CN108330172A - RT-qPCR检测树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法 - Google Patents

RT-qPCR检测树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108330172A
CN108330172A CN201710902502.7A CN201710902502A CN108330172A CN 108330172 A CN108330172 A CN 108330172A CN 201710902502 A CN201710902502 A CN 201710902502A CN 108330172 A CN108330172 A CN 108330172A
Authority
CN
China
Prior art keywords
slc22a12
urat1
gapdh
tree shrew
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710902502.7A
Other languages
English (en)
Inventor
唐东红
王陈芸
叶尤松
李哲丽
马开利
鲁帅尧
肖涵
邱炳玲
陈倩
杨浩
杨忠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Original Assignee
Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC filed Critical Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority to CN201710902502.7A priority Critical patent/CN108330172A/zh
Publication of CN108330172A publication Critical patent/CN108330172A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本发明提供一种RT‑qPCR检测树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法。以树鼩新鲜肾脏组织提取总RNA，按常规逆转录合成得树鼩肾脏组织cDNA第一链为模板，利用PCR引物组合进行实时荧光定量PCR扩增，获得SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值、溶解峰及扩增效率；通过处理得出均一化后的SLC22A12/URAT1基因倍数表达的ΔΔC(t)值而获得SLC22A12/URAT1基因转录水平相对表达值。为研究树鼩尿酸盐阴离子转运体1功能以及相关药物对其影响提供了有效途径。本发明适用于实时定量PCR检测，其灵敏性高、特异性强、操作简单，可重复性高。

Description

RT-qPCR检测树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法
技术领域
本发明涉及一种检测方法，尤其是一种用实时荧光定量RT-qPCR法检测树鼩尿酸盐阴离子转运体1（SLC22A12/URAT1）转录水平的方法，属于分子生物技术领域。
背景技术
尿酸盐阴离子转运体1（urate anion transporter 1， URAT1）是人肾小管重吸收尿酸的主要转运蛋白,是第一个被发现的与肾脏尿酸盐转运的相关蛋白，主要存在于肾小管上皮细胞刷状缘膜上，属于有机阴离子转运蛋白( OAT) 家族，编码基因为SLC22A12，通过介导尿酸从管腔内利用重吸收作用( 管腔两侧的浓度梯度和化学梯度) 转运到肾小管上皮细胞，具有强大的尿酸重吸收能力。机体内, 尿酸经肾小球滤过、肾小管重吸收、肾小管再分泌及分泌后重吸收4 个过程排泄出体外, 而原尿中90%的尿酸被近曲小管S1 段的URAT1重吸收进入上皮细胞, 继而重新进入血液循环，UＲAT1 对近曲小管重吸收起到了关键性的调节作用，抑制URAT1 将大大减少尿酸重吸收而促进尿酸排泄。
近年来，随着人民生活水平的提高，饮食结构和生活习惯的改变，高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）的患病率逐年增高，流行病学研究资料表明高尿酸血症和原发性痛风的发病呈上升趋势，在中国，已经有1.2亿的HUA人群，大约占总人口的10%，中老年及绝经后的妇女为高发人群，近年来发病年龄也呈年轻化的趋势。高尿酸血症与肥胖、高血压、高脂血症、冠状动脉粥样硬化性心脏病、胰岛素抵抗的发生密切相关，已成为识别代谢综合征的早期标志，治疗和控制高尿酸血症已成为代谢性疾病治疗的重要组成部分。无论是药物的筛选, 还是致病机制的研究, 都需要选择一种科学、合理的动物模型来开展高尿酸血症致病机理的研究及开发相关降血尿酸的药物。
树鼩（Tupaia belangeri,tree shrews)，是一种非啮齿类哺乳动物，其分类地位介于灵长目与食虫目之间。树鼩具有体型小，易饲养和操作，管理方便，廉价经济，且其进化程度高，新陈代谢和大体解剖比犬、大小鼠等动物与人更为接近，解剖结构也更近似于人，因此其作为较理想的实验动物在医学与生物学的研究中广泛应用。利用亲缘关系与人类接近的实验动物——树鼩来开展高尿酸血症致病机理的研究及开发相关降血尿酸的药物，需要建立一种树鼩尿酸盐阴离子转运体1，即SLC22A12/URAT1 mRNA 表达的相对定量方法，以研究药物作用树鼩体内SLC22A12/URAT1基因的转录水平变化，进而为研究URAT1功能及其对机体血清尿酸的影响因素打下基础。因此, 建立RT-qPCR检测树鼩尿酸盐阴离子转运体1（ SLC22A12/URAT1）基因转录水平的方法，可对于开展利用动物模型开展的HUA发病机制研究及新药筛选具有重要意义。
实时荧光定量PCR的基因扩增法已被广泛应用于基因转录水平的定量研究。该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、全封闭反应等优点。目前国内外还未见利用树鼩进行SLC22A12/URAT1转录水平定量检测方法的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用实时荧光定量RT-qPCR法检测树鼩尿酸盐阴离子转运体1（SLC22A12/URAT1）转录水平的方法，以在转录水平上对SLC22A12/URAT1基因进行定量检测。
为实现上述目的，本发明以样品总RNA反转录成的cDNA为模板，利用PCR引物组合进行实时荧光定量PCR扩增，根据反应体系中荧光的变化情况定量分析SLC22A12/URAT1转录水平。
本发明的具体方案是：一种RT-qPCR检测树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法，其特征在于包括下列步骤：
（1）设计下列引物：
树鼩SLC22A12/URAT1表达水平的特异性上、下游引物为：
SLC22A12/ URAT1 F：5＇- CTACGACCACGGCACTTTCA-3＇
SLC22A12/ URAT1 R：5＇- AAGGTAACTCCAGGTCAGCAC-3＇
作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物为：
GAPDH F：5＇-AGCCCCATCACCATCTTCC-3＇
GAPDH R：5＇- AATGAGCCCCAGCCTTCTC -3＇；
（2）以树鼩新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得树鼩肾脏组织cDNA第一链；
（3）以步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R上、下游引物以及GAPDH F和GAPDH R上、下游引物为特异性引物，分别在下列PCR扩增体系及反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰，目的基因片段及内参基因片段的溶解峰单一，说明PCR扩增的特异性好；
所述PCR扩增体系及反应条件如下：
PCR扩增体系即25μL体系：
SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；
SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，GAPDH F和GAPDH R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；
反应条件：94℃预变性30s，94℃变性5s、60℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光信号；
（4）将步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链稀释为100、10-1、10-2、10-3、10-4倍浓度作为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R以及GAPDH F和GAPDH R为特异性引物，分别按步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件进行荧光定量PCR扩增，反应结束后根据荧光信号的数据，获得Ct值，通过qPCR仪器自带CFXManager 软件建立SLC22A12/URAT1基因及内参基因GAPDH的溶解曲线及标准曲线，得到SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段的扩增效率、斜率及R2 值；当SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片 段扩增效率分别在80%至120% 之间，同时R2接近1时，说明结果可信度较高，符合荧光定量PCR 要求，可进一步进行待检样品检测；
（5）在步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件下，以步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链作为待测样品cDNA模板，进行实时荧光定量PCR扩增，得到对应的Ct值，将该Ct值以及步骤（4）得到的SLC22A12/URAT1目的基因及内参基因GAPDH的扩增效率，通过qPCR仪器自带CFXManager 软件处理，得出均一化后的SLC22A12/URAT1基因倍数表达的ΔΔC(t)值，从而获得SLC22A12/URAT1基因转录水平相对表达值。
所述步骤3）获得的PCR 扩增产物SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段分别经过下列验证：
1）通过商业生物公司测序分别得到：
所扩增的树鼩SLC22A12/URAT1基因片段核苷酸序列为：
AAGGCTGGGACTGGTGTGTGACTCTCGGGCCCTGAAGCCCATGTCCCAGTCCATCTACTTGACTGGGATGCTGGTGGGAGCTGCTGTGTGTGGCCATGCCTCAGACAGGTTTGGGCGCAGGCTGGTGCTGACCTGGAGTTACCTTT
所扩增的树鼩树鼩内参基因GAPDH片段核苷酸序列为：
ATCAAATGGGGTGATGCTGGTGCCGAGTATGTTGTGGAGACCACCGGTGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTGGGGCTCATTC
2）再将上述测序所得核苷酸序列分别通过DNAMAN软件与NCBI所报道的人的SLC22A12/URAT1基因及GAPDH基因的核苷酸序列进行同源性比对，结果显示：用本发明提供的引物、扩增体系及反应条件进行扩增后的树鼩肾脏组织中SLC22A12/URAT1基因与NCBI报导的人类SLC22A12/URAT1序列（AB071863.1）的同源性为93.02%；用本发明提供的引物、扩增体系及反应条件进行扩增后的树鼩肾脏组织中内参基因GAPDH与NCBI报道的猕猴GAPDH序列（NM_001195426.1）的同源性为93.49%，证明本发明扩增出的目的片段分别为树鼩SLC22A12/URAT1基因片段及GAPDH基因片段。
使用本发明的引物、扩增体系及反应条件进行转录水平定量的样品主要为肾脏组织，也可以为其他组织。
本发明所要解决的技术难点是：
树鼩作为一种近年来开发的实验动物，NCBI基因库中只有预测的树鼩SLC22A12 （SLC22A12/URAT1）基因的核苷酸序列作为参考，序列号：XM_006149848.2，用Primerpremier 5.0软件设计多对引物，经过RT-PCR扩增,根据引物的特点摸索PCR扩增的最佳退火温度，筛选出上述所述的检测树鼩SLC22A12/URAT1基因表达的特异性上、下游引物组合及PCR扩增条件，获得了特异的SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段，并通过对所获得的的特异的SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段的测序及序列分析，进一步证实了所提供的PCR引物组合的特异性，可应用于实时荧光定量PCR法定量检测树鼩尿酸盐阴离子转运体1 SLC22A12/URAT1基因转录水平。
本发明具有下列优点和效果：
1）采用上述方案，可容易地在转录水平上进行树鼩组织中SLC22A12/URAT1基因相对定量检测。
2）本发明所公开的引物是通过本领域技术人员公知的化学合成方法进行DNA 合成后得到的，用该引物序列可实现树鼩SLC22A12/URAT1基因及内参基因GAPDH 的特异性扩增，对材料中非目的基因没有扩增信号，通过本发明的引物，可对树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的变化状况实施定量检测，灵敏度高，方法简单，可重复性高。并且，本发明的引物特异性强，不会受到其他基因的干扰，特异性高，为研究树鼩SLC22A12/URAT1基因的功能及影响因素提供了有效的工具。
附图说明
图1为树鼩RNA完整性测定的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为树鼩SLC22A12/URAT1基因的扩增曲线图；
图3为内参基因GAPDH溶解峰图；
图4为树鼩SLC22A12/URAT1基因的扩增曲线图；
图5为树鼩SLC22A12/URAT1基因的标准曲线图；
图6为树鼩GAPDH基因的扩增曲线图；
图7为树鼩GAPDH基因的标准曲线图；
图8是为肌苷对树鼩肾脏组织SLC22A12/URAT1 mRNA表达水平变化的影响图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例中所使用的材料试剂等，如无特殊说明，均为商业途径得到。
实施例中所使用的实验动物为：滇西亚种树鼩，雌雄各半，80只，体重均在110g~150g范围内，由中国医学科学院医学生物学研究所小动物实验部提供，常规性饲养。饲养环境温度20℃～25℃，湿度40%～70%，自由饮水和采食。
实施例中各种溶液配制原则及方法： Inosine配制：肌苷（Inosine，Sigma公司），批号：Lot # SLBP5740V,称取不同量的肌苷置于锥形瓶里面，以0.9%生理盐水作为溶剂，用水浴锅溶解，一般现配现用。（浓度，C=0.05mg/ml）；别嘌醇（allopurimol）配制，缩写为ALLO溶液配制：称取不同量的ALLO置于锥形瓶里面，以0.9%生理盐水作为溶剂，用水浴锅溶解，一般现配现用。（浓度，C=1mg/ml）；
仪器与耗材：CFX 96TM Real-Time System C1000TM Thermal Cycler 美国bio-rad公司产品，Sigma高速冷冻离心机，Sartoyius公司精密电子天平ME235S；美国bio-rad公司凝胶成像分析系统； 美国bio-rad公司PCR仪：；美国bio-rad公司PowerPac Basic电泳仪；日本Tomy公司SS-325高压蒸气灭菌箱；美国DanoDrop公司ND-1000紫外分光光度计。1000ul、200ul、20ul、10ul、2ul的Gilson移液枪；2ml EP管、500ul EP管；1000ul吸头、200ul吸头、10ul吸头。
实施例
RT-qPCR检测树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法，其特征在于包括下列步骤：
（1）设计下列引物：
树鼩SLC22A12/URAT1表达水平的特异性上、下游引物为：
SLC22A12/ URAT1 F：5＇- CTACGACCACGGCACTTTCA-3＇
SLC22A12/ URAT1 R：5＇- AAGGTAACTCCAGGTCAGCAC-3＇
作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物为：
GAPDH F：5＇-AGCCCCATCACCATCTTCC-3＇
GAPDH R：5＇- AATGAGCCCCAGCCTTCTC -3＇；
树鼩URAT1(SLC22A12)基因表达水平定量用引物序列及片段大小见表1：
表1
（2）以树鼩新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得树鼩肾脏组织cDNA第一链；具体如下：
（2.1）树鼩新鲜肝、肾、小肠组织取材：挑选6只树鼩（体重126.71±5.14g），随机分组，每组2只动物，分别第一组腹腔注射inosine 300mg/kg，第二组腹腔注射inosine 300mg/kg+ ALLO 30mg/kg，第三组对照组腹腔注射生理盐水，给药0.5-1h将动物处死，分别采集新鲜的肝、肾、小肠组织约100mg，置于RNA助溶剂（Tripure，Roche公司）用于树鼩尿酸盐阴离子转运体1（URAT1）基因转录水平的检测；
（2.2）新鲜肝、肾、小肠组织总RNA的提取
取新鲜肝、肾、小肠匀浆器中，加入1ml Tripure试剂在室温下充分匀浆，静置5min，再将其转移至1.5mlEP管中静置5min，加入200ul -20℃预冷的氯仿，漩涡震荡充分，静置15min后4℃、12000r/m离心25min，吸取上清液450ul于另一只1.5mlEP管中，等体积加入-20℃预冷的异丙醇，充分混匀静置10min，4℃、12000r/m离心10min，弃上清液，待管内壁稍干，加1ml-20℃预冷的75%乙醇洗涤沉淀，4℃、7500r/m离心5min，弃上清液，待管内壁稍干，加入30ulDEPC水溶解沉淀，65℃水浴10min，所提取的总RNA样品取1μl经Nanodrop-1000超微量核酸测定仪测定浓度及吸光度比值。测定浓度后加DEPC水稀释至1000ng/ul，放入-80℃冰箱备用；
（2.3） RNA完整性检测
随机取（2.2）步骤所提取的总RNA样品2μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳（120V，400mA）20min，在凝胶成像系统下观察28S，18S和5S条带亮度，分析RNA的完整性。结果可观察到28S，18S和5S三条带，见图1，说明所提取的RNA无降解，完整性好；
（2.4） cDNA的合成
按照逆转录试剂盒PrimeScript™RT reagent Kit说明操作，每10μl体系中依次加入5×PrimeScript Buffer 2μl，PrimeScript RT Enzyme Mix 0. 5μl，Oligo dT Primer 0.5μl，Random 6 mers 0.5μl，总RNA( 浓度稀释为1000 ng /μl) 1μl，RNase Free dH2O 5.5μl，逆转录条件为: 37℃，15min，85℃，5s，4℃，10min，得树鼩肾脏组织cDNA第一链；
（3）以步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R上、下游引物以及GAPDH F和GAPDH R上、下游引物为特异性引物，分别在下列PCR扩增体系及反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰，目的基因片段及内参基因片段的溶解峰单一，说明PCR扩增的特异性好；
所述PCR扩增体系及反应条件如下：
PCR扩增体系即25μL体系：
SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；
SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，GAPDH F和GAPDH R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；
反应条件：94℃预变性30s，94℃变性5s、60℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光信号；
（4）将步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链稀释为100、10-1、10-2、10-3、10-4倍浓度作为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R以及GAPDH F和GAPDH R为特异性引物，分别按步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件进行荧光定量PCR扩增，反应结束后根据荧光信号的数据，获得Ct值，通过qPCR仪器自带CFXManager 软件建立SLC22A12/URAT1基因及内参基因GAPDH的溶解曲线及标准曲线，得到SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段的扩增效率、斜率及R2 值；当SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片 段扩增效率分别在80%至120% 之间，同时R2接近1时，说明结果可信度较高，符合荧光定量PCR 要求，可进一步进行待检样品检测；
（5）在步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件下，以步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链作为待测样品cDNA模板，进行实时荧光定量PCR扩增，得到对应的Ct值，将该Ct值以及步骤（4）得到的SLC22A12/URAT1目的基因及内参基因GAPDH的扩增效率，通过qPCR仪器自带CFXManager 软件处理，得出均一化后的SLC22A12/URAT1基因倍数表达的ΔΔC(t)值，从而获得SLC22A12/URAT1基因转录水平相对表达值。
所述步骤3）获得的PCR 扩增产物SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段分别经过下列验证：
送铂尚生物技术（上海）有限公司测序，测序结果如下：
树鼩SLC22A12/URAT1基因片段扩增核苷酸序列为：
AAGGCTGGGACTGGTGTGTGACTCTCGGGCCCTGAAGCCCATGTCCCAGTCCATCTACTTGACTGGGATGCTGGTGGGAGCTGCTGTGTGTGGCCATGCCTCAGACAGGTTTGGGCGCAGGCTGGTGCTGACCTGGAGTTACCTTT
树鼩内参基因GAPDH片段扩增核苷酸序列为：
ATCAAATGGGGTGATGCTGGTGCCGAGTATGTTGTGGAGACCACCGGTGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTGGGGCTCATTC
基因测序结果分析及验证
再将上述测序所得核苷酸序列分别通过DNAMAN软件与NCBI所报道的人的SLC22A12/URAT1基因及GAPDH基因的核苷酸序列进行同源性比对，结果显示：用本发明提供的引物、扩增体系及反应条件进行扩增后的树鼩肾脏组织中SLC22A12/URAT1基因与NCBI报导的人类SLC22A12/URAT1序列（AB071863.1）的同源性为93.02%；用本发明提供的引物、扩增体系及反应条件进行扩增后的树鼩肾脏组织中内参基因GAPDH与NCBI报道的猕猴GAPDH序列（NM_001195426.1）的同源性为93.49%，证明本发明扩增出的目的片段分别为树鼩SLC22A12/URAT1基因片段及GAPDH基因片段。
所述步骤（4）树鼩SLC22A12/URAT基因及GAPDH基因标准曲线的建立：以Esidilution 梯度稀释步骤3.4逆转录合成的树鼩肾脏cDNA第一链，分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4倍浓度，以原始cDNA第一链及稀释后的cDNA为模板，各做2个平行样进行实时荧光定量检测，按步骤4.7荧光定量PCR体系进行实时荧光定量PCR，得到SLC22A12/URAT1基因和GAPDH基因的溶解曲线和标准曲线。
荧光定量PCR检测肌苷所致的高尿酸血症树鼩肾脏组织SLC22A12/URAT1mRNA表达水平的变化：
qPCR检测体系为防止混在RNA中的基因组DNA带来的假阳性，排除可能的污染，在实验中每个检测样品须做复空，同时设置以mRNA为模板对照及无模板对照，防止假阳性。利用CFX 96TM real-time system荧光定量PCR仪自带的CFX Manager软件对结果进行处理分析，以零点作为对照，以样品ct值软件分析测定均一化后对应得到目的基因的相对表达量。
结果
1、树鼩SLC22A12/URAT1基因荧光定量PCR反应的溶解峰
通过real-time RT-PCR实时荧光定量PCR反应，绘制出的SLC22A12/URAT1溶解峰如图2，GAPDH溶解峰如图3，显示SLC22A12/URAT1基因及内参基因GAPDH扩增特异性好，溶解峰单一。图4为SLC22A12/URAT1 基因，图6为内参基因GAPDH，无模板对照无扩增，对照成立。
2 、树鼩SLC22A12/URAT1基因和GAPDH基因的标准曲线
由图4-7可见，树鼩SLC22A12/URAT1基因和GAPDH基因的标准曲线R2均接近1，说明以此标准曲线进行相对定量较准确，由于荧光强度均较强，故能保证荧光强度的增加与PCR的扩增相对同步，能准确检测PCR的表达，以GAPDH为内源控制物，得到mRNA表达水平的变化。
反应结束后根据各稀释浓度的CT值，CFX Manager软件绘制出扩增曲线及标准曲线，见图4-图7，结果显示SLC22A12/URAT1基因扩增效率为扩增效率为89.7%，斜率-3.595，R2为0.995， GAPDH基因扩增效率为125.4%，斜率-2.833，R2为0.997，目的基因及内参基因扩增效率在80%至120之间，扩增效率理想， 同时R2接近1，结果可信度较高，符合荧光定量PCR要求。
3、正常树鼩新鲜肝、肾组织SLC22A12/URAT1 mRNA表达水平的变化的定量检测
将所获得的新鲜肝、肾组织所提取RNA，经荧光定量检测后， SLC22A12/URAT1 mRNA表达在新鲜肾脏组织表达，在肝脏组织没有检测到SLC22A12/URAT1 mRNA表达。
4、别嘌醇对肌苷所致的高尿酸血症树鼩肝、肾脏、小肠组织SLC22A12/URAT1 mRNA表达水平的变化的定量检测
以上各组所获得的新鲜肝肾组织所提取RNA，经荧光定量检测后，软件分析模式测定均一化后的基因表达 normalized expression，相对表达值见图8。
由CFX Manager软件内部公式计算得出校正的相对定量标准偏差数据表明：SLC22A12/URAT1基因mRNA相对表达水平Inosine组、Inosine+ALLO龄组相对对照组表达差异明显。结果显示树鼩SLC22A12/URAT1 mRNA在树鼩肾脏组织中显著表达，在肝脏及小肠组织中没有检测到其mRNA的表达。肾脏组织的SLC22A12/URAT1基因表达在肌苷给药0.5-1h后相对于对照组显著上调，推测机体由于尿酸合成底物的大量增加，为增加及促进机体尿酸的排泄， SLC22A12/URAT1基因mRNA表达显著上调；别嘌醇组较高尿酸组SLC22A12/URAT1mRNA的表达上调较多，推测为进一步增加及促进机体尿酸的排泄， SLC22A12/URAT1基因mRNA表达较单独用肌苷组动物上调，较对照组显著上调。
5、肌苷(Inosine)，也称为次黄苷、次黄嘌呤核苷等。是由次黄嘌呤于核糖结合而成的核苷类化合物。本药为人体的正常成分，为腺嘌呤的前体，能直接透过细胞膜进入体细胞，参与体内核酸代谢、能量代谢和蛋白质的合成。在嘌呤的从头合成中，肌苷酸(IMP)可以作为合成腺苷酸(AMP)和鸟苷酸(GMP)的前体 ，Inosine是体内ATP、辅酶A、核糖核酸及脱氧核糖核酸等生命分子基本组成，在体内转变为肌苷酸及三磷酸腺苷，并继而转换为其他多种核苷酸，同时肌苷也是尿酸合成的底物。采用腹腔注射给树鼩一定剂量的尿酸合成底物-肌苷，导致次黄嘌呤在体内的蓄积，最终造成树鼩体内尿酸含量增加，造成高尿酸血症， 用于上述实施例可使树鼩SLC22A12/URAT1 mRNA 表达显著上调；别嘌醇（ALLO）通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性使尿酸生成减少,血中及尿中的尿酸含量降低到溶解度以下的水平，主要用于治疗痛风和防止痛风性肾病、继发性高尿酸血症以及重症癫痫的辅助治疗，用于上述实施例推测由于尿酸合成底物的大量增加，机体为调节体内尿酸代谢的平衡，进一步增加尿酸的排泄而进一步促进SLC22A12/URAT1基因mRNA表达，本发明可用于树鼩SLC22A12/ URAT1 mRNA 表达水平的检测，为研究树鼩SLC22A12/URAT1基因的功能及影响因素提供了有效工具，为高尿酸血症等疾病的研究提供可靠手段。
序列表
SLC22A12/URAT1基因特异性上游引物：
SLC22A12/URAT1 F：5- CTACGACCACGGCACTTTCA-3＇
SLC22A12/URAT1基因特异性下游引物：
SLC22A12/URAT1 R：5＇- AAGGTAACTCCAGGTCAGCAC-3＇
内参基因GAPDH特异性上游引物：
GAPDH F：5＇--AGCCCCATCACCATCTTCC -3＇
内参基因GAPDH特异性下游引物：
GAPDH R：5＇- AATGAGCCCCAGCCTTCTC -3＇
所扩增的树鼩SLC22A12/URAT1基因片段核苷酸序列为：
AAGGCTGGGACTGGTGTGTGACTCTCGGGCCCTGAAGCCCATGTCCCAGTCCATCTACTTGACTGGGATGCTGGTGGGAGCTGCTGTGTGTGGCCATGCCTCAGACAGGTTTGGGCGCAGGCTGGTGCTGACCTGGAGTTACCTTT
所扩增的树鼩树鼩内参基因GAPDH片段核苷酸序列为：
ATCAAATGGGGTGATGCTGGTGCCGAGTATGTTGTGGAGACCACCGGTGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTGGGGCTCATTC
序列表
<110> 中国医学科学院医学生物学研究所
<120> RT-qPCR检测树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 树鼩(Tupaia belangeri)
<400> 7
ctacgaccac ggcactttca 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 树鼩(Tupaia belangeri)
<400> 8
aaggtaactc caggtcagca c 21
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 树鼩(Tupaia belangeri)
<400> 9
agccccatca ccatcttcc 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 树鼩(Tupaia belangeri)
<400> 10
aatgagcccc agccttctc 19
<210> 11
<211> 146
<212> DNA
<213> 树鼩(Tupaia belangeri)
<400> 11
aaggctggga ctggtgtgtg actctcgggc cctgaagccc atgtcccagt ccatctactt 60
gactgggatg ctggtgggag ctgctgtgtg tggccatgcc tcagacaggt ttgggcgcag 120
gctggtgctg acctggagtt accttt 146
<210> 12
<211> 83
<212> DNA
<213> 树鼩(Tupaia belangeri)
<400> 12
atcaaatggg gtgatgctgg tgccgagtat gttgtggaga ccaccggtgt cttcaccacc 60
atggagaagg ctggggctca ttc 83

Claims (2)

1.一种RT-qPCR检测树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法，其特征在于包括下列步骤：
（1）设计下列引物：
树鼩SLC22A12/URAT1表达水平的特异性上、下游引物为：
SLC22A12/ URAT1 F：5＇- CTACGACCACGGCACTTTCA-3＇
SLC22A12/ URAT1 R：5＇- AAGGTAACTCCAGGTCAGCAC-3＇
作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物为：
GAPDH F：5＇-AGCCCCATCACCATCTTCC-3＇
GAPDH R：5＇- AATGAGCCCCAGCCTTCTC -3＇；
（2）以树鼩新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得树鼩肾脏组织cDNA第一链；
（3）以步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R上、下游引物以及GAPDH F和GAPDH R上、下游引物为特异性引物，分别在下列PCR扩增体系及反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰；
所述PCR扩增体系及反应条件如下：
PCR扩增体系即25μL体系：
SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；
SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，GAPDH F和GAPDH R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；
反应条件：94℃预变性30s，94℃变性5s、60℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光信号；
（4）将步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链稀释为100、10-1、10-2、10-3、10-4倍浓度作为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R以及GAPDH F和GAPDH R为特异性引物，分别按步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件进行荧光定量PCR扩增，反应结束后根据荧光信号的数据，获得Ct值，通过qPCR仪器自带CFXManager 软件建立SLC22A12/URAT1基因及内参基因GAPDH的标准曲线，得到SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH 片段的扩增效率、斜率及R2 值；
（5）在步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件下，以步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链作为待测样品cDNA模板，进行实时荧光定量PCR扩增，得到对应的Ct值，将该Ct值以及步骤（4）得到的SLC22A12/URAT1目的基因及内参基因GAPDH的扩增效率，通过qPCR仪器自带CFXManager 软件处理，得出均一化后的SLC22A12/URAT1基因倍数表达的ΔΔC(t)值，从而获得SLC22A12/URAT1基因转录水平相对表达值。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤3）获得的PCR 扩增产物SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段分别经过下列验证：
1）通过商业生物公司测序分别得到：
所扩增的树鼩SLC22A12/URAT1基因片段核苷酸序列为：
AAGGCTGGGACTGGTGTGTGACTCTCGGGCCCTGAAGCCCATGTCCCAGTCCATCTACTTGACTGGGATGCTGGTGGGAGCTGCTGTGTGTGGCCATGCCTCAGACAGGTTTGGGCGCAGGCTGGTGCTGACCTGGAGTTACCTTT
所扩增的树鼩树鼩内参基因GAPDH片段核苷酸序列为：
ATCAAATGGGGTGATGCTGGTGCCGAGTATGTTGTGGAGACCACCGGTGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTGGGGCTCATTC
2）将步骤1）测序所得核苷酸序列分别通过DNAMAN软件与NCBI所报道的食蟹猴的SLC22A12/URAT1基因及树鼩GAPDH基因的核苷酸序列进行同源性比对，结果显示：用本发明提供的引物、扩增体系及反应条件进行扩增后的树鼩肾脏组织中SLC22A12/URAT1基因与NCBI报导的食蟹猴SLC22A12/URAT1序列（AB738914.1）的同源性为88.54%；用本发明提供的引物、扩增体系及反应条件进行扩增后的树鼩肾脏组织中GAPDH与NCBI报道的树鼩GAPDH序列（NM--001195426.1 0）的同源性为91.14%，证明本发明扩增出的目的片段分别为树鼩SLC22A12/URAT1基因片段及GAPDH基因片段。
CN201710902502.7A 2017-09-29 2017-09-29 RT-qPCR检测树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法 Pending CN108330172A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710902502.7A CN108330172A (zh) 2017-09-29 2017-09-29 RT-qPCR检测树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710902502.7A CN108330172A (zh) 2017-09-29 2017-09-29 RT-qPCR检测树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108330172A true CN108330172A (zh) 2018-07-27

Family

ID=62922400

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710902502.7A Pending CN108330172A (zh) 2017-09-29 2017-09-29 RT-qPCR检测树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108330172A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111139296A (zh) * 2020-03-10 2020-05-12 中国医学科学院医学生物学研究所 检测树鼩TGF-β基因转录水平的实时荧光定量PCR的引物及方法
CN111154868A (zh) * 2020-03-10 2020-05-15 中国医学科学院医学生物学研究所 实时荧光定量pcr方法检测树鼩slc22a6基因转录水平方法及引物和试剂盒
CN111172251A (zh) * 2020-03-10 2020-05-19 中国医学科学院医学生物学研究所 RT-qPCR法检测树鼩SLC22A8基因转录水平的方法、试剂盒及引物
CN111187846A (zh) * 2020-03-10 2020-05-22 中国医学科学院医学生物学研究所 检测树鼩lcn2基因转录水平的引物、试剂盒及方法
CN111197084A (zh) * 2020-03-10 2020-05-26 中国医学科学院医学生物学研究所 检测树鼩NF-κB基因转录水平的引物、试剂盒及方法
CN114214361A (zh) * 2022-01-07 2022-03-22 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种urat1人源化小鼠模型的构建方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103627783A (zh) * 2012-08-24 2014-03-12 解码（上海）生物医药科技有限公司 痛风易感基因无创检测试剂盒（apoe等基因）
WO2015108180A1 (ja) * 2014-01-17 2015-07-23 洋孝 松尾 痛風発症関連分子、並びに、尿酸関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法及び評価キット、検査体及び薬

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103627783A (zh) * 2012-08-24 2014-03-12 解码（上海）生物医药科技有限公司 痛风易感基因无创检测试剂盒（apoe等基因）
WO2015108180A1 (ja) * 2014-01-17 2015-07-23 洋孝 松尾 痛風発症関連分子、並びに、尿酸関連疾患素因及び炎症関連疾患素因の評価方法及び評価キット、検査体及び薬

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EUKARYOTA ET AL: "PREDICTED: Tupaia chinensis solute carrier family 22 (organic anion/urate transporter), member 12 (SLC22A12), transcript variant X2, mRNA", 《GENBANK DATABASE，ACCESSION NO：XM_006149848.2》 *
JI XIAO等: "Tree shrew(Tupaia belangeri) as a novel laboratory disease animal model", 《ZOOLOGICAL RESEARCH》 *
吴素云: "痛风方对高尿酸血症小鼠SLC2A9、SLC22A12的影响及疗效观察", 《中国博士学位论文全文数据库》 *
施新猷: "《现代医学实验动物学》", 30 September 2000, 人民军医出版社 *
毛古燧等: "尿酸转运蛋白在原发性痛风中的研究进展", 《安徽医药》 *
郑永唐等: "树鼩基础生物学与疾病模型", 《云南科学技术出版社》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111139296A (zh) * 2020-03-10 2020-05-12 中国医学科学院医学生物学研究所 检测树鼩TGF-β基因转录水平的实时荧光定量PCR的引物及方法
CN111154868A (zh) * 2020-03-10 2020-05-15 中国医学科学院医学生物学研究所 实时荧光定量pcr方法检测树鼩slc22a6基因转录水平方法及引物和试剂盒
CN111172251A (zh) * 2020-03-10 2020-05-19 中国医学科学院医学生物学研究所 RT-qPCR法检测树鼩SLC22A8基因转录水平的方法、试剂盒及引物
CN111187846A (zh) * 2020-03-10 2020-05-22 中国医学科学院医学生物学研究所 检测树鼩lcn2基因转录水平的引物、试剂盒及方法
CN111197084A (zh) * 2020-03-10 2020-05-26 中国医学科学院医学生物学研究所 检测树鼩NF-κB基因转录水平的引物、试剂盒及方法
CN114214361A (zh) * 2022-01-07 2022-03-22 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种urat1人源化小鼠模型的构建方法及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108330172A (zh) RT-qPCR检测树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法
Park et al. Amygdalin inhibits genes related to cell cycle in SNU-C4 human colon cancer cells
Zhang et al. An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples
CN108949990A (zh) 一种检测egfr基因突变的试剂盒及方法
CN112442535A (zh) 原发性肺腺癌分子分型及生存风险基因群及诊断产品和应用
Zhu et al. Associations of miR-146a, miR-149, miR-196a2, and miR-499 polymorphisms with ischemic stroke in the northern Chinese han population
CN108949969B (zh) 长链非编码rna在结直肠癌中的应用
CN105256036A (zh) 一种检测血清中lncARSR的试剂盒及其在检测肾癌舒尼替尼耐药中的应用
CN116808063B (zh) 糖尿病的标志物及其应用
CN109402228A (zh) RT-qPCR检测树鼩SLC2A9/Glut9基因转录水平的方法
CN109321569B (zh) 一种引物探针组合物及其应用
CN106987633A (zh) 一种检测结直肠癌血清分泌型lncRNAs的引物和试剂盒
CN108330175A (zh) RT-qPCR检测猕猴SLC22A11/OAT4基因转录水平的方法
CN107586829A (zh) RT‑qPCR检测猕猴SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法
CN104164481B (zh) Rt-pcr检测树鼩黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平的方法
CN108330174A (zh) RT-qPCR检测猕猴SLC2A9/GLUT9基因转录水平的方法
CN109628594B (zh) 一种与肝癌相关的长链非编码rna及其应用
CN108330173A (zh) RT-qPCR检测猕猴ABCG2基因转录水平的方法
Yang et al. Gene expression profiling of the rewarding effect caused by methamphetamine in the mesolimbic dopamine system
Zhang et al. Comprehensive analysis of m7G-related genes and chronic hepatitis B: diagnostic markers, immune microenvironment regulation, disease progression
CN108728519A (zh) RT-qPCR检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平的引物、试剂盒及方法
CN109371023A (zh) 一种环状RNA hsa_circKIAA1199_006及其特异性扩增引物和应用
CN113699221B (zh) HER2 mRNA及环状RNA多重荧光定量PCR检测引物探针及其应用
CN104673918B (zh) 检测csf3r点突变的引物和方法
CN112695083B (zh) 一种检测高血压用药基因多态性的核酸组合物及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination