KR20160145093A

KR20160145093A - 이식거부 및 면억억제 요법의 내성을 진단하기 위한 마이크로 리보핵산(miRNA)의 용도

Info

Publication number: KR20160145093A
Application number: KR1020167031381A
Authority: KR
Inventors: 아브라함 샤케드; 바오-리 창; 브렌단 키팅; 토우미 게토우체
Original assignee: 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
Priority date: 2014-04-10
Filing date: 2015-04-10
Publication date: 2016-12-19
Also published as: WO2015157678A2; WO2015157678A3; KR102505827B1; US20170032100A1; CA2945538A1; EP3129504A2; US20190313957A1; EP3129504A4; BR112016023634A2

Abstract

본 발명은 일부 마이크로RNA(miRNA)의 발현 수준을 이식 수용자에서 이식 결과를 예측하기 위한 진단학적 특징으로서 사용할 수 있다는 발견에 관한 것이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 다양한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 이식 피실험자를 급성 세포성 거부(ACR)와 같은 급성 거부에 대해서 진단하는 방법, 피실험자의 ACR이 있거나 ACR을 나타낼 위험을 예측하는 방법, 및 피실험자에서 표준 범위로부터 면역억제 요법(IST) 투여량 최소화의 성공 또는 실패 가능성을 평가하는 방법에 관한 것이다.

Description

이식거부 및 면억억제 요법의 내성을 진단하기 위한 마이크로 리보핵산(miRNA)의 용도{USE OF MICRO-RIBONUCLEIC ACID(MIRNA) TO DIAGNOSE TRANSPLANT REJECTION AND TOLERANCE OF IMMUNOSUPPRESSION THERAPY}

관련 출원의 상호참조

본 출원은 2014년 4월 10일자로 출원된 미국 가 출원 제 61/977,980 호에 대한 우선권과 이점을 청구하며, 상기 특허는 본 발명에 내용 전체가 참고로 인용된다.

연방 후원 연구 또는 개발에 관한 진술

본 발명은 국립 알러지 및 감염병 연구소(NIAID)에 의해 부여된 ClinicalTrials.gov 식별자: NCT00135694를 갖는 간 이식 환자에서의 면역계 억제 약물의 점진적인 철회(AWISH)에 사용되는 허가 5U01A1063589-0551 및 5U01A1063589-05 및 ITN00111-00sc 하에서 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.

고형 기관 이식은 말기 기관 질병을 갖는 환자에게 구명 치료법을 제공한다. 2010년에, 미국에서 신장 16,899건, 간 6291건, 심장 2333건 및 폐 1770건의 이식을 포함하여 총 28,664건의 이식이 수행되었다(문헌[Engels et al., 2011, JAMA, 306(17):1891-1901]). 면역억제 요법 및 이식 수술 전- 및 후 환자 치료에서 현저한 개선이 이루어졌지만, 이식편 거부는 여전히 이식받은 개인의 대략 60%에 영향을 미치며 따라서 상기 이식편 거부는 이식 후 첫해 내에 이식받은 개인의 40% 이하에서 이식편 거부의 관찰과 함께 다수의 이식편 상실의 위험 인자이다(문헌[Jain et al., 2000, Ann Surg. 232(4):490-500]). 급성 거부가 또한 만성 거부로 진행하는 것으로 공지된 위험 인자이며 따라서 가능한 한 빠른 급성 거부 에피소드의 검출 및 치료가 이식편 손상을 최소화하고 하류 거부 에피소드를 저지하기 위한 주요 목표이다. 대부분의 경우에, 이식된 조직에 대한 적응성 면역 응답이 성공적인 이식에 주요 장애이다. 거부는 상기 이식편상의 동종항원에 대한 면역 응답에 의해 유발되며, 상기 동종항원은 종내 개인에 따라 변하고 따라서 수용자에 의해 이질물로서 인식되는 단백질이다(문헌[Janeway, et al ., 2001, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. New York: Garland Science]).

현행 모니터링 및 진단 도구들은 초기 단계의 급성 거부를 진단하는 능력에 한계가 있다, 예를 들어 급성 신장 동종이식편 거부는 현재 상기 이식편의 바늘 코어 생검에 따라 진단되는데, 상기 생검은 수용자 혈청 중 크레아티닌 수준의 증가와 같은 투박한 생물마커에 의해 초래되는 고도로 침습성인 과정이다(문헌[Girlanda et al., 2007, Semin Nephrol. Jul;27(4):462-78]). 혈청 크레아티닌 수준은 거부를 유효하게 예측하는데 요구되는 감도 및 특이성이 부족하나, 여전히 급성 거부의 최선의 대용 마커이다(문헌[Zhou et al ., 2006, Nephrol Self Assess Program. 5(2): 63-71]). 간 이식에서, 아스파테이트 트랜스퍼라제(AST) 및 알라닌 트랜스퍼라제(ALT)의 상승된 수준의 존재는 간 손상을 평가하는 지표로서 사용된다(문헌[Giboney, 2005, Am Fam Physician 71 (6): 1105-10]). 그러나, 정상의 3배를 넘는 수준은 또한 알콜 독성, 바이러스성 간염, 간암, 패혈증, 윌슨병, 자가면역 간염 및 약물 독성의 포함에 기인할 수도 있다(문헌[Giboney, 2005, Am Fam Physician 15;71(6):1105-1110]; 문헌[Raurich et al ., 2009, Hepatol. Res. 39 (7): 700-5]).

비제한적으로 신장, 심장, 폐, 간, 췌장, 뼈, 골수, 장, 신경, 줄기세포, 줄기세포로부터 유래된 이식물뿐만 아니라 조직 성분 및 조직 복합체를 포함한 초기 동종이식편 거부의 빠른 진단을 허용하는 방법의 개발은 당해 분야에서 중대한 진보일 것이다. 동종이식편 생검은 현재 매우 침습적이며 주사부위의 출혈, 쇼크, 동종이식편 누 (allograft fistulas), 및 심지어 이식편 상실을 포함한 다수의 합병증으로 인해 성가시고 상기 생검 과정은 아동에서 보다 큰 위험을 수반한다. 임상의에게 환자의 거부 궤적의 상태에 관한 정보를 알리기 위해 높은 감도 및 특이성을 갖는 비-침습적인 진단 검사를 입수하는 것은 상당히 가치가 있을 것이다.

지난 10년에 걸쳐 수술 기법, 면역억제요법 및 감염성 모니터링 및 치료의 진보는 환자 및 이식편 생존을 혁신시켰다. 그러나, 이러한 성공에도 불구하고, 이식물 수용자는 여전히 일반적인 집단보다 훨씬 더 높은 이환율 및 사망률을 나타낸다. 이는 부분적으로 만성적인 동종이식편 손상의 영향에 기인하지만, 주요 원인은 만성적인 면역억제성 약물 사용에 의해 영향을 받는 동반이환이다(문헌[Soulillou and Giral 2007, Transplantation 72 (Suppl 12): S89-93]; 문헌[Hourmant et al ., 1998, Lancet 351: 623-628]; 문헌[Halloran, 2004, N Engl J Med 351: 2715-2729]).

면역억제 관련된 독성들은 유의수준일 수 있다. 예를 들어, 성인 간 이식 수용자에서 다수의 연구는 면역억제 요법에의 노출에 따른 신장 기능의 시간-의존적인 연속적 감퇴를 입증하였다. 장기간 면역억제의 다른 중요한 합병증은 이식후 당뇨병의 새로운 발병(NODAT), 고혈압, 고지질혈증 및 스타틴 요법의 필요성을 포함한다(문헌[Srinivas et al ., 2008, CJASN: (Supplement 2) S101-S116]). 이러한 상황을 시정하기 위해서, 기관 이식에 있어서 연구 우선순위가 신규의 강력한 면역억제 약물의 탐색에서 면역억제를 최소화하기 위한 전략의 확인으로 이동하고 있다.

생물마커를 사용하여, 질병을 발생시키는 성향을 측정하거나, 그의 진행을 측정하거나, 또는 예후를 예측할 수 있다(문헌[Wehling, 2006, Eur. J. Clin. Pharmacol, 62:91-95]). 임상 시험에서, 생물마커는 환자 분류를 도울 수 있으며 이에 의해 적합한 집단을 표적화함으로써 성공적인 결과의 기회를 증가시킬 수 있다. 또한, 생물마커는 치료를 개별화하는 것을 수월케 하고 이에 의해 개인화된 약물에 신기원을 선도할 수 있다(문헌[Frank et al ., 2003, Nat. Rev. Drug Discov. 2:566-580]). 분자 생물마커의 면역억제 치료에의 통합은 다수의 이점들, 예를 들어 침습적인 생검의 회피뿐만 아니라 개별화된 최소화를 유도하여 약물-관련된 독성을 감소시킬 수 있다.

마이크로RNA(miRNA)는 표적 유전자의 전사후 발현을 조절하는 약 22개 뉴클레오티드의 작은 비-암호화 RNA 분자이다(문헌[Bartel, 2004, Cell 116: 281-297]). miRNA의 생물발생은 세포핵 및 세포질에서 발생하는 다단계 과정이다. 성숙한 miRNA는 RNA-유도된 침묵화 복합체에 통합되어 mRNA의 3' 비번역 영역(UTR)에 결합하고, 이는 mRNA 분해 또는 번역 억제를 유도한다(문헌[Kim et al ., 2006, Trends Genet 22: 165-173]). 지금까지 1000개 이상의 인간 miRNA가 동정되었으나 다수의 표적 유전자들은 여전히 미지인 채로 남아있다(문헌[Bentwich et al ., 2005, Nat Genet; 37: 766-770]; 문헌[Friedman et al., 2009, Genome Res 19: 92-105]). miRNA는 세포 발생, 세포 분화, 종양발생, 세포사멸 및 증식에 중대한 역할을 하는 것으로 나타났다(문헌[He et al ., 2004, Nat Rev Genet. 5: 522-531]; 문헌[Meltzer, 2005. Nature; 435: 745-746]; 문헌[Chen et al ., 2004, Science; 303: 83-86]). 더욱이, miRNA는 선천적 및 적응성 면역 응답에 관련된다(문헌[Harris et al ., 2010, Am J Transplant; 10: 713-719]; 문헌[Lindsay, 2008, Trends Immunol; 29: 343-351]). 예를 들어, miR-181a는 흉선세포의 T-세포 수용체(TCR) 신호전달 한계를 조절함으로써 클론 결실을 촉진하는 T-세포 감도 및 선택의 내인성 조절제이다(문헌[Li et al ., 2007, Cell 129: 147-161]; 문헌[Ebert et al., 2009, Nat Immunol; 10: 1162-1169]). miR-155는 T 및 B 세포에 의한 사이토킨 생산 및 수지상 세포에 의한 항원 제시에 중요하다(문헌[Rodriguez et al ., 2007, Science; 316: 608-611]). 따라서 면역조절제로서 miRNA는 기관 이식편의 수용자에서 동종이식편 거부, 내성 유도 및 이식후 감염과 관련된 유전자의 발현을 지배할 수 있다(문헌[Harris et al., 2010, Am J Transplant;10:713-719]). 최근의 연구들은 임상적 신장 이식 후 miRNA의 차별적인 발현을 입증하였다. 최근에, miRNA는 인간 및 다른 포유동물, 예를 들어 래트, 마우스, 소 및 말의 혈청 및 혈장 중에 존재하는 것으로 입증되었다(문헌[Chen et al ., 2008, Cell Res. 18:997- 1006]; 문헌[Mitchell et al ., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 10513-10518]). 이러한 발견은 질병의 생물마커로서 miRNA를 사용할 가능성을 연다. 체액 중 miRNA의 존재에 대한 추가적인 증거는 소변 샘플의 분석으로부터 나왔다(문헌[Gilad et al., 2008, PLoS One 3:e3148]). 4개의 miRNA는 요로상피 방광암 (urothelial bladder) 환자의 소변에서 현저하게 상승하였으며, 이는 비침습적인 진단학적 선택권으로서 miRNA의 유용성을 입증한다(문헌[Hanke et al, 2009, Urol. Oncol]). 이들 연구는 모두 중개의학 (translation medicine)에서 임상적 진단을 가능하게 하는 신규의 생물마커로서 miRNA의 잠재적인 용도를 예시한다(문헌[Gilad et al, 2008, PLoS One 3:e3148]; 문헌[Weber et al, 2010, Clin. Chem. 56: 1733-1741]; 문헌[Etheridge et al, 2011, Mutat. Res.; Scholer et al, 2010, Exp. Hematol 38: 1126-1130]).

환자에서 이식편 거부 및 면역억제 요법의 내성의 진단을 위한 miRNA 발현의 검출 및 정량분석 방법이 당해 분야에서 대단히 필요하다. 더욱 또한, 최선의 치료 양상을 제공하기 위해서 임상의에게 환자의 거부 궤적의 상태에 관한 정보를 알리기 위해 높은 감도 및 특이성을 갖는 비-침습적인 진단 검사가 당해 분야에서 필요하다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족시킨다.

본 발명은 피실험자에서 이식된 기관의 이식 거부 (transplant rejection)를 검출하거나 예측하기 위한 방법을 포함한다. 상기 방법은 상기 피실험자로부터의 샘플에서 적어도 하나의 miRNA 발현의 수준을 측정하고, 상기 피실험자로부터의 샘플 중 적어도 하나의 miRNA의 수준을 대조군에서의 기준선 수준과 비교함을 포함하며, 여기에서 상기 대조군에서의 적어도 하나의 miRNA의 수준으로부터 상기 샘플 중 적어도 하나의 miRNA의 수준의 차이는 급성 이식편 거부를 가리키며, 더욱이 급성 이식편 거부가 나타난 경우, 상기 거부에 대한 치료를 권장한다.

본 발명은 또한 이식 피실험자에서 면역억제 요법(IST)의 최소화를 예측하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 상기 피실험자로부터의 샘플에서 적어도 하나의 miRNA 발현의 수준을 측정하고, 상기 피실험자로부터의 샘플 중 적어도 하나의 miRNA의 수준을 대조군에서의 기준선 수준과 비교함을 포함하며, 여기에서 상기 대조군에서의 적어도 하나의 miRNA의 수준으로부터 상기 샘플 중 적어도 하나의 miRNA의 수준의 차이는 IST 최소화의 성공 또는 실패의 가능성을 가리키며, 더욱이 IST 최소화의 실패가 나타난 경우, 피실험자의 치료를 권장한다.

본 발명은 또한 서열번호 1 내지 23으로 이루어지는 다수의 miRNA를 포함하는, 피실험자에서 이식된 기관의 이식 거부를 검출하거나 예측하기 위한 조성물을 포함한다.

본 발명은 또한 서열번호 1 내지 23 및 97 내지 134로 이루어지는 다수의 miRNA를 포함하는, 피실험자에서 이식된 기관의 이식 거부를 검출하거나 예측하기 위한 조성물을 포함한다.

본 발명은 또한 서열번호 1 내지 23 및 97 내지 134로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 miRNA를 검출하도록 형성된 다수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트를 포함한다.

본 발명은 또한 서열번호 6 내지 8, 22, 24 내지 48로 이루어지는 다수의 miRNA를 포함하는 이식-후 피실험자에서 IST 투여량을 최소화하는 능력 또는 무능력을 검출하거나 예측하기 위한 조성물을 포함한다.

본 발명은 또한 서열번호 6 내지 8, 22, 24 내지 48로 이루어지는 그룹으로부터의 적어도 하나의 miRNA를 검출하도록 형성된 다수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트를 포함한다.

일부 실시태양에서, 상기 급성 이식 거부는 급성 세포성 거부(ACR)를 포함한다. 일부 실시태양에서, 피실험자에서 이식된 기관의 이식 거부를 예측하거나 검출하기 위한 상기 적어도 하나의 miRNA는 서열번호 1 내지 3으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 다른 실시태양에서, 피실험자에서 이식된 기관의 이식 거부를 예측하거나 검출하기 위한 상기 적어도 하나의 miRNA는 서열번호 4 내지 15로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 추가의 실시태양에서, 피실험자에서 이식된 기관의 이식 거부를 예측하거나 검출하기 위한 상기 적어도 하나의 miRNA는 서열번호 16 내지 23으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.

더욱 추가의 실시태양에서, 피실험자에서 이식된 기관의 이식 거부를 예측하거나 검출하기 위한 상기 적어도 하나의 miRNA는 서열번호 1 내지 23으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 더욱 추가의 실시태양에서, 피실험자에서 이식된 기관의 이식 거부를 예측하거나 검출하기 위한 상기 적어도 하나의 miRNA는 서열번호 1 내지 23 및 97 내지 134로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 이식 피실험자에서 면역억제 요법(IST)의 최소화를 예측하기 위한 상기 적어도 하나의 miRNA는 서열번호 24 내지 26으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 다른 실시태양에서, 이식 피실험자에서 면역억제 요법(IST)의 최소화를 예측하기 위한 상기 적어도 하나의 miRNA는 서열번호 6 내지 8, 22, 27 내지 48로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 다른 실시태양에서, 이식 피실험자에서 면역억제 요법(IST)의 최소화를 예측하기 위한 상기 적어도 하나의 miRNA는 서열번호 6 내지 8, 22, 24 내지 48로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 상기 IST의 최소화는 초기 투여량보다 적어도 75%까지 더 낮다. 몇몇 실시태양에서, 상기 IST의 최소화는 초기 투여량보다 적어도 25%까지, 적어도 30%까지, 적어도 35%까지, 적어도 40%까지, 적어도 45%까지, 적어도 50%까지, 적어도 55%까지, 적어도 60%까지, 적어도 65%까지, 적어도 70%까지, 적어도 75%까지, 적어도 80%까지, 적어도 85%까지, 적어도 90%까지, 적어도 95%까지, 또는 적어도 100%까지 더 낮다.

일부 실시태양에서, 상기 적어도 하나의 miRNA의 수준은 대조군에서의 적어도 하나의 miRNA의 수준보다 적어도 1배까지 더 높다. 다른 실시태양에서, 상기 적어도 하나의 miRNA의 수준을 측정하는 것은 역전사, PCR, 마이크로어레이, 및 차세대 서열분석으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 기법을 사용한다. 추가의 실시태양에서, 상기 샘플은 소변, 말초 혈액, 혈청, 담즙, 기관지폐포 세척(BAL)액, 심낭액, 위장액, 대변 샘플, 동종이식편 부근의 해부학적 영역으로부터 모은 생물학적 유체, 및 동종이식편으로부터의 생물학적 유체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나이다. 추가의 실시태양에서, 상기 이식된 기관은 심장, 간, 폐, 신장, 장, 췌장, 췌장섬 세포, 눈, 피부 및 줄기 세포로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나이다. 추가의 실시태양에서, miRNA 발현 수준의 비교는 상기 이식된 기관의 급성 거부의 궤적을 나타내기 위해 회귀 모델에서 계산된다. 일부 실시태양에서, 상기 키트의 올리고뉴클레오티드는 적어도 서열번호 1 내지 3을 검출하도록 형성된다. 다른 실시태양에서, 키트의 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나는 서열번호 49 내지 71 및 135 내지 172로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 다른 실시태양에서, 상기 키트의 올리고뉴클레오티드는 적어도 서열번호 24 내지 26을 검출하도록 형성된다. 더욱 다른 실시태양에서, 상기 키트의 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나는 서열번호 53 내지 55, 70, 72 내지 96으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 상기 피실험자는 포유동물이다. 다른 실시태양에서, 상기 포유동물은 인간이다.

본 발명을 예시하기 위해서, 도면에 본 발명의 몇몇 실시태양들을 묘사한다. 그러나, 본 발명은 상기 도면에 묘사된 실시태양들의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않는다.
도 1은 전체 실제 양성 (actual positives) 중 참 양성의 분률(TPR = 참 양성률) 대 전체 실제 음성 (acutal negatives) 중 거짓 양성의 분률(FPR = 거짓 양성률)을 개략하는 수신기 작동 특성(ROC) 플롯을 예시하는 그래프이다. 상기 플롯은 3-miRNA 혈청 ACR 진단 특징 (diagnosis signature)(hsa-miR-125b, hsa-miR-100 및 hsa-miR-483)을 나타낸다.
도 2는 생검 진단된 거부일까지의 3-miRNA ACR 특징(hsa-miR-125b, hsa-miR-100 및 hsa-miR-483)의 종합 점수의 LOESS 평활(비-모수 회귀 방법) 플롯을 묘사하는 그래프이다. ACR의 특징 예측을 "예"로 표지하고 비-ACR은 "아니오"라고 표지한다.
도 3은 25% 용량 실패한 사람들(표지 = "예")과 25% 용량에서 내성인 사람들(표지 = "아니오")간의 면역억제 최소화 중 다양한 용량에서의 3-miRNA 내성 특징 (tolerant signature)의 종합 점수(최소제곱평균 ± 표준 편차, SD)를 예시하는 그래프이다.
도 4는 전체 실제 양성 중 참 양성의 분률(TPR = 참 양성률) 대 전체 실제 음성 중 거짓 양성의 분률(FPR = 거짓 양성률)을 개략하는 수신기 작동 특성(ROC) 플롯을 예시하는 그래프이다. 상기 플롯은 복제 데이터세트에서 발견된 3-miRNA 혈청 ACR 진단 특징을 예시한다.
도 5는 퀴아겐 어레이스(Qiagen Arrays)에 의해 확인된 상위 5개 ACR-관련된 miRNA의 혈청 발현 수준을 묘사하는 일련의 상자그림이다. Y-축은 miRNA 발현 수준(-dCt)을 가리키고 X-축은 ACR 상태를 가리킨다.

본 발명은 일부 마이크로RNA(miRNA)의 발현 수준을 이식 수용자에서 이식 결과를 예측하기 위한 진단학적 특징으로서 사용할 수 있다는 발견에 관한 것이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 다양한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 이식 피실험자를 급성 세포성 거부(ACR)와 같은 급성 거부에 대해서 진단하는 방법, 피실험자의 ACR이 있거나 ACR을 나타낼 위험을 예측하는 방법, 및 피실험자가 표준 범위로부터 면역억제 요법(IST) 투여량의 감소가 성공하기 쉬운지 또는 실패하기 쉬운지를 평가하는 방법에 관한 것이다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 개시된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질을 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질을 기재한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 하기의 용어들은 각각 본 섹션에서 상기 용어들과 관련된 의미를 갖는다.

관사 "하나의"는 본 명세서에서 상기 관사의 문법적 목적어 중 하나 또는 하나 초과(즉 적어도 하나)를 지칭한다. 예로서, "하나의 요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "약"은 양, 시간적 지속기간 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭할 때 명시된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 보다 바람직하게는 ±5%, 훨씬 더 바람직하게는 ±1%, 및 더욱더 바람직하게는 ±0,1%의 변화를 포함함(상기와 같은 변화는 개시된 방법을 수행하기에 적합하기 때문에)을 의미한다.

"비정상"이란 용어는 유기체, 조직, 세포 또는 그의 성분들과 관련하여 사용될 때 "정상적인"(예상되는) 각각의 특징을 나타내는 유기체, 조직, 세포 또는 그의 성분들과 적어도 하나의 관찰가능한 또는 검출가능한 특징(예를 들어 나이, 치료, 실정 등)이 상이한 상기 유기체, 조직, 세포 또는 그의 성분을 지칭한다. 하나의 세포 또는 조직 유형에 대해 정상이거나 또는 예상되는 특징은 상이한 세포 또는 조직 유형의 경우 비정상일 수도 있다.

"질병"은 동물이 항상성을 유지할 수 없고 상기 질병이 개선되지 않는 경우 상기 동물의 건강이 계속해서 나빠지는 상기 동물의 건강 상태이다.

대조적으로, 동물에서 "질환"은 상기 동물이 항상성은 유지할 수 있으나 상기 동물의 건강 상태가 상기 질환의 부재하에서보다 덜 유리한 건강 상태이다. 치료되지 않은 채로 두는 경우, 질환은, 반드시는 아니지만, 상기 동물의 건강상태의 추가적인 감소를 유발한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "조절이 곤란한" 및 "조절장애"란 용어는 대조군 샘플, 예를 들어 하나 이상의 정상적인, 위험이 없는(not-at-risk) 피실험자 또는 상이한 시점에서 동일한 피실험자로부터 수득한 대조군 샘플 중에 존재하는 miRNA의 발현 수준에 비해 피실험자로부터 수득한 샘플 중에 존재하고 검출된 miRNA의 감소되거나(하향-조절되거나) 또는 증가된(상향-조절된) 발현 수준을 개시한다. 일부 예에서, 상기 miRNA 발현 수준을 하나 초과의, 위험이 없는 개인으로부터 획득한 평균값과 비교한다. 다른 경우에, 상기 miRNA 발현 수준을 하나의 정상적인, 위험이 없는 피실험자로부터 수득한 샘플 중에서 평가된 miRNA 수준과 비교한다.

"차별적으로 증가된 발현" 또는 "상향 조절"은 대조군보다 적어도 10% 이상, 예를 들어 20%, 30%, 40%, 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상, 및/또는 1.1 배, 1.2 배, 1.4 배, 1.6 배, 1.8 배, 2.0 배 이상, 및 이들 사이의 모든 전체적인 또는 부분적인 증분의 발현 수준을 지칭한다.

"차별적으로 감소된 발현" 또는 "하향 조절"은 대조군보다 적어도 10% 이상, 예를 들어 20%, 30%, 40%, 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이하, 및/또는 2.0 배, 1.8 배, 1.6 배, 1.4 배, 1.2 배, 1.1 배 이하, 및 이들 사이의 모든 전체적인 또는 부분적인 증분의 발현 수준을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "발현"이란 용어는 특정한 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로서 정의된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단리된"은 직접 또는 간접적으로 인간의 행동을 통해 천연 상태로부터 변경되거나 제거됨을 의미한다. 예를 들어 살아있는 동물 중에 천연으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리되지 않은 것이고", 그의 천연 상태의 공존하는 물질로부터 부분적으로 또는 전적으로 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리된 것이다". 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재하거나, 또는 비-천연 환경, 예를 들어 숙주 세포 중에 존재할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마이크로RNA" 또는 "miRNA"는 일반적으로 약 15 내지 약 50 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 17 내지 23 뉴클레오티드 길이의 miRNA 분자를 개시하며, 예를 들어 RNA 간섭(RNAi)이라 칭하는 과정을 통해 유전자 발현을 조절하는데 중요한 역할을 할 수 있다. RNAi는, 표적 유전자 전령 RNA(mRNA) 중의 서열에 상보성이거나 안티센스인 RNA 서열의 존재가 상기 표적 유전자의 발현을 억제시키는 현상을 개시한다. miRNA는, RNAse III 효소에 의한 연속 절단을 통해 1차 전사물(pri-miRNA)로부터 유래되는 약 70개 이상 뉴클레오티드의 헤어핀 전구체(pre-miRNA)로부터 가공된다.

"핵산"은 데옥시리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오시드로 구성되든지, 포스포디에스테르 결합 또는 변형된 결합, 예를 들어 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 실록산, 카보네이트, 카복시메틸에스테르, 아세트아미데이트, 카바메이트, 티오에테르, 가교된 포스포아미데이트, 가교된 메틸렌 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 가교된 포스포로티오에이트 또는 설폰 결합, 및 상기와 같은 결합들의 조합으로 구성되든지 간에, 임의의 핵산을 의미한다. 핵산이란 용어는 또한 구체적으로 5개의 생물학적으로 존재하는 염기(아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실) 이외의 염기들로 구성된 핵산을 포함한다.

"폴리뉴클레오티드"란 용어는 cDNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드, 안티-센스 RNA, siRNA, miRNA, snoRNA, 게놈 DNA, 합성 형태, 및 센스 및 안티센스 가닥 모두의 혼합된 중합체를 포함하며, 천연 또는 유도체화된, 합성 또는 반합성 뉴클레오티드 염기를 함유하도록 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있다. 또한, 야생형 또는 합성 유전자의 변경, 예를 들어 비제한적으로 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 삽입, 치환, 또는 다른 폴리뉴클레오티드 서열에의 융합이 본 발명의 범위내에 포함된다.

본 명세서에서 폴리뉴클레오티드 서열을 개시하는데 통상적인 표기가 사용된다: 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 단부는 5'-단부이고; 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 방향은 5'-방향이라 지칭된다.

"올리고뉴클레오티드"란 용어는 전형적으로 짧은 폴리뉴클레오티드, 일반적으로는 약 60개 초과의 뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드 서열을 DNA 서열(즉 A, T, G, C)에 의해 나타내는 경우, 상기는 또한 RNA 서열(즉 A, U, G, C)(여기에서 "U"가 "T"를 대체한다)을 포함함을 알 것이다.

"스파이크 처리된 (spike-in)"이란 용어는 가공 도중 샘플에 첨가되고 마이크로어레이의 수행성능을 평가하기 위해 사용되는 규명된 서열 핵산 종(예를 들어 RNA 종, 서열 또는 전사물)을 지칭한다. "스파이크 처리된"은 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA) 또는 핵산 유사체(예를 들어 isoG, isoC 등)와 같은 표준 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 인공 서열을 지칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 규명된 서열 핵산은, 분석하고자 하는 생물학적 샘플 중에서 발견될 것 같지 않고 최소의 자가-하이브리드화 및 세트 중 다른 유사한 서열과 교차 하이브리드화를 갖도록 선택된 서열을 포함한다. 상기와 같은 스파이크 처리된 대조군을 사용하여 마이크로어레이 품질을 동적인 범위, 재현성 등에 대해 모니터할 수 있다. 상이한 스파이크 처리된 대조군을 사용하여 마이크로어레이 분석 중 상이한 과정들을 모니터할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 스파이크 처리된 탐침과 대조군 탐침간에 측정된 하이브리드화 정도를 사용하여 샘플 RNA 또는 miRNA의 하이브리드화 크기를 측정 및 표준화한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "하이브리드화", "하이브리드화하다" 또는 "하이브리드화할 수 있는"은 이중 또는 삼중 가닥 분자 또는 부분적인 이중 또는 삼중 가닥 성질을 갖는 분자의 형성을 의미하는 것으로 이해된다. 핵산 중의 상보성 서열들은 서로 짝을 지어 이중 나선을 형성한다. 생성된 이중 가닥 핵산이 "하이브리드"이다. 하이브리드화는 예를 들어 2개의 상보성 또는 부분적으로 상보성인 서열들 사이에서 있을 수 있다. 상기 하이브리드는 이중 가닥 영역 및 단일 가닥 영역을 가질 수 있다. 상기 하이브리드는 예를 들어 DNA:DNA, RNA:DNA 또는 DNA:RNA일 수 있다. 하이브리드는 또한 변형된 핵산들(예를 들어 LNA 화합물들) 사이에서 형성될 수 있다. 상기 핵산 중 하나 또는 2개를 모두 고체 지지체상에 고정화시킬 수 있다. 하이브리드화 기법을 사용하여 특정한 서열을 검출 및 단리하거나, 상동성을 측정하거나, 또는 하나 또는 2개 가닥 모두의 다른 특징들을 규명할 수 있다. 하이브리드의 안정성은 다양한 인자들, 예를 들어 상보성의 길이, 상보성 영역내 미스매치의 존재, 반응에서 염의 온도 및 농도 또는 상기 하이브리드의 2개 가닥 중 하나의 뉴클레오티드 변형에 따라 변한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "핵산 탐침" 또는 "탐침"은 DNA 탐침 또는 RNA 탐침이다.

고속-대량 서열분석으로서 또한 공지된 "차세대 서열분석"(NGS)이란 용어는 본 명세서에서 DNA 및 RNA를 이전에 사용된 생어(Sanger) 서열분석보다 훨씬 더 신속하고 저렴하게 서열분석할 수 있게 하는 다수의 상이한 현대식 서열분석 기술을 개시하는데 사용된다(문헌[Metzker, 2010, Nature Reviews Genetics 11.1:31-46]). 상기는 샘플의 크기, 시약 비용을 감소시키고 대량의 병행 서열분석 반응들을 가능하게 하는 마이크로- 및 나노기술에 기반한다. 상기는 수 백만 샘플의 동시적인 서열분석 및 분석을 허용하는 고도의 복합 기술일 수 있다. NGS는 제1, 제2, 제3뿐만 아니라 후속의 차세대 서열분석 기술들을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 피실험자로부터의 생물학적 물질, 예를 들어 비제한적으로 기관, 조직, 엑소솜, 혈액, 혈장, 타액, 소변 및 다른 체액을 의미한다. 샘플은 피실험자로부터 수득되는 물질의 임의의 공급원일 수 있다.

"피실험자", "환자", "개인" 등의 용어는 본 명세서에서 호환적으로 사용되며 시험관내이든 동일 반응계이든 본 명세서에 기재된 방법이 수행될 수 있는 임의의 동물 또는 그의 세포를 지칭한다. 몇몇 비제한적인 실시태양에서, 상기 환자, 피실험자 또는 개인은 인간이다. 비-인간 포유동물은 예를 들어 가축 및 애완동물, 예를 들어 양, 소, 돼지, 개, 고양이 및 쥐과의 포유동물을 포함한다. 바람직하게 상기 피실험자는 인간이다. "피실험자"란 용어는 특정한 연령 또는 성별을 나타내는 것은 아니다. 바람직하게 상기 피실험자는 인간 환자이다. 일부 실시태양에서, 상기 피실험자는 기관 이식을 받은 인간이다.

범위: 본 명세서 전체를 통해, 본 발명의 다양한 태양들을 범위 포맷으로 나타낼 수 있다. 범위 포맷의 기재는 단지 편의 및 간략성을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 완고한 제한으로서 해석해서는 안 된다. 상응하게, 범위의 기재는 모든 가능한 하위범위뿐만 아니라 상기 범위내의 개별적인 수치들을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 구체적으로 개시된 하위범위, 예를 들어 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등뿐만 아니라 상기 범위내의 개별적인 숫자들, 예를 들어 1, 2, 2, 7, 3, 4, 5, 5.3 및 6을 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 이를 상기 범위의 폭과 무관하게 적용한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "돌연변이"는 천연 상태로부터의 변경을 생성시키는 DNA 서열의 변화이다. 상기 돌연변이는 적어도 하나의 데옥시리보핵산 염기, 예를 들어 퓨린(아데닌 및/또는 티민) 및/또는 피리미딘(구아닌 및/또는 시토신)의 결실 및/또는 삽입 및/또는 중복 및/또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 유기체(피실험자)의 관찰 가능한 특징(표현형)의 식별가능한 변화를 생성시킬 수도, 생성시키지 않을 수도 있다.

"생검"이란 용어는 진단 검사를 위한 살아있는 환자로부터 조직을 제거함으로써 수득된 표본을 지칭한다. 상기 용어는 흡출 생검, 브러시 생검, 융모 생검, 내시경 생검, 절제 생검, 바늘 생검(피부 또는 기관의 외부 표면을 통해 검사하고자 하는 하부 조직내로 관통하는 적합한 바늘 또는 투관침을 통한 흡출에 의한 제거에 의해 수득된 표본), 개방 생검, 펀치 생검(관상톱), 면도 생검, 스펀지 생검 및 웨지 생검을 포함한다. 생검은 또한 미세침 흡출 생검, 미니코어 바늘 생검, 및/또는 통상적인 경피적 코어 바늘 생검을 포함한다.

"기준선 발현" 또는 "유전자 발현 수준의 기준선 수준"은 건강한 피실험자 또는 잘 기능하는 이식물을 갖는 피실험자의 특정한 유전자 발현 수준을 포함한다. 유전자 발현의 기준선 수준은 급성 거부가 없는 피실험자의 유전자 발현 수준을 포함한다. 상기 유전자 발현의 기준선 수준은 논문상의 숫자 또는 건강한 피실험자 또는 잘 기능하는 이식물을 갖는 피실험자의 대조군 샘플로부터의 유전자 발현의 기준선 수준일 수 있다.

"급성 거부" 또는 "급성 세포성 거부"는 동종이식된 기관에 의해 발생된 면역 반응을 지칭한다. 일반적으로, 상기 급성 거부는 이식 및 어쩌면 다른 세포-특이성 항원이 관상 상피 및 관상 내피에 의해 발현된 후 2 내지 60일째에 개시된다. 상기는 미스매치된 HLA 항원, 및 어쩌면 관상 상피 및 관상 내피에 의해 발현된 다른 세포-특이성 항원에 의해 유발된다. 지연된 과민반응 및 세포독성 기전이 모두 관련되는 것으로 여겨진다. 급성 거부는, 효과기 기능을 수행하고 이식된 조직을 파괴하는 수용자의 면역 세포에 의한 이식된 조직의 침윤을 특징으로 한다. 상기는 간질성 혈관내피세포 팽윤, 림프세포, 원형질 세포, 면역모세포, 대식세포, 호중구의 간질성 축적; 관상 상피의 부종/괴사와 함께 관상 분리; 내피세포의 팽윤 및 액포화, 혈관 부종, 출혈 및 염증, 신장 관상 괴사, 경화된 사구체, 관상 '갑상선화'를 특징으로 할 수 있다.

"만성 거부"는 일반적으로 급성 거부의 성공적인 면역억제의 존재하에서조차, 생착 후 수개월 내지 수년내에 발생한다. 섬유증이 모든 유형의 기관 이식의 만성 거부에 공통 인자이다. 만성 거부는 전형적으로 특정 기관의 특징인 일련의 특이 질환에 의해 개시될 수 있다. 예를 들어 폐 이식에서, 상기와 같은 질환은 기도의 섬유증식성 파괴(폐쇄성 세기관지염)를 포함하며; 심장 이식 또는 심장 조직의 이식, 예를 들어 판막 치환술에서, 상기와 같은 질환은 섬유성 죽상경화증을 포함하고; 신장 이식에서, 상기와 같은 질환은 폐쇄성 신장병증, 신장경화증, 세뇨관간질성 신장병증을 포함하며; 간 이식에서, 상기와 같은 질환은 소멸성 담관 증후군을 포함한다. 만성 거부는 또한 면역억제성 약물과 관련된 허혈성 발작, 이식된 조직의 신경제거, 고지질혈증 및 고혈압을 특징으로 할 수 있다.

"이식 거부"란 용어는 급성 및 만성 이식 거부를 모두 포함한다.

본 명세서에 사용된 "진단"이란 용어는 분자 또는 병적인 상태, 질병 또는 증상의 확인 또는 분류를 지칭한다. 예를 들어 "진단"은 특정 유형의 급성 거부, 예를 들어 급성 세포성 거부의 확인을 지칭할 수 있다.

본 명세서에 사용된 "예측"이란 용어는 환자가 급성 거부를 나타낼 가능성을 지칭한다. 따라서, 예측은 또한 급성 거부가 없는 기간을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이식"이란 용어는 하나의 개인으로부터 "이식물" 또는 "이식편"이라 칭하는 세포, 조직 또는 기관을 취하여 이를 (대개는) 다른 개인에게 놓는 과정을 지칭한다. 상기 이식물을 제공하는 개인을 "공여자"라 칭하고 상기 이식물을 받은 개인을 "숙주"(또는 "수용자")라 칭한다. 동일한 종의 2명의 유전적으로 상이한 개인간에 이식된 기관, 또는 이식편을 "동종이식편"이라 칭한다. 상이한 종의 개인간에 이식된 이식편을 "이종이식편"이라 칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이식 거부"는 수용자에 의해 나타난 활성 면역 응답으로 인한 기관의 기능적 및 구조적 악화를 지칭하며 기관 기능부전의 비-면역학적 원인과는 무관하다. 급성 이식 거부는 수용자의 T 세포 및/또는 B 세포의 활성화로부터 생성될 수 있으며; 주로 T 세포로 인한 거부는 T 세포 매개된 급성 거부 또는 급성 세포성 거부(ACR)로서 분류되고 B 세포가 주로 원인인 거부는 항체 매개된 급성 거부(AMR)로서 분류된다. 일부 실시태양에서, 상기 제공된 방법 및 조성물은 급성 세포성 거부를 검출하고/하거나 예측할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "면역억제" 또는 "면역억제 요법(IST)"이란 용어는 면역계의 활성화 또는 효능을 감소시키는 작용을 수반한다. 의도적으로 유도된 면역억제를 수행하여 신체를 기관 이식 거부로부터 예방하거나, 골수 이식 후 이식편대 숙주병을 치료하거나, 또는 자가면역질병, 예를 들어 류마티스성 관절염 또는 크론병을 치료한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "내성"이란 용어는 특정 항원 또는 항원들의 세트에 대한 선행 노출에 의해 유도된 상기 항원 또는 세트에 특이적인 면역 불응의 상태이다. 내성은 일반적으로 능동 과정, 및 본질적으로 T 세포에 대한 학습 경험인 것으로 이해된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 내성은, 예를 들어 비자기 MHC 항원의 수용자내로의 도입에 응답하여 발생할 수도 있는 면역응답을 장착하는 이식편 수용자의 능력의 억제를 지칭한다. 내성은 체액, 세포성 또는 체액 및 세포성 응답을 모두 수반할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "생물마커"란 용어는 급성 거부를 갖는 피실험자에서 또는 상기 급성 거부가 예상되는 경우에 양 또는 활성이 존재하거나 또는 증가된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 분자를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "진단용 생물마커" 또는 "진단 특징"이란 용어는 miRNA와 같은 마커의 그룹을 포함하며, 상기 그룹의 각 구성원의 양 또는 활성은 급성 거부를 갖는 피실험자에서 또는 상기 급성 거부가 예상되는 경우에 상관이 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 진단 특징은 오직 상기 마커만을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 특징은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 이상의 miRNA를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "내성에 대한 생물마커" 또는 "내성 특징"이란 용어는 miRNA와 같은 마커의 그룹을 포함하며, 상기 그룹의 각 구성원의 양 또는 활성은 일정 수준의 면역억제 최소화에 대한 내성을 갖는 피실험자에서 또는 상기 면역억제 최소화가 예상되는 경우에 상관이 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 내성 특징은 오직 상기 마커만을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 특징은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 이상의 miRNA를 포함한다.

발명의 방법

본 발명은 간 이식 수용자로부터의 혈청 샘플 중에서 "ACR 진단 특징"이라 지칭되는 어떤 마이크로RNA의 수준을 측정함으로써, 고도의 정확성으로 급성 세포성 거부의 추후의 발생을 예상하고; 이식물 생검을 수행하지 않고 고도의 감도 및 특이성으로 급성 세포성 거부를 진단하는 것이 가능하다는 뜻밖의 발견에 관한 것이다. 더욱 또한, 본 발명은 "IST 내성 특징"이라 지칭되는 다른 마이크로RNA 후보의 수준을 측정함으로써, 이식 피실험자에서 면역억제 요법(IST) 투여량을 표준 범위로부터 최소화함의 성공 또는 실패를 예측할 수 있다.

일부 실시태양에서, ACR과 관련된 miRNA는 차별적으로 발현된다. 더욱 다른 실시태양에서, IST 최소화의 실패와 관련된 miRNA는 차별적으로 발현된다. 따라서, 본 발명은 miRNA의 검출 및 정량분석에 유용한 조성물 및 방법, 및 IST 투여량의 조절이 필요한 피실험자에서 상기 조절뿐만 아니라 이식-결과의 진단, 평가 및 궤적의 특성화를 위한 상기 miRNA 특징의 용도에 관한 것이다.

miRNA 마커(들)의 기준 발현량

본 발명의 방법은 피실험자로부터의 생물학적 샘플 중의 miRNA 마커(들)의 측정된 발현량을 miRNA 마커(들)의 기준(즉 대조군) 발현량과 비교함을 포함한다.

급성 세포성 거부의 검출 또는 예측에 대한 기준

하나의 실시태양에서, miRNA(들)의 기준(즉 대조군) 발현 수준을, 비-거부 기관을 갖는 피실험자에서의 miRNA의 발현 수준을 측정함으로써 획득할 수 있다. 예를 들어, 비-거부 기관을 갖는 피실험자는 건강한 피실험자를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 건강한 피실험자는 기관 부전의 위험성을 평가하려는 이식 기관을 갖는 환자와 유사한 연령, 성별, 인종, 이식편-공여자 출처, 밴프 조직학 등급을 갖고/갖거나 상기 환자와 동일한 초기 거부방지 치료를 경험한 환자이다.

비-거부 기관을 갖는 피실험자의 또 다른 예는 잘 기능하는 이식 기관을 갖는 피실험자이다. 잘 기능하는(예를 들어 안정한) 이식 기관은 기관 부전(예를 들어 거부)을 나타내지 않는 이식 기관으로서 정의된다. 바람직하게, 잘 기능하는 이식 기관은 이식 부위에서 이식물 기능장애 또는 이식물 손상의 형태적 증거를 나타내지 않은 이식 기관이다. 바람직하게, 상기 잘 기능하는(예를 들어 안정한) 이식 기관을 갖는 피실험자는 기관 부전의 위험성을 평가하려는 이식 기관을 갖는 피실험자와 유사한 연령, 성별, 인종, 이식편-공여자 출처, 밴프 조직학 등급을 갖고/갖거나 상기 피실험자와 동일한 초기 거부방지 치료를 경험한 피실험자이다.

또 다른 실시태양에서, 상기 기준량은 상기 피실험자로부터의 두 번째 생물학적 샘플에서 상기 mRNA의 발현량을 측정함으로써 획득된다. 예를 들어, 상기 두 번째 생물학적 샘플을 기관 이식 전의 상기 피실험자로부터 및/또는 상기 피실험자의 또 다른 비-거부 기관으로부터 수득할 수 있다.

더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 miRNA의 기준 발현량은 당해 분야에서 허용되는(예를 들어 스파이크 처리된) miRNA의 발현에 대한 값이다.

면역억제 요법( IST ) 최소화의 성공 또는 실패를 예측하기 위한 기준

하나의 실시태양에서, 상기 miRNA의 기준 발현량을, 상기 IST 투여량의 감소를 위한 성공적인 내성을 갖는 이식 피실험자에서 miRNA의 발현량을 측정함으로써 획득한다. 예를 들어, 보다 낮은 IST 투여량하의 피실험자는 건강한 피실험자를 포함한다. 바람직하게, 상기 건강한 피실험자는 IST의 최소화를 위한 이식된 기관을 평가하려는 이식 기관을 갖는 피실험자와 유사한 연령, 성별, 인종, 이식편-공여자 출처, 밴프 조직학 등급을 갖고/갖거나 상기 피실험자와 동일한 초기 거부방지 치료를 경험한 피실험자이다.

또 다른 실시태양에서, 상기 기준량은 기관 이식 전 및/또는 IST 치료 시작 전 및/또는 IST 최소화 시작 전에 상기 피실험자로부터의 두 번째 생물학적 샘플에서 상기 mRNA의 발현량을 측정함으로써 획득된다.

miRNA 마커의 측정된 발현량의 비교

상기 방법은 상기 miRNA의 측정된 발현량을 상기 miRNA의 기준 발현량과 비교함을 포함한다.

급성 세포성 거부의 검출 또는 예측을 위해서

상기 miRNA 마커는 예를 들어 hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-122-5p, hsa-miR-99a-5p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR-34a-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-215, hsa-miR-375, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-505-3p, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-193b-3p, hsa-miR-874, hsa-miR-365a-3p, hsa-miR-152, hsa-miR-148a-3p 및 hsa-miR-29a-5p, 또는 이들의 임의의 조합 중에서 선택된 miRNA일 수 있다.

하나의 실시태양에서, 상기 miRNA 마커는 hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-122-5p, hsa-miR-99a-5p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR-34a-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-215, hsa-miR-375, hsa-miR-193a-5p 및 hsa-miR-483-5p, 또는 이들의 임의의 조합 중에서 선택된다.

또 다른 실시태양에서, 상기 miRNA 마커는 hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-100-5p 및 hsa-miR-483-5p이며, 여기에서 상기 miRNA 마커의 기준 발현량과 비교시 적어도 약 1배와 동등한 상기 miRNA 마커의 발현량의 증가는 상기 이식 기관 거부의 증가된 위험을 암시한다.

적어도 약 1배와 동등한 발현의 증가는 상기 miRNA 마커의 기준 발현량의 증가와 비교시, 적어도 약 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 20-배, 또는 그 이상 및 이들 사이의 모든 부분적인 정수들과 동등한 양의 증가일 수 있다. 발현의 증가를 정량화하는 방법의 예는 본 명세서의 어딘가에 개시된 실시예들에 개시된 바와 같이, 당해 분야에 공지되어 있다.

면역억제 요법( IST )의 최소화의 성공 또는 실패 예측을 위해서

상기 miRNA 마커는 예를 들어 hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-424-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-421, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-223-5p, hsa-miR-495-3p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-374b-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-99a-5p, hsa-miR-18b-5p, hsa-miR-7-1-3p, hsa-miR-181c-5p, hsa-miR-454-3p, hsa-miR-485-3p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-99b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-20a-3p 및 hsa-miR-106b-5p, 또는 이들의 임의의 조합 중에서 선택된 miRNA일 수 있다.

하나의 실시태양에서, 상기 miRNA 마커는 hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-424-3p 및 hsa-miR-125a-5p이며, 여기에서 상기 miRNA 마커의 기준 발현량과 비교시 적어도 약 1배와 동등한 상기 miRNA 마커의 발현의 증가는 상기 IST의 최소화의 증가된 실패 위험을 암시한다.

적어도 약 1배와 동등한 발현의 증가는 상기 miRNA 마커의 기준 발현량의 증가와 비교시, 적어도 약 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 20-배, 또는 그 이상 및 이들 사이의 모든 부분적인 정수들과 동등한 양의 증가일 수 있다. 바람직하게, 상기 증가는 배수 값이다. 발현의 증가를 정량화하는 방법의 예는 본 명세서의 어딘가에 개시된 실시예들에 개시된 바와 같이, 당해 분야에 공지되어 있다.

표준화

하나의 실시태양에서, 본 발명은 상기 miRNA 마커의 발현량을 표준화함을 포함한다. 상기 방법은 상기 피실험자로부터 miRNA의 발현 수준에 대한 기준으로서 상업적으로 입수할 수 있는 스파이크 처리된 마커의 발현량을 측정함을 포함한다.

급성 세포성 거부의 검출 또는 예측을 위해서

상기 방법은 거부된 기관을 갖거나 또는 기관 거부의 위험이 있는 제1 피실험자로부터의 생물학적 샘플 중의 miRNA 마커의 발현량을 측정함을 추가로 포함한다. 상기 방법은 비-거부 기관을 갖는 제2 피실험자로부터의 생물학적 샘플 중의 miRNA 마커의 발현량을 측정함을 추가로 포함한다. 또한, 상기 방법은 이들 두 유형의 피실험자들간에 상기 miRNA 마커의 측정된 양을 비교함을 포함한다. 더욱 또한, 급성 이식 거부가 나타난 경우, 상기 거부에 대한 치료를 권장한다.

상기 제1 피실험자의 miRNA의 수준이 제2 피실험자의 miRNA 수준보다 적어도 1배와 동등한 양만큼 더 큰 경우, 상기 계산은 이식된 기관을 갖는 피실험자에서 상기 이식된 기관의 증가된 거부 위험성을 가리킨다. 적어도 1배인 상기 계산된 증가는 적어도 약 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 20-배, 또는 그 이상 및 이들 사이의 모든 부분적인 정수들과 동등한 증가일 수 있다.

상기 제1 피실험자의 miRNA의 수준이 제2 피실험자의 miRNA 수준보다 1배 미만과 동등한 양만큼 더 큰 경우, 상기 계산은 이식된 기관을 갖는 피실험자에서 상기 이식된 기관의 증가된 거부 위험성을 가리킨다. 1배 미만인 상기 계산된 증가는 기껏해야 약 0.9-, 0.8-, 0.7-, 0.6-, 0.5-, 0.4-, 0.3-, 0.2-, 또는 0.1-배 또는 그 이하와 동등한 증가일 수 있다.

상기 방법은 IST 투여량의 최소화를 고려 중인 시험된 제1 피실험자로부터의 생물학적 샘플 중의 내인성 발현된 작은 비-암호화 기준 RNA의 발현량을 측정함을 추가로 포함한다. 상기 방법은 IST 투여량의 성공적인 최소화를 갖는 제2 피실험자로부터의 생물학적 샘플 중의 miRNA 마커의 발현량을 측정함을 추가로 포함한다. 또한, 상기 방법은 이들 두 유형의 피실험자들간에 상기 miRNA 마커의 측정된 양을 비교함을 포함한다. 더욱 또한, IST 최소화의 실패가 나타난 경우, 상기 피실험자의 치료를 권장한다.

상기 제1 피실험자의 miRNA의 수준이 제2 피실험자의 miRNA 수준보다 적어도 1배와 동등한 양만큼 더 큰 경우, 상기 계산은 IST 치료하의 피실험자에서 IST 투여량 최소화의 증가된 실패 위험성을 가리킨다. 적어도 1배인 상기 계산된 증가는 적어도 약 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 20-배, 또는 그 이상 및 이들 사이의 모든 부분적인 정수들과 동등한 증가일 수 있다.

상기 제1 피실험자의 miRNA의 수준이 제2 피실험자의 miRNA 수준보다 1배 미만과 동등한 양만큼 더 큰 경우, 상기 계산은 IST 치료하의 피실험자에서 IST 투여량 최소화의 증가된 실패 위험성을 가리킨다. 1배 미만인 상기 계산된 증가는 기껏해야 약 0.9-, 0.8-, 0.7-, 0.6-, 0.5-, 0.4-, 0.3-, 0.2-, 또는 0.1-배 또는 그 이하와 동등한 증가일 수 있다.

상응하게, 본 발명의 실시태양에서 상기 miRNA 마커에 대한 변화 배수 또는 이의 균등물을 상기 스파이크 처리된 기준 miRNA에 표준화한다.

급성 이식 거부의 검출

하나의 실시태양에서, 본 발명은 기관 이식을 받은 피실험자에서 급성 거부를 검출하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 상기 피실험자로부터의 시험 샘플 중 급성 거부를 가리키는 miRNA의 발현 수준을 검출하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 miRNA는 hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-122-5p, hsa-miR-99a-5p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR-34a-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-215, hsa-miR-375, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-505-3p, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-193b-3p, hsa-miR-874, hsa-miR-365a-3p, hsa-miR-152, hsa-miR-148a-3p 및 hsa-miR-29a-5p 또는 이들의 임의의 조합 중에서 선택된 적어도 하나이다. 이어서 상기 시험 샘플 중의 miRNA의 발현 수준을 대조군 샘플 중의 miRNA의 수준과 비교하며, 여기에서 상기 대조군 샘플에 대한 상기 시험 샘플 중 miRNA의 양의 증가는 상기 피실험자가 급성 세포성 거부(ACR)를 가짐을 암시한다. 더욱 또한, 급성 이식 거부가 나타난 경우, 상기 거부의 치료를 권장한다.

본 발명은 부분적으로, hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-122-5p, hsa-miR-99a-5p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR-34a-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-215, hsa-miR-375, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-505-3p, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-193b-3p, hsa-miR-874, hsa-miR-365a-3p, hsa-miR-152, hsa-miR-148a-3p 및 hsa-miR-29a-5p, 표 1에 제공된 miRNA, hsa-miR-4790-5p, hsa-miR-3692-3p, hsa-miR-4433b-3p, hsa-miR-6500-3p, hsa-miR-4445-5p, hsa-miR-5194, hsa-miR-4505, hsa-miR-4430, hsa-miR-374c-3p, hsa-miR-4506, hsa-miR-4286, hsa-miR-6816-5p, hsa-miR-758-3p, hsa-miR-4535, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-6765-5p, hsa-miR-3197, hsa-miR-1271-3p, hsa-miR-92a-1-5p, hsa-miR-8054, hsa-miR-455-5p, hsa-miR-7151-3p, hsa-miR-628-3p, hsa-miR-556-5p, hsa-miR-6726-5p, hsa-miR-1179, hsa-miR-3196, hsa-miR-6858-5p, hsa-miR-6778-5p, hsa-miR-4459, hsa-miR-380-5p, hsa-miR-1273e, hsa-let-7b-3p, hsa-miR-4481, hsa-miR-1908-5p, hsa-miR-149-3p, hsa-miR-651-3p 및 hsa-miR-124-5p(표 5에 제공된)를 포함하는 몇몇 miRNA의 증가된 발현이 급성 거부와 관련되고/되거나 이식 피실험자에서 급성 거부를 예측하는데 사용될 수 있다는 관찰에 기반한다. 특정한 실시태양에서, 상기 miRNA는 3개의 생물마커 hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-100-5p 및 hsa-miR-483-5p를 포함한다.

면역억제 요법( IST ) 투여량의 최소화 예측

하나의 실시태양에서, 본 발명은 기관 이식을 받았고 IST 하에 있는 피실험자의 검출 방법을 포함한다. 상기 방법은 상기 피실험자로부터의 시험 샘플 중의 IST를 가리키는 miRNA의 발현 수준을 검출하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 miRNA는 hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-424-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-421, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-223-5p, hsa-miR-495-3p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-374b-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-99a-5p, hsa-miR-18b-5p, hsa-miR-7-1-3p, hsa-miR-181c-5p, hsa-miR-454-3p, hsa-miR-485-3p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-99b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-20a-3p 및 hsa-miR-106b-5p, 또는 이들의 임의의 조합 중에서 선택된 적어도 하나이다. 이어서 상기 시험 샘플 중의 miRNA의 발현 수준을 대조군 샘플 중의 miRNA의 수준과 비교하며, 여기에서 상기 대조군 샘플에 대한 상기 시험 샘플 중 miRNA의 양의 증가는 상기 피실험자가 IST 투여량의 감소에 실패한 듯함을 암시한다. 추가로 상기 IST 최소화의 실패가 나타난 경우, 상기 피실험자의 치료를 권장한다.

본 발명은 부분적으로, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-424-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-421, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-223-5p, hsa-miR-495-3p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-374b-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-99a-5p, hsa-miR-18b-5p, hsa-miR-7-1-3p, hsa-miR-181c-5p, hsa-miR-454-3p, hsa-miR-485-3p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-99b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-20a-3p 및 hsa-miR-106b-5p(표 2에 나열됨)를 포함하는 몇몇 miRNA의 증가된 발현이 피실험자에서 IST 투여량의 최소화 실패 가능성과 관련된다는 관찰에 기반한다. 특정한 실시태양에서, 상기 miRNA는 3개의 생물마커 hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-424-3p 및 hsa-miR-125a-5p를 갖는다.

본 명세서에 기재된 데이터를 근거로, 이제 조성물 및 방법을 동종이식편 생검없이도 급성 거부의 신속하고 신뢰할 수 있는 검출 또는 예측뿐만 아니라 IST 투여량 최소화의 성공 또는 실패의 예측에 이용할 수 있다.

본 명세서에 나열된 miRNA들의 임의의 조합의 양을 본 명세서에 개시된 방법에 따라 검출할 수 있으며 대조군(기준선 수준)과 비교할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 하나의 miRNA의 발현 수준의 차이는 상기 피실험자가 급성 거부를 갖거나 나타낼 것임을 가리킨다. 그러나, 또 다른 실시태양에서, 2, 3, 4, 6, 8, 9 또는 그 이상의 miRNA의 임의의 조합의 양의 변화는 상기 피실험자가 급성 거부를 갖거나 나타낼 것임을 가리킬 수 있다. 이렇게 하여, 면역억제제의 용량을 변형시킬 수 있고, 예를 들어 증가시키거나 감소시키거나 또는 중단할 수 있고/있거나, 새로운 작용제를 상기 투여된 치료 섭생에 가할 수 있다. 일부 실시태양에서, 다른 치료 양상, 예를 들어 혈장교환술을 시작할 수 있다.

본 발명의 몇몇 태양에서, miRNA 발현의 수준을 피실험자로부터 수득한 샘플 중의 하나 이상의 miRNA에 대해서 측정한다. 상기 샘플은 유체 샘플, 예를 들어 혈액 샘플, 바람직하게는 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 함유하는 샘플, 소변 샘플, 바람직하게는 비뇨기세포, 예를 들어 상피세포 또는 침윤성 면역세포를 함유하는 샘플, 기관지폐포 세척액 샘플, 담즙 샘플, 흉수 또는 복막액, 또는 정상적으로 또는 비정상적으로 기능하는 동종이식편에 의해 분배되거나 배출되는 임의의 다른 유체, 또는 동종이식편을 통해 또는 동종이식편의 해부학적 부근에서 삼출 또는 형질도입으로부터 생성되는 임의의 다른 유체, 또는 동종이식편과 생리학적으로 접촉하거나 또는 인접한 임의의 유체일 수 있거나, 또는 본 명세서에 인용된 것들 이외의 임의의 다른 체액도 또한 본 발명에 포함되는 것으로 간주해야 한다.

당해 분야에 공지된 임의의 방법을 miRNA 발현 수준을 측정하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어, 마이크로어레이을 사용할 수 있다. 마이크로어레이은 당해 분야에 공지되어 있으며 유전자 산물(예를 들어 mRNA, 폴리펩티드, 그의 단편 등)에 서열이 상응하는 탐침이 공지된 위치에 특이적으로 하이브리드화되거나 결합될 수 있는 표면으로 이루어진다. 적어도 하나의 관심 miRNA를 검출하기 위해서, 시험 샘플을 적어도 하나의 핵산 탐침과 접촉시킴으로써 하이브리드화 샘플을 형성시킨다. miRNA의 검출에 바람직한 탐침은 miRNA에 하이브리드화할 수 있는 표지된 핵산 탐침이다. 상기 핵산 탐침은 예를 들어 전장 핵산 분자 또는 그의 일부, 예를 들어 적어도 10, 15 또는 20 뉴클레오티드 길이를 갖고 엄격한 조건하에서 적합한 miRNA에 특이적으로 하이브리드화하기에 충분한 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 상기 하이브리드화 샘플을, 상기 핵산 탐침의 관심 miRNA 표적의 특이적인 하이브리드화를 허용하기에 충분한 조건하에서 유지시킨다. 특이적인 하이브리드화를 경우에 따라, 매우 엄격한 조건하에서 또는 보통의 엄격한 조건하에서 수행할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 특이적인 하이브리드화를 위한 하이브리드화 조건은 고도의 엄격성이다. 이어서 특이적인 하이브리드화(존재하는 경우)를 표준 방법을 사용하여 검출한다. 특이적인 하이브리드화가 상기 핵산 탐침과 시험 샘플 중의 miRNA 사이에서 발생하는 경우, 상기 핵산 탐침 중에 존재하는 서열은 또한 상기 피실험자의 miRNA에도 존재한다. 하나보다 많은 핵산 탐침을 또한 사용할 수 있다. 스캐너에 의해 검출된 하이브리드화 강도 데이터는 자동적으로 획득되며 이를 애피메트릭스 마이크로어레이 스위트(Affymetrix Microarray Suite)(MASS) 소프트웨어에 의해 처리한다. 원 데이터 (raw data)를 150의 표적 강도를 사용하여 발현 수준에 표준화한다. 소수의 상이한 유전자들의 miRNA 발현 프로파일을 측정하기 위한 선택적이고 바람직한 방법은 예를 들어 고전적인 TaqMan? 유전자 발현 분석 또는 TaqMan? 저밀도 어레이 - 미세 유동 카드(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems))에 의한다. 특히, 본 발명은 바람직하게는 마이크로RNA qPCR 시스템을 사용한다. 비제한적인 예는 상업적인 키트, 예를 들어 바이오래드(Bio-rad)(미국 캘리포니아주 버클리 소재)로부터 상업적으로 입수할 수 있는 PrimePCRPathway?, 엑시크온(Exiqon)(덴마크 소재)으로부터 상업적으로 입수할 수 있는 miRCURY LNA™ 유니버셜 RT 마이크로RNA PCR, 또는 퀴아겐(Qiagen)(네덜란드 소재)으로부터 상업적으로 입수할 수 있는 커스텀(Custom) RT2 프로파일러(Profiler) PCR 어레이를 포함한다. 상기 miRNA 발현 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있는 방법의 또 다른 예는 나노스트링 테크놀로지(Nanostring Technology)?(미국 워싱톤주 시애틀 소재)로부터의 nCounter?에서와 같이 단일 반응의 수백 개의 독특한 전사물들을 검출하고 카운트하는 분자 색상-암호화 바코드 및 단일 분자 영상화의 사용이다. 상기 기술을 사용하여, 각각의 색상-암호화된 바코드를, 상기 각각의 색상-암호화된 바코드가 단일의 표적 분자를 나타내도록 관심 유전자에 상응하는 단일의 표적-특이성 탐침에 부착시킨다. 바코드는 상기 표적 분자에 직접 하이브리드화하며, 매우 민감한 디지털 데이터를 제공하는 증폭의 필요 없이 개별적으로 카운트될 수 있다. 하이브리드화 후에, 과잉의 탐침을 제거하고 상기 탐침/표적 복합체를 상기 nCounter? 카트리지에 정렬하고 고정화시킨다. 상기 샘플 카트리지를 데이터 수집을 위해 nCounter? 디지털 분석기에 놓고 상기 카트리지 표면상의 색상 코드를 카운트하고 각각의 표적 분자에 대해 표를 작성한다.

마이크로RNA의 프로파일링을 위해 본 발명에 의해 고려되는 다른 기술들은 파이어플라이(Firefly)™ 마이크로RNA 분석(파이어플라이 바이오웍스 인코포레이티드(Firefly BioWorks Inc)(미국 02139 매사추세츠주 캠브리지 소재))과 같은 하이드로젤 입자의 사용에 의존한다. 상기 분석은 다공성 입자를 기본으로 하며, 표적 분자가 다양한 생물학적 샘플에서 정확한 복합적인 miRNA 검출을 촉진하는 독특한 나노규모 3차원 스캐폴드 중에 확산되고 결합되게 한다. 본 발명은 특히 어떠한 선행의 RNA 정제도 없이 혈액, 혈청 또는 혈장과 같은 샘플로부터 직접 순환하는 마이크로RNA 생물마커를 프로파일링하기 위한 파이어플라이™ 순환 마이크로RNA 분석의 사용을 고려한다.

샘플, 특히 miRNA의 전사 상태를 또한 당해 분야에 공지된 다른 핵산 발현 기술에 의해 측정할 수 있다.

하나의 실시태양에서, 상기 miRNA를 기관 이식 수용자로부터의 샘플에서 검출한다. 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 마이크로RNA(특히 본 명세서의 어딘가의 표 1 내지 5에 제공된 miRNA)의 수준을 측정하는데 사용할 수 있다. miRNA를 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 상기 샘플로부터 단리할 수 있다. 비제한적인 예는 상업적인 키트를 포함하며, 예를 들어 퀴아겐(네덜란드 소재)으로부터 상업적으로 입수할 수 있는 miRNeasy?, 또는 몰레큘라 리써치 센터 인코포레이티드(Molecular Research Center, Inc.)(미국 오하이오주 신시내티 소재)로부터 상업적으로 입수할 수 있는 미니 키트 TRI 시약?을 RNA의 단리에 사용할 수 있다.

일반적으로, 상기 단리된 miRNA를 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 증폭시킬 수 있다. 예를 들어 PCR 또는 RT-PCR 방법을 사용하는 증폭 시스템이 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다. 증폭 기술에 대한 일반적인 개요에 대해서, 예를 들어 문헌[Dieffenbach et al ., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1995)]을 참조하시오.

마이크로RNA(특히 본 발명의 어딘가의 표 1 내지 5에 제공된 miRNA)의 수준을 측정하기 위한 또 다른 방법은 예를 들어 복합 PCR에 유용한 분자 비콘 및 다른 표지된 탐침의 사용을 포함한다. 복합 PCR 분석에서, 상기 PCR 혼합물은 선택된 miRNA PCR 산물에 대한 프라이머 및 탐침을 함유한다. 전형적으로, 단일의 형광색소가 상기 분석에 사용된다. 상기 분자 비콘 또는 탐침은 miRNA의 수준을 측정하기 위해 검출된다. 분자 비콘은 예를 들어 문헌[Tyagi and Kramer, Nature Biotechnology 14, 303-308, 1996] 및 안드루스와 니콜스(Andrus and Nichols)의 미국 출원 공보 제 20040053284 호에 기재되어 있다.

miRNA 발현의 또 다른 정확한 프로파일링 방법은 제1, 제2, 제3뿐만 아니라 후속의 차세대 서열분석 기술을 포함하는 차세대 서열분석(NGS)의 사용일 수 있다. 비제한적인 예는 나노포어 또는 반도체 기술(예를 들어 옥스포드 나노포어 테크놀로지스(Oxford Nanopore Technologies), 영국 소재) 또는 일루미나 마이크로RNA-Seq 플랫폼(Illumina microRNA-Seq Platform)(문헌[Luo S., 2012, Methods Mol Biol. 822:183-8])일 수 있었다.

일부 실시태양에서, miRNA 수준의 상향조절은 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 20-배, 또는 그 이상 및 이들 사이의 모든 부분적인 정수의 기준선 수준 이상; 뿐만 아니라 0.9-, 0.8-, 0.7-, 0.6-, 0.5-, 0.4-, 0.3-, 0.2-, 또는 0.1-배, 또는 그 이하의 기준선 수준 이상의 증가를 포함한다.

일부 실시태양에서, 상기 발현 수준을 로그-변환된 miRNA 수준을 사용하여 측정한다. 로그 변환 또는 miRNA 수준은 데이터에서 양의 왜곡도를 실질적으로 감소시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 발현 수준을 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 miRNA 수준을 표준화함으로써 측정된 로그-변환된 miRNA 수준을 사용하여 측정한다. 로지스틱 회귀 모델은 로지스틱 곡선상의 데이터 적합에 의한 급성 거부 발생 확률의 예측에 사용된다. 상기는 2항 회귀에 사용되는 일반화된 선형 모델이다.

일부 실시태양에서, 정량적인 핵산 발현 측정의 해석을 위해서, 샘플들 간의 샘플 입력, RNA 품질 및 RT 효율의 차이에 대한 발현 데이터의 보정을 위해 정규화군(normalizer)이 필요할 수도 있다. 일부 실시태양에서, 증가된 miRNA가 유의수준인지를 정확하게 평가하기 위해서, 상기 miRNA 발현을 표준화하여 샘플들간의 발현 수준을 정확하게 비교할 수 있다, 예를 들어 상기는 발현이 비교되는 기준선 수준이다. 정량분석에서, 예를 들어 정량적인 실시간 역전사효소-PCR(qRT-PCR) 표준화를 조사 중인 miRNA의 발현 수준에 대한 기준으로서 스파이크 처리된 마커를 사용하여 수행할 수 있다. 표준화는 상이한 어레이 또는 PCR 또는 특히 RT-PCR 실험의 측정을 기술적 가변성의 감소 또는 제거에 의해 비교 가능하게 만드는 것을 포함한다. 이들 실험 내에 상기 측정을 왜곡시킬 수 있는 원인의 다양성이 존재한다. 가능한 기술적 간섭 원인은 역전사에서 상이한 효율, 표지 또는 하이브리드화 반응뿐만 아니라 어레이 문제, 시약의 배치 효과, 또는 실험실-특수 조건이다. 표준화에 의해 miRNA 발현의 보다 확고한 검출이 발생할 수 있다.

전형적으로, miRNA 표준화는 공지된 분획 주기수 또는 교차점을 갖는 스파이크 처리된 마커의 사용을 포함한다. 이들을 miRNA 발현의 정량분석에서 기준, 내부 대조군 또는 기준값으로서 사용한다. 스파이크 처리된 마커는 상이한 miRNA 샘플들에 걸쳐 발현 및 전사의 최소 변화를 나타내며 따라서 상이한 샘플들에 걸쳐 가변적인 miRNA 활성의 측정을 위한 대조군, 또는 기준으로서 작용한다. 스파이크 처리된 마커는 비제한적으로 UniSp2 및 UniSp4(엑시크온, 덴마크 소재)일 수 있다.

수신기 작동 특성(receiver operating characteristic: ROC) 곡선을 개별적인 miRNA 수준 및 miRNA 수준들의 선형 조합에 대해 생성시켜, ACR 검출 또는 ACR 예측뿐만 아니라 IST의 성공적인 최소화 가능성의 검출을 위한 최고로 조합된 감도 및 특이성을 제공하는 컷오프 점을 결정할 수 있다.

이는 상기 miRNA 수준들을, 하기 hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-122-5p, hsa-miR-99a-5p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR-34a-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-215, hsa-miR-375, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-505-3p, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-193b-3p, hsa-miR-874, hsa-miR-365a-3p, hsa-miR-152, hsa-miR-148a-3p 및 hsa-miR-29a-5p; 및/또는 hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-424-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-421, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-223-5p, hsa-miR-495-3p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-374b-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-99a-5p, hsa-miR-18b-5p, hsa-miR-7-1-3p, hsa-miR-181c-5p, hsa-miR-454-3p, hsa-miR-485-3p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-99b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-20a-3p 및 hsa-miR-106b-5p에 대해 단독으로, 함께, 또는 임의의 조합으로 측정함을 수반한다. 이어서 이들 조합을 증가된 발현을 근거로 가중치를 더한다. 상이한 생물마커들에 대한 이들 통계학적 분석은 문헌[Zhang et al ., 2005, Biostatistics Working Paper Series]에 개시되어 있다. 당해 분야에 공지된 생물마커의 정량분석을 위한 다른 통계학적 분석 방법들을 또한 사용할 수 있다.

조성물

본 발명은 hsa-miR-125b-5p, hsa-miR-100-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-122-5p, hsa-miR-99a-5p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR-34a-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-215, hsa-miR-375, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-505-3p, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-193b-3p, hsa-miR-874, hsa-miR-365a-3p, hsa-miR-152, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-29a-5p (표 1), hsa-miR-4790-5p, hsa-miR-3692-3p, hsa-miR-4433b-3p, hsa-miR-6500-3p, hsa-miR-4445-5p, hsa-miR-5194, hsa-miR-4505, hsa-miR-4430, hsa-miR-374c-3p, hsa-miR-4506, hsa-miR-4286, hsa-miR-6816-5p, hsa-miR-758-3p, hsa-miR-4535, hsa-miR-490-3p, hsa-miR-6765-5p, hsa-miR-3197, hsa-miR-1271-3p, hsa-miR-92a-1-5p, hsa-miR-8054, hsa-miR-455-5p, hsa-miR-7151-3p, hsa-miR-628-3p, hsa-miR-556-5p, hsa-miR-6726-5p, hsa-miR-1179, hsa-miR-3196, hsa-miR-6858-5p, hsa-miR-6778-5p, hsa-miR-4459, hsa-miR-380-5p, hsa-miR-1273e, hsa-let-7b-3p, hsa-miR-4481, hsa-miR-1908-5p, hsa-miR-149-3p, hsa-miR-651-3p and hsa-miR-124-5p(표 5); 및/또는 hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-424-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-421, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-223-5p, hsa-miR-495-3p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-374b-5p, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-99a-5p, hsa-miR-18b-5p, hsa-miR-7-1-3p, hsa-miR-181c-5p, hsa-miR-454-3p, hsa-miR-485-3p, hsa-miR-374a-5p, hsa-miR-99b-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-20a-3p 및 hsa-miR-106b-5p(표 2)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 3개의 miRNA의 검출에 유용한, 표지되거나(예를 들어 형광물질, 소광물질 등) 또는 표지되지 않은 바람직한 탐침 또는 프라이머의 세트를 포함한다. 특히 바람직한 탐침 세트는 ACR의 진단 또는 예측의 경우 3개의 생물마커, hsa-miR-483-5p, hsa-miR-125b-5p 및 hsa-miR-100-5p; 및 IST의 최소화를 위한 내성 진단의 경우 3개의 생물마커 hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-424-3p and hsa-miR-125a-5p를 검출할 수 있는 탐침을 포함한다.

키트

몇몇 실시태양에서, 키트를 제공한다. 이들 방법에 사용하기 위한 상업적으로 입수할 수 있는 키트는 본 명세서에 비추어 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다. 일반적으로, 키트는 관심 폴리펩티드 또는 핵산 또는 mRNA의 존재를 검출하기에 적합한 검출 시약을 포함할 것이다.

또 다른 실시태양에서, 탐침 세트의 패널이 존재한다. 바람직한 탐침 세트는 하나 이상의 miRNA의 발현을 검출하고 이식편의 거부 및/또는 IST의 최소화에 대한 정보를 제공하도록 설계된다. 탐침 세트는 특정 게놈에서 가능한 한 많은 miRNA를 검출하고자 하는 탐침 세트보다 더 작고 더 저렴하기 때문에 특히 유용하다. 상기 탐침 세트는 급성 거부 또는 IST 최소화에 대한 내성에 관한 정보를 알려주는 miRNA의 검출을 표적화한다. 탐침 세트는 또한 이식 거부 또는 IST의 최소화에 관한 정보를 알려주지 않는 miRNA를 검출하는 다수 또는 소수의 탐침을 포함할 수도 있다. 상기와 같은 탐침은 대조군으로서 및 표준화(예를 들어 스파이크 처리된 마커)에 유용하다. 탐침 세트는 건조 혼합물 또는 용액 중 혼합물일 수 있다. 일부 실시태양에서, 탐침 세트를 고체 기재에 붙여 탐침들의 어레이를 형성시킬 수 있다. 탐침 세트는 또한 복합 PCR에도 유용할 수 있을 것으로 예상된다. 상기 탐침은 핵산(예를 들어 DNA, RNA, DNA 및 RNA의 화학적으로 변형된 형태들), LNA(잠금 핵산), 또는 PNA(펩티드 핵산), 또는 목적하는 핵산 서열과 특이적으로 상호작용할 수 있는 임의의 다른 중합체성 화합물일 수 있다.

키트를 본질적으로 임의의 샘플(예를 들어 소변, 혈액 등) 중의 miRNA의 단리 및/또는 검출을 위해 설계할 수 있을 것으로 생각되며, 광범위하게 다양한 시약 및 방법들은 본 명세서에 비추어 당해 분야에 공지되어 있다.

하기의 실시예들은 본 발명의 태양들을 추가로 예시한다. 그러나, 이들 실시예는 본 명세서에 제시된 바와 같은 본 발명의 교시 또는 개시를 결코 제한하지 않는다.

실시예

이제 본 발명을 하기의 실시예들을 참조하여 기재한다. 이들 실시예는 단지 예시를 위해 제공되고 본 발명을 결코 이들 실시예에 제한되는 것으로 해석해서는 안 되며, 오히려 본 명세서에 제공된 교시의 결과로서 자명해지는 모든 변화들을 포함하는 것으로 해석해야 한다.

추가의 기재 없이, 당해 분야의 통상적인 숙련가는 선행의 기재 및 하기의 예시적인 실시예를 사용하여, 본 발명의 화합물을 제조 및 사용하고 특허청구된 방법을 실시할 수 있을 것으로 믿는다. 따라서 하기의 실시예들은 본 발명의 바람직한 실시태양을 구체적으로 지적하며 상기 개시의 나머지를 임의의 방식으로 제한하는 것으로서 해석해서는 안 된다.

이제 본 명세서에 개시된 실험에 사용되는 물질 및 방법을 개시한다.

물질 및 방법

임상 시험 연구

국립 보건원(NIH)으로부터의 3개의 임상 시험 연구로부터의 데이터를 여기에서 사용하였다. 면역 내성 네트워크 A-WISH 연구(ITN 연구: ITN030, www.clinicaltrials.gov/ct2/show/record/NCT00135694에서 입수할 수 있다), 기관 이식에서 임상 시험(CTOT-03, www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00531921?term=CTOT-03&rank=1에서 입수할 수 있다), 및 성인에서 성인 간으로의 살아있는 공여자 간 이식(A2ALL, www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02073435?term=A2ALL&rank=2에서 입수할 수 있다).

포함 및 제외 기준

연구 피실험자는 임상적으로 지시된 간 생검시에 SVR로 남아있는 이식 전 HCV 감염에 대해 치료된 피실험자를 포함하여, 비-면역 간질환 때문에 이식된 성인 수용자일 것이 요구되었다. 피실험자는 타크롤리무스-기재 면역억제를 받아야 한다. 종합해서, 상기 CTOT-03 및 -04 프로토콜은 채혈을 수반하는 관찰 연구에 참가하기 위해 접근된 피실험자들 중에서 >95% 합의율을 나타내었다.

miRNA 프로파일

RNA를 상기 피실험자의 혈청으로부터 추출한 다음 miRNA 프로파일링 및 분석을 수행하였다. miRNA 프로파일링은 miRCURY LNA™ 유니버셜 RT 마이크로RNA PCR 패널(엑시크온, 덴마크 소재)을 통해 수행되었다. 동일한 용출 부피의 핵산이 각각의 역전사 반응에 사용되도록 혈청 투입을 일정하게 유지한다. 스파이크 처리 분석은 추출, 역전사 및 실시간 PCR의 효율을 조절하였다. 표준 miRNA PCR 어레이를 특징적인 miRNA의 정량적인 측정이 허용되도록 공지된 Cq(분획 주기수 또는 교차점)를 갖는 스파이크 처리 마커와 함께 사용하였다.

발현 데이터 표준화

플레이트간 교정(IPC) 후에, 주기 한계를 벗어난 개별적인 측정을, 상기 측정이 진정한 누락 값이라기보다는 검출 한계 아래에 있기 때문에, 실행으로부터의 최고 Cq 값 출력으로 교체하여 후속 처리에서 그의 포함을 허용하였다. 상기 값을 36으로부터 공제하여 qPCR-기반 분석에 대한 대략적으로 신뢰할만한 정량분석 한계에서 0 설정과 함께 상대적인 발현 값(log2-스케일로)을 제공하였다. 기술적인 처리 변화를 표준화하기 위해서, 각각의 샘플에 대해 UniSp2 및 UniSp4(엑시크온, 덴마크 소재) 외인성 스파이크 처리된 miRNA에 대한 연구 집단 평균으로부터의 편차의 평균을 각 샘플내의 각각의 miRNA에 대한 상대 발현 값으로부터 공제하였다. 모분산 대 상기 표준화된 miRNA 발현 값에 대한 평균 플롯의 분석으로부터, 검출 한계(LOD)를 0 초과인 것으로 추정하였으나, 이를 -2 초과로 연장시킬 수 있었으며, 이때 집단 표준편차의 한계는 2.5 미만이었다. 상기 LOD를 기준으로, -2 미만의 상대 발현 값을 갖는 miRNA를 -3으로 조절하였다. -2 미만의 집단 평균 또는 2.5 초과의 집단 표준 편차를 갖는 miRNA를 연속적인 변수 분석에 부적합한 것으로서 표시하였다. 상기 miRNA가 ACR = 예 및 ACR = 아니오 하위그룹에 대한 적어도 2개의 샘플에 대해 -2 초과의 신호를 갖는 경우, 상기 miRNA를 상대 발현이 -2 초과인 경우 '1'로 또는 그렇지 않으면 '0'으로 값을 양분 후에 범주형 분석에 대해 고려하였다. 연속적인 변수 또는 범주형 분석에 대해 고려되지 않은 miRNA는 후속의 통계학적 분석에 포함시키지 않았다.

통계학적 분석

표준화된 miRNA 발현 값을 추가적인 데이터 QC 및 단일 변수 분석을 위해 어레이 스튜디오(Array Studio) 소프트웨어(www.omicsoft.com)에 가져오기하였다. 주요 성분 분석(PCA) 클러스터링 및 MAD 스코어 모두에 의해 관련된 이상치는 제외시켰다. 생검-입증된 ACR 및 비-거부 에피소드 중 수집된 혈청 샘플들을 발견(14 ACR 및 37 비-ACR 샘플) 및 복제(13 ACR 및 40 비-ACR 샘플) 세트로 무작위로 지정하였다. 상기 ACR 상태와 개별적인 miRNA 발현 수준간의 관련성을 일반적인 선형 모델을 사용하여 시험하여, 이식 이래 잠재적인 코파운더(cofounder) 시간을 조절하였다. 오류 발견율(FDR)을 다수의 시험 보정에 적용하였다.

로지스틱 회귀 분석을 사용하여 비-ACR 에피소드로부터 ACR을 식별하는 ACR-관련된 혈청 miRNA의 인색한 (parasimonious) 부분집합들을 확인하였다. 6-항 이하의 모델을 가변 선택 방법으로서 변환과 함께 계층적 전진으로 형성시켰다. 각각의 예측변수가 P<0.1에서 유의수준인 상기 모델들로부터, 임시 선택은 최적합 모델로서 최대의 로그-가능성 및 최대의 수신기 작동 특성(ROC) 곡선 아래 면적을 갖는 miRNA를 기준으로 하였다. 상기 모델로부터의 회귀 평가는 진단학적 특징을 규명하였으며, 곡선 아래 면적(AUC), 감도 및 특이성을 사용하여 비-ACR 에피소드로부터 ACR을 식별하는 상기 특징의 능력을 평가하였다.

상기 획득된 miRNA 진단학적 특징을 확인하기 위해서, 상기 ITN 샘플로부터 획득된 진단학적 특징 중에 포함된 miRNA에 대한 회귀 계수를 사용하여 상기 복제 데이터세트 중의 각 샘플(CTOT-3 연구로부터 획득된 샘플 및 ITN 시험에 참가한 무작위화되지 않은 피실험자로부터 수집한 샘플)에 대한 상기 miRNA의 발현 값을 요약하기 위해 종합 점수를 계산하였다. 이어서 상기 종합 점수를 로지스틱 회귀 모델에 사용하였다. 정확한 분류%, AUC, 감도 및 특이성을 이들 두 복제 데이터세트에 대해서 계산하였다.

상기 획득된 진단학적 특징의 예측값을 조사하기 위해서, 상응하는 95% 신뢰도 구간(CI)을 갖는 LOESS(국소적으로 추정된 산포도 평활) 곡선을 상기 진단학적 특징의 회상 궤도에 대해 획득하여, ACR 및 비-ACR 에피소드에 대한 생검 시간으로부터 역으로 검토하였다.

상기 내성 생물마커를 확인하기 위해서, 25% 면역억제 용량에서 내성인 피실험자들로부터의 10개 혈청 샘플을 25% IST 용량에서 실패한 피실험자로부터의 11개 혈청 샘플과 비교하였다. 상기 25% IST 용량에서 실패-내성 상태와 개별적인 miRNA 발현 수준간의 관련성을 일반적인 선형 모델을 사용하여 시험하여, 이식 이래 잠재적인 코파운더 시간을 조절하였다. 오류 발견율(FDR)을 다중 시험 보정에 적용하였다. 로지스틱 회귀 분석을 사용하여 다중 시험 보정을 통과한 3개의 IST-내성-관련된 혈청 miRNA로 이루어지는 모델을 형성시켰다. 상기 모델로부터의 회귀 평가는 IST 최소화 특징을 규명하였으며, 곡선 아래 면적(AUC), 감도 및 특이성을 사용하여 다양한 면역억제 최소 투여량에서 25% 면역억제 용량 실패한 피실험자로부터 내성인 피실험자들을 식별하는 상기 특징의 능력을 평가하였다.

모든 통계학적 분석들을 어레이 스튜디오 소프트웨어(www.omicsoft.com), NCSS 버전 8.0.14(www.ncss.com) 및 R(cran.r-project.org)에서 수행하였다.

파워 및 샘플 크기

파워 및 샘플 크기 계산을 일반적인 선형 모델의 사용을 가정하여 수행하였다. 상기 ITN 연구로부터의 평가를, 그의 보다 넓은 샘플 크기 및 보다 안정한 분산 평가때문에 파워 계산에 사용하였다. 상기 3-miRNA ACR-Dx 생물마커 모델 예측 점수의 관찰된 그룹내 분산 및 생검 입증된 거부를 갖는 것으로 예상된 피실험자의 비율을 근거로, 75명의 피실험자(25명의 거부 사례 및 50명의 대조군 비-거부 피실험자)가 파워 분석에서, 상기 ITN 연구에서 관찰된 바와 같이 동일한 크기의 평균 유의수준 차이를 관찰하기 위해 알파=0.00001에서, 또는 상기 ITN 연구에서 관찰된 바와 같이 75% 수준에서 평균 유의수준 차이를 관찰하기 위해 알파=0.001에서 90% 파워를 가질 필요가 있는 것으로 추정되었다.

표

표 1: 2-단계 연구에 의한 ACR 진단과 관련된 miRNA의 목록

표 2: 25% 면역억제 최소화에서 실패한 샘플과 내성 샘플간의 유의수준 miRNA(P<0.01)의 목록

표 3: 19 ACR 및 16 비-ACR 샘플을 포함하여 추적 연구에서 검출된 ACR 진단과 관련된 miRNA의 목록

표 4: 엑시크온 인간 miRNA 패널을 사용하여 확인되고 퀴아겐 인간 miRNome miRNA PCR 어레이로 확인된 상위 ACR-관련된 miRNA의 목록

표 5: 퀴아겐 인간 miRNome miRNA PCR 어레이를 사용하여 확인된 상위 ACR-관련된 miRNA(공칭 p<0.15)의 목록

표 6: ACR 예측 및/또는 IST 최소화 내성을 위해 선택된 miRNA 생물마커들 및 그들의 관련된 표적 서열의 목록

표 7: ACR 예측 및/또는 IST 최소화 내성을 위해 선택된 miRNA 생물마커들 및 그들의 관련된 표적 서열에 대한 서열 식별자

이제 상기 실험들의 결과를 하기 실시예에 기재한다.

실시예 1: 급성 세포성 거부( ACR )의 검출 및 예측을 위한 혈청 miRNA 특징의 확인

여기에 제공된 결과는 임상적으로 지시된 생검 시간에 획득된 miRNA 프로파일이 이식 후 임의의 시간에서 생검-확인된 급성 거부의 진단임을 입증한다.

miRNA 프로파일링을 이식-30(ITN-30) 연구에서 건강한 면역 내성 국립 연구소로부터의 42명의 임상 시험 참가자로부터의 233개 혈청 샘플상에서 수행하였다. 상기는 miRCUPY LNA™ 유니버셜 RT 마이크로RNA PCR v3 패널(엑시크온, 덴마크 소재)을 사용하여, 면역억제 철회로 무작위화된 33명의 피실험자 및 유지로 무작위화된 9명의 피실험자를 포함하였다. 본 연구의 주목적은 1) 급성 세포성 거부(ACR) 사건의 진단을 위해 혈청 miRNA 특징을 확인하고; 2) ACR 사건의 예측을 위해 혈청 miRNA 특징을 확인하고; 3) 내성이 발생한 피실험자로부터 면억억제 철회를 실패한 피실험자를 구별하기 위해 혈청 miRNA 특징을 확인하고; 4) 면역억제 용량 및 저점 수준 (trough level)과 관련된 miRNA 마커를 확인하기 위한 것이다. 상기 엑시크온 miRNA 패널은 독특한 752개 miRNA 분석을 포함하였으며 이 중 240개는 의미 있는 통계학적 분석을 허용하기에 충분한 비율의 샘플에서 신뢰할만한 정량분석 하한 이상이었다. 2-단계 연구 설계(14개 ACR 샘플 및 37개 비-ACR 샘플로 이루어지는 발견 단계; 13개 ACR 샘플 및 40개 비-ACR 샘플로 이루어지는 복제 단계)에서 생검 입증된 거부로부터의 혈청 샘플과 생검 입증된 거부가 없는 혈청 샘플의 비교를 수행하였다. 상기 발견 단계에서 공칭 유의수준(P<0.05)인 miRNA로부터 26개 중 11개가 상기 복제 단계에서 P<0.05에서 확인되었다. 상기 결합된 데이터세트에서, 15개 miRNA가 다중 시험 보정(FDR 조절된 P<0.05) 후에 ACR 진단과 유의수준으로 관련되었다(표 1). 이들 15개 miRNA는 상기 발견과 복제 단계 사이에서 복제된 11개 miRNA 전부를 포함한다. 비-ACR로부터 ACR을 보다 양호하게 구별할 수 있는 다수의 마커 패널/특징을 형성시키기 위해서, 상기 언급한 15개 유의수준 miRNA 및 무작위화 이후 시간을 전진 변수 선택을 위한 로지스틱 회귀 모델링에 입력으로서 사용하였다. 3개의 miRNA, hsa-miR-125b, hsa-miR-100 및 hsa-miR-483은 최종의 인색한 모델 중에 남아있었다. 이들 3개의 miRNA(여기에서 3-miRNA 혈청 ACR 진단 특징으로서 지칭됨)로 구성된 상기 로지스틱 회귀 모델은 0.898의 곡선아래면적(AUC), 92.6% 감도 및 84.2% 특이성(P=0.0001)(도 1)으로 비-ACR로부터 ACR을 구별하는 능력을 제공한다.

간 이식에서 ACR에 대한 예측 특징으로서 상기 언급한 3-miRNA 혈청 ACR 진단 특징을 사용하여, 본 발명은 여기에서 면역억제 요법(IST) 용량의 최소화를 위한 진단 및 예후뿐만 아니라 거부에 대한 궤적을 평가하였다. 구체적으로, ACR 사건을 예측하기 위해 상기 3-miRNA 혈청 ACR 진단 특징을 사용할 가능성을 거부의 개시 전에 조사하였다. LOESS 플롯(도 2)에 도시된 바와 같이, 상기 miRNA 특징 모델 점수는 ACR의 발생 전(0일째)에 상승된 반면, 상기 특징 모델 점수의 수준은 비-ACR 그룹에서 상승하지 않은 채로 있었으며, 이때 ACR의 95% 신뢰도 밴드가 ACR 사건 40일 전에 비-ACR의 경우로부터 분리되었다.

실시예 2: 면역억제 최소화 내성의 예측을 위한 혈청 miRNA 특징의 확인

이들 실험을, 피실험자가 거부의 유도 없이 보다 낮은 용량의 투약을 허용할 수 있을 것임을 예측하는 면역억제 최소화에 대한 추가적인 임상적으로 관련된 생물마커를 확인하기 위해 설계하였다. 각각의 내성 생물마커를 확인하기 위해서, 25% 면역억제 용량(또한 초기 IST 용량의 75%까지의 감소를 의미한다)에서 내성인 피실험자로부터 10개의 혈청 샘플을 25% IST 용량에서 실패한 피실험자로부터의 11개 혈청 샘플과 비교하였다(이들 혈청 샘플을 거부가 발생하기 전 평균 58일째에 취하였다). 상기 25% IST 용량을, 다수의 피실험자(모든 참가자의 40%)가 상기 단계에서 실패하였기 때문에 상기 비교에 대한 기준으로서 사용하였으며, 이는 혈청 miRNA에서 큰 변화가 발생하는 경우를 나타낼 수 있으며, 이는 보다 낮은 IST 용량에서 내성이거나 실패할 수도 있는 환자를 가장 잘 구별한다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 30 miRNA의 수준은 25% IST 용량에서 최종적으로 실패한 피실험자들과 25% IST 용량에서 내성인 피실험자들로부터 취한 샘플들 사이에서 P<0.01에서 현저하게 상이한 것으로 밝혀졌다. 3개의 miRNA는 다중 시험 보정(FDR P<0.05) 후에 여전히 유의수준이었다. 상기 ACR 진단을 위한 혈청 miRNA 생물마커는 보다 높은 유의수준의 내성에 대한 생물마커의 목록상에 있지 않음이 주목되며, 이는 거부 대 내성의 생리학적 상태의 잠재적인 생물학적 차이를 암시한다.

상기 확인된 내성 관련된 miRNA 생물마커가 예측값을 갖는지의 여부를 시험하기 위해서, 25% IST 용량에서 내성 관계에 대해 FDR < 0.05 유의수준 한계를 통과한 3 miRNA(hsa-miR-146b, hsa-miR-424 및 hsa-miR-125a)를 포함하는 종합 점수 모델을 구성하였다. 75% IST 용량에서 또는 무작위로(100% IST 용량) 상기 3 miRNA의 발현 수준을 근거로 계산된 종합 점수를 사용하여 상기 25% IST에서 내성인 피실험자가 25% IST 용량에서 실패한 피실험자와 구별될 수 있는지의 여부를 시험하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 75%(P=0.02) 또는 100%(P=0.06) IST 용량에서 상기 3-miRNA 내성 특징 모델은 상기 25% IST 용량에서 최종적으로 실패한 피실험자들을 상기 25% IST 용량에서 최종적으로 내성으로 된 피실험자들로부터 구별할 수 있다. 상기 75% IST 용량에서 상기 3-miRNA 내성 특징 모델로부터의 점수는 AUC = 0.877, 감도 = 0.82, 특이성 = 0.90을 갖는 것으로 평가되어 상기 25% IST 용량에서 실패하거나 내성으로 되는 피실험자를 예측하였다. 상기 결과는 환자들이 상기 실패율이 최소일 때(우리의 ITN 데이터를 근거로, 93%의 피실험자가 75% IST 용량에서 내성일 수 있는 것으로 평가되었다) 상기 최소화 과정 동안 초기에 25% IST 용량을 계속해서 나타낼 수 있음을 예측함으로써 상기 IST 최소화 과정을 크게 개선시키는 능력을 입증한다.

실시예 3: 급성 세포성 거부( ACR )의 검출 및 예측을 위한 miRNA 혈청 특징의 복제

ACR 진단 특징에 대해서 앞서 확인된 3-miRNA 특징(I기 연구, 앞서 실시예 1에 제공됨)뿐만 아니라 23개의 ACR-관련된 miRNA의 목록을 초기에 복제하기 위해서, 2개의 독립적인 연구로부터의 혈청 샘플의 miRNA 프로파일링을 엑시크온(덴마크 소재)으로부터의 752 miRCURY LNA™ 유니버셜 RT 마이크로RNA PCR v3 패널을 통해 후속으로 분석하였다. 상기 첫 번째 연구는 IST 철회 또는 유지로 무작위화되지 않은 ITN 참가자들로부터의 15개 ACR 및 5개 비-ACR 혈청 샘플을 포함하였다. 두 번째 연구는 NIH-CTOT03 전향적 연구로부터의 4개의 ACR 및 11개의 비-ACR 샘플을 포함하였다. 표준 품질 조절(QC) 척도에 실패한 miRNA를 제외한 후에, 상기 23개 ACR-관련된 miRNA 중 20개를 ACR과의 관계를 시험하기 위해서 로지스틱 회귀 모델링에 포함시켰다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 20개의 miRNA는 모두 상기 추적 연구에서 복제되었다.

ACR을 비-ACR과 구분하는 앞서 확인된 3-miRNA(hsa-miR-125b, hsa-miR-100 및 hsa-miR-483) 혈청 다중 마커 특징의 성능을 또한 상기 추적 연구에서 평가하였다. 상기 3-miRNA 혈청 ACR 진단 특징으로 구성된 종합 점수를 유도하기 위해 상기 로지스틱 회귀 모델에서 상기 연구의 I기(앞서 실시예 1에 제공됨)로부터 획득된 동일한 계수를 사용하는 경우, 상기 모델은 또한, 0.885의 AUC(95% CI: 0.94 내지 0.83), 84% 감도 및 75% 특이성(P=0.01)(도 4)으로 ACR을 비-ACR로부터 구별하는 탁월한 능력을 제공하였다(도 4). 상기 샘플 중 80%가 상기 3-miRNA 혈청 ACR 진단 특징을 사용하여 정확하게 분류되었다.

실시예 4: 급성 세포성 거부( ACR )의 검출 및 예측을 위한 추가적인 miRNA 후보

엑시크온 인간 miRNA 사용 준비가 된 PCR 패널 I 및 II(v.3)(포함된 miRNA의 수: 752개)에 포함되지 않은 추가적인 새로운 miRNA를 확인하기 위해서, 2408개의 인간 miRNA의 훨씬 더 넓은 패널을 함유하는 퀴아겐 인간 miRNome miRNA PCR 어레이를 사용하여 추가적인 ACR-관련된 miRNA를 선별하였다. 생검 입증된 거부 에피소드에서 수집된 4개 및 비-거부 에피소드에서 수집된 11개를 포함하여, 상기 CTOT03 연구로부터의 15개 혈청 샘플을 상기 선별에 사용하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 상기 엑시크온 플랫폼에 의해 확인된 상위 ACR-관련된 miRNA의 대부분은 퀴아겐 miRNome miRNA PCR 어레이를 사용하여 동일한 결합 방향을 나타내었다.

특히, 퀴아겐 인간 miRNome miRNA PCR 어레이를 사용함으로써, 상기 엑시크온 패널에 포함되지 않은 추가적인 ACR-관련된 miRNA를 확인하였다(표 5). 상기 새로 확인된 miRNA 중 일부는 엑시크온 패널을 사용하여 처음에 확인된 것들보다 ACR 및 비-ACR 샘플간에 더 큰 변화 배수를 나타내었으며 복제된 경우에 보다 큰 분별 능력을 잠재적으로 제공한다. 새로 확인된 miRNA의 상위 5개에 대한 상자그림의 예를 도 5에 도시한다.

실시예 5: ACR 예측 및/또는 IST 최소화 내성에 대해 선택된 miRNA 생물마커들 및 그들의 관련된 표적 서열의 상세한 목록

본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물의 개시는 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.

본 발명을 특정한 실시태양들을 참고로 개시하였지만, 본 발명의 다른 실시태양 및 변화들은 본 발명의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 당해 분야의 숙련가들에 의해 고안될 수 있음은 자명하다. 첨부된 특허청구범위는 모든 상기와 같은 실시태양 및 균등한 변화들을 포함하는 것으로 해석하고자 한다.

SEQUENCE LISTING <110> The trustees of the university of pennsylvania <120> Use of micro-ribonucleic acid (miRNA) to diagnose transplant rejection and tolerance of immunosuppression therapy <130> IPA161434-CN <150> US 61/977,980 <151> 2014-04-10 <160> 172 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 1 ucccugagac ccuaacuugu ga 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 2 aacccguaga uccgaacuug ug 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 3 aagacgggag gaaagaaggg ag 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 4 uccauuacac uacccugccu cu 22 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 5 uggaguguga caaugguguu ug 22 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 6 aacccguaga uccgaucuug ug 22 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 7 uguaaacauc cucgacugga ag 22 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 8 cagcagcaca cugugguuug u 21 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 9 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Sapiens <400> 99 caggaguggg gggugggacg u 21 <210> 100 <211> 21 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 100 acacuuguug ggaugaccug c 21 <210> 101 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 101 agauuguuuc uuuugccgug ca 22 <210> 102 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 102 ugagggguuu ggaaugggau gg 22 <210> 103 <211> 18 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 103 aggcugggcu gggacgga 18 <210> 104 <211> 18 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 104 aggcuggagu gagcggag 18 <210> 105 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 105 cacuuagcag guuguauuau au 22 <210> 106 <211> 20 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 106 aaaugggugg ucugaggcaa 20 <210> 107 <211> 17 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 107 accccacucc ugguacc 17 <210> 108 <211> 21 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 108 uggggcgggg caggucccug c 21 <210> 109 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 109 uuugugaccu gguccacuaa cc 22 <210> 110 <211> 17 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 110 guggaccugg cugggac 17 <210> 111 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 111 caaccuggag gacuccaugc ug 22 <210> 112 <211> 25 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 112 gugaggcggg gccaggaggg ugugu 25 <210> 113 <211> 23 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 113 ggaggcgcag gcucggaaag gcg 23 <210> 114 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 114 agugccugcu augugccagg ca 22 <210> 115 <211> 23 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 115 agguugggau cgguugcaau gcu 23 <210> 116 <211> 21 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 116 gaaaguacag aucggauggg u 21 <210> 117 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 117 uaugugccuu uggacuacau cg 22 <210> 118 <211> 21 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 118 cuacaggcug gaaugggcuc a 21 <210> 119 <211> 21 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 119 ucuaguaaga guggcagucg a 21 <210> 120 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 120 gaugagcuca uuguaauaug ag 22 <210> 121 <211> 21 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 121 cgggagcugg ggucugcagg u 21 <210> 122 <211> 21 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 122 aagcauucuu ucauugguug g 21 <210> 123 <211> 18 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 123 cggggcggca ggggccuc 18 <210> 124 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 124 gugaggaggg gcuggcaggg ac 22 <210> 125 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 125 agugggagga caggaggcag gu 22 <210> 126 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 126 ccaggaggcg gaggaggugg ag 22 <210> 127 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 127 ugguugacca uagaacaugc gc 22 <210> 128 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 128 uugcuugaac ccaggaagug ga 22 <210> 129 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 129 cuauacaacc uacugccuuc cc 22 <210> 130 <211> 17 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 130 ggagugggcu ggugguu 17 <210> 131 <211> 21 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 131 cggcggggac ggcgauuggu c 21 <210> 132 <211> 21 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 132 agggagggac gggggcugug c 21 <210> 133 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 133 aaaggaaagu guauccuaaa ag 22 <210> 134 <211> 22 <212> RNA <213> Homo Sapiens <400> 134 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Claims

피실험자에서 이식 기관의 이식 거부를 검출하거나 예측하는 방법으로,
i. 상기 피실험자로부터의 샘플에서 적어도 하나의 miRNA 발현의 수준을 측정하고;
ii. 상기 피실험자로부터의 샘플 중 적어도 하나의 miRNA의 수준을 대조군에서의 기준선 수준과 비교함을 포함하며, 상기 대조군에서의 적어도 하나의 miRNA의 수준으로부터 상기 샘플 중 적어도 하나의 miRNA의 수준의 차이가 급성 이식 거부를 가리키며;
iii. 급성 이식 거부가 나타난 경우, 상기 거부에 대한 치료를 권장하는
방법.
제1항에 있어서,
급성 이식 거부가 급성 세포성 거부(ACR)를 포함하는 방법.
제1항에 있어서,
적어도 하나의 miRNA가 서열번호 1 내지 3으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
제1항에 있어서,
적어도 하나의 miRNA가 서열번호 4 내지 15로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
제1항에 있어서,
적어도 하나의 miRNA가 서열번호 16 내지 23으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
제1항에 있어서,
적어도 하나의 miRNA가 서열번호 1 내지 23으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
제1항에 있어서,
적어도 하나의 miRNA가 서열번호 1 내지 23 및 97 내지 134로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
제1항에 있어서,
피실험자가 포유동물인 방법.
제8항에 있어서,
포유동물이 인간인 방법.
제1항에 있어서,
적어도 하나의 miRNA의 수준이 대조군에서의 적어도 하나의 miRNA의 수준보다 적어도 1배까지 더 높은 방법.
제1항에 있어서,
적어도 하나의 miRNA의 수준을 측정하는 것이 역전사, PCR, 마이크로어레이, 및 차세대 서열분석으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 기법을 사용하는 방법.
제1항에 있어서,
샘플이 소변, 말초 혈액, 혈청, 담즙, 기관지폐포 세척(BAL)액, 심낭액, 위장액, 대변 샘플, 동종이식편 부근의 해부학적 영역으로부터 모은 생물학적 유체, 및 동종이식편으로부터의 생물학적 유체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나인 방법.
제1항에 있어서,
이식된 기관이 심장, 간, 폐, 신장, 장, 췌장, 췌장섬 세포, 눈, 피부 및 줄기 세포로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나인 방법.
제1항에 있어서,
miRNA 발현 수준의 비교를, 이식된 기관의 급성 거부의 궤적을 나타내기 위해 회귀 모델에서 계산하는 방법.
이식 피실험자에서 면역억제 요법(IST)의 최소화를 예측하는 방법으로,
i. 상기 피실험자로부터의 샘플에서 적어도 하나의 miRNA 발현의 수준을 측정하고;
ii. 상기 피실험자로부터의 샘플 중 적어도 하나의 miRNA의 수준을 대조군에서의 기준선 수준과 비교함을 포함하며, 상기 대조군에서의 적어도 하나의 miRNA의 수준으로부터 상기 샘플 중 적어도 하나의 miRNA의 수준의 차이가 IST 최소화의 성공 또는 실패의 가능성을 가리키며;
iii. IST 최소화의 실패가 나타난 경우, 피실험자의 치료를 권장하는 방법.
제15항에 있어서,
적어도 하나의 miRNA가 서열번호 24 내지 26으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
제15항에 있어서,
적어도 하나의 miRNA가 서열번호 6 내지 8, 22, 27 내지 48로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
제15항에 있어서,
적어도 하나의 miRNA가 서열번호 6 내지 8, 22, 24 내지 48로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
제15항에 있어서,
IST의 최소화가 초기 투여량보다 적어도 75%까지 더 낮은 방법.
제15항에 있어서,
IST의 최소화가 초기 투여량보다 적어도 25%까지, 적어도 30%까지, 적어도 35%까지, 적어도 40%까지, 적어도 45%까지, 적어도 50%까지, 적어도 55%까지, 적어도 60%까지, 적어도 65%까지, 적어도 70%까지, 적어도 75%까지, 적어도 80%까지, 적어도 85%까지, 적어도 90%까지, 적어도 95%까지, 또는 적어도 100%까지 더 낮은 방법.
제15항에 있어서,
피실험자가 포유동물인 방법.
제21항에 있어서,
포유동물이 인간인 방법.
제15항에 있어서,
적어도 하나의 miRNA의 수준이 대조군에서의 적어도 하나의 miRNA의 수준보다 적어도 1배까지 더 높은 방법.
제15항에 있어서,
적어도 하나의 마이크로RNA의 수준을 측정하는 것이 역전사, PCR, 마이크로어레이, 차세대 서열분석으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 기법을 사용하는 방법.
제15항에 있어서,
샘플이 소변, 말초 혈액, 혈청, 담즙, 기관지폐포 세척(BAL)액, 심낭액, 위장액, 대변 샘플, 동종이식편 부근의 해부학적 영역으로부터 모은 생물학적 유체, 및 동종이식편으로부터의 생물학적 유체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나인 방법.
제15항에 있어서,
이식된 기관이 심장, 간, 폐, 신장, 장, 췌장, 췌장섬 세포, 눈, 피부 및 줄기 세포로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나인 방법.
제15항에 있어서,
miRNA 발현 수준의 비교를, IST 최소화의 성공 또는 실패 가능성을 예측하기 위해 회귀 모델에서 계산하는 방법.
서열번호 1 내지 23으로 이루어지는 다수의 miRNA를 포함하는, 피실험자에서 이식된 기관의 이식 거부를 검출하거나 예측하기 위한 조성물.
서열번호 1 내지 23 및 97 내지 134로 이루어지는 다수의 miRNA를 포함하는, 피실험자에서 이식된 기관의 이식 거부를 검출하거나 예측하기 위한 조성물.
서열번호 1 내지 23 및 97 내지 134로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 miRNA를 검출하도록 형성된 다수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트.
제30항에 있어서,
올리고뉴클레오티드가 적어도 서열번호 1 내지 3을 검출하도록 형성된 키트.
제30항에 있어서,
올리고뉴클레오티드 중의 적어도 하나가 서열번호 49 내지 71 및 135 내지 172로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 키트.
서열번호 6 내지 8, 22, 24 내지 48로 이루어지는 다수의 miRNA를 포함하는, 이식-후 피실험자에서 IST 투여량을 최소화하는 능력 또는 무능력을 검출하거나 예측하기 위한 조성물.
서열번호 6 내지 8, 22, 24 내지 48로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 miRNA를 검출하도록 형성된 다수의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트.
제34항에 있어서,
올리고뉴클레오티드가 적어도 서열번호 24 내지 26을 검출하도록 형성된 키트.
제34항에 있어서,
올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나가 서열번호 53 내지 55, 70, 72 내지 96으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 키트.