CN114196747A - 一种与代谢相关脂肪性肝病发生发展关联的生物标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种与代谢相关脂肪性肝病发生发展关联的生物标志物。本发明首次发现：与未患代谢相关脂肪性肝病的病人或健康人相比，miR‑552‑3p和/或miR‑552‑5p在代谢相关脂肪性肝病患者的肝内和血清中都显著降低，且其表达量与肝内脂质蓄积、炎症、纤维化和肝损伤程度呈负相关。这提示miR‑552‑3p/5p可作为生物标志物应用于代谢相关脂肪性肝病的诊断。本发明还公开了一种代谢相关脂肪性肝病的诊断方法，该诊断方法可以通过检测血液中miR‑552‑3p/5p来实现对代谢相关脂肪性肝病的无创诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域。具体地，涉及一种与代谢相关脂肪性肝病发生发展关联的生物标志物。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指排除过量酒精、病毒、药物等一系列明确的肝损因素而导致的肝细胞内脂质过度沉积为特征的临床病理综合征，其主要包含四个病理过程。分别是单纯性脂肪变性(simple steatosis，SS)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纤维化(Fibrosis)及肝硬化(Cirrhosis)，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。最近，由多名教授代表的国际脂肪肝专家小组于2020年5月发布声明，达成了以“代谢相关脂肪性肝病(Metabolic associated fatty liver disease，MAFLD)”取代现有命名“非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的共识。
目前，肝活检依旧是临床上诊断和分型这类疾病进程的金标准，但这种侵入式检查存在一定风险，患者依从性差。因此，开发有效的非侵入式诊断方法具有重要的科学意义和临床应用价值。
microRNA(miRNA)是机体内源存在的一类长度在22个碱基左右的非编码单链RNA，它们对基因广泛而精细的调控决定了其在机体包括增殖和分化、生长和死亡、发育、代谢等众多生命过程中的重要作用。自从2002年发现了第一个miRNA(miR-122)与肿瘤的密切关系以来，越来越多的miRNA被证实在许多疾病过程中发生了量的改变，此外它们还参与调控了这些疾病的发生发展。因此，针对miRNA的其中一个应用研究就是发现可用于疾病诊断的miRNA类生物标记物。
因此，本领域迫切需要开发一种用于高效诊断代谢相关脂肪性肝病，也就是非酒精性脂肪性肝病的miRNA类生物标记物及其诊断方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种用于高效诊断代谢相关脂肪性肝病，也就是非酒精性脂肪性肝病的miRNA类生物标记物及其诊断方法。
具体地，本发明提供了一类与MAFLD/NAFLD发生发展相关的生物标志物，miR-552-3p及miR-552-5p。与未患MAFLD/NAFLD病人或健康人相比，miR-552-3p和miR-552-5p在MAFLD/NAFLD患者的肝内和血清中都显著降低，且其表达量与肝内脂质蓄积、炎症、纤维化和肝损伤程度等指标呈负相关。
本发明的第一方面，提供了一种miRNA的检测试剂的用途，所述的miRNA为miRNA552簇的微小RNA，所述miRNA552簇的微小RNA是miR-552-3p和/或miR-522-5p，或其前体序列，用于制备诊断代谢相关脂肪性肝病的试剂盒。
在另一优选例中，所述的代谢相关脂肪性肝病选自下组：排除酒精、病毒和药物等明确损肝因素所致的脂肪肝、肝气球样变、肝点灶样坏死、脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌，或其组合。
在另一优选例中，所述的检测试剂包括：用于检测miR-552-3p和/或miR-552-5p的特异性引物、探针、芯片、试剂盒或核酸膜条。
在另一优选例中，所述的检测是定量检测。
在另一优选例中，所述的检测是指对获自有所需要的对象的样品中的miR-552-3p和/或miR-552-5p和/或pri-miR552和/或pre-miR552基因的表达水平的检测。
在另一优选例中，所述的样品包括：血液样品、肝活检组织样品，或其组合。
在另一优选例中，所述的检测方法包括：测序、核酸杂交、核酸扩增的方法，或其组合。
在另一优选例中，所述的核酸扩增方法选自下组：聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、转录介导的扩增、连接酶链式反应、链置换扩增、基于核酸序列的扩增，或其组合。
在另一优选例中，所述的检测试剂包括：特异性结合针对miR-552-3p和/或miR-552-5p和/或pri-miR552和/或pre-miR552基因的特异性引物对、探针。
在另一优选例中，所述的探针选自下组：SYBR Green、Taqman探针、分子信标、双杂交探针、复合探针，或其组合。
在另一优选例中，所述的miR-552-3p是hsa-miR-552-3p，其序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中，所述的miR-552-5p为hsa-miR-552-5p，其序列如SEQ ID NO:2所示。
在另一个优选例中，所述的pri-miR-552的序列至少包含pre-miR-552的碱基序列，以及pre-miR-552在基因组所在位置的前后各200bp的碱基序列。
在另一个优选例中，所述的pre-miR-552的序列如SEQ ID NO:3所示。
在本发明的第二方面，提供了一种代谢相关脂肪性肝病的诊断试剂盒，所述试剂盒中包括：
(a)miRNA552簇的微小RNA的检测试剂；和
(b)任选的代谢相关脂肪性肝病的其他辅助诊断试剂。
在另一优选例中，所述的代谢相关脂肪性肝病的其他辅助诊断试剂包括：血糖、血脂(甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇)、尿酸、尿素、天冬氨酸氨基转换酶、丙氨酸氨基转换酶、碱性磷酸酶、总胆红素、结合胆红素、肌酐、肌酸磷酸激酶、或γ-谷氨酰转肽酶。
在另一优选例中，所述诊断试剂盒中还包括：RNA提取试剂和材料、RNA反转录试剂和材料、定量PCR反应试剂，或其组合。
在另一优选例中，所述诊断试剂盒中还含有一参照样品，所述参照样品为获自正常对象(未患有代谢性脂肪性肝病的对象)的样品。
在另一优选例中，所述的参照样品为具有与获自正常对象(未患有代谢性脂肪性肝病的对象)的样品中的miRNA-552-3p和/或miRNA-552-5p或其前体序列的基因表达水平相当的miRNA-552-3p和/或miRNA-552-5p或其前体序列的基因表达水平。
在另一优选例中，所述诊断试剂盒中还含有一说明书，所述说明书中记载了：当待检测样品中的miRNA-552-3p和/或miRNA-552-5p或其前体序列的基因表达水平E1显著低于参照样品中的相应基因表达水平E0时，则该对象被诊断为代谢相关脂肪性肝病患者。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1示出了NAFLD患者与非NAFLD患者肝脏内miR-552-3p(A)和miR-552-5p(B)含量差异。Student’s t test方法对数据之间的差异性进行计算。**p<0.01，***p<0.001。
图2示出了NAFLD患者肝脏内miR-552-3p(A)和miR-552-5p(B)含量与肝内脂质蓄积的相关性。
图3示出了NAFLD患者肝脏内miR-552-3p(A)和miR-552-5p(B)含量与肝内炎症的相关性。
图4示出了NAFLD患者肝脏内miR-552-3p(A)和miR-552-5p(B)含量与肝内纤维化的相关性。
图5示出了NAFLD患者肝脏内miR-552-3p(A-B)和miR-552-5p(C-D)含量与气球样变和点灶样坏死的相关性。
图6示出了NAFLD患者肝脏内miR-552-3p(A-C)和miR-552-5p(B)含量与BMI、ALT和AST等NAFLD其他指标的相关性。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次意外地发现miR-552-3p和/或miR-552-5p在代谢相关脂肪性肝病，也就是非酒精性脂肪性肝病诊断中的重要作用。具体地，本发明选择在NAFLD肝组织内异常表达的miR-552-3p及miR-552-5p作为候选分子标志物，采用荧光定量PCR技术分析NAFLD患者和非NAFLD患者肝组织内，NAFLD患者和健康人群血清中这2个miRNA的含量，比较血清中这两个miRNA含量与它们在肝脏内表达水平的对应性，并比较它们与NAFLD疾病进程的相关性，包括脂质蓄积、炎症、纤维化等，以评价血清中miR-552-3p及miR-552-5p在NAFLD诊断和病情监测中的应用价值。实验结果表明，与未患非酒精性脂肪性肝病的病人或健康人相比，miR-552-3p和/或miR-552-5p在非酒精性脂肪性肝病的患者的肝内和血清中都显著降低，且其表达量与肝内脂质蓄积、炎症、纤维化和肝损伤程度呈负相关。在此基础上，发明人完成了本发明。
术语
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文使用的，术语“宿主”、“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类，如牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊、长颈鹿、鹿、骆驼、玲羊、大鼠、小鼠、野兔和家兔。
miRNA及其前体
微小RNA(microRNA，简称miRNA)是近年来在线虫，果蝇和植物，哺乳动物等真核生物中发现的一种内源性的长度为22个核苷酸左右的非编码单链小RNA。它在表达上具有组织和时间的特异性，通过与靶mRNA的碱基互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制，是调节其他功能基因表达的重要调控分子。越来越多的证据表明miRNA虽然微小，但它通过与靶mRNA形成完全或者不完全互不配对从而对生物体的各种生命过程有着至关重要的作用。同时自从2002年发现了第一个miRNA(miR-122)与肿瘤的密切关系以来，越来越多的miRNAs被证实在许多疾病过程中发生了量的改变。
本发明提供了一类在NAFLD中差异表达的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一类RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。miRNA通常可被Northern印迹检测到。miRNA可从初级转录物(Primary miRNA，Pri-miRNA)到前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来。
本发明所述的miRNA是指miRNA552簇的微小RNA，所述miRNA552簇的微小RNA选自下组：miR-552-3p为hsa-miR-552-3p，其序列如SEQ ID NO:1所示。所述miR-552-5p为hsa-miR-552-5p，其序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的优点主要包括：
(1)本发明提供了一组与MAFLF/NAFLD相关的miRNA标志物，其表达量与肝内脂质蓄积、炎症、纤维化和肝损伤(气球样变和电灶样坏死)呈负相关。
(2)本发明方法具有操作简单、高灵敏度和高特异性的优点，可以作为新的MAFLD/NAFLD标志物应用于MAFLD/NAFLD的无创诊断和病情监测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
在本发明中，如果没有特殊说明，实施例中所用的材料均为市售产品，本发明中所使用的方法均为本领域中的常规方法。
实施例1本发明涉及的hsa-microRNA-552-3p和hsa-microRNA-552-5p在NAFLD患者与非NAFLD患者肝脏内含量检测
1.1实验对象
收集2018年4月至2020年7月在上海交通大学医学院附属瑞金医院就诊的12例NAFLD患者和6例非NAFLD患者(外科手术患者)。对于NAFLD患者，男7例，女5例，年龄41.25(24-56)岁，均经病理确诊为NAFLD，且未经治疗。非NAFLD患者作为对照，男4例，女2例，年龄58(49-67)岁，年龄、性别比例与病例研究对象基本相匹配。所有研究对象均签署知情同意书。
1.2实验材料和方法
(1)总RNA抽提
a.从-80℃冰箱取出临床样本，转移至预先装有1mL Trizol的EP管内，放入2-3颗灭菌并烘干的钢珠。将EP管放置于组织研磨机内，60H运行30s，进行两次研磨。转移组织匀浆转移至新的EP管内。b.向EP管内加入200μL氯仿，上下剧烈震荡混匀，室温静置10分钟。将EP管置于离心机内，4℃，12000rpm离心15分钟。c.转移上层透明液体至新的EP管中，加入600μL异丙醇，上下颠倒混匀。室温静置10分钟。将EP管置于离心机内，4℃，12000rpm离心15分钟。观察管底有白色沉淀。d.弃去上清，加入800μL75％乙醇溶液，上下颠倒，使沉淀重悬。于离心机内，4℃，12000rpm离心15分钟。e.弃去上清，室温挥发20分钟。向EP管中加入40μLDEPC水，溶解沉淀。f.取2μLRNA溶液以及DEPC水加入到take3检测板上，用酶标仪检测RNA溶度，并记录。
(2)miRNA反转成cDNA
a.根据样品中RNA浓度，稀释样品浓度值70ng/μL，共10μL。b.配制反转工作液两份，每份工作液包括：0.075μLdNTP mix(100mM)，0.75μL10xRT Buffer，0.5μLMultiscribeRT enzyme(50U/μL)，0.095μLRNase Inhibitor(20U/μL)。分别加入miR-552-3p或miR-552-5p以及U6探针各1.5μL。将配制好的工作液分别加入PCR管中。c.向PCR管中加入4.58μL稀释好的RNA样本，震荡混匀。短暂离心，使溶液在PCR管底部。d.将PCR管置于PCR仪中，条件设定如下：16℃孵育30分钟，42℃孵育30分钟，85℃孵育5分钟，4℃恒温孵育。e.向PCR管中加入40μL DEPC水，混匀待用。
(3)RT-PCR
a.配制RT-PCR反应体系，每份20μL反应体系内包含：10μL TaqMan UniversalMaster Mix II、1μL primer、9μL稀释后反转样本，加入PCR板内。b.贴好封口膜，放于7500Fast Real-Time PCR仪中进行实验。反应条件为95℃孵育10分钟，95℃退火15秒，60℃延伸60秒，从第二步开始循环40次。根据扩增曲线的Ct值进行实验结果计算。
1.3实验结果：
结果如图1A和B所示，与非NAFLD患者相比，NAFLD患者肝内miR-552-3p和miR-552-5p显著下降。
实施例2本发明涉及的hsa-microRNA-552-3p和hsa-microRNA-552-5p在肝脏内的含量与NAFLD病理特征的相关性分析
2.1实验对象
与实施例1的1.1部分相同。
2.2实验材料和方法
miRNA的检测方法如实施例1的1.2部分所述。
2.3实验结果：
结果如图2-6所示，miR-552-3p与肝内炎症、肝损伤(包括气球样变和点灶样坏死)和血清中的ALT呈现显著的负相关，与肝脂肪变性、纤维化和血清中的BMI与AST呈现一定的负相关；miR-552-5p与肝内炎症、纤维化和肝损伤(包括气球样变和点灶样坏死)呈现显著的负相关，与肝脂肪变性和血清中的BMI、ALT与AST呈现一定的负相关。这表示miR-552-3p和miR-552-5p与NAFLD的多种病理状态呈现负相关的关系。
综上所述，miR-552-3p和miR-552-5p在NAFLD肝脏和血清中表达水平显著下调，与NAFLD的肝内脂质蓄积、炎症、纤维化和肝损伤呈负相关，有望成为新型的NAFLD分子标志物应用于NAFLD的诊断和病情监测，具有潜在的临床应用价值。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海药物研究所
上海交通大学医学院附属瑞金医院
<120> 一种与代谢相关脂肪性肝病发生发展关联的生物标志物
<130> P2020-1791
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
aacaggugac ugguuagaca a 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
guuuaaccuu uugccuguug g 21
<210> 3
<211> 96
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
aaccauucaa auauaccaca guuuguuuaa ccuuuugccu guugguugaa gaugccuuuc 60
aacaggugac ugguuagaca aacuguggua uauaca 96
Claims (10)
1.一种miRNA的检测试剂的用途，所述的miRNA为miRNA552簇的微小RNA，所述miRNA552簇的微小RNA是miR-552-3p和/或miR-522-5p，或其前体序列，其特征在于，用于制备诊断代谢相关脂肪性肝病的试剂盒。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的代谢相关脂肪性肝病选自下组：排除酒精、病毒和药物等明确损肝因素所致的脂肪肝、肝气球样变、肝点灶样坏死、脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌，或其组合。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测是指对获自有所需要的对象的样品中的miR-552-3p和/或miR-552-5p和/或pri-miR552和/或pre-miR552基因的表达水平的检测。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的样品包括：血液样品、肝活检组织样品，或其组合。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的miR-552-3p是hsa-miR-552-3p，其序列如SEQ ID NO:1所示。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的miR-552-5p是hsa-miR-552-5p，其序列如SEQ ID NO:2所示。
7.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的pre-miR-552的序列如SEQ ID NO:3所示。
8.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的pri-miR-552的序列至少包含pre-miR-552的碱基序列，以及pre-miR-552在基因组所在位置的前后各200bp的碱基序列。
9.一种代谢相关脂肪性肝病的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
(a)miRNA552簇的微小RNA的检测试剂；和
(b)任选的代谢相关脂肪性肝病的其他辅助诊断试剂。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的代谢相关脂肪性肝病的其他辅助诊断试剂包括：血糖、血脂(甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇)、尿酸、尿素、天冬氨酸氨基转换酶、丙氨酸氨基转换酶、碱性磷酸酶、总胆红素、结合胆红素、肌酐、肌酸磷酸激酶、或γ-谷氨酰转肽酶。
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