CN108753956A - Kdsr基因在制备心肌梗死诊断工具中的应用 - Google Patents

Kdsr基因在制备心肌梗死诊断工具中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了KDSR基因可以作为心肌梗死早期诊断的分子标志物。本发明利用二代测序和QPCR的方法发现KDSR基因在正常人和心肌梗死患者的血液中的表达存在显著差异，即可以通过检测血液中KDSR基因表达情况来判断受试者是否患有心肌梗死。根据两者的相关性，本发明开发了一种诊断心肌梗死的试剂盒，该试剂盒通过检测KDSR基因的表达从而进行心肌梗死的诊断。本发明的诊断试剂盒可用于疾病的早期诊断，在临床上具有广泛的应用前景。

Description

KDSR基因在制备心肌梗死诊断工具中的应用
技术领域
本发明属于分子诊断领域，涉及一种用于心肌梗死诊断的分子标志物，具体涉及血液中的分子标志物-KDSR基因在制备诊断心肌梗死的产品中的应用。
背景技术
心肌梗死是一个全球性的公共卫生问题，严重威胁着公众的健康(J.Ross,Jr.,A50-year research journey.From laboratory to clinic,Circulation journal:official journal of the Japanese Circulation Society,73(2009)3-12；D.Lloyd-Jones,R.Adams,M.Carnethon,G.De Simone,T.B.Ferguson,K.Flegal,E.Ford,K.Furie,A.Go,K.Greenlund,N.Haase,S.Hailpern,M.Ho,V.Howard,B.Kissela,S.Kittner,D.Lackland,L.Lisabeth,A.Marelli,M.McDermott,J.Meigs,D.Mozaffarian,G.Nichol,C.O'Donnell,V.Roger,W.Rosamond,R.Sacco,P Sorlie,R.Stafford,J.Steinberger,T.Thom,S.Wasserthiel-Smoller,N.Wong,J.Wylie-Rosett,Y.Hong,C.American HeartAssociation Statistics,S.)。几种方法学可以有效的应用于心肌梗死的治疗，例如经皮冠状动脉介入或冠状动脉重建术，这些治疗能保护血液流经的局部坏死心肌，减小坏死的区域。治疗后的急性心肌梗死病人的临床结果显示左心室肌的梗死得到了改善。然而，目前针对急性心肌梗死的治疗仍然有限，主要原因是治疗的时间窗非常的狭窄(R.Suresh,X.Li,A.Chiriac,K.Goel,A.Terzic,C.Perez-Terzic,T.J.Nelson,ranscriptome fromcirculating cells suggests dysregulated pathways associated with long-termrecurrent events following first-time myocardial infarction,Journal ofmolecular and cellular cardiology,74(2014)13-21.)，因此迫切需要了解发生急性心肌梗死时的主要分子机制。
心肌梗死是一个复杂的生理过程，缺血导致心肌细胞某些基因的表达级联放大，进而造成心肌细胞的凋亡或坏死，因此延长心肌梗死的治疗时间窗，抑制下游区的基因表达，能够有效防止心肌细胞凋亡或坏死的发生(M.Ashburner,C.A.Ball,J.A.Blake,D.Botstein,H.Butler,J.M.Cherry,A.P.Davis,K.Dolinski,S.S.Dwight,J.T.Eppig,M.A.Harris,D.P.Hill,L.Issel-Tarver,A.Kasarskis,S.Lewis,J.C.Matese,J.E.Richardson,M.Ringwald,G.M.Rubin,G.Sherlock,Gene ontology:tool for theunification of biology.The Gene Ontology Consortium,Nature genetics,25(2000)25-29)。分析心肌缺血后早期应答的基因，研究心肌缺血随时间梯度的基因表达图谱，揭示心肌缺血时的基因活动，能为基础研究和临床诊断提供新的依据。多种生理过程伴随着心肌梗死的出现，例如炎症、异常的钙摄入、细胞周期异常、肽分泌、氧化应激、细胞凋亡等，目前对这些进程发生的精确时间以及发生心肌缺血后一些相关基因何时表达尚不清楚，还有待进一步探索。
现已越来越多的研究发现特异基因能够成为诊断心肌梗死的生物标志物，如以下申请号的专利公开的：201710592045.6、201510923782.0、201810019374.6、201710592044.1、201510727115.5、201510727744.8、201710591408.4、201710592593.9、201510727102.8。大部分疾病都是多基因调控的疾病，为了提高疾病的诊断准确率，将大量基因联合诊断成为必然，因此需要发掘更多与心肌梗死相关的分子标志物以便临床应用。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于心肌梗死早期诊断的分子标志物。相比传统的心肌梗死的诊断方法，使用基因标志物来诊断心肌梗死的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测KDSR基因表达的产品在制备诊断心肌梗死的工具中的应用。
进一步，上面所提到的检测KDSR基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测KDSR基因表达水平以诊断心肌梗死的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断心肌梗死的产品至少包括一对特异扩增KDSR基因的引物；所述用实时定量PCR诊断心肌梗死的产品至少包括一对特异扩增KDSR基因的引物；所述用免疫检测诊断心肌梗死的产品包括：与KDSR蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断心肌梗死的产品包括：与KDSR基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断心肌梗死的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与KDSR蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与KDSR基因的核酸序列杂交的探针。
在本发明的具体实施方案中，所述用实时定量PCR诊断心肌梗死的产品至少包括一对特异扩增KDSR基因的引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一种特殊的诊断工具，检测KDSR基因表达的产品可以应用于该平台实现对KDSR基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知KDSR基因的异常与心肌梗死相关也属于KDSR基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种诊断心肌梗死的工具，所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测KDSR基因转录水平的针对KDSR基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的KDSR蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括KDSR基因在内的多个基因(例如，与心肌梗死相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括KDSR蛋白在内的多个蛋白质(例如与心肌梗死相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与心肌梗死的标志物同时检测，可大大提高心肌梗死诊断的准确率。
其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测KDSR基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括KDSR蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测KDSR基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对KDSR基因的引物和/或探针。根据KDSR基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测KDSR基因表达水平的引物和探针。
与KDSR基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
所述高通量测序平台包括检测KDSR基因表达水平的试剂。
所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够检测KDSR基因的转录水平。
进一步，所述KDSR蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述KDSR蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与KDSR蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
在本发明的具体实施方案中，所述针对KDSR基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示。
用于诊断心肌梗死的KDSR基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中，用于诊断心肌梗死的KDSR基因及其表达产物的来源是血液。
在本发明的上下文中，“KDSR基因”包括KDSR基因以及KDSR基因的任何功能等同物的多核苷酸。KDSR基因(Chromosome 18,NC_000018.10(63327736..63367273,complement))序列可在国际公共核酸序列数据库GeneBank中查询到。
在本发明的上下文中，KDSR基因表达产物包括KDSR蛋白以及KDSR蛋白的部分肽。所述KDSR蛋白的部分肽含有与心肌梗死相关的功能域。
“KDSR蛋白”包括KDSR蛋白以及KDSR蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括KDSR蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与KDSR的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是KDSR蛋白的融合蛋白。对于与KDSR蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留KDSR蛋白的生物学活性即可。
在本发明的上下文中，“诊断心肌梗死”既包括判断受试者是否已经患有心肌梗死、也包括判断受试者是否存在患有心肌梗死的风险。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了KDSR基因表达与心肌梗死相关，通过检测受试者中KDSR的表达，可以判断受试者是否患有心肌梗死、或者判断受试者是否存在患有心肌梗死的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种新的分子标记物-KDSR基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现心肌梗死的早期诊断，从而降低心肌梗死的死亡率。
附图说明
图1显示利用QPCR检测KDSR基因在心肌梗死患者和正常人中的表达差异；
图2显示利用免疫印迹检测KDSR蛋白在心肌梗死患者和正常人中的表达差异。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选心肌梗死患者和正常人中差异表达的基因
1、研究对象
选取6例医院治疗的心肌梗死住院患者为研究对象，其中3例男性，3例女性，平均年龄为56.00士8.75；对照组为7例健康人；以上每位受邀加入研究的患者及健康者均签署知情同意书。
2、样本的收集及储存
患者入院当天，行冠脉造影前采集8mL新鲜无菌动脉血至EDTA抗凝紫头管中。若非马上使用，可将样本放于4℃冰箱内保存2h。
3、Ficoll法分离PBMCs
以下步骤均在超净台内完成：
(1)生理盐水等体积稀释血样，等体积Ficoll液(人淋巴细胞分离液，购自天津市灏洋生物制品科技有限公司)加入50mL离心管内，倾斜45℃角离心管，使用无RNA酶枪头对稀释后的血样进行吸取，沿管壁缓慢加入到分离液面上方，Ficoll分离液上血液样本得以平铺，确保液体层面不被打乱，拧紧管盖。
(2)放入水平离心机，室温800g离心20min，且需缓慢升速。
(3)吸出并弃掉血清层，使用无RNA酶枪头沿管壁吸取血清层与分离液交界处富含PBMCs的白膜层细胞，置于新10mL无RNA酶EP管中，加入生理盐水至10mL，混匀，室温1700r/min离心15min。
(4)弃上清，可见管底沉淀，即为PBMCs，再向管内加入1mL生理盐水，将沉淀吹打混匀，转移至1.5mL无RNA酶EP管中，室温1500r/min离心l0min，再次洗涤细胞。
(5)弃上清，加入1mL Trizol吹打混匀，若非马上提取RNA，可放于-80℃冰箱保存。
4、提取PBMCs中的RNA
总RNA提取采用酚氯仿一步法，在冰上进行所有步骤操作，需佩戴无RNA酶口罩及手套，操作步骤如下：
(1)从-80℃冰箱中拿出溶解于Trizol的PBMCs，缓慢溶解。
(2)向每管中加入200μl的三氯甲烷，剧烈振荡15sec，4℃ 12000r/min离心15min。
(3)向新备好的1.5mL无酶EP管内吸取上层液相(切勿触及中层及下层)，再加入等体积500μl异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，4℃ 12000r/min离心15min。
(4)弃上清，加入1mL 75％乙醇(DEPC水配置)，颠倒混匀数次，洗涤沉淀，随后40C7500r/min离心10min。
(5)弃上清，在不碰到沉淀的前提下，尽量吸出管内液体，随后超净台内敞口静置15-20min，沉淀物干燥后，加入15-20μl 1/1000无RNA酶水溶解RNA。
(6)检测RNA纯度：酶标仪自检、调零后加入2μL溶解后的RNA样本进行检测。直接获取RNA浓度。1.8-2.2的OD260/OD280说明提取的RNA纯度较高，可以使用。
5、高通量转录组测序
(1)RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
(2)转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
(3)差异表达基因的检测
将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
6、结果
RNA-seq结果显示，与正常人群相比，心肌梗死患者血液中高表达的基因为347个，低表达的基因为254个，差异均具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2QPCR实验验证心肌梗死患者和正常人中差异表达的基因
1、研究对象：
筛选标准同实施例1，心肌梗死患者和正常人各35例。
2、血液中总RNA的提取
步骤同实施例1。
3、RT-PCR
(1)RT
RT反应体系(20μl)：
RT反应程序：
42℃ 15min
85℃ 5s
4℃ ---
(2)qPCR
PCR反应体系(20μl)：
PCR反应程序：
扩增程序：
阶段1 95℃ 10min
阶段2 95℃ 10s
60℃ 10s
重复40个循环
设置每个样本3复孔，内参为GAPDH。
(3)引物
KDSR基因和GAPDH基因的引物序列如下：
GAPDH基因
正向引物：5’-CCACATCGCTCAGACACCAT-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物：5’-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3’(SEQ ID NO.4)。
KDSR基因
正向引物：5’-GACTATAACCAAGTAGAGAA-3’(SEQ ID NO.1)；
反向引物：5’-TTGATGCTCATTAACCTT-3’(SEQ ID NO.2)。
(4)结果分析
Ct值为管内荧光强度由本底达到指数增长阶段时对应的循环数。
公式为样品Ct值-内参(GAPDH)Ct值＝△Ct；样品△Ct值-阴性对照△Ct＝△△Ct；样品mRNA相对值＝2-△△Ct。
(5)数据统计
所有数据以平均值±标准差(Mean±SD)显示。方差分析多组数据组间差异。P<0.05为有统计学差异。
4、结果
结果显示，与正常人平均水平相比，35例心肌梗死患者中有30例患者血液中KDSR基因的mRNA水平显著下降。统计结果如图1所示，与正常人相比，心肌梗死患者血液中KDSR基因的mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，结果RNA-seq实验。
实施例3免疫印迹实验验证心肌梗死患者和正常人中差异表达基因的表达产物
1、研究对象：同实施例2。
2、单核细胞分离
心肌梗死患者和正常人取静脉血10ml，注入盛肝素的无菌小瓶中，加盖后立即轻轻摇匀。用无菌吸管加入等体积的HBSS(NaCl 8.0g，Na2HPO40.132g，KH2PO40.06g，KCl0.4g，酚红1ml，NaHCO30.35g，D-葡萄糖1.0g，溶于1000ml双蒸水)，以降低红细胞的凝聚。吸取8ml淋巴细胞分层液置50ml离心管中，将稀释血液沿管壁缓慢加入，保持界面清楚，勿使两者相混，在20℃2000r/min离心30min，小心吸取分层液与血浆交接部位混浊的灰白色层，即淋巴细胞层，加入另一支离心管中，用5倍体积的HBSS洗涤2次，依次以2000r/min、1500r/min在室温下离心10min，以便去除大部分混杂的血小板，用10ml双蒸水与细胞团块混合1min，使残余红细胞裂解，然后迅速加入等量1.8％NaCl溶液，2000r/min离心，去上清，经细胞计数后用HBSS溶液调整细胞至1×106个/ml备用。
3、单核细胞总蛋白质提取
将上述实验所得细胞悬液(浓度为1×106个/ml)室温1 000r/min离心10min，弃上清后加入100μl裂解缓冲液，4℃震荡1h，用超声波仪破碎细胞，每次10s，共10次，于4℃12000r/min离心1h；取上清用Brandford法定量蛋白，分装成2.5μg/μl，-80℃冰箱保存备用。
4、Western blot检测
用常规方法即可。
5、统计学处理
将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将目的白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果显示，与正常人平均水平相比，35例心肌梗死患者中有30例患者血液中KDSR蛋白水平显著下降。统计结果如图2所示，与正常人相比，心肌梗死患者血液中KDSR蛋白水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> KDSR基因在制备心肌梗死诊断工具中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gactataacc aagtagagaa 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgatgctca ttaacctt 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccacatcgct cagacaccat 20
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcaacaata tccactttac cagagt 26

Claims (10)

1.检测KDSR基因表达的产品在制备诊断心肌梗死的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过反转录PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测KDSR基因表达水平以诊断心肌梗死的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用反转录PCR诊断心肌梗死的产品至少包括一对特异扩增KDSR基因的引物；所述用实时定量PCR诊断心肌梗死的产品至少包括一对特异扩增KDSR基因的引物；所述用免疫检测诊断心肌梗死的产品包括：与KDSR蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断心肌梗死的产品包括：与KDSR基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断心肌梗死的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与KDSR蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与KDSR基因的核酸序列杂交的探针。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断心肌梗死的产品至少包括的一对特异扩增KDSR基因的引物如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。
5.一种用于诊断心肌梗死的工具，其特征在于，所述工具能够通过检测样本中KDSR基因的表达来诊断心肌梗死。
6.根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。
7.根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测KDSR基因转录水平的针对KDSR基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的KDSR蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测KDSR基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括KDSR蛋白的特异性抗体；所述试纸包括用于检测KDSR基因转录水平的试剂；所述高通量测序平台包括用于检测KDSR基因转录水平的试剂。
8.根据权利要求7所述的工具，其特征在于，所述检测KDSR基因转录水平的试剂包括针对KDSR基因的引物和/或探针。
9.根据权利要求8所述的工具，其特特征在于，所述针对KDSR基因的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示。
10.根据权利要求5-9中任一项所述的工具，其特征在于，所述样本是血液。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020007270A1 (zh) * 2018-07-03 2020-01-09 北京泱深生物信息技术有限公司 无创诊断心肌梗死的标志物和诊断方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011035012A2 (en) * 2009-09-16 2011-03-24 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods and compositions for diagnosing heart failure
CN105349642A (zh) * 2015-10-30 2016-02-24 北京泱深生物信息技术有限公司 一种急性心肌梗死标志物及其应用
CN107312852A (zh) * 2017-07-19 2017-11-03 北京泱深生物信息技术有限公司 心肌梗死诊断标志物组合物
CN108165623A (zh) * 2018-01-02 2018-06-15 青岛大学 miRNA的应用、应用其的产品及检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011035012A2 (en) * 2009-09-16 2011-03-24 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods and compositions for diagnosing heart failure
CN105349642A (zh) * 2015-10-30 2016-02-24 北京泱深生物信息技术有限公司 一种急性心肌梗死标志物及其应用
CN107312852A (zh) * 2017-07-19 2017-11-03 北京泱深生物信息技术有限公司 心肌梗死诊断标志物组合物
CN108165623A (zh) * 2018-01-02 2018-06-15 青岛大学 miRNA的应用、应用其的产品及检测方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020007270A1 (zh) * 2018-07-03 2020-01-09 北京泱深生物信息技术有限公司 无创诊断心肌梗死的标志物和诊断方法
US11718880B2 (en) 2018-07-03 2023-08-08 Beijing Medintell Biomed Co., Ltd Marker and diagnosis method for noninvasive diagnosis of myocardial infarction

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