CN110384801A - miRNA552簇的微小RNA在治疗LDLC相关代谢性疾病中的应用 - Google Patents

miRNA552簇的微小RNA在治疗LDLC相关代谢性疾病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了miRNA552簇的微小RNA在治疗LDLC相关代谢性疾病中的应用。具体地，miRNA552簇的微小RNA能够特异性地有效地抑制PCSK9蛋白表达，显著降低PCSK9蛋白水平和LDLC水平，从而能够利用miRNA552簇的微小RNA治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病。

Description

miRNA552簇的微小RNA在治疗LDLC相关代谢性疾病中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域。具体地，涉及miRNA552簇的微小RNA在治疗LDLC相关代谢性疾病中的应用。
背景技术
前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin kexin type9，PCSK9)具有通过影响低密度脂蛋白受体(Low-density lipoprotein(LDL)receptor，LDLR)的稳定性，调控胆固醇代谢的作用(Expert Opin Ther Pat.2010；20(11):1547-71)。而血浆中低密度脂蛋白胆固醇(LDL cholesterol，LDLC)的升高是高胆固醇血症、动脉粥样硬化和非酒精性脂肪肝病等脂代谢紊乱的代谢性疾病的主要病理特征，因此PCSK9已经发展成为治疗血脂异常等代谢性疾病的新型治疗靶点。
因此，本领域迫切需要开发一种能够抑制PCSK9蛋白水平，从而治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病的方法。
发明内容
本发明提供了一种能够抑制PCSK9蛋白水平的miRNA552簇的微小RNA，该miRNA能够下调pcsk9基因或其蛋白表达和/或活性，从而治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病。
本发明的第一方面，提供了一种miRNA，或其前体序列、表达载体，或其激动剂的用途，所述的miRNA为miRNA552簇的微小RNA，所述miRNA552簇的微小RNA选自下组：miR-552-3p或miR-552-3p衍生序列、或其经修饰的衍生物，
其中所述miR-552-3p衍生序列具有选自下组的序列：
(a1)5’-(N)0-2Vcaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a2)5’-(N)0-2HVcaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a3)5’-(N)0-2Vacaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a4)5’-(N)0-2Vcagagu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a5)5’-(N)0-2Vcagguu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a6)5’-(N)0-2VcagguN(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a7)5’-(N)0-2VcagguNV(N)6-8N(N)4-6-3’；和/或
(a8)5’-(N)0-2Vcaggu(N)7-8DN(N)4-6-3’；
其中，V为a、g或c，D为a、u或g，H为a、u或c，N为a、g、u或c，(N)0-2表示0、1或2个N，(N)4-6表示4、5或6个N，(N)6-8表示6、7或8个N，(N)7-8表示7或8个N；
用于：
(i)制备下调pcsk9基因或其蛋白表达和/或活性的药物组合物；和/或
(ii)制备治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病的药物组合物。
在另一优选例中，所述miR-552-3p为hsa-miR-552-3p，其序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中，所述的miR-552-3p衍生序列具有如SEQ ID NO.:3-10、15-20、22-31、33-34、46、51、54-58、60-88、90-116、118-119、135-169中任一所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的miR-552-3p衍生序列为将miR-552-3p核苷酸序列(如SEQID NO.:1)进行单碱基缺失、插入和/或替换形成的衍生序列，且所述miR-552-3p衍生序列不包括选自下组的核苷酸序列：如SEQ ID NO.:11-14、21、32、35-45、47-50、52、53、59、89、117、120-134所示的序列。
在另一优选例中，所述miRNA552簇的微小RNA来源于哺乳动物，优选地，来源于人或非人哺乳动物(如猴、猩猩)。
在另一优选例中，所述miRNA552簇的微小RNA包括分离的或人工合成的。
在另一优选例中，所述的经修饰的衍生物包括miR-552-3p或miR-552-3p衍生序列的经修饰的衍生物，其修饰选自下组的一种或多种修饰形式：核苷酸的糖基修饰、核苷酸之间连接方式的修饰、胆固醇修饰、锁核苷酸修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、烃基修饰、和核酸修饰。
在另一优选例中，所述的核苷酸的糖基修饰包括2-O-甲基的糖基修饰、2-O-甲氧乙酯的糖基修饰、2-O-烷基的糖基修饰、2-氟代的糖基修饰、糖环修饰、锁核苷酸修饰；和/或
所述的核苷酸之间连接方式的修饰包括硫代磷酸修饰、磷酸烷基化修饰；和/或
所述的核酸修饰包括“TT”修饰。
在另一优选例中，所述经修饰的miRNA衍生物是具有式I所示结构的化合物单体或其多聚体：
(X)n-(Y)m 式I，
在式I中，
各X为所述的微小RNA；
各Y独立地为促进微小RNA施药稳定性的修饰物；
Y连接于X的左侧、右侧或中间；
n为1-100的(较佳地1-20)正整数(较佳地n为1、2、3、4或5)；
m为1-1000的(较佳地1-200)正整数；
各“-”表示接头、化学键、或共价键。
在另一优选例中，所述的接头是长度为1-10个碱基的核酸序列。
在另一优选例中，所述的Y包括(但不限于)胆固醇、类固醇、甾醇、醇、有机酸、脂肪酸、酯、单糖、多糖、氨基酸、多肽、单核苷酸、多核苷酸。
在另一优选例中，所述的前体序列选自下组：
(a)能够在宿主内被加工成所述的微小RNA的前体miRNA；或
(b)能被宿主转录形成所述的前体miRNA，并加工形成所述的微小RNA的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的前体miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
在另一优选例中，所述的多核苷酸具有式II所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 式II，
式II中，
Seq正向为能在宿主中被加工成所述的微小RNA核苷酸序列；
Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
并且式II所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：
式III中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
在另一优选例中，所述的表达载体用于表达所述的miRNA552簇的微小RNA或其前体miRNA。
在另一优选例中，所述的表达载体含有所述miRNA552簇的微小RNA、或其前体miRNA、或能被宿主转录形成所述前体miRNA的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的表达载体包括：病毒载体和非病毒载体。
在另一优选例中，所述的表达载体为质粒。
在另一优选例中，所述微小RNA的激动剂选自下组：促进miRNA552簇的微小RNA表达的物质、提高miRNA552簇的微小RNA活性的物质。
在另一优选例中，所述的低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病是指以低密度脂蛋白胆固醇异常升高为代表性指标的脂代谢异常的疾病。
在另一优选例中，所述的低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病选自下组：高胆固醇血症、动脉粥样硬化、冠心病、非酒精性脂肪肝病、或其组合。
在另一优选例中，“低密度脂蛋白胆固醇异常升高”指的是低密度脂蛋白胆固醇≥160mg/dL(4.1mmol/L)。而针对冠心病，糖尿病和冠心病风险的人群，低密度脂蛋白胆固醇异常指的是低密度脂蛋白胆固醇＞100mg/dL(2.6mmol/L)。低密度脂蛋白胆固醇的数值可以通过常规方法检测。
在另一优选例中，所述的药物组合物包括(a)miRNA552簇的微小RNA，或其前体序列、表达载体，或其激动剂；以及(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体选自下组：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。
在另一优选例中，所述的药物组合物还含有第二活性成分，且所述的第二活性成分选自下组：pcsk9抑制剂、降脂药、治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病的药物、或其组合。
在另一优选例中，所述的pcsk9抑制剂用于下调PCSK9的表达量或抑制PCSK9活性。
在另一优选例中，所述的降脂药选自下组：降胆固醇药、降甘油三酯药、或其组合。
在另一优选例中，所述的治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病的药物选自下组的疾病的治疗药物：高胆固醇血症、动脉粥样硬化、冠心病、非酒精性脂肪肝病、或其组合。
在另一优选例中，所述治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病的药物选自下组：他汀类药物、贝特类药物、胆碱螯合剂、烟酸及其衍生物、胆固醇吸收抑制剂、或其组合。
本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括：
(i)第一活性成分，所述第一活性成分为miRNA552簇的微小RNA，或其前体序列、表达载体，或其激动剂：其中，所述的miRNA552簇的微小RNA选自下组：miR-552-3p或miR-552-3p衍生序列、或其经修饰的衍生物，
其中所述miR-552-3p衍生序列具有选自下组的序列：
(a1)5’-(N)0-2Vcaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a2)5’-(N)0-2HVcaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a3)5’-(N)0-2Vacaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a4)5’-(N)0-2Vcagagu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a5)5’-(N)0-2Vcagguu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a6)5’-(N)0-2VcagguN(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a7)5’-(N)0-2VcagguNV(N)6-8N(N)4-6-3’；和/或
(a8)5’-(N)0-2Vcaggu(N)7-8DN(N)4-6-3’；
其中，V为a、g或c，D为a、u或g，H为a、u或c，N为a、g、u或c，(N)0-2表示0、1或2个N，(N)4-6表示4、5或6个N，(N)6-8表示6、7或8个N，(N)7-8表示7或8个N；
(ii)第二活性成分，所述第二活性成分不同于第一活性成分，且所述的第二活性成分选自下组：治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病的药物、降脂药、pcsk9抑制剂、或其组合；和
(iii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体选自下组：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为液体剂型，优选地为注射剂，更优选为静脉注射剂或腹腔注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物的施用方法包括直接注射表达RNA552簇的微小RNA质粒。
在另一优选例中，所述药物组合物用于：
(a)下调pcsk9基因或其蛋白表达和/或活性；和/或
(b)治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病。
在另一优选例中，所述第二活性成分为选自下组的疾病的治疗药物：高胆固醇血症、动脉粥样硬化、冠心病、非酒精性脂肪肝病、或其组合。
在另一优选例中，所述第二活性成分选自下组：他汀类药物、贝特类药物、胆碱螯合剂、烟酸及其衍生物、胆固醇吸收抑制剂、或其组合。
在另一优选例中，所述第二活性成分为降胆固醇药和/或降甘油三酯药。
本发明的第三方面，提供了一种治疗药物组合，所述治疗药物组合包括：
(1)第一药物组合物，所述第一药物组合物含有(i)第一活性成分，所述第一活性成分为miRNA552簇的微小RNA，或其前体序列、表达载体，或其激动剂：其中，所述的miRNA552簇的微小RNA选自下组：miR-552-3p或miR-552-3p衍生序列、或其经修饰的衍生物，
其中所述miR-552-3p衍生序列具有选自下组的序列：
(a1)5’-(N)0-2Vcaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a2)5’-(N)0-2HVcaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a3)5’-(N)0-2Vacaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a4)5’-(N)0-2Vcagagu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a5)5’-(N)0-2Vcagguu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a6)5’-(N)0-2VcagguN(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a7)5’-(N)0-2VcagguNV(N)6-8N(N)4-6-3’；和/或
(a8)5’-(N)0-2Vcaggu(N)7-8DN(N)4-6-3’；
其中，V为a、g或c，D为a、u或g，H为a、u或c，N为a、g、u或c,(N)0-2表示0、1或2个N，(N)4-6表示4、5或6个N，(N)6-8表示6、7或8个N，(N)7-8表示7或8个N；
和(ii)药学上可接受的载体；以及
(2)第二药物组合物，所述第二药物组合物选自下组：治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病的药物、降脂药、pcsk9抑制剂、或其组合。
本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性的下调pcsk9基因或其蛋白表达和/或活性的方法，包括步骤：
向细胞培养体系中加入miRNA552簇的微小RNA，或其前体序列、表达载体，或其激动剂，从而下调pcsk9基因或其蛋白表达和/或活性。
本发明第五方面，提供了一种(i)下调pcsk9基因或其蛋白表达和/或活性；和/或(ii)治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病的方法，包括步骤：
向需要的对象施用本发明第一方面所述的活性成分或本发明第二方面所述的药物组合物，从而(i)下调pcsk9基因或其蛋白表达和/或活性；和/或(ii)治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病。
在另一优选例中，所述对象为哺乳动物，较佳地，为人、小鼠、或大鼠。
本发明第六方面，提供了一种筛选(i)下调pcsk9基因或其蛋白表达和/或活性；和/或(ii)治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病的候选化合物的方法，包括步骤：
(a)将加入候选化合物的细胞培养体系作为实验组；将不加入候选化合物的细胞培养体系作为对照组；和
(b)测试实验组和对照组中细胞内miRNA552簇的微小RNA的表达活性；
其中，当实验组中细胞内miRNA552簇的微小RNA的表达活性E1显著高于对照组E2，则表明该候选化合物为(i)下调pcsk9基因或其蛋白表达和/或活性；和/或(ii)治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病的物质。
在另一优选例中，所述的细胞为肝脏细胞,优选地包括HepG2，L02，Huh7等肝实质细胞系。
在另一优选例中，所述的细胞来自人或非人哺乳动物(如啮齿动物或灵长目动物，较佳地包括小鼠、大鼠、兔和/或猴)。
在另一优选例中，步骤(b)中还包括：
进一步测试所获得化合物对实验组或对照组中pcsk9基因或其蛋白表达和/或活性。
在另一优选例中，所述“显著高于”指E1/E2≥1.5，较佳地，≥2，更佳地，≥3。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量的筛选，首次发现，miRNA552簇的微小RNA能够下调pcsk9基因或其蛋白表达和/或活性；和/或(ii)治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病。在此基础上，发明人完成了本发明。
术语
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文使用的，术语“宿主”、“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类，如牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊、长颈鹿、鹿、骆驼、玲羊、大鼠、小鼠、野兔和家兔。
miRNA及其前体
微小RNA(microRNA，简称miRNA)是近年来在线虫，果蝇和植物，哺乳动物等真核生物中发现的一种内源性的长度为22个核苷酸左右的非编码单链小RNA。它在表达上具有组织和时间的特异性，通过与靶mRNA的碱基互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制，是调节其他功能基因表达的重要调控分子。越来越多的证据表明miRNA虽然微小，但它通过与靶mRNA形成完全或者不完全互不配对从而对生物体的各种生命过程有着至关重要的作用。
microRNA是一类在机体内发挥着调节基因转录和翻译的内源性非编码单链RNA分子。它的5’种子区序列(第2～8个核苷酸)在进化上高度保守，是该类核酸分子在细胞质中发挥转录后基因表达调控的重要元件(Bioinformatics.2014；30(10):1377-83)。除了种子区经典调控作用，microRNA还有很多其他尚未被解释清楚的调控机制和作用功能。例如：microRNA-552-3p不仅可以对靶基因P450酶CYP2E1在种子序列与mRNA 3’-UTR结合发挥经典的转录后抑制；同时在非种子序列也与其启动子区互补结合，发挥非经典的转录水平抑制(Biochim Biophys Acta.2016；1859(4):650-62)。这表明microRNA对其靶基因的调控有可能不单单只通过其种子区的序列，也有可能依赖于其非种子区的序列。
本发明提供了一类涉及下调pcsk9基因或其蛋白表达和/或活性的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一类RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-23nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。
人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。
前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。
如本申请所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。
本发明所述的miRNA是指miRNA552簇的微小RNA，所述miRNA552簇的微小RNA选自下组：miR-552-3p或miR-552-3p衍生序列、或其经修饰的衍生物，
其中所述miR-552-3p衍生序列具有选自下组的序列：
(a1)5’-(N)0-2Vcaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a2)5’-(N)0-2HVcaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a3)5’-(N)0-2Vacaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a4)5’-(N)0-2Vcagagu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a5)5’-(N)0-2Vcagguu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a6)5’-(N)0-2VcagguN(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a7)5’-(N)0-2VcagguNV(N)6-8N(N)4-6-3’；和/或
(a8)5’-(N)0-2Vcaggu(N)7-8DN(N)4-6-3’；
其中，V为a、g或c，D为a、u或g，H为a、u或c，N为a、g、u或c，(N)0-2表示0、1或2个N，(N)4-6表示4、5或6个N，(N)6-8表示6、7或8个N，(N)7-8表示7或8个N。
在另一优选例中，所述的微小RNA来源于人或非人哺乳动物；较佳地所述的非人哺乳动物为猴(如猕猴)、猩猩(如黑猩猩)，黑猩猩和人的miRNA552簇的序列完全一致，猕猴和人的miRNA-552的成熟序列相差一个碱基。所述的“功能与miRNA552簇相同或基本相同”是指保留了miRNA552簇的≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％的抑制PCSK9蛋白水平(下调pcsk9基因或其蛋白表达和/或活性)的功能。
本发明还包括miRNA变体和衍生物。此外，广义上的miRNA衍生物也可包括miRNA变体。本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miRNA552簇进行修饰，修饰方式包括(但不限于)：甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、核酸修饰(如“TT”修饰)等。
在另一优选例中，所述miRNA552簇的微小RNA包括分离的或人工合成的。
在另一优选例中，所述miR-552-3p为hsa-miR-552-3p，其序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中，所述的miR-552-3p衍生序列具有如SEQ ID NO.:3-10、15-20、22-31、33-34、46、51、54-58、60-88、90-116、118-119、135-169中任一所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的前体miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
5’-AACCAUUCAAAUAUACCACAGUUUGUUUAACCUUUUGCCUGUUGGUUGAAGAUGCCUUUCAACAGGUGACUGGUUAGACAAACUGUGGUAUAUACA-3’(SEQ ID NO.:2)
多核苷酸
根据本发明所提供的miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸(构建物)，也即所述多核苷酸(构建物)能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。
作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸(构建物)含有式II所示的结构：
Seq正向-X-Seq反向 式II，
式II中，
Seq正向为可在细胞中表达成所述的miRNA552簇的微小RNA的核苷酸序列，Seq反向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq正向为与Seq正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；
式II所示的结构在转入细胞后，形成式III所示的二级结构：
式III中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述；
||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
药物组合物及施用方法
本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括：
(i)(治疗有效量的)第一活性成分，所述第一活性成分为miRNA552簇的微小RNA，或其前体序列、表达载体，或其激动剂：其中，所述的miRNA552簇的微小RNA选自下组：miR-552-3p或miR-552-3p衍生序列、或其经修饰的衍生物，
其中所述miR-552-3p衍生序列具有选自下组的序列：
(a1)5’-(N)0-2Vcaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a2)5’-(N)0-2HVcaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a3)5’-(N)0-2Vacaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a4)5’-(N)0-2Vcagagu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a5)5’-(N)0-2Vcagguu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a6)5’-(N)0-2VcagguN(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a7)5’-(N)0-2VcagguNV(N)6-8N(N)4-6-3’；和/或
(a8)5’-(N)0-2Vcaggu(N)7-8DN(N)4-6-3’；
其中，V为a、g或c，D为a、u或g，H为a、u或c，N为a、g、u或c，(N)0-2表示0、1或2个N，(N)4-6表示4、5或6个N，(N)6-8表示6、7或8个N，(N)7-8表示7或8个N；
(ii)(治疗有效量的)第二活性成分，所述第二活性成分不同于第一活性成分，且所述的第二活性成分选自下组：治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病的药物、降脂药、pcsk9抑制剂、或其组合；和
(iii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体选自下组：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为液体剂型，优选地为注射剂，更优选为静脉注射剂或腹腔注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物的施用方法包括直接注射表达RNA552簇的微小RNA质粒。
在另一优选例中，所述第二活性成分为选自下组的疾病的治疗药物：高胆固醇血症、动脉粥样硬化、冠心病、非酒精性脂肪肝病、或其组合。
在另一优选例中，所述第二活性成分选自下组：他汀类药物、贝特类药物、胆碱螯合剂、烟酸及其衍生物、胆固醇吸收抑制剂、或其组合。
在另一优选例中，所述第二活性成分为降胆固醇药和/或降甘油三酯药。
在另一优选例中，所述的pcsk9抑制剂用于下调PCSK9的表达量或抑制PCSK9活性。
如本文所用，术语“第一活性成分”指的是可用于本发明的miRNA552簇、或其前体序列、或含有其的表达载体、或其激动剂。优选地，所述的活性成分选自下组：
(a)miRNA552簇的微小RNA，所述miRNA552簇的微小RNA选自下组：miR-552-3p或miR-552-3p衍生序列、或其经修饰的衍生物，所述miR-552-3p衍生序列具有(a1)-(a8)中任一所述的序列；
(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的微小RNA；
(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；
(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA552簇的微小RNA、(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；
(e)(a)中所述的微小RNA的激动剂。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.00001mg-50mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
在本发明中miRNA552簇可被用于(i)制备下调pcsk9基因或其蛋白表达和/或活性的药物组合物；和/或(ii)制备治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病的药物组合物。例如，miRNA552簇的衍生物或其激动剂可被用于制备一种药物组合物，所述组合物用于(a)下调pcsk9基因或其蛋白表达和/或活性；和/或(b)治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病。
本发明的优点主要包括：
本发明发现miRNA552簇的微小RNA能够特异性地有效地抑制PCSK9蛋白(表达)水平，显著降低PCSK9蛋白水平和LDLC水平，从而能够利用miRNA552簇的微小RNA治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
在本发明中，如果没有特殊说明，实施例中所用的材料均为市售产品，本发明中所使用的方法均为本领域中的常规方法。
microRNA模拟物的制备
本发明实施例所采用的
hsa-miR-552-3p(序列为5’-aacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:1))；
del-1(序列为5’-acaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:10))；
del-2(序列为5’-aaaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:11))；
del-3(序列为5’-aacggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:12))；
del-4(序列为5’-aacagugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:13))；
del-5(序列为5’-aacagggacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:14))；
del-6(序列为5’-aacagguacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:15))；
del-7(序列为5’-aacaggugcugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:16))；
del-8(序列为5’-aacaggugaugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:17))；
del-9(序列为5’-aacaggugacgguuagacaa-3’(SEQ ID NO:18))；
del-10(序列为5’-aacaggugacuguuagacaa-3’(SEQ ID NO:19))；
del-11(序列为5’-aacaggugacugguagacaa-3’(SEQ ID NO:20))；
del-12(序列为5’-aacaggugacugguugacaa-3’(SEQ ID NO:21))；
del-13(序列为5’-aacaggugacugguuaacaa-3’(SEQ ID NO:22))；
del-14(序列为5’-aacaggugacugguuagcaa-3’(SEQ ID NO:23))；
del-15(序列为5’-aacaggugacugguuagaaa-3’(SEQ ID NO:24))；
del-16(序列为5’-aacaggugacugguuagaca-3’(SEQ ID NO:25))；
ins-1(序列为5’-aaacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:26))；
ins-2(序列为5’-uaacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:27))；
ins-3(序列为5’-gaacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:28))；
ins-4(序列为5’-caacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:29))；
ins-5(序列为5’-aaacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:30))；
ins-6(序列为5’-auacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:31))；
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ins-9(序列为5’-aaacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:34))；
ins-10(序列为5’-aaucaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:35))；
ins-11(序列为5’-aagcaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:36))；
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ins-36(序列为5’-aacaggugcacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:61))；
ins-37(序列为5’-aacaggugaacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:62))；
ins-38(序列为5’-aacaggugaucugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:63))；
ins-39(序列为5’-aacaggugagcugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:64))；
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ins-41(序列为5’-aacaggugacaugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:66))；
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ins-48(序列为5’-aacaggugacucgguuagacaa-3’(SEQ ID NO:73))；
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ins-59(序列为5’-aacaggugacugguguagacaa-3’(SEQ ID NO:84))；
ins-60(序列为5’-aacaggugacuggucuagacaa-3’(SEQ ID NO:85))；
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ins-70(序列为5’-aacaggugacugguuaguacaa-3’(SEQ ID NO:95))；
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ins-72(序列为5’-aacaggugacugguuagcacaa-3’(SEQ ID NO:97))；
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ins-74(序列为5’-aacaggugacugguuagaucaa-3’(SEQ ID NO:99))；
ins-75(序列为5’-aacaggugacugguuagagcaa-3’(SEQ ID NO:100))；
ins-76(序列为5’-aacaggugacugguuagaccaa-3’(SEQ ID NO:101))；
ins-77(序列为5’-aacaggugacugguuagacaaa-3’(SEQ ID NO:102))；
ins-78(序列为5’-aacaggugacugguuagacuaa-3’(SEQ ID NO:103))；
ins-79(序列为5’-aacaggugacugguuagacgaa-3’(SEQ ID NO:104))；
ins-80(序列为5’-aacaggugacugguuagaccaa-3’(SEQ ID NO:105))；
ins-81(序列为5’-aacaggugacugguuagacaaa-3’(SEQ ID NO:106))；
ins-82(序列为5’-aacaggugacugguuagacaua-3’(SEQ ID NO:107))；
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ins-84(序列为5’-aacaggugacugguuagacaca-3’(SEQ ID NO:109))；
ins-85(序列为5’-aacaggugacugguuagacaaa-3’(SEQ ID NO:110))；
ins-86(序列为5’-aacaggugacugguuagacaau-3’(SEQ ID NO:111))；
ins-87(序列为5’-aacaggugacugguuagacaag-3’(SEQ ID NO:112))；
ins-88(序列为5’-aacaggugacugguuagacaac-3’(SEQ ID NO:113))；
rep-1(序列为5’-uacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:114))；
rep-2(序列为5’-gacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:115))；
rep-3(序列为5’-cacaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:116))；
rep-4(序列为5’-aucaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:117))；
rep-5(序列为5’-agcaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:118))；
rep-6(序列为5’-accaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:119))；
rep-7(序列为5’-aaaaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:120))；
rep-8(序列为5’-aauaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:121))；
rep-9(序列为5’-aagaggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:122))；
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rep-11(序列为5’-aacgggugacugguuagacaa-3’(SEQ ID NO:124))；
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rep-62(序列为5’-aacaggugacugguuagacag-3’(SEQ ID NO:8))；
rep-63(序列为5’-aacaggugacugguuagacac-3’(SEQ ID NO:9))；
均由苏州吉玛基因股份有限公司合成。
实施例1本发明涉及的hsa-microRNA-552-3p模拟物对人肝癌细胞(HepG2)培养液中的PCSK9抑制作用检测。
所用细胞模型为人肝癌细胞HepG2(ATCC细胞库，美国)。其中，HepG2细胞系所用培养基为含10％的胎牛血清的MEM培养基，培养于含5％二氧化碳的37℃恒温培养箱中。在HepG2细胞中分别转染浓度为30nM的hsa-miR-552-3p或NC(阴性对照，购自Invitrogen公司，美国，货号12935114)，基于AlphaLISA技术检测细胞培养液中的PCSK9含量。
1、实验材料和方法
1)microRNA模拟物转染细胞实验：
A、将20μL无血清培养基Opti-MEM(购自Thermo Fisher Scientific公司，美国)，0.2μL RNAimax(购自Invitrogen公司，美国)和30nM的microRNA模拟物混合20分钟作为反式转染的转染液加到96孔板的1个空孔内；以及
B、胰酶消化HepG2细胞，计数，按照每孔15000个细胞铺板，和之前的转染液共培育48小时后检测。
2)AlphaLISA技术检测细胞培养液中的PCSK9含量：试剂盒购自PerkinElmer公司(美国)。
A、1×AlphaLISA免疫测定缓冲液的制备：将0.2mL 10×AlphaLISA免疫测定缓冲液加入1.8mL水中，制备成1×AlphaLISA免疫测定缓冲液；
B、制备AlphaLISA抗PCSK9受体珠和生物素化抗体抗PCSK9的混合液(MIX I)：首先将装有AlphaLISA抗PCSK9受体珠和生物素化抗体抗PCSK9的两只小管震荡离心，然后向480μL 1×AlphaLISA免疫测定缓冲液中加入2.4μL 5mg/mL AlphaLISA抗PCSK9受体珠和2.4μL500nM生物素化抗体抗PCSK9，混合后备用；
C、制备链霉亲和素(SA)供体珠的混合液MIX II(注意配置必须在避光条件下进行)：将9.6μL 5mg/mL SA供体珠加入600μL1×AlphaLISA免疫测定缓冲液中；
D、从细胞培养箱中取出转染48小时的96孔板，每孔吸取2μL至384孔白板中，每孔加入8μL的MIX I，盖上封条放入板式离心机中1000rmp离心1分，室温孵育60分；
E、每孔再加入10μL的MIX II，盖上封条包裹上锡箔纸放入板式离心机中1000rmp离心1分,室温避光孵育30分；以及
F、使用EnVision-Alpha仪器(购自PerkinElmer公司，美国)读值。
3)CCK实验测定细胞活力：
A、试剂制备：取6mL MEM培养基加入600μL的CCK-8，混合后备用；以及
B、吸走方法2)中的96孔板中剩余的培养基，加入100μL的CCK-8，培养箱中孵育60分后，用酶标仪在OD450下测值。
2、实验结果：
每个测试孔内PCSK9的相对含量用以下公式计算：
阴性对照(NC)孔PCSK9相对含量＝NC孔PCSK9Alpha读值。
测试孔PCSK9相对含量＝测试孔PCSK9Alpha读值/测试孔CCK读值/NC孔CCK读值。
经过测试hsa-miR-552-3p处理后，与NC孔相比，PCSK9含量是NC孔的0.23倍。
实施例2本发明涉及的hsa-microRNA-552-3p单碱基缺失模拟物对人肝癌细胞(HepG2)培养液中的PCSK9抑制作用检测。
所用细胞模型同实施例1。其中，HepG2细胞系所用培养基为含10％的胎牛血清的MEM培养基，培养于含5％二氧化碳的37℃恒温培养箱中。在HepG2细胞中分别转染浓度为30nM的hsa-miR-552-3p单碱基缺失模拟物或NC(阴性对照，购自Invitrogen公司，美国，货号12935114)，基于AlphaLISA技术检测细胞培养液中的PCSK9含量。
1、实验材料和方法
1)hsa-miR-552-3p单碱基缺失模拟物序列见表1。
2)其他材料与方法同实施例1
2、实验结果：
数据分析方法同实施例1，具体实验结果如表1所示，5’端的第3-7位碱基和第16位碱基发生单碱基缺失后，会使该类microRNA对PCSK9没有抑制作用。
[表1]
实施例3本发明涉及的hsa-microRNA-552-3p单碱基插入模拟物对人肝癌细胞(HepG2)培养液中的PCSK9抑制作用检测。
所用细胞模型同实施例1。其中，HepG2细胞系所用培养基为含10％的胎牛血清的MEM培养基，培养于含5％二氧化碳的37℃恒温培养箱中。在HepG2细胞中分别转染浓度为30nM的hsa-miR-552-3p单碱基插入模拟物或NC(阴性对照，购自Invitrogen公司，美国，货号12935114)，基于AlphaLISA技术检测细胞培养液中的PCSK9含量。
1、实验材料和方法
1)hsa-miR-552-3p单碱基插入模拟物序列见表2。
2)其他材料与方法同实施例1
2、实验结果：
数据分析方法同实施例1，具体实验结果如表2所示，5’端的第1位和第2位碱基间插入g、或第2位和第3位碱基间插入u或g或c、或第3位和第4位碱基间插入任何碱基、或第4位和第5位碱基间插入任何碱基、或第5位和第6位碱基间插入u或g或c、或第6位和第7位碱基间插入a或g或c、或第8位和第9位碱基间插入u、或第15位和第16位碱基间插入c后，会使该类microRNA对PCSK9没有抑制作用。
[表2]
实施例4本发明涉及的hsa-microRNA-552-3p单碱基替换模拟物对人肝癌细胞(HepG2)培养液中的PCSK9抑制作用检测。
所用细胞模型同实施例1。其中，HepG2细胞系所用培养基为含10％的胎牛血清的MEM培养基，培养于含5％二氧化碳的37℃恒温培养箱中。在HepG2细胞中分别转染浓度为30nM的hsa-miR-552-3p单碱基替换模拟物或NC(阴性对照，购自Invitrogen公司，美国，货号12935114)，基于AlphaLISA技术检测细胞培养液中的PCSK9含量。
1、实验材料和方法
1)hsa-miR-552-3p单碱基替换模拟物序列见表3。
2)其他材料与方法同实施例1
2、实验结果：
数据分析方法同实施例1，具体实验结果如表3所示，5’端的第2位碱基替换为u、第3-7位碱基发生单碱基突变后，会使该类microRNA对PCSK9没有抑制作用。
[表3]
通过单碱基缺失和替换实验，证实核苷酸序列通式为5’-(N)0-2Vcaggu(N)7-8N(N)4-6-3’的hsa-miR-552-3p衍生物具有PCSK9的抑制活性；通过单碱基缺失、插入和替换实验，证实核苷酸序列通式为5’-(N)0-2HVcaggu(N)7-8N(N)4-6-3’、5’-(N)0-2Vacaggu(N)7-8N(N)4-6-3’、5’-(N)0-2Vcagagu(N)7-8N(N)4-6-3’、5’-(N)0-2Vcagguu(N)7-8N(N)4-6-3’、5’-(N)0- 2VcagguN(N)7-8N(N)4-6-3’、5’-(N)0-2VcagguNV(N)6-8N(N)4-6-3’和5’-(N)0-2Vcaggu(N)7-8DN(N)4-6-3’的hsa-miR-552-3p衍生序列具有PCSK9的抑制活性。其中，V为a、g或c，D为a、u或g，H为a、u或c，N为a、g、u或c，(N)0-2表示0、1或2个N，(N)4-6表示4、5或6个N，(N)6-8表示6、7或8个N，(N)7-8表示7或8个N。
同时，基于以上实施例，根据本发明的hsa-microRNA-552-3p及其衍生序列能够有效抑制PCSK9表达，因此进而能够降低LDLC的水平，从而治疗LDLC相关代谢性疾病。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海药物研究所
苏州吉玛基因股份有限公司
<120> miRNA552簇的微小RNA在治疗LDLC相关代谢性疾病中的应用
<130> P2018-0630
<160> 169
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
aacaggugac ugguuagaca a 21
<210> 2
<211> 96
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
aaccauucaa auauaccaca guuuguuuaa ccuuuugccu guugguugaa gaugccuuuc 60
aacaggugac ugguuagaca aacuguggua uauaca 96
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
aacaggugac ugguuagaga a 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
aacaggugac ugguuagacu a 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
aacaggugac ugguuagacg a 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
aacaggugac ugguuagacc a 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
aacaggugac ugguuagaca u 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
aacaggugac ugguuagaca g 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
aacaggugac ugguuagaca c 21
<210> 10
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
acaggugacu gguuagacaa 20
<210> 11
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
aaaggugacu gguuagacaa 20
<210> 12
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
aacggugacu gguuagacaa 20
<210> 13
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
aacagugacu gguuagacaa 20
<210> 14
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
aacagggacu gguuagacaa 20
<210> 15
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
aacagguacu gguuagacaa 20
<210> 16
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
aacaggugcu gguuagacaa 20
<210> 17
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
aacaggugau gguuagacaa 20
<210> 18
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
aacaggugac gguuagacaa 20
<210> 19
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
aacaggugac uguuagacaa 20
<210> 20
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
aacaggugac ugguagacaa 20
<210> 21
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
aacaggugac ugguugacaa 20
<210> 22
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 22
aacaggugac ugguuaacaa 20
<210> 23
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 23
aacaggugac ugguuagcaa 20
<210> 24
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 24
aacaggugac ugguuagaaa 20
<210> 25
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 25
aacaggugac ugguuagaca 20
<210> 26
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 26
aaacagguga cugguuagac aa 22
<210> 27
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 27
uaacagguga cugguuagac aa 22
<210> 28
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 28
gaacagguga cugguuagac aa 22
<210> 29
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 29
caacagguga cugguuagac aa 22
<210> 30
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 30
aaacagguga cugguuagac aa 22
<210> 31
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 31
auacagguga cugguuagac aa 22
<210> 32
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 32
agacagguga cugguuagac aa 22
<210> 33
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 33
acacagguga cugguuagac aa 22
<210> 34
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 34
aaacagguga cugguuagac aa 22
<210> 35
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 35
aaucagguga cugguuagac aa 22
<210> 36
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 36
aagcagguga cugguuagac aa 22
<210> 37
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 37
aaccagguga cugguuagac aa 22
<210> 38
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 38
aacaagguga cugguuagac aa 22
<210> 39
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 39
aacuagguga cugguuagac aa 22
<210> 40
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 40
aacgagguga cugguuagac aa 22
<210> 41
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 41
aaccagguga cugguuagac aa 22
<210> 42
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 42
aacaagguga cugguuagac aa 22
<210> 43
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 43
aacaugguga cugguuagac aa 22
<210> 44
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 44
aacaggguga cugguuagac aa 22
<210> 45
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 45
aacacgguga cugguuagac aa 22
<210> 46
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 46
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<210> 47
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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aacaguguga cugguuagac aa 22
<210> 48
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 48
aacaggguga cugguuagac aa 22
<210> 49
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 49
aacagcguga cugguuagac aa 22
<210> 50
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 50
aacaggauga cugguuagac aa 22
<210> 51
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 51
aacagguuga cugguuagac aa 22
<210> 52
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 52
aacaggguga cugguuagac aa 22
<210> 53
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 53
aacaggcuga cugguuagac aa 22
<210> 54
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 54
aacagguaga cugguuagac aa 22
<210> 55
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 55
aacagguuga cugguuagac aa 22
<210> 56
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 56
aacaggugga cugguuagac aa 22
<210> 57
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 57
aacaggucga cugguuagac aa 22
<210> 58
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 58
aacaggugaa cugguuagac aa 22
<210> 59
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 59
aacaggugua cugguuagac aa 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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aacaggugga cugguuagac aa 22
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<212> RNA
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aacaggugca cugguuagac aa 22
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<212> RNA
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aacaggugaa cugguuagac aa 22
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<212> RNA
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aacaggugau cugguuagac aa 22
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aacaggugag cugguuagac aa 22
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aacaggugac cugguuagac aa 22
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<211> 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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aacaggugac cugguuagac aa 22
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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aacaggugac uggguuagac aa 22
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<212> RNA
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<212> RNA
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<212> RNA
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aacaggugac ugcguuagac aa 22
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<211> 22
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<212> RNA
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<212> RNA
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aacaggugac ugguuuagac aa 22
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<212> RNA
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<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> RNA
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aacaggugac ugguuaggac aa 22
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<212> RNA
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<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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aacaggugac ugguuagaac aa 22
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<212> RNA
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<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 103
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<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> RNA
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aacaggugac ugguuagacc aa 22
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<212> RNA
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<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 107
aacaggugac ugguuagaca ua 22
<210> 108
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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aacaggugac ugguuagaca ga 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> RNA
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<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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uacaggugac ugguuagaca a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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gacaggugac ugguuagaca a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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cacaggugac ugguuagaca a 21
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<211> 21
<212> RNA
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aucaggugac ugguuagaca a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 118
agcaggugac ugguuagaca a 21
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<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 119
accaggugac ugguuagaca a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 120
aaaaggugac ugguuagaca a 21
<210> 121
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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aauaggugac ugguuagaca a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 122
aagaggugac ugguuagaca a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 123
aacuggugac ugguuagaca a 21
<210> 124
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 124
aacgggugac ugguuagaca a 21
<210> 125
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 125
aaccggugac ugguuagaca a 21
<210> 126
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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aacaagugac ugguuagaca a 21
<210> 127
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 127
aacaugugac ugguuagaca a 21
<210> 128
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 128
aacacgugac ugguuagaca a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 129
aacagaugac ugguuagaca a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 130
aacaguugac ugguuagaca a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 131
aacagcugac ugguuagaca a 21
<210> 132
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 132
aacaggagac ugguuagaca a 21
<210> 133
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 133
aacaggggac ugguuagaca a 21
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<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 134
aacaggcgac ugguuagaca a 21
<210> 135
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 135
aacagguaac ugguuagaca a 21
<210> 136
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 136
aacagguuac ugguuagaca a 21
<210> 137
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 137
aacaggucac ugguuagaca a 21
<210> 138
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 138
aacagguguc ugguuagaca a 21
<210> 139
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 139
aacagguggc ugguuagaca a 21
<210> 140
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 140
aacaggugcc ugguuagaca a 21
<210> 141
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 141
aacaggugaa ugguuagaca a 21
<210> 142
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 142
aacaggugau ugguuagaca a 21
<210> 143
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 143
aacaggugag ugguuagaca a 21
<210> 144
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 144
aacaggugac agguuagaca a 21
<210> 145
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 145
aacaggugac ggguuagaca a 21
<210> 146
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 146
aacaggugac cgguuagaca a 21
<210> 147
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 147
aacaggugac uaguuagaca a 21
<210> 148
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 148
aacaggugac uuguuagaca a 21
<210> 149
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 149
aacaggugac ucguuagaca a 21
<210> 150
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 150
aacaggugac ugauuagaca a 21
<210> 151
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 151
aacaggugac uguuuagaca a 21
<210> 152
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 152
aacaggugac ugcuuagaca a 21
<210> 153
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 153
aacaggugac uggauagaca a 21
<210> 154
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 154
aacaggugac uggguagaca a 21
<210> 155
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 155
aacaggugac uggcuagaca a 21
<210> 156
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 156
aacaggugac ugguaagaca a 21
<210> 157
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 157
aacaggugac uggugagaca a 21
<210> 158
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 158
aacaggugac uggucagaca a 21
<210> 159
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 159
aacaggugac ugguuugaca a 21
<210> 160
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 160
aacaggugac ugguuggaca a 21
<210> 161
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 161
aacaggugac ugguucgaca a 21
<210> 162
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 162
aacaggugac ugguuaaaca a 21
<210> 163
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 163
aacaggugac ugguuauaca a 21
<210> 164
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 164
aacaggugac ugguuacaca a 21
<210> 165
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 165
aacaggugac ugguuaguca a 21
<210> 166
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 166
aacaggugac ugguuaggca a 21
<210> 167
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 167
aacaggugac ugguuagcca a 21
<210> 168
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 168
aacaggugac ugguuagaaa a 21
<210> 169
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 169
aacaggugac ugguuagaua a 21

Claims (10)

1.一种miRNA，或其前体序列、表达载体，或其激动剂的用途，所述的miRNA为miRNA552簇的微小RNA，所述miRNA552簇的微小RNA选自下组：miR-552-3p或miR-552-3p衍生序列、或其经修饰的衍生物，
其中所述miR-552-3p衍生序列具有选自下组的序列：
(a1)5’-(N)0-2Vcaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a2)5’-(N)0-2HVcaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a3)5’-(N)0-2Vacaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a4)5’-(N)0-2Vcagagu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a5)5’-(N)0-2Vcagguu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a6)5’-(N)0-2VcagguN(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a7)5’-(N)0-2VcagguNV(N)6-8N(N)4-6-3’；和/或
(a8)5’-(N)0-2Vcaggu(N)7-8DN(N)4-6-3’；
其中，V为a、g或c，D为a、u或g，H为a、u或c，N为a、g、u或c，(N)0-2表示0、1或2个N，(N)4-6表示4、5或6个N，(N)6-8表示6、7或8个N，(N)7-8表示7或8个N；
其特征在于，用于：
(i)制备下调pcsk9基因或其蛋白表达和/或活性的药物组合物；和/或
(ii)制备治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病的药物组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miR-552-3p为hsa-miR-552-3p，其序列如SEQ ID NO.:1所示。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的miR-552-3p衍生序列具有如SEQ IDNO.:3-10、15-20、22-31、33-34、46、51、54-58、60-88、90-116、118-119、135-169中任一所示的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病是指以低密度脂蛋白胆固醇异常升高为代表性指标的脂代谢异常的疾病。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病选自下组：高胆固醇血症、动脉粥样硬化、冠心病、非酒精性脂肪肝病、或其组合。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物还含有第二活性成分，且所述的第二活性成分选自下组：pcsk9抑制剂、降脂药、治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病的药物、或其组合。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病的药物选自下组：他汀类药物、贝特类药物、胆碱螯合剂、烟酸及其衍生物、胆固醇吸收抑制剂、或其组合。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：
(i)第一活性成分，所述第一活性成分为miRNA552簇的微小RNA，或其前体序列、表达载体，或其激动剂：其中，所述的miRNA552簇的微小RNA选自下组：miR-552-3p或miR-552-3p衍生序列、或其经修饰的衍生物，
其中所述miR-552-3p衍生序列具有选自下组的序列：
(a1)5’-(N)0-2Vcaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a2)5’-(N)0-2HVcaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a3)5’-(N)0-2Vacaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a4)5’-(N)0-2Vcagagu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a5)5’-(N)0-2Vcagguu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a6)5’-(N)0-2VcagguN(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a7)5’-(N)0-2VcagguNV(N)6-8N(N)4-6-3’；和/或
(a8)5’-(N)0-2Vcaggu(N)7-8DN(N)4-6-3’；
其中，V为a、g或c，D为a、u或g，H为a、u或c，N为a、g、u或c，(N)0-2表示0、1或2个N，(N)4-6表示4、5或6个N，(N)6-8表示6、7或8个N，(N)7-8表示7或8个N；
(ii)第二活性成分，所述第二活性成分不同于第一活性成分，且所述的第二活性成分选自下组：治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病的药物、降脂药、pcsk9抑制剂、或其组合；和
(iii)药学上可接受的载体。
9.一种治疗药物组合，其特征在于，所述治疗药物组合包括：
(1)第一药物组合物，所述第一药物组合物含有(i)第一活性成分，所述第一活性成分为miRNA552簇的微小RNA，或其前体序列、表达载体，或其激动剂：其中，所述的miRNA552簇的微小RNA选自下组：miR-552-3p或miR-552-3p衍生序列、或其经修饰的衍生物，
其中所述miR-552-3p衍生序列具有选自下组的序列：
(a1)5’-(N)0-2Vcaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a2)5’-(N)0-2HVcaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a3)5’-(N)0-2Vacaggu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a4)5’-(N)0-2Vcagagu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a5)5’-(N)0-2Vcagguu(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a6)5’-(N)0-2VcagguN(N)7-8N(N)4-6-3’；
(a7)5’-(N)0-2VcagguNV(N)6-8N(N)4-6-3’；和/或
(a8)5’-(N)0-2Vcaggu(N)7-8DN(N)4-6-3’；
其中，V为a、g或c，D为a、u或g，H为a、u或c，N为a、g、u或c,(N)0-2表示0、1或2个N，(N)4-6表示4、5或6个N，(N)6-8表示6、7或8个N，(N)7-8表示7或8个N；
和(ii)药学上可接受的载体；以及
(2)第二药物组合物，所述第二药物组合物选自下组：治疗低密度脂蛋白胆固醇相关代谢性疾病的药物、降脂药、pcsk9抑制剂、或其组合。
10.一种体外非治疗性的下调pcsk9基因或其蛋白表达和/或活性的方法，其特征在于，包括步骤：
向细胞培养体系中加入miRNA552簇的微小RNA，或其前体序列、表达载体，或其激动剂，从而下调pcsk9基因或其蛋白表达和/或活性。
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