CN109402228A - RT-qPCR检测树鼩SLC2A9/Glut9基因转录水平的方法 - Google Patents

RT-qPCR检测树鼩SLC2A9/Glut9基因转录水平的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种RT‑qPCR检测树鼩SLC2A9/GLUT9基因转录水平的方法，以树鼩新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得树鼩肾脏组织cDNA第一链；利用PCR引物组合进行qPCR扩增，获得SLC2A9/GLUT9基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值、溶解峰及扩增效率；通过处理得出均一化后的SLC2A9/GLUT9基因倍数表达的ΔΔC(t)值，从而获得SLC2A9/GLUT9基因转录水平相对表达值。为研究树鼩GLUT9功能以及相关药物对其影响提供了有效途径。本发明适用于实时定量PCR 检测，其灵敏性高、特异性强、操作简单，可重复性高。

Description

RT-qPCR检测树鼩SLC2A9/Glut9基因转录水平的方法
技术领域
本发明涉及一种检测方法，尤其是涉及一种用实时荧光定量qPCR法检测树鼩葡萄糖转运子9（SLC2A9/GLUT9)基因转录水平的方法，属于分子生物技术领域。
背景技术
近年来，全基因组关联分析(Genome-wide association studies，GWAS)已检出多个导致高尿酸血症和痛风的易感位点及相关候选基因。其中SLC2A9、SLC22A11 和SLC22A12基因功能缺失性突变可引起遗传性低尿酸血症，而过表达则会加强尿酸的重吸收。ABCG2、 SLC17A1 和SLC17A3 基因功能缺陷型变异会降低肾脏和肠道对尿酸的排泄量。GLUT9 是一种果糖转运蛋白，属于SLC2A9 家族，位于肾脏肾小管上皮细胞基底外侧膜上，主要负责将尿酸分泌到细胞外，是一种新型高能尿酸转运体，在维持尿酸稳态中起重要作用。之前对于尿酸转运蛋白的研究，主要集中于尿酸如何由肾小管转运至上皮细胞内部，而对其如何由细胞内进入血液的过程，研究甚少。全身SLC2A9/GLUT9 基因敲除小鼠表现尿液中尿酸浓度过高，且伴有早期发作的肾病，表现为结石，间质性肾炎，皮质纤维炎症以及轻微肾机能不全等，这说明尿酸的重吸收过程受阻。与此相比，肝脏SLC2A9/GLUT9 基因钝化小鼠只是表现出尿液和血液中尿酸浓度过高，而没有表现出尿酸性肾病或者肾脏结构异常。以上研究证明GLUT9 能够通过对肾脏和肝脏中尿酸的转运作用，实现全身尿酸稳态平衡。
近年来，随着人民生活水平的提高，饮食结构和生活习惯的改变，高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）的患病率逐年增高，流行病学研究资料表明高尿酸血症和原发性痛风的发病呈上升趋势，在中国，已经有1.2亿的HUA人群，大约占总人口的10%，中老年及绝经后的妇女为高发人群，近年来发病年龄也呈年轻化的趋势。高尿酸血症与肥胖、高血压、高脂血症、冠状动脉粥样硬化性心脏病、胰岛素抵抗的发生密切相关，已成为识别代谢综合征的早期标志，治疗和控制高尿酸血症已成为代谢性疾病治疗的重要组成部分。无论是药物的筛选, 还是致病机制的研究, 都需要选择一种科学、合理的动物模型来开展高尿酸血症致病机理的研究及开发相关降血尿酸的药物。
树鼩（Tupaia belangeri,tree shrews)，是一种非啮齿类哺乳动物，其分类地位介于灵长目与食虫目之间。树鼩具有体型小，易饲养和操作，管理方便，廉价经济，且其进化程度高，新陈代谢和大体解剖比犬、大小鼠等动物与人更为接近，解剖结构也更近似于人，因此其作为较理想的实验动物在医学与生物学的研究中广泛应用。利用亲缘关系与人类接近的实验动物—树鼩来开展高尿酸血症致病机理的研究及开发相关降血尿酸的药物，需要建立一种树鼩SLC2A9/ GLUT9mRNA 表达的相对定量方法，以研究药物作用树鼩体内SLC2A9/ GLUT9基因的转录水平变化，进而为研究GLUT9功能及其对机体血清尿酸的影响因素打下基础。因此, 建立qPCR检测树鼩SLC2A9/GLUT9基因转录水平的方法，可对于开展利用动物模型开展的HUA发病机制研究及新药筛选具有重要意义。
实时荧光定量PCR的基因扩增法已被广泛应用于基因转录水平的定量研究。该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、全封闭反应等优点。为研究树鼩体内SLC2A9/GLUT9转录水平，需建立一种能够对树鼩SLC2A9/GLUT9 mRNA定量检测的方法，为进一步研究打下基础。目前国内外还未见利用树鼩进行SLC2A9/GLUT9转录水平定量检测方法的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用实时荧光定量qPCR法检测树鼩SLC2A9/GLUT9基因转录水平的方法，以在转录水平上对SLC2A9/GLUT9基因进行定量检测。
为实现上述目的，本发明通过下列技术方案完成：以样品总RNA反转录成的cDNA为模板，利用PCR引物组合进行实时荧光定量PCR扩增，根据反应体系中荧光的变化情况定量分析SLC2A9/GLUT9基因转录水平的变化。具体如下：
一种RT-qPCR检测树鼩SLC2A9/GLUT9基因转录水平的方法，包括下列步骤：
（1）设计下列引物：
树鼩SLC2A9/GLUT9基因表达水平的特异性上、下游引物为：
SLC2A9/GLUT9 F：5’- ACAATGAAGCAGGAGCGACA -3’
SLC2A9/GLUT9 R：5’- ACTCAGGGTGATGTACGGGA-3’
作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物为：
GAPDH F：5＇-AGCCCCATCACCATCTTCC-3＇
GAPDH R：5＇- AATGAGCCCCAGCCTTCTC -3＇；
（2）以树鼩新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得树鼩肾脏组织cDNA第一链；
（3）以步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC2A9/GLUT9F和SLC2A9/GLUT9R上、下游引物以及GAPDH F和GAPDH R上、下游引物为特异性引物，分别在下列PCR扩增体系及反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得SLC2A9/GLUT9基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰；Real-time荧光定量qPCR目的片段及内参基因特异性通过绘制出的溶解峰来证实；
所述PCR扩增体系及反应条件如下：
PCR扩增体系即25μL体系：
SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；
SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，GAPDH F和GAPDH R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；
反应条件：94℃预变性30s，94℃变性5s、60℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光信号；
（4）将步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链稀释为100、10-1、10-2、10-3、10-4倍浓度作为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC2A9/GLUT9 F和SLC2A9/GLUT9R上、下游引物以及GAPDH F和GAPDH R上、下游引物为特异性引物，分别按步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件进行荧光定量PCR扩增，反应结束后根据荧光信号的数据，获得Ct值，通过qPCR仪器自带CFXManager 软件建立SLC2A9/GLUT9基因及内参基因GAPDH的溶解曲线及标准曲线，得到SLC2A9/GLUT9基因片段及内参基因GAPDH片段的扩增效率、斜率及R2 值；当目的基因及内参基因扩增效率在80%至120%之间，同时R2接近1，说明结果可信度较高，符合荧光定量PCR要求，可进一步进行待检样品检测；
（（5）在步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件下，以步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链作为待测样品cDNA模板，进行实时荧光定量PCR扩增，得到对应的Ct值，将该Ct值以及步骤（4）得到的SLC2A9/GLUT9基因及内参基因GAPDH的扩增效率，通过qPCR仪器自带CFXManager 软件处理，得出均一化后的SLC2A9/GLUT9基因倍数表达的ΔΔC(t)值，从而获得SLC2A9/GLUT9基因转录水平相对表达值。
所述步骤（3）获得的PCR扩增产物SLC2A9/GLUT9基因片段及内参基因GAPDH片段分别经过下列验证：
1）通过商业生物公司测序分别得到：
所扩增的树鼩SLC2A9/GLUT9基因片段核苷酸序列为：
TCAGGCTGTCTGCCTCTTCTCTGCATTGGCGTGTTCACCGGACAGCTGCTGGGCCTGCCAGAGCTGCTGGAAAAGGAGAGTACCTGGCCATACCTGTTCGGAGTGATCATTGTCCCTGCCTTCATCCAGCTGGTGAGCCTGCCCTTTCTACCTGATAGCCCACGCTACCTTCTCTATCCTCGTGGGAGATATATA
所扩增的树鼩树鼩内参基因GAPDH片段核苷酸序列为：
ATCAAATGGGGTGATGCTGGTGCCGAGTATGTTGTGGAGACCACCGGTGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTGGGGCTCATTC
2）再将上述测序所得核苷酸序列分别通过DNAMAN软件与NCBI所报道的人及树鼩的SLC2A9/GLUT9基因及GAPDH基因的核苷酸序列进行同源性比对，结果显示：用本发明提供的引物、扩增体系及反应条件进行扩增后的树鼩肾脏组织中SLC2A9/GLUT9基因与NCBI人SLC2A9/GLUT9序列（NM_020041.2）的同源性为91.45%；用本发明提供的引物、扩增体系及反应条件进行扩增后的树鼩肾脏组织中GAPDH与NCBI猕猴GAPDH序列(NM_001195426.1）的同源性为93.49%，证明本发明所扩增出的目的片段分别为：树鼩的SLC2A9/GLUT9基因片段及GAPDH基因片段。
使用本发明的引物以及方法进行转录水平定量样品主要为肾脏组织，也适用于其他组织使用。
树鼩作为一种近年来开发的实验动物，NCBI基因库中只有预测的树鼩SLC2A9/GLUT9基因的核苷酸序列作为参考，序列号：XM_006149848.2，用Primer premier 5.0软件设计多对引物，经过RT-PCR扩增,根据引物的特点摸索PCR扩增的最佳退火温度，筛选出上述所述的检测树鼩SLC2A9/GLUT9基因表达的特异性上、下游引物组合及PCR扩增条件，获得了特异的SLC2A9/GLUT9基因片段及内参基因GAPDH片段，并通过对所获得的的特异的SLC2A9/GLUT9基因片段及内参基因GAPDH片段的测序及序列分析，进一步证实了所提供的PCR引物组合的特异性，可应用于实时荧光定量PCR法定量检测树鼩葡萄糖转运子SLC2A9/GLUT9基因转录水平。
本发明具有下列优点和效果：
1）采用上述方案，可较为容易地在转录水平上进行树鼩组织中SLC2A9/GLUT9基因相对定量检测。
2）本发明所公开的引物是通过本领域技术人员公知的化学合成方法进行DNA 合成后得到的，用该引物序列可实现树鼩SLC2A9/GLUT9基因及内参基因GAPDH 的特异性扩增，对材料中非目的基因没有扩增信号，通过本发明的引物，可对树鼩SLC2A9/GLUT9基因转录水平的变化状况实施定量检测，灵敏度高，方法简单，可重复性高。并且，本发明的引物特异性强，不会受到其他基因的干扰，特异性高，为研究树鼩SLC2A9/GLUT9基因的功能及影响因素提供了有效的工具。
附图说明
图1为树鼩RNA完整性测定的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为树鼩SLC2A9/GLUT9基因溶解峰图；
图3为内参基因GAPDH溶解峰图；
图4为树鼩SLC2A9/GLUT9基因的扩增曲线图；
图5为树鼩SLC2A9/GLUT9基因的标准曲线图；
图6为树鼩GAPDH基因的扩增曲线图；
图7为树鼩GAPDH基因的标准曲线图；
图8为肌苷及别嘌醇对树鼩肝、肾、小肠组织SLC2A9/GLUT9 mRNA表达水平变化的影响图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料试剂等，如无特殊说明，均为商业途径得到。
下述本实施例中所使用的实验动物：滇西亚种树鼩，雌雄各半，80只，体重均在110g~150g范围内，由中国医学科学院医学生物学研究所小动物实验部提供，常规性饲养。饲养环境温度20℃～25℃，湿度40%～70%，自由饮水和采食。
下述实施例中的各种溶液配制原则及方法： Inosine配制：肌苷（Inosine，Sigma公司），批号：Lot # SLBP5740V,称取不同量的肌苷置于锥形瓶里面，以0.9%生理盐水作为溶剂，用水浴锅溶解，一般现配现用。（浓度，C=0.05mg/ml）；别嘌醇（allopurimol）配制，缩写为ALLO溶液配制：称取不同量的ALLO置于锥形瓶里面，以0.9%生理盐水作为溶剂，用水浴锅溶解，一般现配现用。（浓度，C=1mg/ml）；
下述实施例中的仪器与耗材：CFX 96TM Real-Time System C1000TM Thermal Cycler美国bio-rad公司产品，Sigma高速冷冻离心机，Sartoyius公司精密电子天平ME235S；美国bio-rad公司凝胶成像分析系统； 美国bio-rad公司PCR仪：；美国bio-rad公司PowerPacBasic电泳仪；日本Tomy公司SS-325高压蒸气灭菌箱；美国DanoDrop公司ND-1000紫外分光光度计。1000ul、200ul、20ul、10ul、2ul的Gilson移液枪；2ml EP管、500ul EP管；1000ul吸头、200ul吸头、10ul吸头。
实施例
一种RT-qPCR检测树鼩SLC2A9/GLUT9基因转录水平的方法，包括下列步骤：
（1）设计下列引物：
根据人、小鼠、猕猴SLC2A9/GLUT9共有序列号：人NM_020041.2、NM_001001290.1；小鼠NM_001102414.1、NM_001012363.2、NM_001102415.1、NM_145559.2；猕猴XM_015137992.1设计引物，以猕猴的GAPDH核苷酸序列设计引物作为内参基因，基因登录号NM_001195426.1，用Primer premier 5.0软件设计引物，由上海生物工程有限公司合成：
树鼩SLC2A9/GLUT9基因表达水平的特异性上、下游引物为：
SLC2A9/GLUT9 F：5’- ACAATGAAGCAGGAGCGACA -3’
SLC2A9/GLUT9 R：5’- ACTCAGGGTGATGTACGGGA-3’
作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物为：
GAPDH F：5＇-AGCCCCATCACCATCTTCC-3＇
GAPDH R：5＇- AATGAGCCCCAGCCTTCTC -3＇；
树鼩SLC2A9/GLUT9基因表达水平定量用引物序列及片段大小见表1：
表1
（2）以树鼩新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得树鼩肾脏组织cDNA第一链；具体如下：
（2.1）树鼩新鲜肝、肾、小肠组织取材：挑选6只树鼩（体重126.71±5.14g），随机分组，每组2只动物，分别第一组腹腔注射inosine 300mg/kg，第二组腹腔注射inosine 300mg/kg+ ALLO 30mg/kg，第三组对照组腹腔注射生理盐水，给药0.5-1h将动物处死，分别采集新鲜的肝、肾、小肠组织约100mg，置于RNA助溶剂（Tripure，Roche公司）用于树鼩SLC2A9/GLUT9基因转录水平的检测；
（2.2）新鲜肝、肾、小肠组织总RNA的提取
取新鲜肝、肾、小肠匀浆器中，加入1ml tripure在室温下充分匀浆，静置5min，再将其转移至1.5mlEP管中静置5min，加入200ul -20℃预冷的氯仿，漩涡震荡充分，静置15min后4℃、12000r/m离心25min，吸取上清液450ul于另一只1.5mlEP管中，等体积加入-20℃预冷的异丙醇，充分混匀静置10min，4℃、12000r/m离心10min，弃上清液，待管内壁稍干，加1ml-20℃预冷的75%乙醇洗涤沉淀，4℃、7500r/m离心5min，弃上清液，待管内壁稍干，加入30ulDEPC水溶解沉淀，65℃水浴10min，所提取的总RNA样品取1μl经Nanodrop-1000超微量核酸测定仪测定浓度及吸光度比值，测定浓度后加DEPC水稀释至1000ng/ul，放入-80℃冰箱备用；
（2.3） RNA完整性检测
随机取4.2步骤所提取的总RNA样品2μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳（120V，400mA）20min，在凝胶成像系统下观察28S，18S和5S条带亮度，分析RNA的完整性。结果可观察到28S，18S和5S三条带，见图1，说明所提取的RNA无降解，完整性好；
（2.4） cDNA的合成
按照逆转录试剂盒PrimeScript™ RT reagent Kit说明操作，每10μl体系中依次加入5×PrimeScript Buffer 2μl，PrimeScript RT Enzyme Mix 0. 5μl，Oligo dT Primer0.5μl，Random 6 mers 0.5μl，总RNA( 浓度稀释为1000 ng /μl) 1μl，RNase Free dH2O5.5μl，逆转录条件为: 37℃，15min，85℃，5s，4℃，10min，得树鼩肾脏组织cDNA第一链；
（3）以步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC2A9/GLUT9F和SLC2A9/GLUT9R上、下游引物以及GAPDH F和GAPDH R上、下游引物为特异性引物，分别在下列PCR扩增体系及反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得SLC2A9/GLUT9基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰；Real-time荧光定量qPCR目的片段及内参基因特异性通过绘制出的溶解峰来证实；
所述PCR扩增体系及反应条件如下：
PCR扩增体系即25μL体系：
SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；
SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，GAPDH F和GAPDH R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；
反应条件：94℃预变性30s，94℃变性5s、60℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光信号；
（4）将步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链稀释为100、10-1、10-2、10-3、10-4倍浓度作为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC2A9/GLUT9 F和SLC2A9/GLUT9R上、下游引物以及GAPDH F和GAPDH R上、下游引物为特异性引物，分别按步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件进行荧光定量PCR扩增，反应结束后根据荧光信号的数据，获得Ct值，通过qPCR仪器自带CFXManager 软件建立SLC2A9/GLUT9基因及内参基因GAPDH的溶解曲线及标准曲线，得到SLC2A9/GLUT9基因片段及内参基因GAPDH片段的扩增效率、斜率及R2 值；当目的基因及内参基因扩增效率在80%至120%之间，同时R2接近1，说明结果可信度较高，符合荧光定量PCR要求，可进一步进行待检样品检测；
（（5）在步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件下，以步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链作为待测样品cDNA模板，进行实时荧光定量PCR扩增，得到对应的Ct值，将该Ct值以及步骤（4）得到的SLC2A9/GLUT9基因及内参基因GAPDH的扩增效率，通过qPCR仪器自带CFXManager 软件处理，得出均一化后的SLC2A9/GLUT9基因倍数表达的ΔΔC(t)值，从而获得SLC2A9/GLUT9基因转录水平相对表达值。
所述步骤（3）获得的PCR扩增产物SLC2A9/GLUT9基因片段及内参基因GAPDH片段分别经过下列验证：
1）通过商业生物公司测序分别得到：
所扩增的树鼩SLC2A9/GLUT9基因片段核苷酸序列为：
TCAGGCTGTCTGCCTCTTCTCTGCATTGGCGTGTTCACCGGACAGCTGCTGGGCCTGCCAGAGCTGCTGGAAAAGGAGAGTACCTGGCCATACCTGTTCGGAGTGATCATTGTCCCTGCCTTCATCCAGCTGGTGAGCCTGCCCTTTCTACCTGATAGCCCACGCTACCTTCTCTATCCTCGTGGGAGATATATA
所扩增的树鼩树鼩内参基因GAPDH片段核苷酸序列为：
ATCAAATGGGGTGATGCTGGTGCCGAGTATGTTGTGGAGACCACCGGTGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTGGGGCTCATTC
2）再将上述测序所得核苷酸序列分别通过DNAMAN软件与NCBI所报道的人及树鼩的SLC2A9/GLUT9基因及GAPDH基因的核苷酸序列进行同源性比对，结果显示：用本发明提供的引物、扩增体系及反应条件进行扩增后的树鼩肾脏组织中SLC2A9/GLUT9基因与NCBI人SLC2A9/GLUT9序列（NM_020041.2）的同源性为91.45%；用本发明提供的引物、扩增体系及反应条件进行扩增后的树鼩肾脏组织中GAPDH与NCBI猕猴GAPDH序列(NM_001195426.1）的同源性为93.49%，证明本发明所扩增出的目的片段分别为：树鼩的SLC2A9/GLUT9基因片段及GAPDH基因片段。
所述步骤（4）树鼩SLC2A9/GLUT9基因及GAPDH基因的溶解曲线和标准曲线的建立：以Esidilution 梯度稀释步骤3.4逆转录合成的树鼩肾脏cDNA第一链，分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4倍浓度，以原始cDNA第一链及稀释后的cDNA为模板，各做2个平行样进行实时荧光定量检测，按步骤4.7荧光定量PCR体系进行实时荧光定量PCR，得到SLC2A9/GLUT9基因和GAPDH基因的溶解曲线和标准曲线。
荧光定量PCR检测肌苷所致的高尿酸血症树鼩肾脏组织SLC2A9/GLUT9 mRNA表达水平的变化：
qPCR检测体系为防止混在RNA中的基因组DNA带来的假阳性，排除可能的污染，在实验中每个检测样品须做复空，同时设置以mRNA为模板对照及无模板对照，防止假阳性。利用CFX 96TM real-time system荧光定量PCR仪自带的CFX Manager软件对结果进行处理分析，以零点作为对照，以样品ct值软件分析测定均一化后对应得到目的基因的相对表达量。
结果
1、树鼩SLC2A9/GLUT9基因荧光定量PCR反应的溶解峰
通过real-time RT-PCR实时荧光定量PCR反应，绘制出的SLC2A9/GLUT9溶解峰如图2，GAPDH溶解峰如图3，显示SLC2A9/GLUT9基因及内参基因GAPDH扩增特异性好，溶解峰单一。图4为SLC2A9/GLUT9基因，图6为内参基因GAPDH，无模板对照无扩增，对照成立。
2、树鼩SLC2A9/GLUT9基因和GAPDH基因的标准曲线
由图4-7可见，树鼩SLC2A9/GLUT9基因和GAPDH基因的标准曲线R2均接近1，说明以此标准曲线进行相对定量较准确，由于荧光强度均较强，故能保证荧光强度的增加与PCR的扩增相对同步，能准确检测PCR的表达，以GAPDH为内源控制物，得到mRNA表达水平的变化。
反应结束后根据各稀释浓度的CT值，CFX Manager软件绘制出扩增曲线及标准曲线，见图4—图7，结果显示SLC2A9/GLUT9基因扩增效率为扩增效率为107.7%，斜率-3.151，R2为0.996， GAPDH基因扩增效率为125.4%，斜率-2.833，R2为0.997，目的基因及内参基因扩增效率在80%至126%之间，扩增效率理想，同时R2接近1，结果可信度较高，符合荧光定量PCR要求。
3、正常树鼩新鲜肝、肾组织SLC2A9/GLUT9 mRNA表达水平的变化的定量检测：
将所获得的新鲜肝、肾组织所提取RNA，经荧光定量检测后， SLC2A9/GLUT9 mRNA表达在树鼩肝、肾、小肠组织中均具有表达，进一步表明机体的肝、肾、小肠组织是尿酸代谢的重要组织。
4、别嘌醇对肌苷所致的高尿酸血症树鼩肝、肾脏、小肠组织SLC2A9/GLUT9 mRNA表达水平的变化的定量检测：
以上各组所获得的新鲜肝肾组织所提取RNA，经荧光定量检测后，软件分析模式测定均一化后的基因表达，相对表达变化见图8。
由CFX Manager软件内部公式计算得出校正的相对定量标准偏差数据表明：SLC2A9/GLUT9基因mRNA相对表达水平Inosine组、Inosine+ALLO龄组相对对照组表达差异明显。在肝脏组织中，肌苷Inosine在造成动物血清尿酸升高的同时，SLC2A9/GLUT9 mRNA的表达相对于正常为给药对照动物显著下调，别嘌醇用药后造成动物血清尿酸值降低的同时，相对于高尿酸动物，可上调SLC2A9/GLUT9mRNA表达。在肾脏组织中，肌苷Inosine在造成动物血清尿酸升高的同时，SLC2A9/GLUT9 mRNA的表达相对于正常为给药对照动物，显著上调，别嘌醇用药后造成动物血清尿酸值降低的同时，相对于高尿酸动物，可进一步上调SLC2A9/GLUT9 mRNA表达。在小肠组织中，肌苷Inosine在造成动物血清尿酸升高的同时，SLC2A9/GLUT9 mRNA的表达相对于正常为给药对照动物显著上调，别嘌醇用药后造成动物血清尿酸值降低的同时，相对于高尿酸动物，显著下调SLC2A9/GLUT9mRNA表达。
5、肌苷(Inosine)，也称为次黄苷、次黄嘌呤核苷等。是由次黄嘌呤于核糖结合而成的核苷类化合物。本药为人体的正常成分，为腺嘌呤的前体，能直接透过细胞膜进入体细胞，参与体内核酸代谢、能量代谢和蛋白质的合成。在嘌呤的从头合成中，肌苷酸(IMP)可以作为合成腺苷酸(AMP)和鸟苷酸(GMP)的前体 ，Inosine是体内ATP、辅酶A、核糖核酸及脱氧核糖核酸等生命分子基本组成，在体内转变为肌苷酸及三磷酸腺苷，并继而转换为其他多种核苷酸，同时肌苷也是尿酸合成的底物。采用腹腔注射给树鼩一定剂量的尿酸合成底物-肌苷，导致次黄嘌呤在体内的蓄积，最终造成树鼩体内尿酸含量增加，造成高尿酸血症， 用于上述实施例可使树鼩在肝脏组织中，肌苷Inosine在造成动物血清尿酸升高的同时，SLC2A9/GLUT9 mRNA的表达相对于正常为给药对照动物显著下调；在肾脏。小肠组织中，肌苷Inosine在造成动物血清尿酸升高的同时，SLC2A9/GLUT9 mRNA的表达相对于正常为给药对照动物，显著上调，见图8。
别嘌醇（ALLO）通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性使尿酸生成减少,血中及尿中的尿酸含量降低到溶解度以下的水平，主要用于治疗痛风和防止痛风性肾病、继发性高尿酸血症以及重症癫痫的辅助治疗，用于上述实施例推测机体为调节体内尿酸代谢的平衡，在肝、肾脏组织中别嘌醇上调了SLC2A9/GLUT9 mRNA表达，在小肠组织中别嘌醇显著下调了SLC2A9/GLUT9 mRNA表达。见图4。
本发明可用于树鼩肝脏、肾脏、小肠组织等组织的SLC2A9/GLUT9 mRNA 表达水平的检测，为研究树鼩SLC2A9/GLUT9基因的功能及影响因素提供了有效工具，为高尿酸血症等疾病的研究提供可靠手段。
序列表
SLC2A9/GLUT9基因特异性上游引物：
SLC2A9/GLUT9F：5’- ACAATGAAGCAGGAGCGACA -3’5-
SLC2A9/GLUT9基因特异性下游引物：
SLC2A9/GLUT9 R：5’- ACTCAGGGTGATGTACGGGA-3’
内参基因GAPDH特异性上游引物：
GAPDH F：5＇--AGCCCCATCACCATCTTCC -3＇
内参基因GAPDH特异性下游引物：
GAPDH R：5＇- AATGAGCCCCAGCCTTCTC -3＇
所扩增的树鼩SLC2A9/GLUT9基因片段扩增序列为：
TCAGGCTGTCTGCCTCTTCTCTGCATTGGCGTGTTCACCGGACAGCTGCTGGGCCTGCCAGAGCTGCTGGAAAAGGAGAGTACCTGGCCATACCTGTTCGGAGTGATCATTGTCCCTGCCTTCATCCAGCTGGTGAGCCTGCCCTTTCTACCTGATAGCCCACGCTACCTTCTCTATCCTCGTGGGAGATATATA
所扩增的树鼩树鼩内参基因GAPDH片段扩增序列为：
ATCAAATGGGGTGATGCTGGTGCCGAGTATGTTGTGGAGACCACCGGTGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTGGGGCTCATTC
序列表
<110> 中国医学科学院医学生物学研究所
<120> RT-qPCR检测树鼩SLC2A9/Glut9基因转录水平的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 树鼩(Tupaia belangeri)
<400> 1
acaatgaagc aggagcgaca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 树鼩(Tupaia belangeri)
<400> 2
actcagggtg atgtacggga 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 树鼩(Tupaia belangeri)
<400> 3
agccccatca ccatcttcc 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 树鼩(Tupaia belangeri)
<400> 4
aatgagcccc agccttctc 19
<210> 5
<211> 195
<212> DNA
<213> 树鼩(Tupaia belangeri)
<400> 5
tcaggctgtc tgcctcttct ctgcattggc gtgttcaccg gacagctgct gggcctgcca 60
gagctgctgg aaaaggagag tacctggcca tacctgttcg gagtgatcat tgtccctgcc 120
ttcatccagc tggtgagcct gccctttcta cctgatagcc cacgctacct tctctatcct 180
cgtgggagat atata 195
<210> 6
<211> 83
<212> DNA
<213> 树鼩(Tupaia belangeri)
<400> 6
atcaaatggg gtgatgctgg tgccgagtat gttgtggaga ccaccggtgt cttcaccacc 60
atggagaagg ctggggctca ttc 83

Claims (1)

1.一种RT-qPCR检测树鼩SLC2A9/GLUT9基因转录水平的方法，其特征在于包括下列步骤：
（1）设计下列引物：
树鼩SLC2A9/GLUT9基因表达水平的特异性上、下游引物为：
SLC2A9/GLUT9 F：5’- ACAATGAAGCAGGAGCGACA -3’
SLC2A9/GLUT9 R：5’- ACTCAGGGTGATGTACGGGA-3’
作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物为：
GAPDH F：5＇-AGCCCCATCACCATCTTCC-3＇
GAPDH R：5＇- AATGAGCCCCAGCCTTCTC -3＇；
（2）以树鼩新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得树鼩肾脏组织cDNA第一链；
（3）以步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC2A9/GLUT9F和SLC2A9/GLUT9R上、下游引物以及GAPDH F和GAPDH R上、下游引物为特异性引物，分别在下列PCR扩增体系及反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得SLC2A9/GLUT9基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰；
所述PCR扩增体系及反应条件如下：
PCR扩增体系即25μL体系：
SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；
SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，GAPDH F和GAPDH R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；
反应条件：94℃预变性30s，94℃变性5s、60℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光信号；
（4）将步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链稀释为100、10-1、10-2、10-3、10-4倍浓度作为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC2A9/GLUT9 F和SLC2A9/GLUT9R上、下游引物以及GAPDH F和GAPDH R上、下游引物为特异性引物，分别按步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件进行荧光定量PCR扩增，反应结束后根据荧光信号的数据，获得Ct值，通过qPCR仪器自带CFXManager 软件建立SLC2A9/GLUT9基因及内参基因GAPDH的溶解曲线及标准曲线，得到SLC2A9/GLUT9基因片段及内参基因GAPDH片段的扩增效率、斜率及R2 值；
（5）在步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件下，以步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链作为待测样品cDNA模板，进行实时荧光定量PCR扩增，得到对应的Ct值，将该Ct值以及步骤（4）得到的SLC2A9/GLUT9基因及内参基因GAPDH的扩增效率，通过qPCR仪器自带CFX Manager软件处理，得出均一化后的SLC2A9/GLUT9基因倍数表达的ΔΔC(t)值，从而获得SLC2A9/GLUT9基因转录水平相对表达值。
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CN111154868A (zh) * 2020-03-10 2020-05-15 中国医学科学院医学生物学研究所 实时荧光定量pcr方法检测树鼩slc22a6基因转录水平方法及引物和试剂盒
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