KR101366724B1

KR101366724B1 - 의식장애환자의 병태 검출방법 및 검출용 키트

Info

Publication number: KR101366724B1
Application number: KR1020087020983A
Authority: KR
Inventors: 코 이가미; 토모하루 오카자키; 코이치 신묘주; 토모꼬 오노; 후미오 후루사키
Original assignee: 미쓰비시 가가쿠 메디엔스 가부시키가이샤
Priority date: 2006-02-16
Filing date: 2007-02-15
Publication date: 2014-02-25
Also published as: JP5221333B2; EP1990421A1; CN101384728A; US20090220990A1; EP1990421B1; WO2007094394A1; JPWO2007094394A1; EP1990421A4; US9297815B2; CA2642546A1; ES2386574T3; CN101384728B; KR20080094802A

Abstract

의식장애환자의 본 윌브랜드 인자 절단효소의 양 및/또는 활성을 분석하는 의식장애환자의 병태 검출방법 및 본 윌브랜드 인자 절단효소에 특이적으로 결합하는 항체 혹은 그 절편, 또는 본 윌브랜드 인자 혹은 그 절편을 함유하는 의식장애환자의 병태검출용 키트를 개시한다. 병태의 검출에는 예를 들면, 뇌혈관장애의 검출, 동맥경화성 혈관장애의 검출 혹은 중증도의 검출 혹은 중증도의 예측이 포함된다.

본 윌브랜드 인자, ADAMTS13, 본 윌브랜드 인자 절단효소, 의식장애, 다장기부전

Description

의식장애환자의 병태 검출방법 및 검출용 키트{Method for Detection of Condition in Conciousness Disorder Patient and Kit for the Detection}

본 발명은 의식장애자(특히, 혼미 또는 혼수 등의 의식불명환자)의 병태 검출방법(파악방법)에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 피험자의 생체시료(예를 들면, 혈액) 중의 본 윌브랜드 인자(von Willebrand factor; 이하, vWF라 함) 절단효소의 양(농도) 및/또는 그의 효소활성을 분석(혹은 정량)하는 것에 의하여, 현시점에서의 증증도 판정 또는 장래의 중증도 예측이 가능하다.

1980년까지 일본의 가장 많은 사망원인은 뇌졸중이었으나, 치료기술의 진보와 구명구급의료의 발전에 의하여, 근래 20년간은 약 1/4까지 감소하였다. 그러나, 한편으로는, 급속하게 진행하는 고령화 사회에 발맞추어, 현재에 와서는 다시 환자수가 증가하는 경향이 있다. 이의 예방을 위하여, 일상생활에서의 건강관리가 중요함과 동시에, 뇌졸중 등에 의한 혼미· 혼수 상태의 초기단계에서, 의식장애의 원인을 정확하게 파악하고, 적절한 처치(치료, 예후의 관찰)를 실시하여야 환자의 생명을 연장시킬 수 있다.

뇌졸중은 혈관이상에 의하여 일어나는 뇌의 장애(뇌의 혈관이 어떤 원인으로 파괴되거나, 막히는 발작성 장애)로, 생명의 위험성, 마비나 언어장애라는 후유증을 남기기 때문에, 조기의 적절한 치료가 중요하다.

뇌졸중은 뇌의 혈관이 파열하여 생기는 출혈성 병변에 의한 것과 뇌의 혈관이 폐색하여 생기는 허혈성 병변에 의한 것으로 나뉜다. 출혈성 병변에는 지주막하출혈과 뇌출혈이 있고, 허혈성 병변은 뇌경색과 일과성 뇌허혈발작으로 분류된다.

뇌경색은 혈전에 의한 뇌동맥의 폐색에 의하여 발생하는 질환이고, 일본의 사망원인 3위인 뇌졸중의 주원인으로 사망율이 높은 질환이다. 뇌경색은 뇌동맥이 어떤 원인에 의하여 막히고, 그 이하 조직에 혈액이 흐르지 않게 되거나, 혹은 흐르기 어렵게된 상태를 말한다. 사망원인의 약 20%가 뇌혈관 질환이고, 이 중 약 50%가 뇌경색이 차지하고 있다. 뇌경색은 뇌색전과 뇌혈전의 2가지로 분류된다. 뇌색전은 뇌동맥에는 직접적인 원인이 없고, 심장병에 의해 심장 내에서 형성된 혈전, 단백질, 지방 등의 응고물이 뇌동맥에 흘러들어와, 뇌동맥을 막아 일어난다. 이에 비하여, 뇌혈전은 뇌동맥 그 자체의 동맥경화를 원인으로 발생하는 것이다. 발생빈도는 뇌색전보다 뇌혈전이 높다.

혼미·혼수의 원인은 뇌졸중뿐만 아니라, 두부외상 등에 의한 뇌간손상, 알콜중독이나, 진정제 등의 약의 과잉섭취, 심정지, 동맥류, 중증의 폐질환, 일산화탄소의 흡인, 간질발작, 갑상선 기능저하, 간부전과 신부전, 당뇨병에 의한 저혈당 등이 있다. 따라서, 적절하고 정확한 판단을 내리기 위해서도, 많은 검사결과가 필요하다. 예를 들면, 혈액 중의 당, 나트륨, 알콜, 산소, 이산화탄소 등의 농도, 적 혈구수와 백혈구수, 뇨 중의 당과 유해 물질이 조사된다. 또한, 트롬보닌과 심장유래 지방산 결합단백질(H-FABP)을 측정하는 것으로, 환자의 혼미·혼수가 심근경색에 의한 것임을 파악할 수 있고, 적절한 치료를 선택할 수 있다. 그러나, 뇌혈전의 원인이 되는 동맥경화를 진단하는 방법으로는, 현재, 안저(眼底)검사, X선, CT, MRI, 맥파속도법, 초음파에 의한 혈류계측 등의 비침습적 진단법과 혈관조영, 혈관내시경, 혈관내 에코 등의 관혈적 검사 등에 의한 것이나, 모두 동맥경화성 혈관장애의 정도와 증상의 진전을 모니터링하는 것으로 충분하다고 말할 수 없다.

한편, 본 윌브랜드 인자(von Willebrand factor; 이하, vWF라 함) 절단효소[이하, ADAMTS13(vWF 절단효소의 별칭)이라 함]는 본래, 매우 중증의 치사율이 높은 혈전성 혈소판감소성 자반증(Thrombotic thrombocytopenic purpura; 이하, "TTP"라 함)의 발증에 관여하는 것이 알려져, 혈장으로부터 vWF 절단효소가 정제되어(비특허문헌 1), cDNA 클로닝에 의하여 유전자가 결정되었다. 실제로, ADAMTS13의 유전자 변이가 vWF분해활성을 현저하게 저하시키는 것이 명백하게 밝혀졌다(비특허문헌 2). 근년, ADAMTS13에 대한 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 응용한 효소면역측정법이 개발되어(특허문헌 1), 혈소판 응집이 관여하는 혈전증의 원인 및 혈전증의 혈전형성 경향의 검출법이 확립되었다. 이를 사용하여, 각종 혈전증 환자의 혈장 내의 ADAMTS13의 농도가 정상인과 비교하여 현저하게 저하되어 있다는 것을 밝혀내었다.

예를 들면, 특허문헌 2에는 ADAMTS13을 정량하는 것을 특징으로 하는 혈전형성 경향의 정도 또는 혈전증의 검출방법이 개시되어 있고, 상기 혈전증으로는 급성 혹은 만성 골수성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 전신성 에리토마토디스, 폐색전, 뇌경색, 간중심정맥폐색증, 급성 림프구성 백혈병, 혈전성 미소혈관장애, 혈전성 혈소판감소성 자반증, 용혈성 요독증증후군 또는 심부정맥혈전증을 들 수 있다. 또한, 특허문헌 3에는 ADAMTS13 및/또는 그의 분해인자(예를 들면, 에라스타제, 프라스민 또는 트롬빈)를 분석하는 파종성 혈관내 응고증후군(Disseminated Intravascular Coagulation;DIC) 또는 전신성 염증반응증후군(systemic inflammatory response syndrome;SIRS) 환자의 혈소판혈전증 또는 장기장애의 검출방법이 개시되어 있다.

ADAMTS13의 활성측정법은 종래부터 SDS-아가로즈 전기영동과 오토래디오그래피 또는 웨스턴블럿법을 조합한 vWF 거대멀티머의 검출법이 사용되어왔다(비특허문헌 3). 또한 근래 ADAMTS13에 의한 vWF의 특이적 분해부위인 A2 도메인의 73잔기를 이용하여, 그 주변부위에 형광기와 소광기를 도입한 FRETS-VWF73이 개되어어, ADAMTS13 활성측정을 간단히 수행할 수 있게 되었다(비특허문헌 4).

특허문헌 1:국제공개 제2004/029242호 팜플렛

특허문헌 2:국제공개 제2005/062054호 팜플렛

특허문헌 3:국제공개 제2006/049300호 팜플렛

비특허문헌 1:Fukikawa, K. 등, Blood,(미국), 2001년, 제98권 p.1662-6

비특허문헌 2:Levy,G.G. 등, Nature ,(영국), 2001년, 제413권 p.488-494

비특허문헌 3: Furlan, M. 등, Blood ,(미국), 1996년, 제87권 p.4223-4234

비특허문헌 4:Kokame, K. 등, British Journal of Hematology ,(영국), 2005 년, 제129권 p93-100

발명의 개시

발명이 해결하려는 과제

상기와 같이 혼미·혼수의 원인은 여러 방면에 걸쳐있으며, 그 유래를 조기에 파악하는 것이 중요하다. 특히, 뇌혈관 장애환자의 뇌혈전의 원인이 되는 동맥경화를 진단하는 여러가지 검사방법이 존재하지만, 동맥경화성 혈관장애의 정도와 증상의 진전을 모니터링하기에는 불충분하다. 또한, 의식장애 및/또는 다장기부전으로의 증상발전을 동반하는 병태로 진전하는데 이르는 메카니즘과 그 발병원인이되는 물질의 전부가 해명된 것이 아니기 때문에, 생명예후가 나빠지는 환자가 끊이지 않는다. 뇌혈관장애 환자에 있어서, 이와 같은 중증의 증상에 빠질 가능성이 있는 환자를 보다 빨리 진찰하여 적절한 치료를 조기에 수행하여, 다장기부전을 포함하는 중증의 병태로 진전되는 것을 방지할 수 있는 가능성도 생각할 수 있다.

본 발명자는 예의 노력하여 연구를 계속한 결과, 뇌졸중 등의 혼미 또는 혼수상태 환자의 ADAMTS13을 분석하여, 그 측정결과로부터 병태의 파악 또는 중증 증상으로의 진전을 예측할 수 있다는 것을 확인하였다. 보다 구체적으로는, 뇌혈관장애환자의 혈장 중의 ADAMTS13의 농도 및/또는 그의 활성을 측정하고, 동맥경화성 혈관장애의 정도에 따라 ADAMTS13의 농도가 저하되는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명에 있어서는, 중증의 간장애를 가지는 증례에서 ADAMTS13의 농도 및 활성이 현저히 감소하고 있는 경우에 의식장애 및 다장기부전을 동반하는 중증으로 발전하는 것을 새롭게 발견하고, 이의 측정이 중증의 예측과 예후의 관리에 유용하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명의 과제는 의식장애환자의 병태 검출방법 및 검출용 키트를 제공하는데 있다.

과제를 해결하기 위한 수단

상기 과제는 본 발명에 의한, 의식장애환자에 있어서, 본 윌브랜드 인자 절단효소의 양 및/또는 활성을 분석하는 것을 특징으로 하는, 상기 의식장애환자의 병태의 검출방법에 의하여 해결할 수 있다.

본 발명의 검출방법의 바람직한 양태에 의하면, 상기 병태의 검출은 뇌혈관장애의 검출, 동맥경화성 혈관장애의 검출 또는 중증도의 검출 또는 중증도의 예측이다.

본 발명의 검출방법의 다른 바람직한 양태에 의하면, 본 윌브랜드 인자 절단효소 양의 분석을 본 윌브랜드 인자 절단효소에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 사용하는 면역학적 방법에 의하여 수행한다.

본 발명의 검출방법의 또 다른 바람직한 양태에 의하면, 본 윌브랜드 인자 절단효소의 활성분석을 본 윌브랜드 인자 또는 그 단편을 사용하여 수행한다.

또한, 본 발명은 본 윌브랜드 인자 절단효소에 특이적으로 결합하는 항체 혹은 그 단편, 또는 본 윌브랜드 인자 혹은 그 단편을 포함하는 의식장애환자의 병태 검출용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 검출용 키트의 바람직한 양태에 의하면, 상기 병태의 검출은 뇌혈관장애의 검출, 동맥경화성 혈관장애의 검출 또는 중증도의 검출 또는 중증도의 예측이다.

본 명세서에 있어서, 용어 [분석]은 분석대상물질(예를 들면, ADAMTS13)의 존재 유무를 판정하는 [검출]과 분석대상물질의 양(농도) 또는 활성을 정량적 또는 반정량적으로 결정하는 [측정]이 포함된다.

본 명세서에 있어서, 용어 [병태의 검출(파악)]에는, 예를 들면, 뇌혈관장애의 유무 또는 정도의 검출 또는 예측, 각종 증상 [예를 들면, 뇌혈관장애 및/또는 그의 다른 합병증(예를 들면, 의식장애, 다장기부전, 간기능장애)]의 중증도의 검출 또는 예측, 각종 증상 [예를 들면, 뇌혈관장애 및/또는 그의 다른 합병증(예를 들면, 의식장애, 다장기부전, 간기능장애)]의 발증의 예측(즉, 발증 위험성의 평가), 각종 증상[예를 들면, 뇌혈관장애 및/또는 그의 다른 합병증(예를 들면, 의식장애, 다장기부전, 간기능장애)]의 예후의 예측, 모니터링, 치료법의 결정 등이 포함된다.

발명의 효과

본 발명에 따르면, 의식장애환자에 있어서, 현시점에서의 중증도 정도의 판정 혹은 장래의 중증도의 예측이 가능하다.

예를 들면, 본 발명은 의식장애환자(예를 들면, 뇌혈관장애환자)에 있어서, 의식장애 및/또는 다장기부전의 발증을 동반하는 중증의 증상에 빠질 가능성이 있는 환자를 보다 빨리 진단할 수 있는 것으로, 이의 임상적 가치는 매우 높다고 생각된다.

본 발명에 따르면, 간편성, 신속성 및 특이성이 뛰어난 의식장애 및/또는 다장기부전의 검출이 가능하다. 또한, 하기 실시예에 의하여, 의식장애 혹은 다장기부전 발증의 새로운 발생원인으로서 "ADAMTS13의 현저한 감소"가 확인되어, 종래에는 해당 환자에 대하여 처방되지 않았던 ADAMTS13을 증가시키거나, 감소되지 않게 하는 치료방법[신선동결혈장(FFP)의 주입, 혈장교환 등]을 수행하면 병상의 악화를 멈출수 있는 것으로 생각된다. 이는 ADAMTS13의 모니터링이 직접적으로 뇌경색환자에 대하여 전술한 바와 같은 치료효과의 좋고 나쁨의 판정에 사용할 수 있다는 것을 나타내는 것이다.

도 1은 ADAMTS13을 함유하는 정상 사람 전혈장 및 그의 희석액으로 처리한 vWF의 SDS -아가로오스 겔 전기영동 결과를 나타내는 도면을 대신한 사진이다.

도 2는 도 1에 나타난 전기영동상으로부터 작성한 표준곡선이다.

도 3은 아테롬 혈전성 뇌경색 증례의 ADAMTS13 항원량을 통계처리한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 라쿠나 뇌경색 증례의 ADAMTS13 항원량을 통계처리한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 실시예 3의 증례 1의 임상경과를 나타낸 그래프이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

[1] 본 발명의 검출방법

본 발명의 방법에서는 ADAMTS13의 양(농도) 또는 그의 효소활성 중 적어도 하나를 분석(혹은 측정 또는 정량)하여, 정상인의 ADAMTS13의 양(농도) 또는 그의 효소활성과 비교하는 것에 의하여, 혹은 양(농도) 및 활성을 경시적으로 측정 또는 정량하는 것에 의하여, 의식장애환자의 병태 검출을 수행할 수 있다. 본 발명의 방법은,

(1) 피검시료 중의 ADAMTS13의 양(농도) 또는 효소활성을 분석하는 공정; 및

(2) 상기 분석치를 정상인의 수치와 비교하는 공정;

을 포함할 수 있다. 혹은, 본 발명의 방법은,

(1) 피검시료 중의 ADAMTS13의 양(농도) 또는 효소활성을 경시적으로 분석하는 공정; 및

(2) 상기 분석치의 경시적 경향을 해석하는 공정;

을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, [본 윌브랜드 인자 절단효소(vWF 절단효소)]는 본 윌브랜드 인자(vWF)의 A2 도메인에 존재하는 티로신(842)과 메티오닌(843)을 특이적으로 절단하고, ADAMTS13으로도 불리는 메탈로프로테아제이다.

본 발명의 방법에서는 정상인과 비교하여, ADAMTS13의 양(농도) 및/또는 그 의 효소활성의 저하를 지표로 할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에서는 ADAMTS13의 양(농도) 또는 효소활성을 경시적으로 측정하고, 그의 감소경향을 지표로할 수 있다. 예를 들면, 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 의식장애 및/또는 다장기부전의 발증을 동반하는 병태로 진전하는 환자에서는 그러한 병태로 진전하기 이전에 먼저 건강인과 비교하여, 체액시료 중에 함유되어 있는 ADAMTS13의 농도 및 효소활성이 현저하게 저하되어 있다.

본 발명의 방법에서는 ADAMTS13 농도 및/또는 그의 효소활성을 측정 또는 정량하고, 정상인의 정상치 범위보다도 낮은 수치를 나타내는 경우(예를 들면, 역치를 넘는 경우), 혹은 경시적으로 ADAMTS13의 농도 및/또는 효소활성을 측정 또는 정량하고, 그 측정치가 감소경향을 나타내는 경우에는 피험자가 뇌혈관장애를 일으키고 있거나(또는 장애 정도가 높거나), 혹은 그 발증의 위험성이 높다고 판정 또는 예측할 수 있다. 또한, 각종증상 [예를 들면, 뇌혈관장애 및/또는 다른 합병증(예를 들면, 의식장애, 다장기부전, 간기능장애)]의 중증도가 높다고 판정할 수 있어, 각종 증상[예를 들면, 뇌혈관장애 및/또는 그의 합병증(예를 들면, 의식장애, 다장기부전, 간기능성 장애)]의 발증의 위험성이 높다고 예측할 수 있으며, 각종증상[예를 들면, 뇌혈관장애 및/또는 그의 합병증(예를 들면, 의식장애, 다장기부전, 간기능성 장애)]의 예후의 상태가 불량하다는 것을 예측할 수 있다.

한편, ADA4MTS13 농도 및/또는 그의 효소활성이 정상치 범위내인 경우, 혹은 경시적으로 ADAMTS13 농도 및/또는 그의 효소활성을 측정 또는 정량하여, 그 측정치가 증가경향을 나타내는 경우에는 피험자가 뇌혈관장애를 일으키지 않거나(또는 장애의 정도가 낮거나), 혹은 그 발증의 위험성이 낮다고 판정 또는 예측할 수 있다. 또한, 각종 증상 [예를 들면, 뇌혈관장애 및/또는 다른 합병증(예를 들면, 의식장애, 다장기부전, 간기능장애)]의 중증도가 낮다고 판정할 수 있어, 각종 증상[예를 들면, 뇌혈관장애 및/또는 다른 합병증(예를 들면, 의식장애, 다장기부전, 간기능장애)]의 발증의 위험성이 낮다고 예측할 수 있으며, 각종증상[예를 들면, 뇌혈관장애 및/또는 다른 합병증(예를 들면, 의식장애, 다장기부전, 간기능장애)]의 예후 상태가 양호하다고 예측할 수 있다.

본 발명의 방법을 적용할 수 있는 대상(피험자)로는, 의식장애환자, 특히, 혼미 또는 혼수 등의 의식불명환자를 들 수 있으며, 뇌혈관장애환자(뇌졸중환자)인 것이 바람직하다.

뇌혈관장애로서는 예를 들면, 일과성 뇌허혈 발작, 아테롬 혈전성 뇌경색, 심원성 뇌색전증, 라쿠나 뇌경색, 뇌출혈, 지주막하출혈, 두개내 출혈, 뇌혈관성 치매 또는 고혈압성 뇌증 등을 들 수 있다. 간기능장애로서는 예를 들면, 급성 바이러스간염, 만성 바이러스간염, 자기면역성 간염, 알콜성 간장애, 간경변, 원발성 담즙성 간경변, 간세포암 또는 약제성 간장애 등을 들 수 있다.

동맥경화성 혈관장애는 대동맥, 관상동맥, 뇌동맥 또는 경동맥에 많이 발생하고, 심근경색이나 뇌경색 등의 주원인이 되는 병태이다. 동맥경화소(巢)는 혈관내피세포의 장애에 의하여 개시되어, 장애부위에서의 혈소판의 응집과 흡착, 혈관평골근세포의 내막으로의 유도·증식, 응집한 혈소판으로의 식세포의 유도, 평골근세포와 식세포로부터 포말세포의 생성 등에 기초한 죽상동맥경화소(아테롬)의 형 성, 나아가, 콜라겐의 변성부착 등에 의한 경화에 이르러, 동맥경화소가 완성된다고 생각된다. 이들 동맥경화소는 구조적 취약성을 나타내고, 혈행역학적인 힘이 방아쇠가 되어 덩어리가 파괴되고, 조직인자와 혈액응고 인자와의 반응에 의하여 급격하게 혈전이 형성된다. 동맥경화성 혈관장애의 위험인자로서는 고혈압, 고지혈증, 흡연, 비만, 통풍, 스트레스, 운동부족, A형 행동 패턴 혹은 HDL 콜레스테롤의 낮은 상태 등 매우 많이 있다. 최근, 뇌혈관장애에 있어서도 이들 생활습관병의 증가에 수반하여, 아테롬 혈전성 뇌경색과 심원성 뇌경색증이 증가경향에 있다. 뇌혈관장애 중에서도 이들 동맥경화성 혈관장애에 기인하는 것은 허혈성의 뇌경색이고, 그 예로, 예를 들어 내경동맥 기시부와 중대뇌동맥 수평부의 아테롬 형성에 의한 동맥 협착·폐색에 기인하는 아테롬 혈전성 뇌경색; 혹은 경부에 있는 총경동맥의 동맥경화를 원인으로 하는 것이 많은 비교적 큰 혈관의 동맥경화에 의한 동맥원성 색전증; 또는 관동맥질환에 기인하는 심장의 부정맥 등이 원인으로, 심강 내에 형성된 피브린 혈전 유도에 의하여 내경동맥과 뇌동맥이 돌연 폐색하여, 급격한 뇌순환장애와 함께 발증하는 심원성 뇌색전증; 또는 천통(穿通)동맥의 세동맥경화를 주원인으로, 고혈압이 위험인자로 생각되는 라쿠나 뇌경색을 들 수 있다.

본 발명의 방법에서는 정상인과 피험자로부터 각각 검체를 채취하여, 각각의 ADAMTS13 농도 및/또는 그의 효소활성을 측정한 후, 측정치를 비교하는 것에 의하여, 상기 검출 및/ 또는 예측을 수행할 수 있으나, 통상적으로는, 정상인으로부터 채취한 검체를 사용하여 ADAMTS13 농도 및/또는 그의 효소활성의 정상치 범위 또는 판정용 역치를 미리 결정하여 두는 것이 바람직하다. 정상치 범위 또는 판정용 역 치가 미리 결정되어 있는 경우에는 예측대상인 피험자에 대하여 ADAMTS13의 분석을 수행하는 것만으로, 상기 피험자의 상기 검출 및/또는 예측을 수행할 수 있다. 상기 정상치 범위 또는 판정용 역치는, 여러가지 조건, 예를 들면, 기초질환, 성별, 연령 등에 의하여 변화하는 것으로 예상되나, 당업자라면, 피험자에 대응하는 적당한 모집단을 적의 선택하여, 그 집단으로부터 얻은 데이타를 통계학적으로 처리하여, 정상치 범위 또는 판정용 역치를 결정할 수 있다.

예를 들면, 하기 실시예에 나타낸 모집단에 있어서는 ADAMTS13 농도에 관하여 이상이 있다고 보이는 수치는 50%이하이고, ADAMTS13의 효소활성에 관하여, 이상이 있다고 보이는 수치는 40%이하 이다.

본 발명의 방법에 있어서, ADAMTS13의 농도 또는 효소활성을 분석하는 방법은 ADAMTS13의 농도 또는 효소활성을 정량적 또는 반정량적으로 결정하는 것이 가능하거나, 또는 ADAMTS13의 존재 유무를 판정하는 것이 가능하다면 특별히 한정되는 것은 아니다.

ADAMTS13 농도를 분석하는 방법은 예를 들면, 항ADAMTS13 항체 또는 그 단편을 사용한 면역학적 수단(예를 들면, 효소면역측정법, 라텍스 응집면역측정법, 화학발광면역측정법, 형광항체법, 방사면역측정법, 면역침강법, 면역조직염색 또는 웨스턴블럿 등), 생화학적 수단(예를 들면, 효소학적 측정법) 또는 mRNA양을 측정하는 분자생물학적 수법 등을 들 수 있다.

ADAMTS13의 농도 분석방법으로서 면역학적 수법을 사용하는 경우에는, 항ADAMTS13 항체 또는 그의 단편은 공지의 방법, 예를 들면, 국제공개 제2004/029242 호 팜플렛에 기재된 방법에 따라 조제할 수 있고, 각종 면역학적 측정도, 예를 들면, 국제공개 제2004/029242호 팜플렛에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

ADAMTS13 농도를 측정하는 방법으로는 감도 및 간편성에 따라 면역학적 방법이 바람직하다. 여기서 면역학적방법이란, ADAMTS13에 대한 항체를 이용하여 ADAMTS13을 예를 들면, ELISA법, 라텍스법 또는 이뮤노크로마토그래피 법으로 분석하는 방법이다. 면역학적 방법으로는 예를 들면, ADAMTS13을 표지하는 경합법, 항체를 표지하는 샌드위치법, 항체를 코팅한 비드의 응집을 관찰하는 라텍스법, 또는 금 콜로이드 등의 착색입자에 결합한 항체를 이용하는 방법 등, 여러가지 방법이 있으나, ADAMTS13에 대한 항체를 이용하는 방법이라면, 본 발명의 바람직한 양태에 포함된다. 항체는 모노클로날 항체라도 폴리클로날항체라도 좋다. 항체단편, 예를 들면, Fab, Fab', F(ab')₂또는 Fv를 사용할 수도 있다.

ADAMTS13의 효소활성을 분석하는 방법으로서는 예를 들면, vWF 또는 그 단편을 사용하는 생화학적 수법[예를 들면, SDS-아가로스 전기영동법과 오토래디오그래프 또는 웨스턴블럿법을 조합하여 vWF 거대멀티머의 검출법(비특허문헌 3), vWF의 A2 도메인 중 Asp1596-Arg1668의 73잔기에 해당하는 합성 펩티드에 형광기[2-(N-methylamino)benzoyl, Nma]와 소광기(2,4-dinitrophenyl, Dnp)를 도입한 방법에 의하여 vWF 절단활성을 검출하는 방법(비특허문헌 4), 혹은 vWF 또는 그 단편과 vWF의 ADAMTS13 절단부위를 특이적으로 인식하는 항체 또는 그 단편을 이용하는 면역학적 수법 등을 들 수 있다.

ADAMTS13의 효소활성을 분석하는 방법으로는 합성기질을 이용하는 측정법이나 면역측정법을 들 수 있다. 이들은, 예를 들면, 일본특허출원 2005-148793호 명세서에 기재된 방법에 의하여 실시할 수 있고, 구체적으로는 (1) ADAMTS13을 함유할 가능성이 있는 피검시료와 vWF 또는 그 단편을 불용성 담체에 결합시킨 고정화 기질을 액 중에서 접촉시키는 공정, (2) 상기 액과 불용성 담체를 분리하는 공정, 및 (3) 불용성 담체에 잔존하는 vWF 또는 그 단편, 및/또는 불용성 담체로 부터 유리된 혈중의 vWF 단편을 분석하는 공정을 포함하는 분석방법에 의하여 실시할 수 있다. 또한, 상기 분석방법에 있어서, 불용성 담체에 결합하는 vWF 또는 그 단편이 ADAMTS13의 절단에 의하여 불용성 담체로부터 유리되는 기질 단편측이 표지물질로 표지되어 있는 양태도 가능하다. 추가로, ADAMTS13의 절단으로 생기는 네오안티겐(절단면의 아미노산을 포함하는 부분 배열)과 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편 혹은 압타머(aptamer) 등을 이용하여 이들을 표지물질로 표식하고, 상기 분석공정에서 사용함으로써 효소활성을 분석할 수도 있다. 상기 표지물질로서는 예를 들면, 형광물질, 발광물질, 발색물질 또는 효소를 들 수 있으며, 불용성 담체로서는 예를 들면, 각종 플라스틱(예를 들면, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리아미드 또는 폴리테트라플루오로에틸렌)으로 구성된 라텍스입자, 유리입자, 자성입자 또는 마이크로타이터 웰 등을 들 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 피검시료로서는 예를 들면, 혈장 또는 혈청 형태의 혈액이 바람직하지만, 그 이외에도, 예를 들면, 세포조직액, 림프액, 흉선수, 복수, 양수, 위액, 뇨, 췌장액, 골수액 또는 타액 등의 각종 체액을 이용할 수도 있다.

[2] 본 발명의 검출용 키트

본 발명의 검출용 키트는 본 발명의 방법을 실시하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 검출용 키트에는 그 분석대상에 대하여, ADAMTS13 농도를 분석하는 것에 의하여 상기 장애를 검출할 수 있는 검출용 키트(이하, 농도분석형 키트라함)와, ADAMTS13의 효소활성을 분석하는 것에 의하여 상기 장애를 검출할 수 있는 검출용 키트(이하, 효소활성 분석형 키트라 함)가 포함된다.

본 발명의 농도분석형 키트는 항ADAMTS13 항체 또는 그 단편을 적어도 하나 이상 함유하고, 서로 다른 2종류 이상의 항ADAMTS13 항체를 함유하는 것이 바람직하다. 상기 항ADAMTS13 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날항체 중 어느 것이라도 가능하다. 또한, 서로 다른 2 종류 이상의 항ADAMTS13 항체를 함유하는 경우에는, 어느 한쪽(제2항체)을 표지항체로 하는 것도 가능하고, 또는 표지화 대신에 제2항체에 대한 항체에 표지를 결합시킨 표지항체를 키트에 추가하는 것도 가능하다.

본 발명의 효소활성 분석형 키트는 vWF 또는 그 단편을 적어도 하나이상 함유한다. 또한, vWF 또는 그 단편이 표지되어 있는 것을 키트에 사용할 수도 있다. 혹은, vWF 또는 그 단편을 표지하는 대신에, ADAMTS13의 절단으로 생기는 네오안티겐(절단면의 아미노산을 포함하는 부분배열)과 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 키트에 추가할 수도 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 이들이 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

<<실시예 1: SDS-아가로오스 겔 전기영동에 의한 ADAMTS13 효소활성의 측정>>

ADAMTS13을 함유하는 정상 사람 전혈장 및 그 희석액을 트리스 완충액(pH7.4; 1.5mol/L 요소 및 0.1mol/L 염화바륨 함유)과 같은 양 혼합하고, 추가로 최종농도 2.4mmol/L가 되도록 4-[2-아미노에틸]-벤젠설포닐플루오라이드 염산염(4-[2-Aminoethyl]-benzenesulfonyl fluoride, hydrochloride; Pefabloc; Roche 사)를 첨가하였다. 이렇게 처리한 샘플용액을 vWF(비특허문헌 3에 기재된 방법에 의하여, 사람혈장으로부터 정제한 것) 3μg/mL을 함유하는 트리스 완충액(pH7.4; 1.5mol/L 요소)와 1:5의 용량비로 혼합하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하여, 재조합 vWF를 샘플 용액 중의 ADAMTS13으로 분해하였다. 분해반응은 최종농도 40mmol/L가 되도록 EDTA를 첨가하여 정지시켰다. 이렇게 조제한 샘플을 비환원 조건에서 SDS-아가로오스 겔 전기영동(1.4% 아가로스겔)으로 분리한 후, 웨스턴블럿 법으로 PVDF(polyvinylidene difluoride)막에 트랜스퍼하였다. 시판 블로킹제(블록에스;대일본제약)로 실온에서 블로킹한 후, 트리스 완충액(pH 7.4)으로 세척하였다. 트리스 완충액(pH 7.4)/10% 블록에스로 1/1000 희석한 HRP(horseradish peroxidase) 표지 항vWF 항체(DAKO사)로 1시간 실온에서 반응시킨 후, 트리스완충액(pH7.4)으로 3 회 세척한 후, 시판 발색키트(이뮤노스테인 HRP-1000, 코니카 사)로 발색시켰다.

전기영동 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 각 레인의 수치(단위=%)는 정상사람 전혈장을 100%로 한 경우의 정상 사람 전혈장 및 그 희석액에 함유된 전혈장의 함유비율이다. 샘플 중의 ADAMTS13 에 의하여 vWF가 분해되어, 그 멀티머 사이즈에 준하는 vWF 밴드의 길이로 되어 검출되고 있다.

vWF 밴드의 길이(단위=mm)를 종축, 전혈장의 함유비율을 횡축으로 하여, 도 2에 나타낸 표준곡선을 작성하였다.

<<실시예 2: 뇌혈관장애 증례의 ADAMTS13 항원량의 측정>>

아테롬 혈전성 뇌경색 증례 및 라쿠나 뇌경색 증례의 환자 유래 혈장을 피검시료로하여, ADAMTS13 항원량을 측정하였다. ADAMTS13 항원량은 시판 키트(vWF 절단효소 ELISA kit;미츠비시카가쿠 야토론)을 사용하여 측정하였다.

아테롬 혈전성 뇌경색 증례에 관한 결과를 도 3에, 라쿠나 뇌경색 증례에 관한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 3 및 도 4에서 Y축[ADAMTS13:Ag(%)]은 정상인 전혈장의 ADAMTS13 항원량을 100%로 한 경우의 ADAMTS13 항원량(단위=%)이다. 도 3에 나타낸 [P<0.05]는 위험율 5% 미만에서 유의차가 있는 것을 의미한다. 도 4에 나타낸 [P<0.01]은 위험율 1% 미만에서 유의차가 있는 것을 의미한다.

아테롬 혈전성 뇌경색 증례(도 3)에 있어서는 타부위(즉, 뇌 이외의 부위)의 혈관이벤트[예를 들면, 진구성 심근경색(OMI) 및/또는 폐색성 동맥경화증(ASO) 합병의 유무별로 ADAMTS13 항원량을 비교하였다. 타부위의 혈관이벤트 비합병군과 비교하여, 합병군에서는 ADAMTS13 항원량이 유의하게 저하하고 있다.

또한, 라쿠나 뇌경색 증례(도 4)에 있어서는, MRI화상 상으로 해석을 수행하여, 단발경색군과 다발경색군으로 선별하고, 각각에서 ADAMTS13 항원량을 비교하였다. 단발경색군에 비하여, 다발경색군에서는 ADAMTS13항원량이 유의하게 저하되고 있다.

도 3 및 도 4에 나타낸 결과는 뇌혈관장애 환자에 있어서 ADAMTS13의 혈중의 농도가 저하되면, 동맥경화성의 혈관장애가 더 진행되고 있는 것을 시사하는 것이고, 이는 ADAMTS13가 뇌혈관장애의 정도를 반영하는 마커로서 의미가 있음을 나타내는 것이다. 예를 들면, 아테롬 혈전성 뇌경색은 내경동맥 기시부와 중대뇌동맥 수평부의 아테롬 형성에 의한 동맥 협착·폐색에 기인한다. 또한, 진구성 심근경색, 폐색성 동맥경화증도 동맥경화성 혈관장애로 간주된다. 추가로, 라쿠나 뇌경색은 천공동맥의 세동맥경화를 주원인으로 하고, 이 경색이 다발하는 경우, 뇌동맥 이외에도 동맥경화 부위가 확인되는 경우가 많고, 단발과 다발을 비교하면, 동맥경화성의 혈관장애가 더 진행되고 있다고 생각된다.

<<실시예 3: 의식장애 및/또는 다장기부전의 발증을 동반하는 병태로 진전하는 증례에 있어서 임상상과 ADAMTS13 수치>>

아급성기~만성기의 뇌혈관장애 133증례(아테롬 혈전성 뇌경색 50예, 심원성 뇌경색증 22예, 라쿠나 뇌경색 34예, 뇌출혈 19예, 지주막하출혈 8예)에 있어서, 실시예 1에 나타낸 SDS-아가로스겔 전기영동에 의하여 ADAMTS13 효소활성을 측정하 고, 또한, 실시예 2에 나타낸 시판 키트(vWF 절단효소 ELISA 키트:미츠비시카가쿠야토론)에 의하여 ADAMTS13 항원량을 측정하였다. 이들 중에서 ADAMTS13 효소활성이 30% 미만의 증례는 6예이고, 상기 6예는 전부 뇌경색[심원성 뇌경색증(CEBI) 3예, 라쿠나 뇌경색(LBI) 3예]이고, 중증의 간장애(담관암 1예, 알콜성 간염 1예, 만성 C형 간염 4예) 및 의식장애를 수반하고 있다. 상기 6예의 임상상과 ADAMTS13 수치를 표 1에 나타내었다.

증례			병형	입원시 ADAMTS13 수치		입원시 합병증	퇴원시 ADAMTS13 수치
번호	연령	성별	병형	항원량(%)	효소활성(%)	입원시 합병증	효소활성(%)
1	81	여성	CEBI	30.6	14.7	담관암 전이성간염 담관염	0.0
2	61	남성	CEBI	31.1	13.9	알콜성 간염 간경변 폐염	0.0
3	69	남성	CEBI	33.2	14.2	C형간염 간경변	0.0
4	76	남성	LBI	39.2	20.8	C형간염, 간암 간경변, 폐염	3.4
5	84	남성	LBI	37.8	18.8	C형간염 폐염	0.0
6	70	남성	LBI	38.4	21.2	C형간염 담낭염	39.4

표 1에 나타낸 6예 중, 입원중에 ADAMTS13 효소활성이 더 저하된 5증례(증례 1~ 증례 5)에 대하여는, 다장기부전증후군(MODS)으로 진전하여, 생명예후불량으로 나빠졌다. 즉, 증례 6은 MODS에 이르지 않고, 생명예후 불량에서 벗어났다(생존중).

증례 1의 임상경과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 있어서, 「Ag」및「Act」는 각각 ADAMTS13 항원량 및 ADAMTS13 효소활성을 의미한다. 증례 1은 2004년 6월 22일(6/22 '04)에 입원(입원시의 기초질환으로서, 담관염, 다발성 간전이 및 재발성 담관염이 발증)하여, 동년 9월 10일(9/10)에 의식장애 및 다장기부전증후군(MODS)의 증상이 나타나고, 점점 악화되어 동년 9월 28일(9/28 '04)에 사망하였다.

상기 결과로부터, ADAMTS13이 중증 간장애 시에 현저하게 저하된 경우, 의식장애, MODS로의 촉진인자가 되고 있는 것으로 강하게 시사된다. 즉, 의식장애 및/또는 다장기부전의 발증을 동반하는 병태로 진전하는 요인으로서, 「ADAMTS13 의 현저한 감소」자체가 병태형성에 즈음하여 매우 중요한 의의를 가지는 것으로 생각된다. 또한, 상기 6증례 중 ADAMTS13 효소활성이 낮다고 해도(21%), 그 활성치를 유지하고 그 이상의 감소가 보이지 않았던 증례(증례 6)에 대해서는, MODS에 이르지 않고, 생명예후 불량을 면하였다. 이 결과로부터는 「ADAMTS13의 현저한 감소」가 중증의 진전 병태를 형성하는데에 성립요인이 되는 가능성을 시사하는 것 뿐만아니라, 당해 환자에 대하여, 지금까지 처방되지 않았던 ADAMTS13 보충치료법의 새로운 유효성을 고찰할 수 있다. ADAMTS13 항원량 및 효소활성을 모니터링하고, 그의 감소 정도를 검출하는 것은 MODS에의 진전을 보다 빨리 예측할 수 있어 조기 치료방침을 결정하고, 나아가서는 환자의 구명조치로 이어지는 진단법이 되는 것을 나타내는 것이다.

본 발명은 의식장애환자의 병태 검출의 용도로 적용할 수 있다.

이상, 본 발명을 특정의 양태에 따라 설명하였으나, 당업자에게 자명한 변형과 개량은 본 발명의 범위에 포함된다.

Claims

혼미 또는 혼수환자에서, 아테롬성 혈전성 뇌경색, 심원성 뇌색전병 및 라쿠나형 뇌경색으로 구성된 군에서 선택되는 뇌혈관장애의 중증도의 검출 또는 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 상기 환자의 시료로부터, 본 윌브랜드 인자 절단효소의 양 또는 활성, 혹은 본 윌브랜드 인자 절단효소의 양 및 활성을 분석하는 방법.
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제1항에 있어서, 본 윌브랜드 인자 절단효소의 분석을 본 윌브랜드 인자 절단효소에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 사용하는 면역학적 수법에 의하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 본 윌브랜드 인자 절단효소 활성의 분석을 본 윌브랜드 인자 또는 그 단편을 사용하는 것에 의하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
본 윌브랜드 인자 절단효소에 특이적으로 결합하는 항체 혹은 그 단편, 또는 본 윌브랜드 인자 혹은 그 단편을 함유하는 혼미 또는 혼수환자에서, 아테롬성 혈전성 뇌경색, 심원성 뇌색전병 및 라쿠나형 뇌경색으로 구성된 군에서 선택되는 뇌혈관장애의 중증도의 검출 또는 예측용 키트.
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