IT202100011951A1 - METODO DI IDENTIFICAZIONE DI microRNA DERIVATI DA EV PER DISCRIMINARE PAZIENTI TRAPIANTATI CON RIGETTO E SENZA RIGETTO - Google Patents

METODO DI IDENTIFICAZIONE DI microRNA DERIVATI DA EV PER DISCRIMINARE PAZIENTI TRAPIANTATI CON RIGETTO E SENZA RIGETTO Download PDF

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Description

DESCRIZIONE
del brevetto per invenzione industriale dal titolo: ?METODO DI IDENTIFICAZIONE DI microRNA DERIVATI DA EV PER DISCRIMINARE PAZIENTI TRAPIANTATI CON RIGETTO E SENZA RIGETTO ?
La presente invenzione ? relativa ad un metodo di identificazione di microRNA derivati da EV per discriminare pazienti trapiantati con rigetto e senza rigetto.
In particolare il metodo secondo l?invenzione ? in grado di discriminare anche tra pazienti trapiantati con rigetto acuto e cronico.
Nell'ultimo decennio, i miRNA sono emersi come mediatori cardine nell'AMR acuto e cronico, nella funzione del trapianto ritardato o nella fibrosi interstiziale / atrofia tubulare, proponendo il suo potenziale valore come biomarcatori non invasivi.
Nel seguito vengono utilizzate le seguenti abbreviazioni:
AAMR (Acute Antibody Mediated Rejection) o rigetto acuto mediato da anticorpi;
AMR (Antibody Mediated Rejection) o rigetto mediato da anticorpi;
CAMR (Chronic Antibody Mediated Rejection) o rigetto cronico mediato da anticorpi;
TX Ctrl (Control transplanted recipients) o controllo di riceventi trapiantati;
DSA (Donor Specific Antibodies) o anticorpi specifici del donatore;
EndMT (Endothelial-to-mesenchymal transition) o transizione endoteliale-mesenchimale;
EV (Extracellular vesicles) o vescicole extracellulari.
Le EV hanno dimostrato di fornire potenziali microRNA (miRNA) come carico per cellule bersaglio specifiche. In modo efficace, la natura unica del doppio strato delle EV consente di proteggere il miRNA dalla degradazione.
Secondo la presente invenzione viene realizzato un metodo di identificazione di microRNA derivati da EV per discriminare pazienti trapiantati con rigetto e senza rigetto , come definito nella rivendicazione 1.
Per una migliore comprensione della presente invenzione viene ora descritta una forma di realizzazione preferita, a puro titolo di esempio non limitativo, con riferimento ai disegni allegati, nei quali:
- la figura 1 riporta i risultati sperimentali ottenuti mediante microarray miRNA profiling ed in particolare 42 miRNA sottoregolati e 34 miRNA sovraregolati, secondo l?invenzione;
- la figura 2 mostra i risultati sperimentali e d in particolare le differenze nel contenuto di miRNA EV tali da separare i pazienti AAMR e CAMR nel metodo secondo l?invenzione;
- le figure 3A-3D mostrano grafici di risultati sperimentali condotti dal Richiedente ed in particolare, l'analisi microarray per confrontare i profili miRNA di EV isolati da AAMR e CAMR rispetto ai pazienti Tx Controls;
- le figure 4A-4F mostrano grafici di secondi risultati sperimentali condotti dal Richiedente, secondo l?invenzione.
Il Richiedente ha effettuato prove sperimentali a supporto della caratterizzazione del miRNA da EV derivato da plasma AMR. In particolare ? stata utilizzata l'analisi microarray per confrontare i profili miRNA di EV isolati da AAMR e CAMR rispetto ai pazienti Tx Controls (come mostrato in Fig 3). Mediante microarray miRNA profiling sono stati rilevati 42 miRNA sottoregolati e 34 miRNA sovraregolati (Figura 1) con FDR <0,05 e Fold change> 2 (Figura 3A).
L'analisi dei componenti principali ha mostrato che questi 76 miRNA erano in grado di distinguere EV derivato da AMR da pazienti TX sani (Figura 3B). Il Richiedente ha anche studiato se le differenze nel contenuto di miRNA EV potessero separare i pazienti AAMR e CAMR. Sono stati rilevati 9 miRNA espressi in modo differenziale nei due gruppi AMR (otto sottoregolati e solo uno sovraregolato in AAMR rispetto a CAMR; Figura 2 e Figura 3C).
Secondo l?invenzione, in modo efficace, questi miRNA potrebbero distinguere EV derivato da AAMR da EV derivato da CAMR (Figura 3D).
Il Richiedente ha studiato i possibili geni bersaglio di questi miRNA (Risultati mostrati in Fig.1 e Fig2) in base alla loro espressione, al loro fold changee al valore p. ? interessante notare che diversi bersagli sono stati associati alla regolazione dei geni CDKN1A e CDKN2A come miR-24-3p, miR-let-7d-5p, miR-101-3p, mir-345-5p, miR-20-5p, miR-132-3p .
Studi precedenti, svolti dal medesimo Richiedente, hanno dimostrato che la senescenza prematura e la transizione endoteliale-mesenchimale rappresentano un nuovo meccanismo coinvolto nella progressione del deterioramento cronico dell'innesto dopo il trapianto renale.
Il Richiedente ha quindi selezionato miRNA che regolano specificamente i geni associati alla senescenza come CDKN1A, CDKN2A, insieme ai primi geni della fibrosi come Collagene I, TGFB e geni correlati al complemento. Utilizzando diversi database liberamente disponibili (TargetScan, miRDB, miRTarBase, DIANA TarBase) il Richiedente ha identificato due miRNA sottoregolati nell'EV derivato da AMR rispetto al controllo Tx: mir-24-3p che regolano CDKN1A, CDKN1B, TGFB, CDK6 e Properdin (Properdin posizione 18 -24 di CFP 3 'UTR, 7mer-8m con 98 punteggio di contesto percentile rank); mir-29a-3p che modula i geni pro-fibrotici COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL4A1, mediatori del percorso Wnt come DKK1 e recettori solubili frizzled SFRP2, CD276 e CD274 (PD-L1). Infine, miR-101-3p ? stato associato alla regolazione del gene Klotho, CDKN1A e C3 mediante analisi TargetScan (Figura 4A, 4B).
Secondo l?invenzione, sono stati individuati quattro miRNA miR-604 sovraregolati, miR-590-3p, miR-let-7d-5p, miR-515-3p. In particolare, miR-604, miR-590-3p interagiscono con i siti canonici conservati 8mer e 7mer che si adattano alla regione seme di ciascun miRNA a 3'-UTR dei componenti del complemento CD59, Fattore D, CFHR4 e Fattore H.
Mentre miR-let-7d-5p e miR-515-3p regolano i geni CDKN1A, H2AFX (associati a senescenza e risposta al danno del DNA) e COL1A1, COL1A2, TGFBR1 / 2 (associati alla fibrosi).
Infine, Il Richiedente ha convalidato la loro espressione mediante RT-PCR, confermando i dati del microarray (Figura 7C-F).
Nell'ultimo decennio, i miRNA sono emersi come mediatori cardine nell'AMR acuto e cronico, nella funzione del trapianto ritardato o nella fibrosi interstiziale / atrofia tubulare, proponendo il suo potenziale valore come biomarcatori non invasivi. Negli studi alla base della presente invenzione, ? stato fornito il profilo miRNA di EV derivato da AMR e descritto per la prima volta il coinvolgimento di miR-24-3p, miR-29b-3p nella regolazione della senescenza tubulare e EndMT, possibilmente attraverso la modulazione di CDKN1A, CDKN2A, TGF? e geni correlati al collagene.
Secondo la presente invenzione, ? stato dimostrato che miR-24-3p ? altamente sovraregolato a livello renale durante il danno da ischemia / riperfusione, in particolare a seguito di ischemia fredda estesa e prevalentemente da cellule endoteliali. ? interessante notare che il trattamento in vivo con oligonucleotide antisenso anti-miR24-3p prima dell'ischemia / riperfusione renale ha migliorato la funzione renale e ha portato a una diminuzione significativa di NGAL e KIM-1.
I membri della famiglia miR-29 condividevano la stessa regione seme e sono coinvolti in modo critico nella fibrosi renale hanno come bersaglio il 3 'UTR di molti geni del collagene in organi diversi. Pertanto, sulla base di questa evidenza ? stato suggerito che la loro modulazione sia una potenziale terapia antifibrotica e biomarcatore AKI. Utilizzando il software di previsione il Richiedente, ha trovato la regolazione convalidata della segnalazione di DKK1 / Wnt / beta-catenina, una via associata all'invecchiamento renale prematuro e di CD276, coinvolta nella risposta all?immunit? delle cellule T.
? stato inoltre riscontrato un aumento dei livelli di miR-604, miR-515-3p, miR-let-7d-5p e miR-590-3p. Il candidato molto promettente miR-604 ? stato finora introdotto come potenziale regolatore nel carcinoma a cellule renali, nell'infezione persistente da virus dell'epatite B e nello sviluppo di carcinoma epatocellulare e lesioni precancerose orali. ? interessante notare che ? stato confermato un aumento del livello di miR-604 in AAMR e EV derivato da CAMR, in linea con il cambiamento di andamento osservato. I geni bersaglio convalidati di miR604 includevano entrambi i marcatori di senescenza come Lims1 (LIM e proteina di dominio simile all'antigene delle cellule senescenti 1), proteine di controllo del ciclo cellulare (come CDC42 e proteina tumorale p73) e, cosa pi? importante, regolatori del complemento come CD59, Fattore di complemento D e CFHR4.
Per quanto riguarda miR-515-3p, ? meno noto nelle impostazioni di trapianto di rene e regola direttamente l'espressione della vimentina e della metalloproteinasi-3 della matrice (MMP3) legandosi alla sequenza codificante e alla regione 3'UTR nel processo di transizione epiteliale mesenchimale associata all'esofago metastatico carcinoma a cellule squamose.
Inoltre, mir-590-3p svolge un ruolo chiave nell'invecchiamento cellulare, partecipa allo sviluppo di molte malattie tra cui il cancro agendo come biomarcatore predittivo (104); miR-590-3p ? stato descritto come un attore centrale nell'AKI inibendo TRAF6 nei topi settici, legandosi alle sue regioni 3'-UTR (105), per correlare con la gravit? della nefropatia da IgA (106) e per colpire i geni associati all'inflammasoma (Pathway NLRP1 / IL-1?) e stress ossidativo renale (NOX4).
La Fig 3. Mostra i risultati dell?analisi dei miRNA espressi in modo differenziale nell'EV plasmatico da pazienti con AMR rispetto ai pazienti con controllo Tx.
In particolare, Il grafico (A) in figura 3, mostra la relazione tra cambiamento di andamento e significativit? statistica. I punti rosso e blu nel grafico rappresentano gli mRNA espressi in modo differenziale con significativit? statistica. 34 miRNA erano sovraregolati (punti rossi) e 42 miRNA erano sottoregolati (punti blu) nei pazienti AMR rispetto al controllo Tx con FDR <0,05 e cambio di piega> 2. (B) Analisi dei componenti principali (PCA) basata su tutti i miRNA espressi tra i tre gruppi. Analisi dei componenti principali che mostra 76 miRNA in grado di distinguere MV derivati da AMR da EV derivati da controlli di trapianto. Analisi dei miRNA espressi in modo differenziato negli EV plasmatici di pazienti con AAMR rispetto al diagramma del vulcano CAMR (C) che mostra 1 miRNA sovraregolato e 8 miRNA sottoregolati in EV da AAMR rispetto a CAMR. (D) Analisi dei componenti principali che mostra i 9 miRNA in grado di distinguere MV derivati da AAMR da EV derivati da CAMR.
La Fig 4 mostra la validazione dei miRNA mediante qPCR.
La validazione del miRNA in EV da pazienti AAMR, CAMR e Tx Ctrl. Box plot che rappresentano i miRNA che erano sovraregolati o sottoregolati in AAMR e CAMR rispetto al gruppo Tx CTRL. Le linee centrali mostrano le mediane; i limiti delle caselle indicano il 25 ? e 75 ? percentile come determinato dal software R; baffi si estendono da ogni quartile al minimo o al massimo. n = 8, * p <0,05, ANOVA unidirezionale, test non parametrico. Il test di Tukey ? stato utilizzato per correggere confronti multipli utilizzando test di ipotesi statistiche.
Il rilascio di vescicole extracellulari (EV) comprendenti sia gli esosomi (diametro <100 nm) sia le microvescicole di grandi dimensioni (MV, diametro> 100 nm) nel sangue intero, nel plasma, nel siero o in altri fluidi biologici (per esempio urine, saliva, liquido cefalo rachidiano) costituisce un processo cellulare fondamentale per la comunicazione intercellulare. Queste EV sono state identificate come promettenti biomarcatori per diverse patologie, come per il cancro, le malattie infettive e nell?ambito del trapianto anche per il rigetto.
Secondo la presente invenzione, al fine di isolare le EV plasmatiche campioni di sangue venoso periferico sono stati raccolti in provette Vacutainer (Becton Dickinson) con EDTA come anticoagulante ed i campioni sono stati processati entro 30 minuti dalla raccolta. Il sangue ? stato prima centrifugato per 20 minuti a 6000 g per rimuovere cellule, piastrine, corpi apoptotici e altre particelle e aggregati di grandi dimensioni. Aliquote di plasma sono state mantenute a ?80 ?C fino al momento dell'uso o ulteriormente centrifugate per isolare le vescicole extracellulari.
L'arricchimento di EV ? preferibilmente eseguito mediante ultracentrifugazione per 2 ore a 100.000 ? g a 4 ? C.
In alternativa, l?isolamento delle EV ? condotto con metodi diversi come l?utilizzo kit di arricchimento che utilizzano buffer di precipitazione della frazione esosomiale o kit che utilizzano biglie coniugate ad anticorpi diretti contro marcatori di superficie delle EV. Dopo la purificazione delle EV, diversi test di controllo della qualit?, del numero e delle dimensioni delle EV sono stati condotti per consentire eventualmente di valutare la derivazione cellulare delle EV e di svolgere analisi intermedie.
Successivamente, l?RNA totale delle EV ? stato isolato.
Secondo la presente invenzione, i miRNA espressi in maniera differenziale sono stati validati mediante Real Time PCR, un metodo che permette di valutare l?espressione genica differenziale dei miRNA target rispetto ad un gene costitutivo (housekeeping)scelto come controllo endogeno di espressione. Il miRNA housekeeping validato per la sua espressione stabile nelle EV plasmatiche di pazienti trapiantati renali ? stato il miR-16-5P.
Il metodo secondo l?invenzione consente la discriminazione tra soggetti con rischio di rigetto e soggetto non a rischio di rigetto.
Il Richiedente ha identificato 5 miRNA differenziamente espressi tra gruppo TX ctrl e gruppo Rigetto, acuto o cronico anticorpo mediato, rispettivamente AAMR e CAMR; 1 miRNA risultava differenzialmente upregolato nel gruppo AAMR rispetto al TX ctrl ed al gruppo CAMR.
In particolare, per il miR-24-3p downregolato nel gruppo AAMR,CAMR rispetto al gruppo TX Ctrl.: un soggetto trapiantato ? identificato come soggetto a rischio di rigetto se il valore di espressione del miRNA ? inferiore a 2,5 o valore similare corrispondente al 25? percentile dei soggetti trapiantati senza rigetto.
In particolare, per il miR-29a-3p downregolato, nell?espressione nel gruppo AAMR,CAMR rispetto al gruppo TX Ctr: un soggetto trapiantato ? identificato come soggetto a rischio di rigetto se il valore di espressione del miRNA ? inferiore a 3,15 o valore similare corrispondente al 25? percentile dei soggetti trapiantati senza rigetto.
In particolare, per il miR-604 upregolato nel gruppo AAMR e nel gruppo CAMR rispetto al gruppo TX Ctrl: un soggetto trapiantato ? identificato come soggetto a rischio di rigetto se il valore di espressione del miRNA ? superiore a 1,2 o valore similare corrispondente al 75? percentile dei soggetti trapiantati senza rigetto.
In particolare, per il miR-515-3p upregolato nel gruppo AAMR e nel gruppo CAMR rispetto al gruppo TX Ctrl: un soggetto trapiantato ? identificato come soggetto a rischio di rigetto se il valore di espressione del miRNA ? superiore a 1,14 o valore similare corrispondente al 75? percentile dei soggetti trapiantati senza rigetto.
In particolare, per il miR-let-7d-5p upregolato nel gruppo AAMR e nel gruppo CAMR rispetto al gruppo TX Ctrl: un soggetto trapiantato ? identificato come soggetto a rischio di rigetto se il valore di espressione del miRNA ? superiore a 4,5 o valore similare corrispondente al 75? percentile dei soggetti trapiantati senza rigetto.
In particolare, per il miR-590-3p upregolato nel gruppo AAMR rispetto al gruppo TX Ctrl, e nel gruppo AAMR rispetto al gruppo CAMR: se il fold change del miRNA rispetto al TX Ctrl ? compreso tra 1 e 3 si osserva diagnosi di rigetto cronico anticorpo mediato (CAMR), se superiore a 3 si osserva diagnosi di rigetto acuto anticorpo mediato (AAMR).
Un soggetto trapiantato ? identificato come soggetto a rischio di rigetto se sono verificate una o pi? delle condizioni precedenti.
Pertanto, il metodo secondo l?invenzione consente di discriminare pazienti trapiantati con rigetto e senza rigetto.
Risulta, infine, chiaro che al metodo secondo l?invenzione qui descritto e illustrato possono essere apportate modifiche e varianti senza per questo uscire dall?ambito protettivo della presente invenzione, come definito nelle rivendicazioni allegate.

Claims (10)

RIVENDICAZIONI
1. Metodo di identificazione microRNA derivati da EV comprendente le seguenti fasi:
- isolare le EV plasmatiche da campioni di sangue venoso periferico;
- Arricchire le EV mediante ultracentrifugazione ; - purificare le EV;
- effettuare test di controllo della qualit?, del numero e delle dimensioni delle EV per consentire di valutare la derivazione cellulare delle EV e di svolgere analisi intermedie;
- Isolare l?RNA totale delle EV ;
- Validare i miRNA espressi in maniera differenziale mediante Real Time PCR;
- Valutare un miRNA e discriminare tra soggetti trapiantati con rigetto e soggetti trapiantati senza rigetto.
2. Metodo di identificazione microRNA derivati da EV secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la fase di isolare le EV plasmatiche da campioni di sangue venoso periferico comprende le seguenti fasi:
- Raccogliere una pluralit? di campioni di sangue venoso periferico in provette Vacutainer con EDTA come anticoagulante;
- processare i campioni entro 30 minuti dalla raccolta centrifugando per 20 minuti a 6000 g per rimuovere cellule, piastrine, corpi apoptotici e altre particelle e aggregati di grandi dimensioni;
- mantenere aliquote di plasma a ?80 ?C fino al momento dell'uso o ulteriormente centrifugare per isolare le vescicole extracellulari.
3. Metodo di identificazione microRNA derivati da EV secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la fase di isolare le EV plasmatiche da campioni di sangue venoso periferico avviene mediante kit di arricchimento che utilizzano buffer di precipitazione della frazione esosomiale o kit che utilizzano biglie coniugate ad anticorpi diretti contro marcatori di superficie delle EV.
4. METODO DI IDENTIFICAZIONE DI microRNA DERIVATI DA EV secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la fase di arricchire le EV mediante ultracentrifugazione avviene per 2 ore a 100.000 ? g ed a una temperatura pari a 4 ? C.
5. Metodo di identificazione microRNA derivati da EV secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la fase di valutare il miRNA e discriminare tra soggetti trapiantati con rigetto e soggetti trapiantati senza rigetto, detto miRNA essendo il miR-24-3p downregolato nel gruppo AAMR,CAMR rispetto al gruppo TX Ctrl., comprende:
- identificare un soggetto trapiantato come soggetto a rischio di rigetto se il valore di espressione del miRNA ? inferiore a 2,5 o valore corrispondente al 25? percentile dei soggetti trapiantati senza rigetto.
6. Metodo di identificazione microRNA derivati da EV secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la fase di valutare il miRNA e discriminare tra soggetti trapiantati con rigetto e soggetti trapiantati senza rigetto, detto miRNA essendo miR-29a-3p downregolato, nell?espressione nel gruppo AAMR,CAMR rispetto al gruppo TX Ctrl, comprende:
- Identificare un soggetto trapiantato come soggetto a rischio di rigetto se il valore di espressione del miRNA ? inferiore a 3,15 o valore corrispondente al 25? percentile dei soggetti trapiantati senza rigetto.
7. Metodo di identificazione microRNA derivati da EV secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la fase di valutare il miRNA e discriminare tra soggetti trapiantati con rigetto e soggetti trapiantati senza rigetto, detto miRNA essendo miR-604 upregolato nel gruppo AAMR e nel gruppo CAMR rispetto al gruppo TX Ctrl, comprende:
- Identificare un soggetto trapiantato come soggetto a rischio di rigetto se il valore di espressione del miRNA ? superiore a 1,2 o valore corrispondente al 75? percentile dei soggetti trapiantati senza rigetto.
8. Metodo di identificazione microRNA derivati da EV secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la fase di valutare il miRNA e discriminare tra soggetti trapiantati con rigetto e soggetti trapiantati senza rigetto, detto miRNA essendo miR-515-3p upregolato nel gruppo AAMR e nel gruppo CAMR rispetto al gruppo TX Ctrl: comprende:
- Identificare un soggetto trapiantato come soggetto a rischio di rigetto se il valore di espressione del miRNA ? superiore a 1,14 o valore corrispondente al 75? percentile dei soggetti trapiantati senza rigetto.
9. Metodo di identificazione microRNA derivati da EV secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la fase di valutare il miRNA e discriminare tra soggetti trapiantati con rigetto e soggetti trapiantati senza rigetto, detto miRNA essendo miR-let-7d-5p upregolato nel gruppo AAMR e nel gruppo CAMR rispetto al gruppo TX Ctrl, comprende:
- Identificare un soggetto trapiantato come soggetto a rischio di rigetto se il valore di espressione del miRNA ? superiore a 4,5 o valore corrispondente al 75? percentile dei soggetti trapiantati senza rigetto.
10. Metodo di identificazione microRNA derivati da EV secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la fase di valutare il miRNA e discriminare tra soggetti trapiantati con rigetto e soggetti trapiantati senza rigetto, detto miRNA essendo miR-590-3p upregolato nel gruppo AAMR rispetto al gruppo TX Ctrl, e nel gruppo AAMR rispetto al gruppo CAMR, comprende:
- Identificare un soggetto come soggetto a rischio di rigetto cronico anticorpo mediato (CAMR) quando il fold change del miRNA rispetto al TX Ctrl ? compreso tra 1 e 3;
- Identificare un soggetto come soggetto a rischio di rigetto acuto anticorpo mediato (AAMR) se il fold change del miRNA rispetto al TX Ctrl ? superiore a 3.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130287772A1 (en) * 2010-03-01 2013-10-31 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings Biomarkers for theranostics
US20160138106A1 (en) * 2014-11-14 2016-05-19 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Circulating Non-coding RNA Profiles for Detection of Cardiac Transplant Rejection
US20170032100A1 (en) * 2014-04-10 2017-02-02 The Trustees Of The University Of Pennslyvania Use of micro-ribonucleic acid (mirna) to diagnose transplant rejection and tolerance of immunosuppression therapy
WO2017066390A1 (en) * 2015-10-13 2017-04-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for using enriched exosomes as a platform for monitoring organ status

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130287772A1 (en) * 2010-03-01 2013-10-31 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings Biomarkers for theranostics
US20170032100A1 (en) * 2014-04-10 2017-02-02 The Trustees Of The University Of Pennslyvania Use of micro-ribonucleic acid (mirna) to diagnose transplant rejection and tolerance of immunosuppression therapy
US20160138106A1 (en) * 2014-11-14 2016-05-19 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Circulating Non-coding RNA Profiles for Detection of Cardiac Transplant Rejection
WO2017066390A1 (en) * 2015-10-13 2017-04-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for using enriched exosomes as a platform for monitoring organ status

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