CN111826466A - 乙型肝炎感染患者或携带者外泌体miRNA分子标志物组合及筛查试剂盒 - Google Patents

乙型肝炎感染患者或携带者外泌体miRNA分子标志物组合及筛查试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了乙型肝炎感染患者或携带者外泌体miRNA分子标志物组合及筛查试剂盒，提取中国汉族乙型肝炎患者的血浆外泌体，筛选出乙型肝炎相关标志物hsa‑miR‑150‑5p、hsa‑miR‑1246、hsa‑miR‑5787以及hsa‑miR‑8069，为乙型肝炎患者、携带者和健康者提供早期筛查诊断和监测预后复发的标志物，从而预测乙型肝炎发生率，为治疗乙型肝炎患者和携带者提供新靶标。

Description

乙型肝炎感染患者或携带者外泌体miRNA分子标志物组合及 筛查试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及乙型肝炎感染患者或携带者外泌体miRNA分子标志物组合及筛查试剂盒。
背景技术
慢性乙型肝炎因乙型肝炎病毒(HBV)而引起的，乙型肝炎患者和HBV携带者是本病的主要传染源，主要传播路径可通过母婴、血和血液制品、破损的皮肤黏膜及性接触传播。
miRNA是一类非编码的小RNA分子，可通过转录抑制或诱导信使RNA的降解负向调节基因表达。很多报道表明，miRNA稳定存在于血浆、血清、唾液、尿液、精液等体液中，miRNA已成为各种疾病新颖、无创的监测指标，如肿瘤、心力衰竭、肝脏损伤等。
Xian研究表明，乙型肝炎患者以及携带者，血浆/血清的miRNA存在统计学差异，具体为miR-144-5p、hsa-miR-195-3p、miR-451a和miR-920。Zhang等也发现，与健康人群相比，慢性乙肝患者血清中有34种miRNA的表达发生改变，其中12种表达上调(其中包括了miR-122、miR-572、miR-575和miR-638)，22种表达下调(其中包括了miR-744)。其中，慢性乙肝患者中miR-122、miR-572和miR-638的表达水平明显高于非酒精性脂肪肝患者的表达水平，而miR-744的表达水平则明显低于非酒精性脂肪肝患者的表达水平。进一步统计学分析证实血清中miR-122、miR-572、miR-575、miR-638和miR-744用特异性地区分慢性乙肝、非酒精性脂肪肝及健康人群。Chen等进一步发现四个miRNA：let-7c、miR-23b、miR-122和miR-150在隐匿性HBV感染者血清中表达量明显高于健康人血清，可用于区分隐匿性HBV感染者和健康人群，从而为隐匿性HBV感染者提供敏感而精确的检测用生物标志物。此外，最新的研究还证实，血清miRNA表达谱还可以用于区分慢性乙型肝炎的不同中医证型，包括肝胆湿热证和肝肾阴虚证，其中肝胆湿热型乙肝患者血清miR-583和miR-663的表达水平会明显高于肝肾阴虚型乙肝患者。
外泌体是一类介导体内生物信息分子传递的纳米级小囊泡，外泌体能在体内运载和传递生物信息分子，在免疫调节、心血管疾病和肿瘤等生理病理过程中发挥着重要的功能。外泌体可由体内各种活细胞分泌，体液中含量很高，每微升血清中外泌体的数量可达3×106，其携带的RNA、蛋白质和脂类等生物信息分子会随着疾病进展转归发生变化，是颇具临床诊断价值的循环标志物。而纯度高的、干扰少的外泌体及其内容物对于后续的临床诊断有着重要的实用价值。新型循环生物标志物外泌体(exosomes)由于能够在循环系统中传递和保护RNA逐渐成为了近几年的研究热点。有报道提出：如肠上皮细胞来源外泌体携带的MHC-Ⅱ类分子可经树突状细胞激活T细胞，在黏膜表面发挥免疫监督作用等。外泌体作为大分子信息物质的载体，在机体信号转导过程中发挥着重要的生理作用。而且其稳定的生物学特性、内容物多样性、非侵入性及检测迅速，使外泌体有望成为应用前景广阔的新型循环生物标志物，能够辅助诊断临床疾病。
综上所述，迫切需要一类准确、特异以及灵敏的miRNA，能够在乙型肝炎病毒(HBV)患者、携带者和健康者人群早期筛查、诊断和监测预后复发中发挥作用。
发明内容
本发明的首要目的在于提供乙型肝炎感染患者或携带者外泌体miRNA分子标志物组合及筛查试剂盒。
为达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明第一方面，提供了hsa-miR-150-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-5787以及hsa-miR-8069作为乙型肝炎的标志物的应用。
发明人借助以上标志物，发现在健康对照人群以及乙型肝炎病毒感染者中，多个标志物的表达水平存在显著的表达差异。因此，本发明选用以上标志物作为乙型肝炎病毒感染的标志物。
本发明第二方面，提供了定量检测标志物表达量的试剂在制备诊断或预后检测乙型肝炎的试剂中的应用，所述标志物如前面所示。上述标志物在乙型肝炎感染者与健康对照组人群中存在差异表达，因此，可以定量检测上述乙型肝炎标志物来实现对乙型肝炎感染者的诊断或对其预后的评估。
根据本发明的实施例，所述的诊断或预后检测的步骤包括：
1)确定受试者标志物的表达量；所述标志物如前面所示；
2)根据受试者和对照组的表达量差异，预测受试者是否感染乙型肝炎。上述标志物在乙型肝炎感染者与健康对照组人群中存在差异表达，因此，可以定量检测上述乙型肝炎标志物来实现对乙型肝炎的诊断或对其预后的评估。
根据本发明的实施例，若受试者hsa-miR-150-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-5787以及hsa-miR-8069对照组表达量有显著差异，说明受试者可能感染乙型肝炎病毒；
若受试者标志物表达量和对照组无显著差异，说明受试者可能未感染乙型肝炎，所述标志物如前面所述。根据定量检测上述标志物来实现对乙型肝炎的诊断或对其预后的评估，可以准确获知受试者乙型肝炎的情况。
根据本发明的实施例，所述定量检测表达量的试剂包括基因和/或蛋白水平检测的试剂。所述试剂不仅通过PCR定量检测样本中标志物的核酸片段的含量，或通过酶联免疫分析、放射免疫分析、Western印迹法、蛋白芯片法等定量检测样本中标志物的蛋白质的表达量。
本发明第三方面，提供了一种用于乙型肝炎预后预测的试剂盒，所述试剂盒中含有定量检测标志物表达量的试剂，所述标志物如前面所述。利用本发明试剂盒能够对受试者样本中的标志物实现定量检测，检测结果在与对照组进行比较后，可以准确地用于诊断乙型肝炎，或评估乙型肝炎的预后，或筛选乙型肝炎药物。
根据本发明的实施例，所述预后预测的步骤包括：
1)确定受试者标志物的表达量；所述标志物如前面所示；
2)根据受试者和对照组的表达量差异，预测受试者是否患有乙型肝炎。根据预后预测步骤，可以定量检测标志物表达量，从而判断受试者是否患有乙型肝炎。
根据本发明的实施例，步骤2)若受试者hsa-miR-150-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-5787以及hsa-miR-8069表达量与对照组表达量有显著差异，说明受试者可能感染乙型肝炎病毒；
若受试者标志物表达量和对照组无显著差异，说明受试者未感染乙型肝炎病毒。
本发明第四方面，提供了一种用于乙型肝炎病毒感染预后预测的方法，包括以下步骤：
1)确定受试者标志物的表达量；所述标志物如前面所示；
2)根据受试者和对照组的表达量差异，预测受试者是否感染乙型肝炎病毒；
所述方法不适于疾病诊断和治疗。
其中，预后预测是指受试者感染乙型肝炎病毒的风险，或者指受试者的预后；或者指候选药物对乙型肝炎的效用。
本发明第五方面，提供了一种计算机可读存储介质，存储有计算机可执行指令，用于执行前面所述乙型肝炎预后预测的方法。
本发明第六方面，提供了一种评价系统，包括检测装置和比对装置；
所述检测装置，用于确定受试者标志物的表达量；所述标志物如前面所示；
所述比对装置，用于根据受试者和对照组的表达量差异，预测受试者是否感染乙型肝炎病毒。
本发明第七方面，hsa-miR-150-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-5787以及hsa-miR-8069，可以作为受试者可能感染乙型肝炎病毒的分子标志物。
根据本发明的实施例，hsa-miR-1246可以区分乙型肝炎患者或乙型肝炎病毒携带者。
根据本发明的实施例，提供了前面所述标志物作为筛选乙型肝炎药物的应用。
本发明第八方面，提供了一种筛选药物的方法，将候选药物给药乙型肝炎动物，检测给药前后动物标志物的表达量，标志物如前面所述；
其中，给药后hsa-miR-150-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-5787以及hsa-miR-8069表达量与给药前表达量有显著差异，则是候选药物为目标药物的指示。
为了解决上述存在的问题本发明利用中国汉族人群乙型肝炎病毒(HBV)患者、携带者和健康者血浆中外泌体的RNA，先制备荧光标记探针、再进行miRNA芯片杂交并对其研究，与对照组比较，筛选出差异表达的miRNA作为敏感标志物，用于乙型肝炎病毒(HBV)患者、携带者和健康者人群早期筛查、诊断和监测预后复发。
本发明的有益效果是：
本发明筛选并验证了hsa-miR-150-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-5787以及hsa-miR-8069这几种标志物为乙型肝炎病毒(HBV)患者、携带者和健康者人群早期筛查诊断和监测预后复发的生物标志物，从而预测乙型肝炎发生的可能性，为临床治疗乙型肝炎患者和携带者提供新靶标、新途径。
附图说明
图1是本发明用于评估系统的组成；其中，核酸分离装置100，测序装置110，比对装置120。
图2是技术路线图。
图3是血浆外泌体电镜图和粒径图。
图4是四个血浆外泌体的分子标志物表达水平，A-D分别是miR-150-5p、miR-1246、miR-5787和miR-8069的相对表达量，其中HC-exosome、CHB-exosome、ASC-exosome分别是健康对照组-外泌体、慢性乙肝组-外泌体、ASC为携带者组-外泌体，下同。
图5是单个分子标志物的ROC曲线图(CHB VS HC)，
图6是单个分子标志物的ROC曲线图(ASC VS HC)。
图7是两个分子标志物联合ROC曲线图(CHB VS HC)，A-E分别是miR-1246和miR-150-5p联合，miR-1246和miR-5787联合，miR-150-5p和miR-5787联合、miR-5787和miR-8069联合、miR-150-5p和miR-8069联合。
图8是两个分子标志物联合ROC曲线图(ASC VS HC)，A-E分别是miR-1246和miR-150-5p联合，miR-1246和miR-5787联合，miR-150-5p和miR-5787联合、miR-5787和miR-8069联合、miR-150-5p和miR-8069联合。
图9是三至四个分子标志物联合ROC曲线图(CHB VS HC)，A-C分别是miR-1246、miR-150-5p和miR-5787联合，miR-150-5p、miR-5787和miR-8069联合，miR-1246、miR-150-5p、miR-5787和miR-8069四者联合。
图10是三至四个分子标志物联合ROC曲线图(ASC VS HC)，A-C分别是miR-1246、miR-150-5p和miR-5787联合，miR-150-5p、miR-5787和miR-8069联合，miR-1246、miR-150-5p、miR-5787和miR-8069四者联合。
具体实施方式
实施例1
1)中国汉族人群乙型肝炎病毒(HBV)临床病例资料信息采集
经医院伦理委员会同意，随机选取2016年1月～2017年12月期间在申报单位附属医院乙型肝炎病毒(HBV)患者共50-80例作为研究对象，均为汉族人群。同时感染人类免疫缺陷病毒或丙型肝炎病毒(HCV)、自身免疫性肝炎、药物性损伤或酒精中毒的参与者被排除在外。诊断为肝硬化或肝癌的患者也被排除在外。
乙型肝炎的血浆样本中外泌体的提取：
将血浆3000g 15min 4℃离心后静置；吸出400ul上清至新的1.5ml EP管中；在EP管中加入100ul exo quick试剂，充分涡旋混匀(每250ul血浆加exo quick试剂63ul)；4℃静置30min，1500g 30min 4℃离心；离心后立刻取出静置，除上清得沉淀；在沉淀中加入200ul DEPC水重悬，涡旋振荡至沉淀完全溶解，得外泌体。
2)外泌体中提取RNA以及RNA质量检测
根据上述步骤已经制备好的外泌体，使用TRIzol法从中提取RNA，并用RNaseyMini Kit(QIAGEN)纯化。使用NanoDrop ND-1000测量纯化后的RNA浓度，电泳检测RNA完整性。
3)制备荧光标记探针与芯片杂交
RNA标记和杂交根据Exiqon提供的方法进行。
将通过质检的RNA，用miRCURYTM Array Power Labeling kit(Cat#208032-A,Exiqon)对miRNA进行标记。具体步骤如下：a.1微克的RNA加水至2μL，再加入1μL的CIP缓冲液and CIP酶(Exiqon)，混合后于37℃静置30min。b.再置于95℃下5min终止反应，然后加入3μL的labeling缓冲液、1.5μL的fluorescent label(Hy3TM)、2.0μL的DMSO以及2.0μL的labeling enzyme，在16℃下反应1h。c.最后置于65℃下15min终止反应。
标记完成后，将样品与miRCURY TM LNA Array(v.19.0)(Exiqon)芯片杂交，根据Exiqon的实验方法进行。
a.25μL的样品与25μL的杂交缓冲液混合，95℃下变性2min，然后置于冰上2min。b.与芯片在56℃下杂交16-20h，杂交系统为Nimblegen Systems，Inc.，Madison，WI，USA。c.杂交完成后，使用Wash缓冲液kit(Exiqon)清洗芯片。
然后使用Axon GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片。
4)图像采集和数据分析
5)筛选移植前后差异表达miRNA
初步选取出具有高表达相对量以及低表达相对量的miRNA，然后再采用荧光定量PCR动态观察，观察乙型肝炎患者、携带者与对照组健康人群具有显著表达差异的miRNA，绘制敏感标志物的变化曲线。确定具有差异表达的miRNA：hsa-miR-150-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-5787以及hsa-miR-8069。
6)临床验证，动态监测。
实施例2
一种用于乙型肝炎诊断或预后预测的试剂盒，该试剂盒中含有定量检测hsa-miR-150-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-5787以及hsa-miR-8069表达量的试剂。
实施例3
一种用于乙型肝炎诊断或预后预测的方法，包括以下步骤：
1)确定受试者标志物的表达量；所述标志物如hsa-miR-150-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-5787以及hsa-miR-8069；
2)根据受试者和对照组的表达量差异，预测受试者是否感染乙型肝炎病毒；
所述方法不适于疾病诊断和治疗。
实施例4
一种计算机可读存储介质，存储有计算机可执行指令，用于执行前面所述乙型肝炎预后预测的方法：
1)确定受试者标志物的表达量；所述标志物如hsa-miR-150-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-5787以及hsa-miR-8069；
2)根据受试者和对照组的表达量差异，预测受试者是否感染乙型肝炎病毒。
实施例5
一种评价乙型肝炎的系统，包括检测装置和比对装置。图1是本发明用于评估系统的组成示意图。核酸分离装置100，用于从受试者分离核酸样本；检测装置110，用于确定受试者标志物的表达量；比对装置120，用于根据受试者和对照组的表达量差异，预测受试者是否感染乙型肝炎病毒。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.hsa-miR-150-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-5787以及hsa-miR-8069作为乙型肝炎的标志物的应用。
2.定量检测标志物表达量的试剂在制备诊断或预后检测乙型肝炎的试剂盒中的应用，所述标志物如权利要求1所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的诊断或预后检测的步骤包括：
1)确定受试者标志物的表达量；所述标志物如权利要求1所示；
2)根据受试者和对照组的表达量差异，预测受试者是否患有乙型肝炎病毒感染。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，若受试者标志物表达量与对照组表达量有显著差异，说明受试者可能患有乙型肝炎或是乙型肝炎病毒携带者；
若受试者标志物表达量和对照组无显著差异，说明受试者可能未感染乙型肝炎病毒；所述标志物如权利要求1所示。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述定量检测表达量的试剂包括基因和/或蛋白水平检测的试剂。
6.一种用于乙型肝炎诊断或预后预测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有定量检测标志物表达量的试剂，所述标志物如权利要求1所述。
7.一种用于乙型肝炎诊断或预后预测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)确定受试者标志物的表达量；所述标志物如权利要求1所示；
2)根据受试者和对照组的表达量差异，预测受试者是否感染乙型肝炎病毒；
所述方法不适于疾病诊断和治疗。
8.一种计算机可读存储介质，其特征在于，存储有计算机可执行指令，用于执行权利要求7所述乙型肝炎预后预测的方法。
9.一种评价乙型肝炎感染的评价系统，其特征在于，包括检测装置和比对装置；
所述检测装置，用于确定受试者标志物的表达量；所述标志物如权利要求1所示；
所述比对装置，用于根据受试者和对照组的表达量差异，预测受试者是否感染乙型肝炎病毒。
10.一种筛选药物的方法，其特征在于，将候选药物给药乙型肝炎动物，检测给药前后动物标志物的表达量，标志物如权利要求1所述；
其中，给药后标志物表达量与给药前表达量有显著差异则是候选药物为目标药物的指示。
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