CN107312836A - 小分子RNAmiRNA‑146a‑5p在相关疾病风险诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及小分子RNAmiRNA‑146a‑5p在评估心肌收缩功能的药物的制备中的用途、在诊断与心肌收缩功能相关的疾病的药物的制备中的用途以及用于所述用途的试剂盒。

Description

小分子RNAmiRNA-146a-5p在相关疾病风险诊断中的应用

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及小分子RNAmiRNA-146a-5p在评估心肌收缩功能的药物的制备中的用途、在诊断与心肌收缩功能相关的疾病的药物的制备中的用途以及用于所述用途的试剂盒。

背景技术

心力衰竭，简称心衰，是指由于心脏的收缩功能和(或)舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍症候群，此种障碍症候群集中表现为肺淤血、腔静脉淤血。心力衰竭并不是一个独立的疾病，而是心脏疾病发展的终末阶段。数据显示，超过50岁以后心脏功能开始呈现下降趋势，主要表现为左室射血分数正常的舒张功能下降，其后随着年龄的逐渐增大，在同时合并其他器质性心脏疾病，最终发展为心力衰竭，其一年死亡率为21-30％。根据2015年中国心血管病报告，心血管病死亡占城乡居民总死亡原因的首位，农村为44.6％，城市为42.51％。心血管病的疾病负担日渐加重，已成为重大的公共卫生问题。深圳市2015年卫生年鉴显示，心血管疾病作为除肿瘤以外的第二大死因，其中冠心病、心肌梗塞和高血压心脏病分别排前三位，而这三种疾病的终末期表现均为心力衰竭。只有大约50％的心衰患者被临床确诊，当年龄大于70岁，其心衰死亡率高达90％，心脏衰竭已经成为一种老年病。根据《深圳市部分医疗机构2016年前三季度门诊住院次均医药费用情况表》显示三甲医院住院次均费用为14862元(以深圳市人民医院为例)，其中，心衰由于其反复发作且每次住院治疗天数相较于其他疾病更长，所以给患者及其家属造成的经济负担和社会压力更大。

虽然，目前诊断心衰的公认的客观指标为B型利钠肽和N末端B型利钠肽原的浓度增高。但是，目前BNP对于各种心血管疾病的诊断仍没有明确的界值，如对于舒张性心功不全、右心衰竭、老龄患者合并肾功能不全等，还需要个体化评价。对于慢性心衰的左室重塑、血管活性肽与BNP的关系和影响也还有待研究。除此之外，临床上还会通过临床指征、心电图等方法进行诊断和评估，然而据研究，当舒张功能开始降低的同时伴有收缩功能的减弱，但往往被代偿肥大的心肌细胞所掩盖，造成左心室射血分数(LVEF)值正常，会导致临床诊断率低，确诊时间晚。目前对于衰老心功能的研究主要集中在舒张功能方面，对于早期同时降低的收缩功能的研究几乎没有。所以，寻找能反映心肌收缩力的生物标记物，有着及其重要的临床价值。

外泌体(exosome)，是活细胞经过"内吞-融合-外排"等一系列调控过程而形成的膜性囊泡，来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)，直径约为30-150nm，密度在1.13-1.21g/m1，天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。外泌体内含蛋白质、脂质以及miRNA等成分，可以携带蛋白，运送RNA，在细胞间物质和信息转导中起重要作用。研究表明，来源不同细胞的外泌体含有源细胞最关键的功能分子。不同细胞来源的外泌体所含的蛋白质及miRNA不同，其生物学功能也有差异，血液中的外泌体是一种密度很低的固相成分，被认为携带有丰富的生物标志物信息。并且，在人体体液如血清、尿液、组织液等中被外泌体的膜所包裹的RNA不会被核酸酶讲解，而且不受蛋白，IgG等高分丰度蛋白的影响。由于来源于细胞，外泌体所含的物质表征着细胞中的部分物质，也就给检测细胞内的某些蛋白质与核酸的变化带来了可能性。目前，可以运用组学手段，通过一定实验和数据分析方法研究样品中的蛋白质、DNA及RNA，对比正常个体的样品数据，找到疾病特异性的的分子标志物，为疾病的早期诊断、病因分析、治疗靶点、预后情况等提供重要基础和依据。近年来，已经有许多疾病，包括某些肿瘤，可以通过对患者血清中的外泌体的检测，实现早期诊断，同时为疗效判断和预后提供重要依据。在临床诊断实践中，检测核酸标记物具有灵敏度高、特异性好、可精确定量的特点，很适合作为早期诊断的标志物。

MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，几个miRNAs也可以调节同一个基因。可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。因此，具保守估计，约60％～70％的人类蛋白编码基因受miRNA的调控，单个miRNA分子能够与数百个功能各异的靶mRNA相结合而发挥调节作用，参与了哺乳动物几乎所有的病理和生理活动，如个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等，与许多疾病的发生、发展存在着密切的联系。根据Mitchell等人2008年的研究，miRNA能以一种非常稳定的形式存在于人体血浆中，以保护其免受内源性RNase的降解。同时，Chen等通过高通量测序技术对血清中miRNA进行了分析，在男、女性健康人血清中分别发现了100和90种血清miRNA，且在恶劣条件(如高温、极低或极高的PH环境、多次冻融)下仍能保持稳定，而此时大多数RNA都已降解。此外，对正常人和不同疾病患者血清/血浆中miRNA检测结果发现，miRNA广泛存在于正常人和患者的血清/血浆中，并且随着生理状况、疾病种类和病程不同，miRNA的表达谱将发生特异性变化。如，有大量研究表明，在急性心肌梗死动物模型和心肌梗死患者血浆中心肌特异性miRNA-133会显著升高；近年来国内有关研究表明，急性心肌梗死时心肌细胞的miRNA-1表达水平明显升高，并且冠脉病变程度越大，心肌缺血越严重，miRNA-1表达水平越高，miRNA-1和心肌梗死后心肌缺血程度存在显著相关性。

血液中的外泌体被认为携带有丰富的生物标记物信息，来源于不同细胞的外泌体含有能提示源细胞功能的关键分子，因此，体液中的外泌体在临床诊断中的意义越来越被人们重视。这也提示我们，可以寻找人类心肌收缩力下降时表达量有明显改变的miRNA标记物，并以此作为生物标记物对心肌细胞的收缩功能进行评估。

发明内容

本发明的目的在于提供评估心肌收缩功能、诊断与心肌收缩功能相关的疾病的简单快捷的方法以及相关药物。

在第一方面，本发明提供了小分子RNA miRNA-146a-5p在评估受试者心肌收缩功能的药物的制备中的用途。

在本发明的实施方案中，其中所述小分子RNAmiRNA-146a-5p是血清中外泌体小体内的miRNA-146a-5p。

在本发明的实施方案中，其中所述药物用于定量检测所述小分子RNAmiRNA-146a-5p的表达量。

在本发明的实施方案中，所述药物包括基于所述小分子RNAmiRNA-146a-5p设计的引物。

在本发明的实施方案中，所述引物为用于PCR定量或反转录的引物。

在本发明的实施方案中，用于PCR定量的所述引物为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。

在第二方面，本发明提供了小分子RNA miRNA-146a-5p在诊断受试者心脏衰竭的药物的制备中的用途。

在本发明的实施方案中，所述小分子RNAmiRNA-146a-5p是血清中外泌体小体内的miRNA-146a-5p。

在本发明的实施方案中，所述药物用于定量检测所述小分子RNAmiRNA-146a-5p的表达量。

在本发明的实施方案中，所述药物包括基于所述小分子RNAmiRNA-146a-5p设计的引物。

在本发明的实施方案中，所述引物为用于PCR定量或反转录的引物。

在本发明的实施方案中，用于PCR定量的所述引物为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。

在第三方面，本发明提供了用于评估心肌功能的试剂盒，其中所述试剂盒包含定量检测miRNA-146a-5p的表达量进行的试剂。

在本发明的实施方案中，所述小分子RNAmiRNA-146a-5p是血清中外泌体小体内的miRNA-146a-5p。

在本发明的实施方案中，所述试剂包括基于所述小分子RNAmiRNA-146a-5p设计的引物。

在本发明的实施方案中，所述引物为用于PCR定量或反转录的引物。

在本发明的实施方案中，用于PCR定量的所述引物为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。

有益效果：

1.相对传统的心脏功能检查，如临床指征、超声影像和实验室检查，本发明具有取材方便、操作简单、特异性强、快速准确的优点，并且能在心脏代偿期检测到心肌收缩功能的下降。本发明通过对心肌收缩功能个性化的评估，有望实现心衰的早诊断早治疗，提高心衰诊断率，从而改善心血管疾病或发生心衰患者的预后情况。

2.本发明检测血清/血浆中的稳定的miRNA，而传统方法检测的分子标记物是蛋白多肽。在定量检测方面，miRNA的定量精度和灵敏度非常高，使用RT-PCR技术可以达到分子身段检测的能力；传统方法检测蛋白多肽的精准度和灵敏度都较差。

3.传统标记物可由多种细胞分泌，在不同生理病理状态下，都有可能发生改变，需要进行其他的检查；本发明特异性更强，能有效弥补传统方法的不足。

附图说明

通过以下参照附图对本发明实施例的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优点将更为清楚，在附图中：

图1显示利用QPCR验证心衰病人血液中外泌体来源的miRNA-146a-5p的表达情况；

图2显示外泌体来源和血液来源的miRNA-146a-5p在心衰患者、心脏其他疾病和正常人的表达情况，其中A：血清来源的miRNA-146a-5p；B：外泌体来源的miRNA-146a-5p；

图3显示利用ROC曲线分析miRNA-199a区分心功能正常组和心衰组时的敏感性和特异性。

具体实施方式

以下基于实施例对本发明进行描述，但是本发明并不仅仅限于这些实施例。

实施例1实时荧光定PCR(QPCR)验证miRNA的差异表达

所述miRNA-146a-5p是血液外泌体来源的miRNA-146a-5p，其序列为SEQ ID NO：1TGAGAACTGAATTCCATGGGTT

基于SEQ ID NO：1设计了以下用于QPCR(荧光定量)的引物：

正向引物SEQ ID NO：2CCGATGTGTATCCTCAGCTTTG

反向引物SEQ ID NO：3GACAGAGATATCCCAGCTGAAG。

选择心衰患者组、疾病对照组和正常对照组各50例样本进行如下实验：

1.1RNA提取

1.1.1外泌体的分离与纯化

(1)全血3000*g离心15min，移去细胞和细胞碎片；

(2)取上层液体移入离心管，加入适量exoquick试剂，4℃下反应30min；优选250μl血清中加入63μl exoquick试剂；

(3)1500*g离心混合液30min(exosome沉于管下)；

(4)吸出上清，离心1500*g 5min吸出所有上清(不能震动离心管)；

(5)用250μl PBS溶解全部沉淀，-80℃保存。

1.1.2总RNA的提取

①加入Trizol，剧烈震荡1min，室温保存10min；

②加氯仿0.2ml，剧烈震荡1min，充分混匀，室温下放置3min-5min；

③4℃，12000rpm高速离心15min后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管中,注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积异丙醇，1-2ul糖原，充分颠倒混匀，于-20℃保存6小时以上(保持离心管竖直状态)；

④4℃，12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液；

⑤按1ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC冷乙醇洗涤沉淀(-20℃保存)，洗涤沉淀物，充分混合均匀，静置10min，4℃，12000rpm高速离心10min，弃掉上清液，重复一遍操作；

⑥室温下放置5min以充分晾干沉淀，加入10ul DEPC水溶解沉淀；

⑦用Nanodrop2000紫外分光光度计测定RNA纯度及浓度，冻存于-80℃或直接进行下游实验。

1.2反转录

37℃孵育1h。然后反应管中加入1μl 0.5μg/μl Oligo(dT)特异性RT引物，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。

42℃孵育1h。

将反转录好的样品进行10倍稀释后-20℃备用。

1.3 QPCR反应

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量，结果如图1所示，与心脏其他疾病患者相比，miRNA-146a-5p在心衰患者血液中的含量低，同RNA-sep结果一致。

1.3.1 qPCR体系和程序如下：

1.3.2跑胶检验

8％PAGE胶的配制：

试剂	8％PAGE
		双蒸水	15.46ml
30％聚丙烯酰胺	4ml
		50×TAE	400μl
10％APS	140μl
		TEMED	7μl

跑胶条件：160V，25-30min

凝胶成像：电泳完成后，从电泳槽中取下胶板，轻轻撬开两块玻璃板，并小心将PAGE胶剥离，放入凝胶成像仪中，用核酸染料稀释液(1:1000)涂抹均匀，孵育5min，凝胶成像。拍照、结果分析

1.4结果

图1.与正常组相比，miRNA-146a-5p心衰患者组的外泌体中的含量低，同RNA测序的结果一致(*p<0.05vs正常组)。

图2.与心脏其他疾病组相比，miRNA-146a-5p心衰患者组的外泌体和血液中含量均降低，同RNA测序的结果一致(*p<0.05vs正常组；#p<0.05vs疾病对照组)，但是，外泌体的降低幅度，远远高于血清中的降低程度，说明外泌体可以很好的指示心衰患者的疾病发生情况。

实施例2：分析miRNA对心力衰竭的诊断

以上述外泌体来源的miRNA-146a-5p为研究对象，将对照组和心衰患者组敏感性和特异性上做比较，以心衰病人为实验组，心脏其他疾病作为对照组(各组临床指标参见表1)。

表1各组临床指标统计表*P<0.05vs正常组

首先利用exoquic试剂来提取血浆中的外泌体。选用50例心衰血浆样本，50例心脏其他疾病患者血浆样本进行外泌体提取，然后进行外泌体内miRNA-146a-5p QPCR实验，求得各标本CT值，利用ROC曲线分析显示，miRNA-146a-5p在区分心衰组和非心衰组时，其AUC值为0.897，最佳临界点时的敏感性为81％、特异性为86％(见图3)。实验结果显示外泌体中miRNA作为潜在的诊断标志物的灵敏性和特异性都好于血浆组。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种改动和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳大学

<120> 小分子RNAmiRNA-146a-5p在相关疾病风险诊断中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人类序列

<400> 1

tgagaactga attccatggg tt 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgatgtgta tcctcagctt tg 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gacagagata tcccagctga ag 22

Claims (9)

1.小分子RNA miRNA-146a-5p在评估受试者心肌收缩功能的药物的制备中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述小分子RNAmiRNA-146a-5p是血清中外泌体小体内的miRNA-146a-5p。

优选地，所述药物用于定量检测所述小分子RNAmiRNA-146a-5p的表达量。

优选地，所述药物包括基于所述小分子RNAmiRNA-146a-5p设计的引物。

更优选地，所述引物为用于PCR定量或反转录的引物。

更优选地，用于PCR定量的所述引物为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。

3.小分子RNA miRNA-146a-5p在诊断受试者心脏衰竭的药物的制备中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述小分子RNAmiRNA-146a-5p是血清中外泌体小体内的miRNA-146a-5p。

优选地，所述药物用于定量检测所述小分子RNAmiRNA-146a-5p的表达量。

更优选地，所述药物包括基于所述小分子RNAmiRNA-146a-5p设计的引物。

更优选地，所述引物为用于PCR定量或反转录的引物。

在优选地，用于PCR定量的所述引物为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。

5.一种用于评估心肌功能的试剂盒，其中所述试剂盒包含定量检测miRNA-146a-5p的表达量进行的试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述小分子RNAmiRNA-146a-5p是血清中外泌体小体内的miRNA-146a-5p。

7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其中所述试剂包括基于所述小分子RNAmiRNA-146a-5p设计的引物。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述引物为用于PCR定量或反转录的引物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中用于PCR定量的所述引物为SEQ ID NO：2和SEQID NO：3。