CN116497112A - 检测产品、引物或其组合、检测产品及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及检测产品、引物或其组合、检测产品及应用。本发明提供了标志物，所述标志物具有：如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本发明公开了血浆miR‑32‑5p作为癫痫诊断标志物及其用途。通过临床实验证实：与健康对照组人群相比，癫痫患者血浆中miR‑32‑5p的水平显著升高。因此血浆miR‑32‑5p的水平可用于癫痫诊断标记物。并研制出以检测血浆miR‑32‑5p水平的检测试剂和试剂盒，该试剂或试剂盒可用于临床癫痫患者的辅助诊断及预后评估。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及检测产品、引物或其组合、检测产品及应用。
背景技术
癫痫是最常见的严重脑部疾病之一，影响全球7000多万人。严重影响患者正常生活、工作和学习。癫痫的产生是由于神经元兴奋性作用增强，抑制性作用减弱或两者兼有之。癫痫的临床诊断主要根据发作史，目击者对发作过程提供可靠的详细描述，辅以脑电图痫性放电证据才可确诊，目前尚无敏感性和特异性强的血液学诊断指标。进一步癫痫具有反复发作的特点，而且发作程度个体间也有差异，但是目前尚无客观的指标评价癫痫患者发作程度。因此，寻找新的血液指标对癫痫发作预警、癫痫发作程度及用药后癫痫控制情况进行评估至关重要。
MicroRNAs(miRNAs)是一类长度为20～25个核苷酸序列的非编码RNA，它们通过结合靶基因mRNAs的非翻译区(Untranslted Region，UTR)从而调节mRNA的转录或者减少mRNA水平。研究表明，miRNAs表达的失调参与众多疾病的发生如癌症、脆性X染色体综合征、自闭症、精神分裂症、阿尔茨海默病、心血管疾病等。血液中含有丰富的miRNAs，研究显示血液中miRNAs可作为肿瘤、脓毒症、心血管疾病、子宫内膜异位症和阿尔兹海默症等多种疾病诊断和预后指标。
但是目前尚未见癫痫患者血清学有效和敏感性诊断指标。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了检测产品、引物或其组合、检测产品及应用。本发明公开了血浆miR-32-5p作为癫痫诊断标志物及其用途。通过临床实验证实：与健康对照组人群相比，癫痫患者血浆中miR-32-5p的水平显著升高。因此血浆miR-32-5p的水平可用于癫痫诊断标记物。并研制出以检测血浆miR-32-5p水平的检测试剂和试剂盒，该试剂或试剂盒可用于临床癫痫患者的辅助诊断及预后评估。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了标志物，所述标志物具有：
(1)、如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
(2)、与(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:1为：uauugcacauuacuaaguugca。
在本发明的一些实施方案中，上述标志物中，所述标志物为miR-32-5p。
在本发明的一些实施方案中，上述标志物中，所述标志物的来源为血浆。
本发明还提供了标志物在制备诊断和/或预后评估癫痫的产品中的应用。
本发明还提供了引物或其组合，以上述标志物为扩增的目的片段。
在本发明的一些实施方案中，上述引物或其组合中所述标志物的引物具有：
(4)、如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或
(5)、与(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(4)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(6)、与(4)或(5)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:2为：ggcggcggtattgcacattactaa。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:3为：gcgcaatgcatcgcatagcaactgt。
在本发明的一些实施方案中，上述引物或其组合，还包括以内参基因U6为目的片段的引物；
所述内参基因U6的引物具有：
(7)、如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；或
(8)、与(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(7)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(9)、与(7)或(8)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:4为：ctcgcttcggcagcaca。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:5为：aacgcttcacgaatttgcgt。
本发明还提供了检测产品，包括上述引物或其组合以及可接受的助剂。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述助剂包括：反转录试剂或PCR扩增试剂。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品中，所述助剂包括：逆转录缓冲液、逆转录酶、TB green，ROX染料、RNase-Free、标准品或对照品中的一种或多种。
在本发明的一些实施方案中，上述检测产品包括：芯片、检测试剂或试剂盒中的一种或多种。
本发明还提供了扩增方法，以上述引物或其组合或上述检测产品中的引物或其组合为目的片段扩增。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法中，所述检测包括以下步骤：提取所述待测样本的miRNA，逆转录后获得cDNA，扩增所述标志物和所述内参基因U6，通过熔解曲线和扩增曲线，获得所述标志物的相对定量值。
本发明还提供了癫痫的检测方法，以上述引物或其组合或上述检测产品对待测样品的DNA进行扩增，若出现荧光信号，为阳性；反之，为阴性。
本发明提供的癫痫辅助诊断试剂盒的制作基于miRNA的QCR检测技术，该试剂盒用于检测血浆中miR-32-5p水平，试剂盒包含检测miR-32-5p的检测试剂；检测试剂包括检测试剂包括QPCR实验中使用的miR-32-5p和内参基因U6的扩增引物，miR-32-5p的PCR扩增正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，反向引物为miRNA PCR扩增通用引物，序列如SEQID NO:3所示；所述U6的PCR扩增正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述U6的PCR扩增反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。更进一步地，所述试剂盒还包含常用的逆转录反应试剂和PCR扩增试剂，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的。
该试剂盒的检测方法包括：(1)提取血浆miRNA；(2)将提取的miRNA逆转录成cDNA；(3)在荧光实时定量PCR仪上将miRNA和内参基因进行扩增检测；(4)通过溶解曲线和扩增曲线分析，2-ΔΔCT法进行miR-32-5p的相对定量。
该试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物检测miR-32-5p的表达辅助判断癫痫，不仅稳定，检测方便，而且定量精确，大大提高癫痫诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导临床准确做出诊断和个性化治疗。
本发明提供了标志物，所述标志物具有：
(1)、如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
(2)、与(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
本发明的有益效果包括：
(1)本发明采用血浆miR-32-5p水平对癫痫进行诊断。该血浆miR-32-5p标志物对癫痫患者的诊断灵敏度达到了58.82％，特异度达到了85％，目前临床上尚缺乏癫痫敏感性和特异性强的血液学诊断指标，因此，本发明的血浆miR-32-5p标志可用于癫痫的临床辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
(2)血液miRNAs是一种新型生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，因此，本发明通过检测血浆miR-32-5p标志表达将大大提高癫痫诊断的敏感性和特异性，为癫痫的诊断和预后评估开创全新局面，同时为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(3)本发明以检测与癫痫辅助诊断相关的血浆miR-32-5p和U6扩增引物来制备试剂盒，该试剂盒的灵敏度达到58.82％，特异性达到85％，操作简单，使用方便，可用于癫痫的辅助诊断和用药后的效果评估，使得癫痫的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确对癫痫进行诊断，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示健康对照组人群和癫痫患者血浆中miR-32-5p的表达水平；
图2示健康对照组人群和癫痫患者血浆中miR-32-5p表达水平的ROC曲线。
具体实施方式
本发明公开了检测产品、引物或其组合、检测产品及应用。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种用于癫痫辅助诊断的血浆miRNA标志物，所述血液miRNA标志物为miR-32-5p，所述miR-32-5p的序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了一种上述血浆miRNA标志物在制备癫痫辅助诊断试剂或试剂盒中的应用。
根据上述的应用，优选地，所述试剂盒包含检测miR-32-5p的检测试剂。
本发明还提供了一种miR-32-5p的检测试剂在制备癫痫辅助诊断试剂或试剂盒中的应用。
根据上述的应用，优选地，所述检测试剂包括miR-32-5p和内参基因U6的扩增引物。
根据上述的应用，优选地，所述miR-32-5p的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示，反向引物为miRNA PCR扩增通用引物，序列如SEQ ID NO:3所示；所述U6的PCR扩增正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述U6的PCR扩增反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
本发明还提供了一种用于癫痫辅助诊断的试剂盒，所述试剂盒用于检测血浆中的miR-32-5p。
根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒包含检测miR-32-5p的检测试剂。
根据上述的试剂盒，优选地，所述检测试剂包括QPCR实验中使用的miR-32-5p和内参基因U6的扩增引物，所述miR-32-5p的PCR扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，反向引物为miRNA PCR扩增通用引物，序列如SEQ ID NO:3所示；所述U6的PCR扩增正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述U6的PCR扩增反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包含反转录反应试剂和PCR扩增试剂，如逆转录缓冲液、逆转录酶、TB green，ROX染料和RNase-Free水等，另外还可以含有标准品和对照品。
具体地说，本发明的技术方案包括：
(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。
(2)血浆miR-32-5p差异表达分析：选择癫痫病例及与癫痫病例年龄、性别匹配的健康对照人群，检测其血浆miR-32-5p的表达水平。
(3)血浆miR-32-5p筛查和诊断试剂盒的研制：根据血浆miR-32-5p开发癫痫诊断试剂盒。
上述步骤(2)中血浆miRNA定量分析采用QPCR检测来完成。
采用QPCR进行血浆miR-32-5p的检测，具体的操作步骤为：
(1)提取样本miRNA；
(2)将步骤(1)获得的miRNA逆转录成cDNA；
(3)在荧光实时定量PCR仪上将miR-32-5p和内参基因进行扩增检测；
(4)通过溶解曲线和扩增曲线分析，2-ΔΔCT法进行miR-32-5p的相对定量。
本发明中收集癫痫患者及健康对照组人群的血液：
病例为南华大学附属第一医院神经内科(2021-2022年)确诊的初发癫痫患者血液。对照为同期健康管理中心收集的健康个体，按性别和年龄(±5岁)与病例进行频数匹配，收集健康对照组患者20例，癫痫患者17例，所有病例均签署知情同意书。用于研究的血液样本用抗凝管收集，12000rcf离心15分钟，收集上层血浆于-80℃保存待测。
本发明实施例1和实施例2中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1QPCR检测癫痫病人及健康对照人群血浆miR-32-5p的表达
(1)血浆miRNA的提取(miRNA提取试剂盒购自康为世纪，货号：CW0627)
①取冻存的血浆并充分解冻，取300μL血浆样本，加入1mL Trizon Reagent，反复吹打后在25℃条件下静置5分钟；
②向样本中加入200μL氯仿，上下颠倒震荡20秒，在25℃条件下静置5分钟；
③4℃12000rpm离心15分钟，将上层水相移到一个新的离心管中；
④向上述③溶液中加入1/3倍体积的无水乙醇，混匀，将得到的混合液转入已装入收集管的吸附柱RM中，可分多次转入；4℃12000rpm离心30秒，离心后弃掉吸附柱，保留流出液；
⑤向上述流出液中加入2/3倍体积的无水乙醇，混匀后将混合液转入已装入收集管的吸附柱RS，可分多次转入，4℃12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱RS重新放回收集管中；
⑥向吸附柱RS中加入700μL BufferRWT(使用前加入无水乙醇)，4℃12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱RS重新放回收集管中；
⑦向吸附柱RS中加入500μL BufferRW2(使用前加入无水乙醇)，4℃12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱RS重新放回收集管中；
⑧4℃12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱RS在25℃条件下静置5分钟，以晾干；
⑨将吸附柱RS置于一个新的无RNase的离心管中，并向吸附柱的中间部位加入50μL DEPC水，在25℃条件下放置1分钟，4℃12000rpm离心1分钟；然后将离心管中的溶液重新加入到RS吸附柱中，在25℃条件下放置1分钟，4℃12000rpm离心1分钟；收集离心管的流出液即为miRNA溶液，得到的miRNA溶液保存于-80℃以防降解。
(2)miRNA的逆转录(Mir-XTMmiRNA试剂盒购自TAKARA公司，货号638313)
①将步骤(1)提取的miRNA溶液3.75μL转移到200μL的离心管中，向每个样本中加入5μL mRQ Buffer和1.25μL mRQ Enzyme，充分震荡混匀后离心；
②在37℃的条件下孵育1小时，然后在85℃的条件下孵育5分钟，得到cDNA保存于-20℃备用。
(3)QPCR反应(PCR扩增试剂TB GreenTM Premix Ex TaqTM II购自Takara公司，货号RR820A)
①采用10μL的反应体系，每个样本设置4个平行管；QPCR的反应体系为：TBgreenMix 5μL，ForwordPrimer 0.4μL，Reverse Primer 0.4μL，DEPC水3.2μL，cDNA模板1μL，充分震荡混匀后离心；
②QPCR的扩增程序为：95℃10min；95℃15s，60℃45s，40个循环，在罗氏LightCycler480荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应；
③检测miR-32-5p的正向引物序列如SEQ ID NO:2所示，反向引物序列如SEQ IDNO:3所示；以U6作为内参基因，检测内参基因U6的正向引物序列如SEQ ID NO:4所示；反向引物序列如SEQ ID NO:5所示；
④通过溶解曲线和扩增曲线分析，2-ΔΔCT法进行miR-32-5p的相对定量，患者血浆检测结果如图1所示；由图1可知，与健康对照人群相比，初发癫痫患者血浆中miR-32-5p表达升高5.23倍。
实施例2分析血浆miR-32-5p对癫痫的诊断价值
根据血浆miR-32-5p的QPCR的结果，对患者血浆样品miR-32-5p表达水平的分析，以对照组miR-32-5p表达量的单侧95％参考值范围为标准，利用graphpadprism 7.0软件绘制ROC曲线来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估miR-32-5p对癫痫发病的判断能力；结果如图2和表1所示，显示使用miR-32-5p区分癫痫患者和健康对照人群时，其AUC值为0.8044，最佳临界点的敏感性为58.82％、特异性为85％；因此血浆miR-32-5p的水平能够很好区分癫痫患者和健康对照人群，并可作为癫痫治疗效果的评估指标。
表1miR-32-5p表达及ROC分析
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.标志物，其特征在于，所述标志物具有：
(1)、如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
(2)、与(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(3)、与(1)或(2)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的标志物在制备诊断和/或预后评估癫痫的产品中的应用。
3.引物或其组合，其特征在于，以如权利要求1所述标志物为扩增的目的片段。
4.如权利要求3所述的引物或其组合，其特征在于，所述标志物的引物具有：
(4)、如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或
(5)、与(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(4)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(6)、与(4)或(5)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
5.如权利要求3或4所述的引物或其组合，其特征在于，还包括以内参基因U6为目的片段的引物；
所述内参基因U6的引物具有：
(7)、如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；或
(8)、与(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(7)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(9)、与(7)或(8)所述核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
6.检测产品，其特征在于，包括如权利要求3至5任一项所述的引物或其组合以及可接受的助剂。
7.如权利要求6所述的检测产品，其特征在于，包括：芯片、检测试剂或试剂盒中的一种或多种。
8.扩增方法，其特征在于，以如权利要求3至5任一项所述的引物或其组合或如权利要求6或7所述检测产品中的引物或其组合为目的片段扩增。
9.癫痫的检测方法，其特征在于，以如权利要求3至5任一项所述的引物或其组合或如权利要求6或7所述的检测产品对待测样品的DNA进行扩增，若出现荧光信号，为阳性；反之，为阴性。
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