情報に基づいて、将来の炎症の進行状態に関する情報を含む診断支援情報を出力する診断支援情報出力手段を備えている。

診断支援情報出力手段が、炎症性サイトカインに特異的な転写制御因子の情報を記憶する記憶手段と、情報取得手段により取得された活性型転写制御因子情報と前記記憶手段に記憶された情報に基づいて、炎症性サイトカインの発現量が増加するか否かを予測する予測手段とを備え、予測手段の予測結果に基づいて診断支援情報を出力することが好ましい。前記記憶手段は、さらに抗炎症性サイトカインに特異的な転写制御因子の情報を記憶する手段であってもよい。

あるいは診断支援情報出力手段が、炎症性反応が亢進するか否かの情報を記憶する記憶手段と、情報取得手段により取得された活性型転写制御因子情報と前記記憶手段に記憶された情報に基づいて、炎症性反応が亢進するか否かを予測する予測手段とを備え、予測手段の予測結果に基づいて診断支援情報を出力するものであってもよく、前記記憶手段は、さらに、抗炎症性反応が亢進するか否かの情報を記憶する手段であってもよい。

なお、この実施形態では、ＮＦκＢの測定データに基づいて発現するサイトカインの予測を行ったが、測定する転写制御因子の種類を増加させ、発現するサイトカインの種類を予測するようにしてもよい。ＩＬ８の発現予測を行う場合、転写制御因子の種類および量比（測定値、定量値等）はAP1:C/EBP:NFkB = 1 : 1 : 1である。ＩＬ６の発現予測を行う場合は、AP1:C/EBP:NFkB:CREB = 1 : 1 : 1 : 1である。ＩＬ２の発現予測を行う場合は、AP1:NFAT:Sp1 = 1 : 1 : 1である。ＴＮＦαの発現予測を行う場合は、AP1:NFkB:Sp1:EGR1:AP2:CRE1 = 1 : 3 : 1 : 1 :1 : 1である。ＩＬ４の発現予測を行う場合は、AP1:C/EBP = 1 : 2である。ＩＬ１０の発現予測を行う場合には、CRE1:CRE3:CRE4:TATA:C/EBP1:C/EBP3:C/EBP5 = 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1である。

なお、これらの量比は、個人、サンプル前処理工程による誤差を含むため、それぞれの転写制御因子量の誤差は± 0.5程度である。例えば、 AP1:C/EBP:NFkB:CREB = 1.2 : 0.6 : 0.9 : 1.3 の場合には ＩＬ６ と判定することができる。

本発明は、敗血症などの全身性炎症反応症候群（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＳＩＲＳ））、抗炎症反応症候群（Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＣＡＲＳ））等の免疫システム異常疾患の診断支援情報出力装置及び診断支援情報出力プログラムに関し、原因となるサイトカインの発現を転写段階で予測することにより数時間後に現れるであろう症状に関する診断支援情報を出力する診断支援情報出力装置及び診断支援情報出力プログラムに関する。

本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、急激に症状が変化し得る免疫システム異常疾患の治療に際して、適切な診断支援情報を出力することができる免疫システム異常疾患の診断支援情報出力装置を提供することにある。また、本発明の他の目的は、コンピュータを免疫システム異常疾患の診断支援情報出力装置として機能させるための診断支援情報出力プログラムを提供することである。

また、本発明の免疫システム異常疾患の診断支援情報出力プログラムは、患者から採取した生物学的試料に含まれ、炎症性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインからなる群より選択されるサイトカインに特異的な活性型転写制御因子の存在量を、表面プラズモン共鳴法、水晶振動子マイクロバランス法、及び１分子蛍光相関法からなる群より選択される測定方法を用いて測定して得られた活性型転写制御因子情報を取得する情報取得手段；及び取得した活性型転写制御因子情報に基づいて、将来の炎症の進行状態に関する情報を含む診断支援情報を出力する診断支援情報出力手段としてコンピュータを機能させるものである。
尚、本明細書にいう「活性型転写制御因子」とは、細胞質内に複合体として存在している状態の転写制御因子とは区別して用いられ用語で、サイトカインの発現にあたり関係する遺伝子を転写するために複合体から離脱して核内に移行した転写制御因子をいう。

本発明の診断支援情報出力装置は、症状が経時的に変化していくような免疫システムの異常疾患の患者から採取した試料に基づいて、数時間後におこる炎症の状態に関する診断支援情報を出力するので、好適な治療を施すことができ、また重篤な症状が現れる前に予防措置を採ることができる。
本発明の免疫システム異常疾患の診断支援情報出力プログラムは、患者から採取した試料に含まれる、症状が現れる原因となるサイトカインが発現する前の転写段階を制御している活性型転写制御因子量を測定して得られる活性型転写制御因子情報を取得し、さらに取得した情報に基づいて将来の炎症の進行状態に関する情報を含む診断支援情報を出力できるように、コンピュータを機能させることができる。

〔免疫システム異常疾患の診断支援方法〕
免疫システム異常疾患の診断支援方法は、患者から採取した生物学的試料に含まれ、炎症性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインからなる群より選択されるサイトカインに特異的な活性型転写制御因子の存在量を測定する工程；及び測定された活性型転写制御因子の存在量に基づいて、将来の炎症の進行状態に関する情報を含む診断支援情報を出力する工程を備えている。

診断支援方法が対象とする免疫システム異常疾患としては、敗血症などの全身性炎症反応症候群（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＳＩＲＳ））、抗炎症反応症候群（Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＣＡＲＳ））等が挙げられ、特にＳＩＲＳが診断支援対象として適している。

本発明の免疫システム異常疾患の診断支援情報出力装置は、数時間後に発現されるサイトカインの予測結果に基づく情報を出力するので、症状や患者から採取した試料中に存在するサイトカインの測定といった従来の診断方法では適切な対処が困難であった、時事刻々と症状が変化する疾病、すなわち敗血症やＳＩＲＳ等の免疫システム異常疾患について、数時間後に起る症状を予測して治療にあたることが可能となる。
従って、本発明の診断支援情報出力装置を医療現場に設置しておくことにより、従来、正確な症状の原因把握が困難であった免疫システム異常疾患について、数時間後に起る症状に対する適切な治療方法の選択が可能となり、ひいては救命率の向上、ＩＣＵ滞在時間を短縮化することが可能となる。

本発明の免疫システム異常疾患の診断支援情報出力装置は、患者から採取した生物学的試料に含まれ、炎症性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインからなる群より選択されるサイトカインに特異的な活性型転写制御因子の存在量を、表面プラズモン共鳴法、水晶振動子マイクロバランス法、及び１分子蛍光相関法からなる群より選択される測定方法を用いて測定して得られた活性型転写制御因子情報を取得する情報取得手段；ディスプレイ；及び前記情報取得手段により取得した活性型転写制御因子情報に基づいて、将来の炎症性反応が亢進するか否かの情報および炎症性反応の治療方法の情報を含む診断支援情報を前記ディスプレイに表示する診断支援情報出力手段を備えている。

前記診断支援情報が、炎症性サイトカインの発現量が増加するか否かの情報を含むものであってもよい。

前記治療方法の情報は、抗炎症剤の投与の情報を含むことが好ましい。

また、本発明の免疫システム異常疾患の診断支援情報出力プログラムは、上記本発明の診断支援情報出力プログラムとして、コンピューターを機能させるものである。
尚、本明細書にいう「活性型転写制御因子」とは、細胞質内に複合体として存在している状態の転写制御因子とは区別して用いられ用語で、サイトカインの発現にあたり関係する遺伝子を転写するために複合体から離脱して核内に移行した転写制御因子をいう。

Claims (19)

1. 患者から採取した生物学的試料に含まれ、炎症性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインからなる群より選択されるサイトカインに特異的な活性型転写制御因子の存在量を測定する工程；及び
   測定された活性型転写制御因子の存在量に基づいて、将来の炎症の進行状態に関する情報を含む診断支援情報を出力する工程
   を備えた免疫システム異常疾患の診断支援方法。
2. 前記炎症の進行状態に関する情報が、炎症性反応が亢進するか否かの情報、および抗炎症性反応が亢進するか否かの情報からなる群から選択される情報を含む請求項１に記載の診断支援方法。
3. 前記炎症の進行状態に関する情報が、炎症性サイトカインの発現量が増加するか否かの情報、および抗炎症性サイトカインの発現量が増加するか否かの情報、からなる群から選択されるサイトカイン発現情報を含む請求項１に記載の診断支援方法。
4. 前記診断支援情報は、治療方法の情報を含む請求項１に記載の診断支援方法。
5. 前記治療方法は、抗炎症剤の投与、血漿交換、および顆粒球コロニー刺激因子の投与からなる群より選択される請求項４に記載の診断支援方法。
6. 前記試料は、患者から採取した細胞の核抽出物である請求項１に記載の診断支援方法。
7. 前記測定工程は、測定開始から測定結果が得られるまでの時間が３０分以下である測定方法により実施される請求項１に記載の診断支援方法。
8. 前記測定方法は、表面プラズモン共鳴法、水晶振動子マイクロバランス法、及び１分子蛍光相関法からなる群より選択される１種である請求項７に記載の診断支援方法。
9. 前記測定工程は、２種以上の活性型転写制御因子を測定する請求項１に記載の診断支援方法。
10. 前記免疫システム異常疾患は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）である請求項１に記載の診断支援方法。
11. 患者から採取した生物学的試料に含まれ、炎症性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインからなる群より選択されるサイトカインに特異的な活性型転写制御因子の存在量を測定して得られた転写制御因子情報を取得する情報取得手段；及び
    取得した転写制御因子情報に基づいて、将来の炎症の進行状態に関する情報を含む診断支援情報を出力する診断支援情報出力手段
    を備えた免疫システム異常疾患の診断支援情報出力装置。
12. 前記炎症の進行状態に関する情報が、炎症性反応が亢進するか否かの情報、および抗炎症性反応が亢進するか否かの情報からなる群から選択される情報を含む請求項１１に記載の診断支援情報出力装置。
13. 前記炎症の進行状態に関する情報が、炎症性サイトカインの発現量が増加するか否かの情報、および抗炎症性サイトカインの発現量が増加するか否かの情報からなる群から選択されるサイトカイン発現情報を含む請求項１１に記載の診断支援情報出力装置。
14. 前記診断支援情報は、治療方法の情報を含む請求項１１に記載の診断支援情報出力装置。
15. 前記治療方法は、抗炎症剤の投与、血漿交換、および顆粒球コロニー刺激因子の投与からなる群より選択される請求項１４に記載の診断支援情報出力装置。
16. 診断支援情報出力手段が、炎症性サイトカインに特異的な転写制御因子の情報を記憶する記憶手段；及び情報取得手段により取得された転写制御因子情報と前記記憶手段に記憶された情報とに基づいて炎症性サイトカインの発現量が増加するか否かを予測する予測手段を備え、
    予測手段の予測結果に基づいて診断支援情報を出力する請求項１１に記載の診断支援情報出力装置。
17. 前記記憶手段は、さらに抗炎症性サイトカインに特異的な転写制御因子の情報を記憶する手段である請求項１６に記載の診断支援情報出力装置。
18. 診断支援情報出力手段が、炎症性反応が亢進するか否かの情報を記憶する記憶手段；及び情報取得手段により取得された転写制御因子情報と前記記憶手段に記憶された情報に基づいて炎症性反応が亢進するか否かを予測する予測手段を備え、
    予測手段の予測結果に基づいて診断支援情報を出力する請求項１１に記載の診断支援情報出力装置。
19. 前記記憶手段は、さらに、抗炎症性反応が亢進するか否かの情報を記憶する手段である請求項１８に記載の診断支援情報出力装置。