CN113718029A - S100a4蛋白在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断中的应用 - Google Patents

S100a4蛋白在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医学生物学技术领域，尤其涉及S100A4在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断中的应用。本发明通过在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄患者的外周血单个核细胞中发现外周血单个核细胞中S100A4的表达明显上调。同时还发现S100A4的基因表达水平与血浆中S100A4的蛋白表达水平存在相关关系，差异具有统计学意义，提示S100A4作为动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断分子标记物的可行性并且可以达到对动脉粥样硬化性肾动脉狭窄无创诊断，具有重大临床应用价值。

Description

S100A4蛋白在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断中的应用
技术领域
本发明属于医学生物学技术领域，尤其涉及S100A4在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断中的应用。
背景技术
动脉粥样硬化性肾动脉狭窄是继发性高血压和肾功能衰竭的主要原因，近7%的老年人存在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄(60%管腔闭塞)，大多数肾动脉狭窄由动脉粥样硬化所致，形成不同程度的动脉粥样斑块及钙化，常常会使肾动脉成锥形或偏心狭窄，单侧或双侧肾动脉主干或主要分支狭窄超过50%即可诊断为肾动脉狭窄。动脉粥样硬化性肾动脉狭窄发病机制不清，但由于动脉粥样硬化造成的肾动脉管腔的狭窄，影响肾脏的供血功能，激活RAAS系统，引起机体的内分泌系统调节紊乱导致心脏的左室重构、血压增高和血管重塑等一系列的病理生理的改变。肾动脉狭窄往往发病症状不典型，多合并继发性高血压、缺血性肾病、终末期肾病后到医院就诊方能确定原发疾病的诊断。随机前瞻性试验研究发现无论是药物治疗还是微创介入治疗，无论是加强治疗还是充分控制血压治疗，肾脏和肾外并发症并不少见。然而，动脉粥样硬化性肾动脉狭窄精确机制、准确检测和最佳治疗仍然是未知的。以早期检测和针对这些致病途径的防治策略的研究可能会阻止临床终点事件的发展，故对动脉粥样硬化性肾动脉狭窄检测和针对这些致病途径的策略是我们亟待解决的问题。
S100蛋白是一种低分子质量的酸性蛋白，目前其家族成员主要有21个，S100蛋白家族的总体特征是其属于细胞类型特异性表达蛋白质，S100蛋白存在2个EF手的钙离子结合蛋白结合区域，S100家族成员因其具有不同的钙离子蛋白与不同的受体蛋白结合发挥不同的亲和能力，在细胞内和细胞间发挥不同的生物学作用。S100A4为S100家族成员的成纤维样的特殊蛋白，S100A4位于1号染色体长臂2区1带，由3个exon和1个intron组成，含有101个氨基酸，分子量为11.5KD。同S100家族的其它成员一样，S100A4也具有EF手型的钙离子结合特征结构，S100A4通过与特异性的钙离子结合后，空间构象发生变化，暴露S100A4配体与受体结合的部位，S100A4与特异性的受体结合后，发生炎症信号的级联放大效应，诱导和促进肿瘤转移，参与了肝脏、肺脏的纤维化、炎症和自身免疫性疾病的病理生理过程。S100A4在细胞内主要参与靶细胞的凋亡、迁移，S100A4的外泌可以促进中性粒细胞、单核巨噬细胞等炎症细胞表达和分泌细胞因子、生长因子、趋化因子及细胞外的基质金属蛋白酶，刺激促炎相关通路的激活，外泌的S100A4主要具有促炎、促转移的活性。
因此，研发在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄发病检测敏感性及特异性生化标志物是动脉粥样硬化性肾动脉狭窄防治亟待解决的重要的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种动脉粥样硬化性肾动脉狭窄临床诊断分子标志物S100A4在制备诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的试剂或试剂盒中的应用。本发现所提供的标志物具有高灵敏度和高特异性的特点并研制成相应的辅助诊断试剂或试剂盒，具有重大的临床意义。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
本发明提供了一种S100A4基因或其编码蛋白作为生物标志物在制备诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的试剂盒中的应用。
进一步地，所述试剂盒通过逆转录PCR、实时定量PCR或蛋白免疫检测试剂盒检测样本中S100A4基因或其编码蛋白的表达水平。
更进一步地，所述逆转录PCR和/或实时定量PCR检测试剂盒包括SEQ ID NO .3-SEQ ID NO .4所示的扩增S100A4基因的引物。
更近一步地，所述蛋白免疫检测试剂盒包括与S100A4蛋白特异性结合的抗体。
优选地，所述样本为血浆血和/或外周血单个核细胞。
进一步地，所述S100A4基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
进一步地，所述S100A4蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
本发明还提供了一种S100A4基因或其编码蛋白作为生物标志物在制备诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的试剂盒中的应用，其特征在于，所述S100A4基因荧光定量检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：
步骤1、收集外周血单个核细胞；
步骤2、提取外周血单个核细胞RNA；
步骤3、将抽提出的RNA反转录成对应的cDNA；
步骤4、将反转录后的cDNA进行对S100A4和GAPDH基因的荧光定量PCR扩增；
步骤5、以GAPDH作为内参，记录每个反应的Ct值，以2-△CT的方式表示人外周血单个核细胞中的S100A4的表达量，△CT为目标S100A4与参照GAPDH的CT值之差。
本发明还提供了一种S100A4基因或其编码蛋白作为生物标志物在制备诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的试剂盒中的应用，其特征在于，所述S100A4蛋白检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：
步骤1、分离收集血浆样品；
步骤2、测定血浆中S100A4浓度；
步骤3、绘制S100A4标准曲线；
步骤4、根据步骤3中绘制的S100A4标准曲线，以及步骤2中待检样品稀释倍数及待检样品测定的OD值，可以计算待检测样品的浓度；同时绘制S100A4的ROC曲线，计算曲线下面积，同时将待检测样品的浓度与临界值浓度进行比较。
进一步地，所述步骤4中曲线下面积作为判断检测结果敏感性和特异性的指标；所述临界值浓度为369.59 pg/mL。
与现有技术相比本发明的有益效果。
本发明首先在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄患者的外周血单个核细胞中发现外周血单个核细胞中S100A4的表达明显上调，其表达水平是正常对照患者的外周血单个核细胞中2.64倍，外周血单个核细胞中S100A4表达含量在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄表达显著增高，关联分析的研究显示，动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的患者外周血单个核细胞中S100A4的基因表达水平与血浆中S100A4的蛋白表达水平存在相关关系，相关系数为r=0.56，统计学差异p=0.003，差异具有统计学意义，提示S100A4作为动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断分子标记物的可行性并且可以达到对动脉粥样硬化性肾动脉狭窄无创诊断，具有重大临床应用价值。
附图说明
图1为对照组、动脉粥样硬化肾动脉狭窄组S100A4蛋白浓度变化。
图2 ROC曲线分析S100A4对动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断的敏感性和特异性。
图3 S100A4动脉粥样硬化性肾动脉狭窄患者外周血单个核细胞中S100A4基因表达与血浆中S100A4表达的相关关系。
具体实施方式
以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。在实施例中的操作方法均为本技术领域常规操作方法。
实施例1 。
S100A4的实验流程。
1、研究对象。
2000年6月至2016年9在北部战区总医院心血管内科行肾动脉造影检查的受试研究人群，其中125例（男性78例，女性47例）为动脉粥样硬化性肾动脉狭窄组，肾动脉造影检查显示阳性（肾动脉狭窄大于等于60%），肾动脉造影检测显示无肾动脉狭窄的研究人群为对照组。
有经验丰富的临床医生详细的问诊后获得入选研究对象的一般临床资料（发病时间、性别、年龄、高血压病史、近期吸烟史）和详细的血液生化指标（实验室检查指标：血常规、血糖、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、甘油三酯、总胆固醇等生化指标），同时检测肾功能的检测指标肌酐清除率、血肌酐及尿素氮等，完善入选研究对象的心电图、心脏超声、腹部超声、双侧肾动脉多普勒超声及胸部X线等检查(表1)。
表1对照组和动脉粥样硬化性肾动脉狭窄组入选研究对象的一般临床资料的特征
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
入院研究对象第二天清晨空腹采集静脉血，室温放置30min，3000r/min离心分离血浆，将待检测的血浆样品统一编号置于–80℃保存。将剩余血细胞按照下述步骤提取人外周血单个核细胞，进行荧光定量PCR反应，分析外周血单个核细胞中S100A4的表达含量。
本研究经北部战区总医院医学伦理委员会同意，研究中所有符合入选标准的研究对象均知情并签署知情同意书。
2、入选标准和排除标准。
入选标准：经皮肾动脉造影检测肾动脉主干发生动脉粥样硬化且狭窄程度≥60%；动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的患者出现进行性肾功能快速恶化；顽固性高血压患者，血压＞180/110mmHg（其未服用降压药时）；或经过正规三联降压药（血管紧张素转换酶抑制剂/血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、钙拮抗剂、α受体阻滞剂、利尿剂和β受体阻滞剂）治疗后血压＞140/90mmHg；患者出现进行性慢性肾脏病（原因不明），三联降压药物规律服用仍出现肾功能进行性恶化的患者。
排除标准：患者有纤维肌性结构发育不良、肾移植术后排斥反应、大动脉炎、神经纤维瘤病、结节性多动脉炎等引起的肾动脉狭窄患者；造血系统异常、凝血系统障碍的受试者；肾动脉瘤、腹主动脉瘤压迫、肾动脉栓塞压迫、肾移植术后移植肾动脉狭窄的受试者；活动性炎性疾病、肝脏疾病、恶性肿瘤、自身免疫系统疾病及服用免疫抑制药物的受试者。
3、肾动脉狭窄的诊断方法。
3.1肾功能的检测：入选研究对象的血浆生化指标检测血浆尿素氮和血浆肌酐正常值范围：尿素：3.6-9.5mmol/L；肌酐：57-111μmol/L。
3.2彩色普勒超声检查：肾动脉彩超是一种检查肾脏的动脉系统是否正常的方法，可以检测肾动脉各段的血流动力学参数，用来判断肾内血流灌注情况、肾动脉是否狭窄及狭窄程度，肾动脉狭窄引起的肾性高血压，大多数的肾动脉狭窄是由于动脉粥样硬化引起的。肾动脉狭窄一般发病隐匿，做“肾动脉彩超”检查判断肾动脉是否狭窄及闭塞具有重要临床意义，肾动脉彩超便捷、快速、无创、可追踪复查等优点，现已成为肾内血流灌注异常及肾动脉狭窄患者的首选影像学筛查工具。缺点肾动脉彩超检测受到胃肠道气体对超声波的干扰影响诊断结果。
3.3计算机体层血管成像(简称CT血管造影)：CTA是一种无创的检查手段，通过静脉注射碘造影剂，在增强CT的扫描下进行血管的三维重建来判断血管是否存在狭窄以及狭窄的程度。
3.4肾脏造影检查：肾血管造影术是诊断肾动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的金标准，而造影是一种有创性的检查，是通过对上肢或者下肢的动脉进行穿刺，注射碘造影剂，在x线下显像，直观的显示肾动脉血管粥样硬化的情况，判断肾动脉是否存在狭窄、闭塞以及狭窄的程度。
4、实验流程。
4.1、按照入选标准、排除标准及肾动脉造影结果入选研究对象共336例，并分为对照组111例、肾动脉粥样硬化肾动脉狭窄组125例。
4.2、对纳入的125例肾动脉粥样硬化肾动脉狭窄的患者，有经验丰富的临床医生详细的问诊后获得入选研究对象的一般临床资料（发病时间、性别、年龄、高血压病史、近期吸烟史）和详细的临床资料（实验室检查指标：血常规、血糖、超敏C反应蛋白（hs-CRP）、甘油三酯、总胆固醇等生化指标），同时检测肾功能的检测指标血肌酐及尿素氮等，完善入选研究对象的心电图、心脏超声、腹部超声、双侧肾动脉多普勒超声及胸部X线等检查。
入院研究对象第二天清晨空腹采集静脉血，室温放置30min，3000r/min离心分离血浆，将待检测的血浆样品统一编号置于–80℃保存。将剩余血细胞按照下述步骤提取人外周血单个核细胞，进行荧光定量PCR反应，分析外周血单个核细胞中S100A4的表达含量。
4.3、S100A4血浆浓度的测定：本研究所采用的S100A4 ELISA检测试剂盒购置于日本CircuLexTM公司，其组分如下：(96孔微孔板；抗S100A4单克隆抗体；含Tween®-20的10X洗涤液；1X缓冲液，用于样品稀释；12 mL HRP(辣根过氧化物酶)标记抗S100A4抗体；20 mL显色用的底物四甲基联苯胺(TMB)；20 mL N H2SO4。S100A4 ELISA试剂盒的检测范围为0.375ng/mL至24ng/mL，检测灵敏度为0.28ng/mL。首先按照要求绘制标准曲线，按照要求稀释S100A4的标准品，建立检测S100A4血浆浓度的标准曲线，按照浓度梯度稀释S100A4的标准品，每孔加入标准品100mL，标准品的浓度梯度分别为24ng/mL、12ng/mL、6ng/mL、3ng/mL、1.5ng/mL、0.75ng/mL、0ng/mL。
S100A4酶联免疫吸附实验测定血浆中S100A4的表达含量，将特异性S100A4的单克隆抗体预涂在微孔板上，将待检测的肾动脉粥样硬化肾动脉狭窄的患者的血浆标本原液或者稀释液100mL血浆样品放入到待检测的反应板孔内，待检测的反应板置于室温25℃反应1h后洗涤反应检测板。每个孔内加入100µL HRP标记的抗S100A4抗体酶标抗体工作液，室温25℃放置检测板1h，洗板，在待检测板的孔内加入100mL显色用的底物四甲基联苯胺，25℃20min孵育后，加入终止液体，450/540nm双波长检测待检测孔的吸光度值，或者应用450nm单波长检测待检孔的吸光度值。绘制标准曲线，并使用该标准曲线确定未知样品的浓度。
4.4、外周血单个核细胞RNA提取，荧光定量PCR的具体步骤如下：
外周血单个核细胞的分离：取一支15mL尖头离心管，向尖头离心管中加入淋巴细胞分离液5mL；将分离血浆后的红细胞悬液加入等体积稀释液，将稀释好的红细胞悬液小心用吸管加入到淋巴细胞分离液的液面上，水平转子4℃600g30min，离心管的液体分为3层，单个核细胞层在液体的上层，中性粒细胞层在分离液体的下层，下层为红细胞悬液层，用吸管吸取分离液的单个核细胞层到另一个尖头离心管中，将清洗液10mL加入到尖头离心管中收集分离的单个核细胞，4℃250g10min离心，收集后的细胞为外周血单个核细胞，加入Trizol1mL，室温静置后使其充分裂解，4℃12,000g5min离心，弃沉淀，加入到新的EP管中（去除RNA酶）；按照每1mL Trizol加入200μL氯仿的比例，反复振荡后室温静置15min后，4℃12,000g5min离心，将上层水相收集到新的EP管中；按1mL Trizol加入0.5mL异丙醇的比例加入液体，4℃ 12,000g 10min离心后；用1mL 75%乙醇悬浮沉淀。4℃ 12,000g8 min离心，尽量弃上清；室温晾干；用适量去除RNA酶的H2O融解提取人外周血单个核细胞的RNA形成人外周血单个核细胞的RNA的溶解液。首先应用反转录PCR试剂盒将收集的人外周血单个核细胞的RNA 进行去除基因组DNA的反应，反应体系如下：整个反应体系为（10μL反应体系）包括：5×gDNA Eraser buffer 2μL；gDNA eRaser Buffer 2 μL；Total RNA 1μg；RNase FreeddH2O；通过反转录试剂盒将提取的RNA反转录成为cDNA，反应体系如下：5×PrimerScriptbuffer2 4μL；primeScript RT Enzyme Mix I 1 μL；RT primer Mix 1μL；RNase FreeddH2O 4μL；Reaction solution from step 10μL，反应条件如下：37℃ 15min；85℃ 5s ,4℃恒温。
利用primerbank在线引物设计软件（https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/）设计S100A4（NCBI gene ID 6275）的引物序列为：F:5’-GATGAGCAACTTGGACAGCAA-3’,R:5’-CTGGGCTGCTTATCTGGGAAG-3’，基因的片段123bp，选择GAPDH为本实验的内参，GAPDH（NCBI gene ID 2597）的引物序列为：F:5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’,R:5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’，基因的片段197bp；体系如下：加入10μL 2×mix,上游引物及下游引物各0.8μL，cDNA模板 2μL，ROX reference Dye0.4μL，ddH2O 6 uL, 20 uL反应体系；温度条件如下:95℃，30 s(1cycle, 预变性)；95℃，5s；60℃，31s（40 cycle）；95℃，15s；60℃，60s；95℃，15s（1 cycle），以2-△CT的方式表示人外周血单个核细胞的S100A4的表达量，△CT为目标S100A4与参照GAPDH的CT值之差。
5、统计学分析。
采用SPSS 23.0统计学软件包进行统计分析，对照组和动脉粥样硬化性肾动脉狭窄患者组的一般资料的特征采用例数和百分数表示，正常对照组和肾动脉粥样硬化肾动脉狭窄的患者组血浆中及外周血单核细胞中S100A4的基因表达水平的差异采用均数±标准差表示，t检验或单变量ANOVA进行两组间的比较，卡方检验或确切概率检验进行两组间比较，显著性差异的定义为P＜0.05认为有统计学意义。
ROC曲线全称为受试者工作特征曲线，血浆S100A4浓度诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的临床诊断的最佳临界值、敏感性及特异性采用ROC曲线分析。
实施例2。
外周血中单个核细胞中S100A4的表达。
动脉粥样硬化性肾动脉狭窄是多种原因导致的一种肾血管性疾病，其发病隐匿，合并继发性高血压、缺血性肾病、终末期肾病等疾病后才引起人们的关注，因此对动脉粥样硬化性肾动脉狭窄血浆生物标志物的发现显得尤为重要。因此，研发在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄发病检测敏感性及特异性生化标志物是诊断和治疗肾动脉狭窄亟待解决的重要的问题。
本发明首先在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄患者的外周血单个核细胞中发现外周血单核细胞中S100A4的表达明显上调，其表达水平是正常对照人群外周血单个核细胞中2.64倍，外周血单个核细胞中S100A4表达含量在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄表达显著增高，关联分析的研究显示，动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的患者外周血单个核细胞中S100A4的基因表达水平与血浆中S100A4蛋白表达水平存在相关关系，结果如图3所示，相关系数为r=0.56，统计学差异p=0.003。
实施例3。
S100A4作为动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断的ROC曲线评分。
S100A4的AUC面积分别为：0.750，S100A4诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的敏感性为0.645，诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄特异性为0.778，S100A4诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的95%可信区间为0.708-0.793，369.59 pg/mL为S100A4诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的诊断标准，能够区别诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的发生。
实施例4。
荧光定量PCR试剂盒的制备。
基于本研究获得的引物序列，组装成用于动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的诊断试剂盒，该研究发明的试剂盒所用的引物序列利用primerbank在线引物设计软件（https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/）设计S100A4（NCBI gene ID 6275）的引物序列为：F:5’-GATGAGCAACTTGGACAGCAA-3’,R:5’-CTGGGCTGCTTATCTGGGAAG-3’，基因的片段123bp；GAPDH（NCBI gene ID 2597）的引物序列：F:5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’,R:5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’，基因的片段197bp；该试剂盒中包含去除DNA酶试剂，cDNA扩增合成的试剂及进行S100A4 mRNA 反转录反应的试剂（ROX荧光反应染料）。不同的反应体系和反应条件选择如下：
1、去除基因组DNA试剂组成及反应体系：5×gDNA Eraser buffer 2μL；gDNAeRaser Buffer 2 μL；Total RNA 1μg；反应条件：42℃ 2m，4℃，∞（1cycle）
2、反转录反应的试剂组成及反应体系：PrimerScript RT Enzyme Mix I 1 μL；RTprimer Mix 1μL；RNase Free ddH2O 4μL； Reaction solution from step 10μL 37℃，15m；85℃ 5s；4℃，∞（1cycle）。
3、荧光定量PCR反应试剂组成及反应体系：上游引物及下游引物各0.8μl，cDNA模板 2μL，ROX reference Dye 0.4μl，ddH2O 6 μL；反应条件：95℃，30 s(1cycle, 预变性)；95℃，5s；60℃，31s（40 cycle）。95℃，15s；60℃，60s；95℃，15s（1 cycle）（反转录反应）。
4、以2-△CT的方式表示人外周血白细胞中的S100A4的表达量，△CT为目标S100A4与参照GAPDH的CT值之差。
在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的患者血浆中表达水平明显高于正常组，差异具有统计学差异。ROC曲线分析发现369.59 pg/mL为S100A4诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的最佳诊断临界值，其诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的敏感性为64.5 %，特异性为77.8 %，ROC曲线下的面积为0.75。通过荧光定量PCR 检测分析发现动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的患者外周血单个核细胞中S100A4的表达水平显著高于对照组，提示在基因表达水平上肾动脉狭窄的患者外周血单个核细胞中S100A4表达含量上调，进而影响S100A4的血浆中的表达水平，S100A4基因水平上的表达与血浆中S100A4的表达含量存在正相关关系（r=0.56,p=0.003）。亟此，S100A4在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的患者的转录水平和蛋白的表达水平都明显增高，S100A4的转录水平和血清学表达水平可作为动脉粥样硬化性肾动脉狭窄患者的血浆生化标志物预测动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的发生，可以作为临床药物干预的靶点观察动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的临床治疗效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。
序列表
<110>中国人民解放军北部战区总医院
<120> S100A4蛋白在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断中的应用
<141> 2021-09-17
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2186
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
attcttcccc tctctacaac cctctctcct cagcgcttct tctttcttgg tttggtgagt 60
tgtgttggcc tgactggcat gcaaggggtg tcagaggcca gggctgggga aggagaaggg 120
gaggctggtg ggggccagat gtgctaaaga gatccagatg tgagattctg atgtggaact 180
ctgggtggat tgtgtgcgtg ggtgtgcatg gcacacacac acatgcacgt aagacggagg 240
aaaaaacaaa cagaaaagtg agcaagtgac tgaatttgag ctctccaggt gcttctgaga 300
tgtgggcttg cacacgctgt tgctatagta cgtgttggta tgtatgtgcc tgtgggtatc 360
tgcactggct catgtttgct gggttgcgca ctcgggagca ggaagcaaag gaaaggcaga 420
aggcaactgt gggcctttgt ctggtggtgt gccccatgag cctctgccct gcacgcagca 480
gcccagctcg agaaggtgca tggcctctgc agcttctctt ccaacccttg cctctgccac 540
ctcactttgc ccctccccat gctgagagct aagcggctgt gctggttttt tccactgcag 600
gcccctgggc aggcctccag cagccacacc cagttctggg agggaaaaga atggcaaggg 660
cggggccttt gtggctgagc tgtgggagtg gatagactga gtgaggggtg gaaaaaatgc 720
tgttgttgag gcaaggcctg ggaggccctg ggagtttgct gcccgaatct ccagagcttg 780
cgcagcggat cttgcaaatg ttcactgccc agagcatgtg ttccccactg tgcacaccct 840
cccagccagg tgcgggggcc cactgctctg ggctccccca gggagggagc agagtctcgc 900
caagtgctcc tggagggatg ggagtggagc ctggcattct gaacacatct ctgaggggtg 960
ggattaataa gacggtctct gtgcctcctg ctcccagatc ctgactgctg tcatggcgtg 1020
ccctctggag aaggccctgg atgtgatggt gtccaccttc cacaagtact cgggcaaaga 1080
gggtgacaag ttcaagctca acaagtcaga actaaaggag ctgctgaccc gggagctgcc 1140
cagcttcttg ggggtgagtg ggtagtgcct gagtgagtcc ccacgtgggg catttcccac 1200
agaggagggc agcagtcttg ctctagagca ttagctacag agggcatcta tcagtggggt 1260
ggctgcctgg ggtggaaaca cattgaacac caccactcac tgcctggccc catgctgaaa 1320
gagggctgag aatgaatggg tcagacactg ccaggtgctt tgcacaactt aactgaaggg 1380
aagactaagc tcagagtgct aagtaacttc ccaaggtggt cagtgtacac aactgccatc 1440
cggaccggga ctgtctgact cttgccatca ctccaacagt ggacactgtt tgagtttcta 1500
tttggcttgt agatgtgaag acacagatgt ggagatgatc acaggcctgc agacgttccc 1560
ttcaaacaat aacaatgtat atttgtatca aacataacac agtttatata ttgttttcat 1620
gactattact acctcatggg attattagaa caaccttggg tgaaaatgta gtggtcccgt 1680
catttttcca ttgcaccagg tactcagact tccttatcca aggagcacct tctccaccct 1740
agcttagcct tgagggttgg agttccaaac tggacctccc aaaggagcct ccctgaactc 1800
tggtctggga gtagaaactg ggtctggtcc tggctccacc cactgggctt ctgttttcta 1860
tctgtagcct cttctccctc cagaaaagga cagatgaagc tgctttccag aagctgatga 1920
gcaacttgga cagcaacagg gacaacgagg tggacttcca agagtactgt gtcttcctgt 1980
cctgcatcgc catgatgtgt aacgaattct ttgaaggctt cccagataag cagcccagga 2040
agaaatgaaa actcctctga tgtggttggg gggtctgcca gctggggccc tccctgtcgc 2100
cagtgggcac tttttttttt ccaccctggc tccttcagac acgtgcttga tgctgagcaa 2160
gttcaataaa gattcttgga agtttt 2186
<210> 2
<211> 101
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ala Cys Pro Leu Glu Lys Ala Leu Asp Val Met Val Ser Thr Phe
1 5 10 15
His Lys Tyr Ser Gly Lys Glu Gly Asp Lys Phe Lys Leu Asn Lys Ser
20 25 30
Glu Leu Lys Glu Leu Leu Thr Arg Glu Leu Pro Ser Phe Leu Gly Lys
35 40 45
Arg Thr Asp Glu Ala Ala Phe Gln Lys Leu Met Ser Asn Leu Asp Ser
50 55 60
Asn Arg Asp Asn Glu Val Asp Phe Gln Glu Tyr Cys Val Phe Leu Ser
65 70 75 80
Cys Ile Ala Met Met Cys Asn Glu Phe Phe Glu Gly Phe Pro Asp Lys
85 90 95
Gln Pro Arg Lys Lys
100
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 3
gatgagcaac ttggacagca a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 4
ctgggctgct tatctgggaa g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 5
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 6
ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims (10)

1.S100A4基因或其编码蛋白作为生物标志物在制备诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的S100A4基因或其编码蛋白作为生物标志物在制备诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒通过逆转录PCR、实时定量PCR或蛋白免疫检测试剂盒检测样本中S100A4基因或其编码蛋白的表达水平。
3.根据权利要求1所述的S100A4基因或其编码蛋白作为生物标志物在制备诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的试剂盒中的应用，其特征在于，所述逆转录PCR和/或实时定量PCR检测试剂盒包括SEQ ID NO .3-SEQ ID NO .4所示的扩增S100A4基因的引物。
4.根据权利要求1所述的S100A4基因或其编码蛋白作为生物标志物在制备诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的试剂盒中的应用，其特征在于，所述蛋白免疫检测试剂盒包括与S100A4蛋白特异性结合的抗体。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述样本为血浆血和/或外周血单个核细胞。
6.根据权利要求1所述的S100A4基因或其编码蛋白作为生物标志物在制备诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的试剂盒中的应用，其特征在于，所述S100A4基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
7.根据权利要求1所述的S100A4基因或其编码蛋白作为生物标志物在制备诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的试剂盒中的应用，其特征在于，所述S100A4蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
8.S100A4基因或其编码蛋白作为生物标志物在制备诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的试剂盒中的应用，其特征在于，所述S100A4基因荧光定量检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：
步骤1、收集外周血单个核细胞；
步骤2、提取外周血单个核细胞RNA；
步骤3、将抽提出的RNA反转录成对应的cDNA；
步骤4、将反转录后的cDNA进行对S100A4和GAPDH基因的荧光定量PCR扩增；
步骤5、以GAPDH作为内参，记录每个反应的Ct值，以2-△CT的方式表示人外周血单个核细胞中的S100A4的表达量，△CT为目标S100A4与参照GAPDH的CT值之差。
9.S100A4基因或其编码蛋白作为生物标志物在制备诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的试剂盒中的应用，其特征在于，所述S100A4蛋白检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：
步骤1、分离收集血浆样品；
步骤2、测定血浆中S100A4浓度；
步骤3、绘制S100A4标准曲线；
步骤4、根据步骤3中绘制的S100A4标准曲线，以及步骤2中待检样品稀释倍数及待检样品测定的OD值，可以计算待检测样品的浓度；同时绘制S100A4的ROC曲线，计算曲线下面积，同时将待检测样品的浓度与临界值浓度进行比较。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述步骤4中曲线下面积作为判断检测结果敏感性和特异性的指标；所述临界值浓度为369.59 pg/mL。
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