WO2020007270A1 - 无创诊断心肌梗死的标志物和诊断方法 - Google Patents

无创诊断心肌梗死的标志物和诊断方法 Download PDF

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WO2020007270A1
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myocardial infarction
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杨承刚
李曙光
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北京泱深生物信息技术有限公司
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the invention belongs to the field of molecular diagnosis, and relates to a noninvasive diagnosis marker and method for diagnosis of myocardial infarction, in particular to the application of markers in blood: ING1, RAE1, DOCK10, KDSR, IVD, MAEA in the diagnosis of myocardial infarction.
  • Myocardial infarction is a global public health problem that seriously threatens the health of the public (J. Ross, Jr., A. 50-year research, journal. From laboratories to clinic, Circulation, journal: official, journal of Japan, Circulation, Society, 73 ( 2009) 3-12; D. Lloyd-Jones, R. Adams, M. Carnethon, G. De Simone, TBFerguson, K. Flegal, E. Ford, K. Furie, A. Go, K. Greenlund, N. Haase, S. Haipern, M. Ho, V. Howard, B. Kissela, S. Kittner, D. Lackland, L. Lisabeth, A. Marelli, M. McDermott, J.
  • Myocardial infarction is a complex physiological process. Ischemia leads to the amplification of the expression cascade of certain genes in myocardial cells, which leads to apoptosis or necrosis of myocardial cells. Therefore, the treatment time window of myocardial infarction is prolonged, and gene expression in the downstream region can be suppressed. Effectively prevent the occurrence of cardiomyocyte apoptosis or necrosis (M. Ashburner, CABall, JABlake, D. Botstein, H. Butler, JMCherry, APDavis, K.
  • the object of the present invention is to provide a non-invasive diagnosis marker and diagnostic method for myocardial infarction.
  • the use of gene markers to diagnose myocardial infarction has the timeliness, specificity and sensitivity, so that patients can know the disease risk early in the disease, and take corresponding prevention and Treatment measures.
  • the invention provides a marker for diagnosing myocardial infarction, the marker is selected from one or more of the following groups: ING1, RAE1, DOCK10, KDSR, IVD, MAEA.
  • the invention provides the application of a product for detecting the expression of the aforementioned markers in the preparation of a tool for diagnosing myocardial infarction.
  • the aforementioned products for detecting the expression of the aforementioned markers include: detecting the expression of the aforementioned markers by RT-PCR, real-time quantitative PCR, immunodetection, in situ hybridization, microarray or high-throughput sequencing platforms Level to diagnose myocardial infarction.
  • a product for detecting the expression level of the marker to diagnose myocardial infarction by reverse transcription PCR includes at least a pair of primers specifically amplifying the marker; and detecting the expression level of the marker to diagnose myocardial infarction by real-time quantitative PCR.
  • the product includes at least a pair of primers that specifically amplify the marker; the product that detects the expression level of the marker to diagnose myocardial infarction by immunoassay includes: an antibody that specifically binds to the marker; the detection site by in situ hybridization
  • the product of the marker expression level for diagnosing myocardial infarction includes: a probe that hybridizes with the nucleic acid sequence of the marker; the product of the marker detection level of the marker for diagnosing myocardial infarction includes: a protein chip and a gene chip; wherein The protein chip includes antibodies that specifically bind to the marker, and the gene chip includes probes that hybridize to the nucleic acid sequence of the marker.
  • the product of at least one pair of primers specifically amplifying the marker included in the product for detecting the expression level of the marker by real-time quantitative PCR to diagnose myocardial infarction is as follows:
  • the primer sequences of ING1 are shown in SEQ ID NO.1 and SEQ ID NO.2;
  • RAE1 The primer sequences of RAE1 are shown in SEQ ID NO. 3 and SEQ ID NO. 4;
  • DOCK10 The primer sequences of DOCK10 are shown in SEQ ID NO.5 and SEQ ID NO.6;
  • KDSR primer sequences are shown in SEQ ID NO.7 and SEQ ID NO.8;
  • IVD primer sequences are shown in SEQ ID NO. 9 and SEQ ID NO. 10;
  • the primer sequences of MAEA are shown in SEQ ID NO.11 and SEQ ID NO.12.
  • the diagnostic tool includes a chip, a kit, a test strip, or a high-throughput sequencing platform.
  • the high-throughput sequencing platform is a special diagnostic tool. Products that detect the expression of the aforementioned markers can be applied to the platform to detect the expression of the aforementioned markers.
  • high-throughput sequencing technology With the development of high-throughput sequencing technology, the construction of a person's gene expression profile will become a very convenient task. By comparing the gene expression profiles of disease patients and normal population, it is easy to analyze which gene abnormality is associated with the disease. Therefore, it is also within the scope of the present invention to know that the abnormality of the aforementioned markers and the myocardial infarction in high-throughput sequencing are related to the myocardial infarction.
  • the invention also provides a tool for diagnosing myocardial infarction.
  • the diagnostic tool includes a chip, a kit, a test strip, or a high-throughput sequencing platform.
  • the chip includes a gene chip and a protein chip;
  • the gene chip includes a solid phase carrier and an oligonucleotide probe fixed on the solid phase carrier, and the oligonucleotide probe includes a chip for detecting the marker An oligonucleotide probe for the marker at the transcription level;
  • the protein chip includes a solid-phase carrier and a specific antibody for the marker immobilized on the solid-phase carrier; and the gene chip can be used to detect Expression levels of multiple genes (e.g., multiple genes associated with myocardial infarction) including the markers described above.
  • the protein chip can be used to detect the expression level of a plurality of proteins including the aforementioned markers (for example, a plurality of proteins associated with myocardial infarction). By detecting multiple markers simultaneously with myocardial infarction, the accuracy of myocardial infarction diagnosis can be greatly improved.
  • the kit includes a gene detection kit and a protein immunodetection kit; the gene detection kit includes a reagent for detecting the aforementioned marker transcription level; and the protein immunodetection kit includes the aforementioned Specific antibodies for markers.
  • the reagents include reagents required in the process of detecting the expression levels of the aforementioned markers by using RT-PCR, real-time quantitative PCR, immunodetection, in situ hybridization, or chip methods.
  • the reagent comprises a primer and / or a probe directed to the aforementioned marker. Primers and probes that can be used to detect the expression levels of the aforementioned markers are easily designed based on the nucleotide sequence information of the aforementioned markers.
  • the probe that hybridizes to the nucleic acid sequence of the aforementioned marker may be DNA, RNA, DNA-RNA chimera, PNA, or other derivatives.
  • the length of the probe is not limited, as long as specific hybridization is completed and specific binding with the nucleotide sequence of interest is achieved, any length is acceptable.
  • the probe can be as short as 25, 20, 15, 13, or 10 bases in length.
  • the length of the probe can be as long as 60, 80, 100, 150, 300 base pairs or longer, or even the entire gene. Because different probe lengths have different effects on hybridization efficiency and signal specificity, the length of the probes is usually at least 14 base pairs, and the longest is generally not more than 30 base pairs. Complementary length is best at 15-25 base pairs.
  • the self-complementary sequence of the probe is preferably less than 4 base pairs, so as not to affect the hybridization efficiency.
  • the high-throughput sequencing platform includes reagents for detecting the expression levels of the aforementioned markers.
  • the test paper includes a test paper carrier and an oligonucleotide fixed on the test paper carrier, and the oligonucleotide is capable of detecting the transcription level of the aforementioned marker.
  • the specific antibodies of the aforementioned markers include monoclonal antibodies and polyclonal antibodies.
  • the specific antibodies of the aforementioned markers include intact antibody molecules, any fragments or modifications of the antibodies (eg, chimeric antibodies, scFv, Fab, F (ab ') 2, Fv, etc.) as long as the fragments can It is sufficient to retain the ability to bind to the aforementioned markers.
  • the preparation of antibodies for protein levels is well known to those skilled in the art, and the present invention can use any method to prepare the antibodies.
  • the primer sequence for the marker is as follows:
  • the primer sequences of ING1 are shown in SEQ ID NO.1 and SEQ ID NO.2;
  • RAE1 The primer sequences of RAE1 are shown in SEQ ID NO. 3 and SEQ ID NO. 4;
  • DOCK10 The primer sequences of DOCK10 are shown in SEQ ID NO.5 and SEQ ID NO.6;
  • KDSR primer sequences are shown in SEQ ID NO.7 and SEQ ID NO.8;
  • IVD primer sequences are shown in SEQ ID NO. 9 and SEQ ID NO. 10;
  • the primer sequences of MAEA are shown in SEQ ID NO.11 and SEQ ID NO.12.
  • Sources of the aforementioned markers for diagnosing myocardial infarction include, but are not limited to, blood, tissue fluid, urine, saliva, spinal fluid, and other body fluids from which genomic DNA can be obtained.
  • the source of the aforementioned marker for diagnosing myocardial infarction is blood.
  • the invention provides a method for diagnosing myocardial infarction.
  • the method comprises: detecting the expression level of the aforementioned marker in a sample of a subject; if compared with a normal person, ING1, RAE1, and MAEA in the sample of the subject If the expression of at least one of them is significantly increased, or the expression of at least one of DOCK10, KDSR, and IVD is significantly decreased, the subject is diagnosed as a patient with myocardial infarction.
  • the method includes:
  • the method includes:
  • the sample source is blood.
  • ING1 gene includes polynucleotides of the ING1 gene as well as any functional equivalent of the ING1 gene.
  • the sequence of the ING1 gene (Chromosome 13, NC_000013.11 (110712623..110721074)) can be queried in the international public nucleic acid sequence database GeneBank.
  • RAE1 gene includes polynucleotides of the RAE1 gene as well as any functional equivalent of the RAE1 gene.
  • the RAE1 gene (Chromosome 20, NC_000020.11 (57351089..57378463)) sequence can be queried in the international public nucleic acid sequence database GeneBank.
  • a "DOCK10 gene” includes a polynucleotide of the DOCK10 gene as well as any functional equivalent of the DOCK10 gene.
  • the DOCK10 gene (Chromosome 2, NC_000002.12 (224765090 .. 225042689, completion)) sequence can be queried in the International Public Nucleic Acid Sequence Database GeneBank.
  • a "KDSR gene” includes a polynucleotide of the KDSR gene as well as any functional equivalent of the KDSR gene.
  • the KDSR gene (Chromosome 18, NC_000018.10 (63327736..63367273, completion)) sequence can be queried in the international public nucleic acid sequence database GeneBank.
  • an "IVD gene” includes a polynucleotide of the IVD gene as well as any functional equivalent of the IVD gene.
  • the IVD gene (Chromosome 15, NC_000015.10 (40405485..40435948)) sequence can be queried in the international public nucleic acid sequence database GeneBank.
  • MAEA gene includes polynucleotides of the MAEA gene as well as any functional equivalent of the MAEA gene.
  • the MAEA gene (Chromosome 4, NC_000004.12 (1289851..1340148)) sequence can be queried in the international public nucleic acid sequence database GeneBank.
  • gene expression products include gene-encoded proteins and partial peptides of gene-encoded proteins.
  • the protein partial peptide contains a functional domain related to myocardial infarction.
  • Protein includes proteins and any functional equivalents of proteins.
  • the functional equivalent includes a protein conservatively mutated protein, or an active fragment thereof, or an active derivative thereof, an allelic variant, a natural mutant, an induced mutant, and a DNA capable of hybridizing to DNA under high or low stringent conditions. Encoded protein.
  • a protein modified by adding one or more amino acid residues is a fusion protein of the aforementioned markers.
  • diagnosing myocardial infarction includes both determining whether a subject already has a myocardial infarction and also determining whether the subject is at risk of having a myocardial infarction.
  • the present invention finds for the first time that ING1, RAE1, DOCK10, KDSR, IVD, and MAEA gene expression are related to myocardial infarction.
  • ING1, RAE1, DOCK10, KDSR, IVD, and MAEA gene expression are related to myocardial infarction.
  • the present invention finds a new molecular marker-ING1, RAE1, DOCK10, KDSR, IVD, MAEA. Compared with traditional detection methods, molecular diagnosis is more timely, specific and sensitive, which can realize the early diagnosis of myocardial infarction. Thereby reducing the mortality of myocardial infarction.
  • Figure 1 shows the difference in the expression of ING1 gene between patients with myocardial infarction and normal people by QPCR;
  • Figure 2 shows the expression difference of RAE1 gene detected in patients with myocardial infarction and normal people by QPCR
  • Figure 3 shows the difference in expression of DOCK10 gene detected in patients with myocardial infarction and normal by QPCR
  • Figure 4 shows the expression difference of KDSR gene detected in patients with myocardial infarction and normal people by QPCR
  • Figure 5 shows the difference in expression of IVD gene between patients with myocardial infarction and normal people by QPCR
  • Figure 6 shows the difference in expression of the MAEA gene in patients with myocardial infarction and normal people using QPCR
  • FIG. 7 shows the difference in expression of ING1 protein between myocardial infarction patients and normal people by immunoblotting
  • FIG. 8 is a graph showing the difference in expression of RAE1 protein in patients with myocardial infarction and normal people by immunoblot;
  • Figure 9 shows the detection of the expression difference of DOCK10 protein in patients with myocardial infarction and normal people by immunoblotting
  • Figure 10 shows the expression difference of KDSR protein in patients with myocardial infarction and normal people by immunoblot
  • FIG. 11 shows the difference in expression of IVD protein between myocardial infarction patients and normal people by immunoblot
  • FIG. 12 shows the difference in expression of MAEA protein between patients with myocardial infarction and normal people by immunoblotting.
  • RNA Discard the supernatant, add 1mL Trizol and mix by pipetting. If RNA is not extracted immediately, it can be stored in -80 °C refrigerator.
  • RNA purity The microplate reader self-checks and adds 2 ⁇ L of the dissolved RNA sample for detection after zero adjustment. Get the RNA concentration directly. An OD260 / OD280 of 1.8-2.2 indicates that the extracted RNA is of high purity and can be used.
  • TopHat v1.3.1 is used to match the clean fragments with the UCSC H.sapiens reference genome (hg19).
  • the pre-built index of the H.sapiens UCSC hg19 version is downloaded from the TopHat homepage
  • each read default to 20
  • TopHat builds a library of possible splice sites based on exon regions and GT-AG splice signals. Based on these splice site libraries, reads that are not mapped to the genome are mapped to the genome. We use the system default parameters of the TopHat method.
  • the matching read file is processed by Cufflinks v1.0.3.
  • Cufflinks v1.0.3 normalizes the number of RNA-seq fragments to calculate the relative abundance of transcripts.
  • the FPKM value refers to the number of fragments per million sequenced fragments that match a 1 kb exon region of a particular gene.
  • the Bayesian reasoning method is used to calculate the confidence interval of the FPKM estimate.
  • the referenced GTF annotation file used by Cufflinks was downloaded from the Ensembl database (Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf).
  • Cuffdiff uses the original match file to re-evaluate the expression abundance of the transcripts listed in the GTF file and detect the differential expression. Only if the q value is less than 0.01 in the Cuffidff output, the test shows that a successful comparison is considered a differential expression.
  • RNA-seq results showed that compared with the normal population, 347 genes were highly expressed in the blood of patients with myocardial infarction, and 254 genes were under-expressed. The differences were statistically significant (P ⁇ 0.05).
  • the screening criteria were the same as in Example 1. There were 35 patients with myocardial infarction and normal patients each.
  • Set 3 replicates for each sample, and the internal reference is GAPDH.
  • the primer sequences are as follows:
  • Reverse primer 5'-CTCACATACAGCAGGAAG-3 '(SEQ ID NO. 2).
  • Reverse primer 5'-AAGACAGACAACCAATGCTA-3 '(SEQ ID NO. 4).
  • Reverse primer 5'-CGTGTAGGTTGTTCTCTGA-3 '(SEQ ID NO. 6).
  • Reverse primer 5'-TTGATGCTCATTAACCTT-3 '(SEQ ID NO. 8).
  • Reverse primer 5'-ATCCAGAACTTGTTGCCATT-3 '(SEQ ID NO. 10).
  • Reverse primer 5'-GGATAGAAAGCAGAGAATT-3 '(SEQ ID NO. 12).
  • Reverse primer 5'-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3 '(SEQ ID NO. 14).
  • the Ct value is the number of cycles when the fluorescence intensity in the tube reaches the exponential growth stage from the background.
  • venous blood 10 ml of venous blood was taken from patients with myocardial infarction and normal people, and injected into sterile vials containing heparin. After capping, they were shaken gently immediately.
  • Add an equal volume of HBSS NaCl 8.0g, Na 2 HPO 4 0.132g, KH 2 PO 4 0.06g, KCl 0.4g, phenol red 1ml, NaHCO 3 0.35g, D-glucose 1.0g, and dissolve in 1000ml using a sterile pipette. Double distilled water) to reduce the aggregation of red blood cells. Pipette 8ml lymphocyte layered solution into a 50ml centrifuge tube.
  • Centrifuge the cell suspension (concentration 1 ⁇ 10 6 cells / ml) obtained in the above experiment at 1000 r / min for 10 minutes at room temperature. Discard the supernatant and add 100 ⁇ l of lysis buffer, shake at 4 ° C for 1 h, and disrupt the cells with an ultrasonic instrument for 10 s each A total of 10 times, centrifuged at 12000 r / min for 1 h at 4 °C; the supernatant was quantified by Brandford method, aliquoted into 2.5 ⁇ g / ⁇ l, stored at -80 °C refrigerator for future use.
  • the gray value of the protein band was analyzed using Image J software, and ⁇ -actin was used as an internal reference to normalize the gray value of the target white band.
  • the results were expressed as mean ⁇ standard deviation, statistical analysis was performed using SPSS13.0 statistical software, and the difference between the two was tested by t test, which was considered statistically significant when P ⁇ 0.05.

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Abstract

公开了无创诊断心肌梗死的标志物和诊断方法。利用二代测序和QPCR的方法发现ING1、RAE1、DOCK10、KDSR、IVD、MAEA在正常人和心肌梗死患者的血液中的表达存在显著差异，即可以通过检测血液中ING1、RAE1、DOCK10、KDSR、IVD、MAEA表达情况来判断受试者是否患有心肌梗死。根据两者的相关性，开发了一种诊断心肌梗死的试剂盒，该试剂盒通过检测ING1、RAE1、DOCK10、KDSR、IVD、MAEA的表达从而进行心肌梗死的诊断。上述诊断试剂盒可用于疾病的早期诊断，在临床上具有广泛的应用前景。

Description

无创诊断心肌梗死的标志物和诊断方法
本申请要求于2018年07月03日提交中国专利局、申请号为201810718258.3、发明名称为“心肌梗死的诊断标志物-ING1基因”；申请号为201810715884.7、发明名称为“RAE1基因或蛋白作为诊断心肌梗死的生物标志物的应用”；申请号为201810717286.3、发明名称为“用于早期诊断心肌梗死的DOCK10基因”；申请号为201810715888.5、发明名称为“KDSR基因在制备心肌梗死诊断工具中的应用”；申请号为201810718260.0、发明名称为“诊断心肌梗死的IVD基因及其应用”；申请号为201810717258.1、发明名称为“血液中MAEA基因的诊断新功能”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明属于分子诊断领域，涉及一种无创诊断心肌梗死的标志物和诊断方法，具体涉及血液中的标志物：ING1、RAE1、DOCK10、KDSR、IVD、MAEA在诊断心肌梗死中的应用。
背景技术
心肌梗死是一个全球性的公共卫生问题，严重威胁着公众的健康(J.Ross,Jr.,A 50-year research journey.From laboratory to clinic,Circulation journal:official journal of the Japanese Circulation Society,73(2009)3-12；D.Lloyd-Jones,R.Adams,M.Carnethon,G.De Simone,T.B.Ferguson,K.Flegal,E.Ford,K.Furie,A.Go,K.Greenlund,N.Haase,S.Hailpern,M.Ho,V.Howard,B.Kissela,S.Kittner,D.Lackland,L.Lisabeth,A.Marelli,M.McDermott,J.Meigs,D.Mozaffarian,G.Nichol,C.O'Donnell,V.Roger,W.Rosamond,R.Sacco,P Sorlie,R.Stafford,J.Steinberger,T.Thom,S.Wasserthiel-Smoller,N.Wong,J.Wylie-Rosett,Y.Hong,C.American Heart Association Statistics,S.)。几种方法学可以有效的应用于心肌梗死的治疗，例如经皮冠状动脉介入或冠状动脉重建术，这些治疗能保 护血液流经的局部坏死心肌，减小坏死的区域。治疗后的急性心肌梗死病人的临床结果显示左心室肌的梗死得到了改善。然而，目前针对急性心肌梗死的治疗仍然有限，主要原因是治疗的时间窗非常的狭窄(R.Suresh,X.Li,A.Chiriac,K.Goel,A.Terzic,C.Perez-Terzic,T.J.Nelson,ranscriptome from circulating cells suggests dysregulated pathways associated with long-term recurrent events following first-time myocardial infarction,Journal of molecular and cellular cardiology,74(2014)13-21.)，因此迫切需要了解发生急性心肌梗死时的主要分子机制。
心肌梗死是一个复杂的生理过程，缺血导致心肌细胞某些基因的表达级联放大，进而造成心肌细胞的凋亡或坏死，因此延长心肌梗死的治疗时间窗，抑制下游区的基因表达，能够有效防止心肌细胞凋亡或坏死的发生(M.Ashburner,C.A.Ball,J.A.Blake,D.Botstein,H.Butler,J.M.Cherry,A.P.Davis,K.Dolinski,S.S.Dwight,J.T.Eppig,M.A.Harris,D.P.Hill,L.Issel-Tarver,A.Kasarskis,S.Lewis,J.C.Matese,J.E.Richardson,M.Ringwald,G.M.Rubin,G.Sherlock,Gene ontology:tool for the unification of biology.The Gene Ontology Consortium,Nature genetics,25(2000)25-29)。分析心肌缺血后早期应答的基因，研究心肌缺血随时间梯度的基因表达图谱，揭示心肌缺血时的基因活动，能为基础研究和临床诊断提供新的依据。多种生理过程伴随着心肌梗死的出现，例如炎症、异常的钙摄入、细胞周期异常、肽分泌、氧化应激、细胞凋亡等，目前对这些进程发生的精确时间以及发生心肌缺血后一些相关基因何时表达尚不清楚，还有待进一步探索。
现已越来越多的研究发现特异基因能够成为诊断心肌梗死的生物标志物，如以下申请号的专利公开的：201710592045.6、201510923782.0、201810019374.6、201710592044.1、201510727115.5、201510727744.8、201710591408.4、201710592593.9、201510727102.8。大部分疾病都是多基因调控的疾病，为了提高疾病的诊断准确率，将大量基因联合诊断成为必然，因此需要发掘更多与心肌梗死相关的分子标志物以便临床应用。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供无创诊断心肌梗死的标志物和诊断方法。相比传统的心肌梗死的诊断方法，使用基因标志物来诊断心肌梗死的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了诊断心肌梗死的标志物，所述标志物选自以下组中的一个或几个：ING1、RAE1、DOCK10、KDSR、IVD、MAEA。
本发明提供了检测前面所述的标志物表达的产品在制备诊断心肌梗死的工具中的应用。
进一步，上面所提到的检测前面所述的标志物表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测前面所述的标志物表达水平以诊断心肌梗死的产品。
进一步，通过反转录PCR检测所述标志物表达水平以诊断心肌梗死的产品至少包括一对特异扩增所述标志物的引物；通过实时定量PCR检测所述标志物表达水平以诊断心肌梗死的产品至少包括一对特异扩增所述标志物的引物；通过免疫检测检测所述标志物表达水平以诊断心肌梗死的产品包括：与所述标志物特异性结合的抗体；通过原位杂交检测所述标志物表达水平以诊断心肌梗死的产品包括：与所述标志物的核酸序列杂交的探针；通过芯片检测所述标志物表达水平以诊断心肌梗死的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与所述标志物特异性结合的抗体，基因芯片包括与所述标志物的核酸序列杂交的探针。
在本发明的具体实施方案中，通过实时定量PCR检测所述标志物表达水平以诊断心肌梗死的产品至少包括的一对特异扩增所述标志物的引物序列如下：
ING1的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
RAE1的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
DOCK10的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
KDSR的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；
IVD的引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；
MAEA的引物序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测前面所述的标志物表达的产品可以应用于该平台实现对前面所述的标志物的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知前面所述的标志物的异常与心肌梗死相关也属于前面所述的标志物的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种诊断心肌梗死的工具，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测所述标志物转录水平的针对所述标志物的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的所述标志物的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括前面所述的标志物在内的多个基因(例如，与心肌梗死相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括前面所述的标志物在内的多个蛋白质(例如与心肌梗死相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与心肌梗死的标志物同时检测，可大大提高心肌梗死诊断的准确率。
其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测前面所述的标志物转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括前面所述的标志物的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测前面所述的标志物表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对前面所述的标志物的引物和/或探针。根据前面所述的标志物的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测前面所述的标志物表达水平的引物和探针。
与前面所述的标志物的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、 300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
所述高通量测序平台包括检测前面所述的标志物表达水平的试剂。
所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测前面所述的标志物的转录水平。
进一步，所述前面所述的标志物的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述前面所述的标志物的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与前面所述的标志物的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
在本发明的具体实施方案中，针对所述标志物的引物序列如下：
ING1的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
RAE1的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
DOCK10的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
KDSR的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；
IVD的引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；
MAEA的引物序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
用于诊断心肌梗死的前面所述的标志物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断心肌梗死的前面所述的标志物的来源是血液。
本发明提供了一种诊断心肌梗死的方法，所述方法包括：检测受试者样本中前面所述的标志物的表达水平；若与正常人相比，受试者样本中ING1、RAE1和MAEA中的至少一个表达显著升高，或，DOCK10、KDSR和IVD中的至少一个表达显著降低，则该受试者被诊断为心肌梗死患者。
进一步，所述方法包括：
(1)收集受试者样本；
(2)提取受试者样本中的RNA或蛋白，检测前面所述的标志物的表达水平；
(3)与正常人相比，受试者样本中ING1、RAE1和MAEA中的至少一个表达显著升高，或，DOCK10、KDSR和IVD中的至少一个表达显著降低，则该受试者被诊断为心肌梗死患者。
更进一步，所述方法包括：
(1)鉴定前面所述的标志物是用于诊断心肌梗死的生物标志物；
(2)收集受试者样本；
(3)提取受试者样本中的RNA或蛋白，检测前面所述的标志物的表达水平；
(4)与正常人相比，受试者样本中ING1、RAE1和MAEA中的至少一个表达显著升高，或，DOCK10、KDSR和IVD中的至少一个表达显著降低，则该受试者被诊断为心肌梗死患者。
优先地，所述样本来源是血液。
在本发明的上下文中，“ING1基因”包括ING1基因以及ING1基因的任何功能等同物的多核苷酸。ING1基因(Chromosome 13,NC_000013.11(110712623..110721074))序列可在国际公共核酸序列数据库GeneBank中查询到。
在本发明的上下文中，“RAE1基因”包括RAE1基因以及RAE1基因的任何功能等同物的多核苷酸。RAE1基因(Chromosome 20，NC_000020.11(57351089..57378463))序列可在国际公共核酸序列数据库GeneBank中查询到。
在本发明的上下文中，“DOCK10基因”包括DOCK10基因以及DOCK10基因的任何功能等同物的多核苷酸。DOCK10基因(Chromosome 2,NC_000002.12(224765090..225042689,complement))序列可在国际公共核酸序列数据库GeneBank中查询到。
在本发明的上下文中，“KDSR基因”包括KDSR基因以及KDSR基因的任何功能等同物的多核苷酸。KDSR基因(Chromosome 18,NC_000018.10(63327736..63367273,complement))序列可在国际公共核酸序列数据库GeneBank中查询到。
在本发明的上下文中，“IVD基因”包括IVD基因以及IVD基因的任何功能等同物的多核苷酸。IVD基因(Chromosome 15,NC_000015.10(40405485..40435948))序列可在国际公共核酸序列数据库GeneBank中查询到。
在本发明的上下文中，“MAEA基因”包括MAEA基因以及MAEA基因的任何功能等同物的多核苷酸。MAEA基因(Chromosome 4,NC_000004.12(1289851..1340148))序列可在国际公共核酸序列数据库GeneBank中查询到。
在本发明的上下文中，基因表达产物包括基因编码蛋白以及基因编码蛋白的部分肽。所述蛋白部分肽含有与心肌梗死相关的功能域。
“蛋白”包括蛋白以及蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是前面所述的标志物的融合蛋白。对于蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留所述的标志物的生物学活性即可。
在本发明的上下文中，“诊断心肌梗死”既包括判断受试者是否已经患有心肌梗死、也包括判断受试者是否存在患有心肌梗死的风险。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了ING1、RAE1、DOCK10、KDSR、IVD、MAEA基因表达与心肌梗死相关，通过检测受试者中ING1、RAE1、DOCK10、KDSR、IVD、MAEA的表达，可以判断受试者是否患有心肌梗死、或者判断受试者是否存在患有心肌梗死的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种新的分子标记物-ING1、RAE1、DOCK10、KDSR、IVD、MAEA，相比传统的检测手段，分子诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现心肌梗死的早期诊断，从而降低心肌梗死的死亡率。
附图说明
图1显示利用QPCR检测ING1基因在心肌梗死患者和正常人中的表达差异；
图2显示利用QPCR检测RAE1基因在心肌梗死患者和正常人中的表达差异；
图3显示利用QPCR检测DOCK10基因在心肌梗死患者和正常人中的表达差异；
图4显示利用QPCR检测KDSR基因在心肌梗死患者和正常人中的表达差异；
图5显示利用QPCR检测IVD基因在心肌梗死患者和正常人中的表达差异；
图6显示利用QPCR检测MAEA基因在心肌梗死患者和正常人中的表达差异；
图7显示利用免疫印迹检测ING1蛋白在心肌梗死患者和正常人中的表达差异；
图8显示利用免疫印迹检测RAE1蛋白在心肌梗死患者和正常人中的表达差异图；
图9显示利用免疫印迹检测DOCK10蛋白在心肌梗死患者和正常人中的表达差异；
图10显示利用免疫印迹检测KDSR蛋白在心肌梗死患者和正常人中的表达差异；
图11显示利用免疫印迹检测IVD蛋白在心肌梗死患者和正常人中的表达差异；
图12显示利用免疫印迹检测MAEA蛋白在心肌梗死患者和正常人中的表达差异。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 筛选心肌梗死患者和正常人中差异表达的基因
1、研究对象
选取6例医院治疗的心肌梗死住院患者为研究对象，其中3例男性，3例女性，平均年龄为56.00士8.75；对照组为7例健康人；以上每位受邀加入研究的患者及健康者均签署知情同意书。
2、样本的收集及储存
患者入院当天，行冠脉造影前采集8mL新鲜无菌动脉血至EDTA抗凝紫头管中。若非马上使用，可将样本放于4℃冰箱内保存2h。
3、Ficoll法分离PBMCs
以下步骤均在超净台内完成：
(1)生理盐水等体积稀释血样，等体积Ficoll液(人淋巴细胞分离液，购自天津市灏洋生物制品科技有限公司)加入50mL离心管内，倾斜45℃角离心管，使用无RNA酶枪头对稀释后的血样进行吸取，沿管壁缓慢加入到分离液面上方，Ficoll分离液上血液样本得以平铺，确保液体层面不被打乱，拧紧管盖。
(2)放入水平离心机，室温800g离心20min，且需缓慢升速。
(3)吸出并弃掉血清层，使用无RNA酶枪头沿管壁吸取血清层与分离液交界处富含PBMCs的白膜层细胞，置于新10mL无RNA酶EP管中，加入生理盐水至10mL，混匀，室温1700r/min离心15min。
(4)弃上清，可见管底沉淀，即为PBMCs，再向管内加入1mL生理盐水，将沉淀吹打混匀，转移至1.5mL无RNA酶EP管中，室温1500r/min离心l0min，再次洗涤细胞。
(5)弃上清，加入1mL Trizol吹打混匀，若非马上提取RNA，可放于-80℃冰箱保存。
4、提取PBMCs中的RNA
总RNA提取采用酚氯仿一步法，在冰上进行所有步骤操作，需佩戴无RNA酶口罩及手套，操作步骤如下：
(1)从-80℃冰箱中拿出溶解于Trizol的PBMCs，缓慢溶解。
(2)向每管中加入200μl的三氯甲烷，剧烈振荡15sec，4℃12000r/min离心15min。
(3)向新备好的1.5mL无酶EP管内吸取上层液相(切勿触及中层及下层)，再加入等体积500μl异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，4℃12000r/min离心15min。
(4)弃上清，加入1mL 75％乙醇(DEPC水配置)，颠倒混匀数次，洗涤沉 淀，随后40C 7500r/min离心10min。
(5)弃上清，在不碰到沉淀的前提下，尽量吸出管内液体，随后超净台内敞口静置15-20min，沉淀物干燥后，加入15-20μl 1/1000无RNA酶水溶解RNA。
(6)检测RNA纯度：酶标仪自检、调零后加入2μL溶解后的RNA样本进行检测。直接获取RNA浓度。1.8-2.2的OD260/OD280说明提取的RNA纯度较高，可以使用。
5、高通量转录组测序
(1)RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
(2)转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
(3)差异表达基因的检测
将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
6、结果
RNA-seq结果显示，与正常人群相比，心肌梗死患者血液中高表达的基因为 347个，低表达的基因为254个，差异均具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2 QPCR实验验证心肌梗死患者和正常人中差异表达的基因
1、研究对象：
筛选标准同实施例1，心肌梗死患者和正常人各35例。
2、血液中总RNA的提取
步骤同实施例1。
3、RT-PCR
(1)RT
RT反应体系(20μl)：
Figure PCTCN2019094268-appb-000001
RT反应程序：
42℃  15min
85℃  5s
4℃   ---
(2)qPCR
PCR反应体系(20μl)：
Figure PCTCN2019094268-appb-000002
Figure PCTCN2019094268-appb-000003
PCR反应程序：
ING1扩增程序：
Figure PCTCN2019094268-appb-000004
RAE1扩增程序：
Figure PCTCN2019094268-appb-000005
DOCK10扩增程序：
Figure PCTCN2019094268-appb-000006
KDSR扩增程序：
Figure PCTCN2019094268-appb-000007
IVD扩增程序：
Figure PCTCN2019094268-appb-000008
MAEA基因扩增程序：
Figure PCTCN2019094268-appb-000009
设置每个样本3复孔，内参为GAPDH。
(3)引物
引物序列如下：
ING1基因：
正向引物：5’-CAAGGAACCTCAAGTCAT-3’(SEQ ID NO.1)；
反向引物：5’-CTCACATACAGCAGGAAG-3’(SEQ ID NO.2)。
RAE1基因：
正向引物：5’-CAACTACAGACAATCACAATCC-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物：5’-AAGACAGACAACCAATGCTA-3’(SEQ ID NO.4)。
DOCK10基因：
正向引物：5’-GTCTGGATTCGCTGGATAA-3’(SEQ ID NO.5)；
反向引物：5’-CGTGTAGGTTGTTCTCTGA-3’(SEQ ID NO.6)。
KDSR基因：
正向引物：5’-GACTATAACCAAGTAGAGAA-3’(SEQ ID NO.7)；
反向引物：5’-TTGATGCTCATTAACCTT-3’(SEQ ID NO.8)。
IVD基因：
正向引物：5’-GCTCTGATGTTGTCTCTATGAA-3’(SEQ ID NO.9)；
反向引物：5’-ATCCAGAACTTGTTGCCATT-3’(SEQ ID NO.10)。
MAEA基因：
正向引物：5’-GTGATGAACGAGAACAAT-3’(SEQ ID NO.11)；
反向引物：5’-GGATAGAAAGCAGAGAATT-3’(SEQ ID NO.12)。
GAPDH基因
正向引物：5’-CCACATCGCTCAGACACCAT-3’(SEQ ID NO.13)；
反向引物：5’-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3’(SEQ ID NO.14)。
(4)结果分析
Ct值为管内荧光强度由本底达到指数增长阶段时对应的循环数。
公式为样品Ct值-内参(GAPDH)Ct值＝ △Ct；样品△Ct值-阴性对照△Ct＝ △△Ct；样品mRNA相对值＝2 -△△Ct。
(5)数据统计
所有数据以平均值±标准差(Mean±SD)显示。方差分析多组数据组间差异。P<0.05为有统计学差异。
4、结果
结果显示，与正常人平均水平相比，35例心肌梗死患者中有32例患者血液中ING1基因的mRNA水平显著上调。统计结果如图1所示，与正常人相比，心肌梗死患者血液中ING1基因的mRNA水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果RNA-seq实验。
结果显示，与正常人平均水平相比，35例心肌梗死患者中有32例患者血液中RAE1基因的mRNA水平显著上调。统计结果如图2所示，与正常人相比，心肌梗死患者血液中RAE1基因的mRNA水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果RNA-seq实验。
结果显示，与正常人平均水平相比，35例心肌梗死患者中有33例患者血液 中DOCK10基因的mRNA水平显著下降。统计结果如图3所示，与正常人相比，心肌梗死患者血液中DOCK10基因的mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果RNA-seq实验。
结果显示，与正常人平均水平相比，35例心肌梗死患者中有30例患者血液中KDSR基因的mRNA水平显著下降。统计结果如图4所示，与正常人相比，心肌梗死患者血液中KDSR基因的mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果RNA-seq实验。
结果显示，与正常人平均水平相比，35例心肌梗死患者中有34例患者血液中IVD基因的mRNA水平显著下降。结果如图5所示，与正常人相比，心肌梗死患者血液中IVD基因的mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果RNA-seq实验。
结果显示，与正常人平均水平相比，35例心肌梗死患者中有34例患者血液中MAEA基因的mRNA水平显著上调。统计结果如图6所示，与正常人相比，心肌梗死患者血液中MAEA基因的mRNA水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果RNA-seq实验。
实施例3 免疫印迹实验验证心肌梗死患者和正常人中差异表达基因的表达产物
1、研究对象：同实施例2。
2、单核细胞分离
心肌梗死患者和正常人取静脉血10ml，注入盛肝素的无菌小瓶中，加盖后立即轻轻摇匀。用无菌吸管加入等体积的HBSS(NaCl 8.0g，Na 2HPO 4 0.132g，KH 2PO 4 0.06g，KCl 0.4g，酚红1ml，NaHCO 3 0.35g，D-葡萄糖1.0g，溶于1000ml双蒸水)，以降低红细胞的凝聚。吸取8ml淋巴细胞分层液置50ml离心管中，将稀释血液沿管壁缓慢加入，保持界面清楚，勿使两者相混，在20℃2000r/min离心30min，小心吸取分层液与血浆交接部位混浊的灰白色层，即淋巴细胞层，加入另一支离心管中，用5倍体积的HBSS洗涤2次，依次以2000r/min、1500r/min在室温下离心10min，以便去除大部分混杂的血小板，用10ml双蒸水与 细胞团块混合1min，使残余红细胞裂解，然后迅速加入等量1.8％NaCl溶液，2000r/min离心，去上清，经细胞计数后用HBSS溶液调整细胞至1×10 6个/ml备用。
3、单核细胞总蛋白质提取
将上述实验所得细胞悬液(浓度为1×10 6个/ml)室温1000r/min离心10min，弃上清后加入100μl裂解缓冲液，4℃震荡1h，用超声波仪破碎细胞，每次10s，共10次，于4℃12000r/min离心1h；取上清用Brandford法定量蛋白，分装成2.5μg/μl，-80℃冰箱保存备用。
4、Western blot检测
用常规方法即可。
5、统计学处理
将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将目的白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果显示，与正常人平均水平相比，35例心肌梗死患者中有32例患者血液中ING1蛋白水平显著上调。统计结果如图7所示，与正常人相比，心肌梗死患者血液中ING1蛋白水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。
结果显示，与正常人平均水平相比，35例心肌梗死患者中有32例患者血液中RAE1蛋白水平显著上调。统计结果如图8所示，与正常人相比，心肌梗死患者血液中RAE1蛋白水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。
结果显示，与正常人平均水平相比，35例心肌梗死患者中有33例患者血液中DOCK10蛋白水平显著下降。统计结果如图9所示，与正常人相比，心肌梗死患者血液中DOCK10蛋白水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
结果显示，与正常人平均水平相比，35例心肌梗死患者中有30例患者血液中KDSR蛋白水平显著下降。统计结果如图10所示，与正常人相比，心肌梗死 患者血液中KDSR蛋白水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
结果显示，与正常人平均水平相比，35例心肌梗死患者中有34例患者血液中IVD蛋白水平显著下降。统计结果如图11所示，与正常人相比，心肌梗死患者血液中IVD蛋白水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
结果显示，与正常人平均水平相比，35例心肌梗死患者中有34例患者血液中MAEA蛋白水平显著上调。统计结果如图12所示，与正常人相比，心肌梗死患者血液中MAEA蛋白水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (15)

  1. 一种诊断心肌梗死的标志物，其特征在于，所述标志物选自以下组中的一个或几个：ING1、RAE1、DOCK10、KDSR、IVD、MAEA。
  2. 检测权利要求1所述的标志物表达的产品在制备诊断心肌梗死的工具中的应用。
  3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过反转录PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测所述标志物表达水平以诊断心肌梗死的产品。
  4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过反转录PCR检测所述标志物表达水平以诊断心肌梗死的产品至少包括一对特异扩增所述标志物的引物；通过实时定量PCR检测所述标志物表达水平以诊断心肌梗死的产品至少包括一对特异扩增所述标志物的引物；通过免疫检测检测所述标志物表达水平以诊断心肌梗死的产品包括：与所述标志物特异性结合的抗体；通过原位杂交检测所述标志物表达水平以诊断心肌梗死的产品包括：与所述标志物的核酸序列杂交的探针；通过芯片检测所述标志物表达水平以诊断心肌梗死的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与所述标志物特异性结合的抗体，基因芯片包括与所述标志物的核酸序列杂交的探针。
  5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过实时定量PCR检测所述标志物表达水平以诊断心肌梗死的产品至少包括的一对特异扩增所述标志物的引物序列如下：
    ING1的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
    RAE1的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
    DOCK10的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
    KDSR的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；
    IVD的引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；
    MAEA的引物序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
  6. 一种用于诊断心肌梗死的工具，其特征在于，所述工具能够通过检测样本中权利要求1所述的标志物的表达来诊断心肌梗死。
  7. 根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。
  8. 根据权利要求7所述的工具，其特征在于，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测所述标志物转录水平的针对所述标志物的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的所述标志物的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测所述标志物转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括所述标志物的特异性抗体；所述试纸包括用于检测所述标志物转录水平的试剂；所述高通量测序平台包括用于检测所述标志物转录水平的试剂。
  9. 根据权利要求8所述的工具，其特征在于，所述检测所述标志物转录水平的试剂包括针对所述标志物的引物和/或探针。
  10. 根据权利要求9所述的工具，其特特征在于，针对所述标志物的引物序列如下：
    ING1的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
    RAE1的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
    DOCK10的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
    KDSR的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；
    IVD的引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；
    MAEA的引物序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
  11. 根据权利要求6-10中任一项所述的工具，其特征在于，所述样本是血液。
  12. 一种诊断心肌梗死的方法，其特征在于，所述方法包括：检测受试者样本中权利要求1所述的标志物的表达水平；若与正常人相比，受试者样本中ING1、RAE1和MAEA中的至少一个表达显著升高，或，DOCK10、KDSR和IVD中的至少一个表达显著降低，则该受试者被诊断为心肌梗死患者。
  13. 根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
    (1)收集受试者样本；
    (2)提取受试者样本中的RNA或蛋白，检测权利要求1所述的标志物的表达水平；
    (3)与正常人相比，受试者样本中ING1、RAE1和MAEA中的至少一个表达显著升高，或，DOCK10、KDSR和IVD中的至少一个表达显著降低，则该受试者被诊断为心肌梗死患者。
  14. 根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
    (1)鉴定权利要求1所述的标志物是用于诊断心肌梗死的生物标志物；
    (2)收集受试者样本；
    (3)提取受试者样本中的RNA或蛋白，检测权利要求1所述的标志物的表达水平；
    (4)与正常人相比，受试者样本中ING1、RAE1和MAEA中的至少一个表达显著升高，或，DOCK10、KDSR和IVD中的至少一个表达显著降低，则该受试者被诊断为心肌梗死患者。
  15. 根据权利要求12-14任一项所述的方法，其特征在于，所述样本是血液。
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