CN111187846A - 检测树鼩lcn2基因转录水平的引物、试剂盒及方法 - Google Patents

检测树鼩lcn2基因转录水平的引物、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测树鼩LCN2基因转录水平的引物、试剂盒及方法，属于分子生物技术领域。检测树鼩LCN2基因转录水平的引物包括树鼩LCN2基因表达水平的特异性上、下游引物和作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物。本发明以样品总RNA反转录成的cDNA为模板，利用上述引物进行实时荧光定量PCR扩增，根据反应体系中荧光的变化情况定量LCN2基因转录水平。应用本发明所公开的引物序列可实现对树鼩GAPDH基因及LCN2基因的特异性扩增，对材料中非目的基因没有扩增信号，通过本发明的引物可对树鼩LCN2基因转录水平的变化情况实施定量检测，其操作简单，可重复性高，特异性强，灵敏度好。

Description

检测树鼩LCN2基因转录水平的引物、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种检测树鼩LCN2基因转录水平的引物、试剂盒及方法，尤其涉及一种非诊断目的的用实时荧光定量RT-qPCR法检测树鼩LCN2基因转录水平的方法。
背景技术
LCN2(人脂质运载蛋白2)又称中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，是急性肾损伤的标志物，肾小管上皮细胞、中性粒细胞、肺泡巨噬细胞会少量分泌中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。参与炎症免疫应答，肾脏间质细胞向上皮细胞转化过程受输尿管芽分泌因子的调控，能实时监控肾损伤的发展过程，使诊断更具有特异性和敏感性。LCN2是BAT(棕色脂肪组织）活化的关键调节剂。它的缺乏导致体重增加，并损害适应性生热作用。LCN2上调UCP1(解偶联蛋白1)的表达，它介导BAT的产热活性。值得注意的是，最初从嗜中性粒细胞中分离出来的LCN2与肥胖和脂肪细胞炎症有关，因为核因子-κB（NF-κB）可以激活其表达。此外，LCN2被认为是一种铁结合蛋白，可以诱导氧化应激。LCN2介导炎症和氧化应激的调节中起重要作用。
目前对LCN2基因的研究主要集中在其蛋白功能及对蛋白的检测分析上，对其转录水平的研究可以更深入的了解作用机制和调控机制。为研究树鼩体内LCN2的转录水平，需建立一种能够精确对LCN2 mRNA定量检测的方法，为LCN2的进一步研究打下基础。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种检测树鼩LCN2基因转录水平的引物、试剂盒及方法，以在转录水平上对LCN2基因进行定量检测。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
检测树鼩LCN2基因转录水平的引物，包括树鼩LCN2基因表达水平的特异性上、下游引物和作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物；
其中，树鼩LCN2基因表达水平的特异性上、下游引物序列如下：
LCN2 F：5＇-ggaagtggtacaccgtaggc-3＇；
LCN2 R：5＇-gtagctgccgtcttcgttca-3＇；
作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物序列如下：
GAPDH F：5＇-agccccatcaccatcttcc-3＇；
GAPDH R：5＇-aatgagccccagccttctc-3＇。
本发明同时提供含有上述检测树鼩LCN2基因转录水平的引物的试剂盒。
本发明还提供上述引物或试剂盒在非诊断目的检测树鼩LCN2基因转录水平的应用。
本发明另外提供用于非诊断目的检测树鼩LCN2基因转录水平的方法，包括如下步骤：
步骤（1），分别以健康和待测树鼩新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，逆转录合成得树鼩肾脏组织cDNA第一链；
步骤（2），建立树鼩GAPDH基因及LCN2基因标准曲线：以Easy dilution梯度稀释步骤（1）得到的健康树鼩肾脏组织cDNA第一链，分别以未稀释cDNA第一链及稀释后的cDNA为模板，进行实时荧光定量检测，并分别以LCN2 F和LCN2 R、GAPDH F和GAPDH R为特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增，分别得到健康树鼩GAPDH基因、LCN2基因的溶解曲线和扩增曲线；
之后以起始模板量拷贝数Log10的对数值为X轴，以Cq值为Y轴进行绘制，分别得到GAPDH基因、LCN2基因的标准曲线；
步骤（3），将步骤（1）得到的待测树鼩肾脏组织cDNA第一链分别以LCN2 F和LCN2 R、GAPDH F和GAPDH R为特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增，扩增体系和扩增程序与步骤（2）相同，分别得到待测树鼩GAPDH基因、LCN2基因的溶解曲线和扩增曲线；
之后根据步骤（2）得到的标准曲线进行计算，得到树鼩LCN2基因转录水平。
基于实时荧光定量检测的原理，即每个模板的Cq值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下：Cq=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)（n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。）起始拷贝数越多，Cq值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Cq值。因此，获得未知样品的Cq值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。所以根据步骤（2）得到的标准曲线和每个样品的Cq值，利用Bio-Rad CFXManager 3.1软件中自带的基因表达计算功能就能得到树鼩LCN2基因转录水平。
进一步，优选的是，以Easy dilution梯度稀释步骤（1）树鼩肾脏组织cDNA第一链，梯度稀释倍数分别为5倍、25倍、125倍、625倍。
进一步，优选的是，实时荧光定量PCR扩增体系下：SYBR Premix Ex Taq II (2x)5μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA模板0.8μL，去离子水3.4μL，总计10μL，上、下游引物浓度均为10μM。
进一步，优选的是，实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性10s、60℃退火30s、40个循环。
在检测时，当溶解曲线上峰不唯一时，则说明实验中存在污染，需要重新进行检测。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明适用于实时荧光定量PCR检测。应用本发明所公开的引物序列可实现对树鼩GAPDH基因及LCN2基因的特异性扩增，对材料中非目的基因没有扩增信号，通过本发明的引物可对树鼩LCN2基因转录水平的变化情况实施定量检测，其操作简单，可重复性高，特异性强，灵敏度好。本发明为研究树鼩LCN2基因的功能及影响因素提供了有效工具。
附图说明
图1为树鼩GAPDH基因的扩增曲线；
图2为树鼩GAPDH基因的标准曲线；
图3为树鼩LCN2基因的扩增曲线；
图4为树鼩LCN2基因的标准曲线；
图5为树鼩GAPDH基因的表达扩增曲线；
图6为树鼩GAPDH基因的表达熔解峰；
图7为树鼩LCN2基因的表达扩增曲线；
图8为树鼩LCN2基因的表达熔解峰；
图9为树鼩LCN2基因的表达相对表达；
图10为树鼩LCN2基因肾脏扩增产物胶图；M：maker；1和2为两只不同的树鼩扩增产物胶图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
下述实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料试剂等，如无特殊说明，均为商业途径得到。
1、本实施例中所使用的实验动物：树鼩，雌性9只，雄性10只。
2、实验动物的分组及给药：将做过空白血清检测的19只树鼩取出1只雄性树鼩待取肾脏组织做标准曲线，剩余18只树鼩随机分成对照组、30天给药组，120天给药组，各6只。雌雄各半，雌性体重均在110g~135g，雄性体重均在120g~150g。对照组每日腹腔注射（iP）1％羧甲基纤维素钠溶液（CMC-Na，1g羧甲基纤维素钠溶于100ml去离子水）40mg/kg，给药时间为120天，给药组以同样剂量ip注射氧嗪酸钾（OA），给药时间分别为30天和120天。
3、实验方法
3.1树鼩肾脏组织的采集
取肾脏组织置于RNA助溶剂（Tripure，Roche公司）用于LCN2基因转录水平的检测。
3.2肾脏总RNA的提取
19只动物都取新鲜肾脏0.1g于匀浆器中，加入1mL Tripure在室温下充分匀浆，静置5min，再将其转移至1.5mL EP管中静置5min，加入200μL -20℃预冷的氯仿，漩涡震荡充分，静置15min后4℃、12000r/min离心25min，吸取上清液450μL于另一只1.5mL EP管中，等体积加入-20℃预冷的异丙醇，充分混匀静置10min，4℃、12000r/m离心10min，弃上清液，待管内壁稍干，加1mL -20℃预冷的体积百分浓度为75%的乙醇洗涤沉淀，4℃、7500r/m离心5min，弃上清液，待管内壁稍干，加入30μL DEPC水溶解沉淀，65℃水浴10min，所提取的总RNA样品取1μL经Nanodrop-1000超微量核酸测定仪测定浓度及吸光度比值。测定浓度后加DEPC水稀释至1000ng/μL，放入-80℃冰箱备用。
3.3 cDNA的合成
按照逆转录试剂盒PrimeScript™RT reagent Kit说明操作，每30μL体系中依次加入5×PrimeScript Buffer 6μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 1.5μL，Oligo dT Primer 1.5μL，Random 6 mers 1.5μL，总RNA(浓度稀释为1000 ng /μL) 3μL，RNaseFree dH2O 16.5μL，逆转录条件为：37℃ 15min，85℃ 5s，4℃ 10min。
3.4 目的基因引物的设计
根据NCBI基因库中树鼩的LCN2和GAPDH的基因序列，利用引物设计软件Pimer Express5.0分别进行引物设计，经北京百泰克公司合成，GAPDH作为内参基因。
3.5 本实施例树鼩LCN2基因表达水平定量用引物序列及片段大小见表1。
表1
Figure 602093DEST_PATH_IMAGE002
3.6 目的基因荧光定量PCR反应体系的确定
按TAKARA生物有限公司产品PCR试剂（SYBR Premix Ex TaqII），在实时荧光定量仪CFX96 Real-Time System 上进行扩增和数据分析，PCR扩增体系如下：LCN2及GAPDH上、下游引物各0.4μL（10μM），SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)5μL，灭菌去离子水3.4μL、cDNA 0.8μL；进行下列实时荧光定量PCR：95℃预变性30s，95℃变性10s、60℃退火30s、40个循环。
其中，所扩增的树鼩LCN2基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所扩增的树鼩内参基因GAPDH片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.7 树鼩GAPDH基因及LCN2基因标准曲线的建立：以Easy dilution梯度稀释步骤3.3逆转录合成的未给药树鼩肾脏cDNA第一链，分别依次对其5倍、25倍、125倍、625倍稀释，以原始cDNA第一链及稀释后的cDNA为模板，各做2个平行样进行实时荧光定量检测，按步骤3.6荧光定量PCR体系进行实时荧光定量PCR。实时荧光定量检测的原理，即每个模板的Cq值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下：Cq=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)（n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。）起始拷贝数越多，Cq值越小。基于以上原理，利用Bio-Rad CFXManager 3.1软件可得到LCN2基因和GAPDH基因的溶解曲线和标准曲线。
3.8 样品基因表达差异分析
根据步骤3.7得到的LCN2基因和GAPDH基因标准曲线和每个样品的Cq值，利用Bio-RadCFX Manager 3.1软件中自带的基因表达计算功能就能得到树鼩LCN2基因转录水平。
4 结果
4.1 树鼩LCN2基因荧光定量PCR反应的溶解曲线
由图8可见，在LCN2基因扩增过程中荧光定量PCR反应的溶解曲线仅见单独的峰，反应产物的电泳结果仅见一条特异性表达条带，表明扩增的目的片段特异性良好。
4.2 树鼩LCN2基因和GAPDH基因的标准曲线
由图2和图4可见，树鼩LCN2基因和GAPDH基因的标准曲线R2均接近1，说明以此标准曲线进行相对定量较准确，由于荧光强度均较强，故能保证荧光强度的增加与PCR的扩增相对同步，能准确检测PCR的表达，以GAPDH为内源控制物，得到mRNA表达水平的变化。
4.3 氧嗪酸钾所致的高尿酸血症树鼩肾脏组织LCN2 mRNA表达水平的变化的定量检测
步骤2各组所获得的新鲜肾脏组织所提取的RNA，反转录得cDNA，经实时荧光定量PCR检测，可得各组LCN2 mRNA表达水平差异，腹腔注射40mg/kg剂量的氧嗪酸钾，LCN2在肾脏的mRNA表达水平，对照组为0.9，30天给药组为1.0，较对照组无明显变化。120天给药组为2.6，较对照组明显上调，肾脏组织LCN2 mRNA 表达上调，见图9。
4.4 氧嗪酸钾（OA )是尿酸酶抑制剂，能通过抑制尿酸酶活性，减少尿酸的分解与排泄，使尿酸值升高，可造成树鼩高尿酸血症，尿酸升高可引起肾脏相关疾病，用于上述实施例可使LCN2 mRNA 表达上调。说明本发明可用于LCN2 mRNA 表达水平的检测，为研究树鼩LCN2基因的功能及影响因素提供了有效工具，为高尿酸血症和肾脏等疾病的研究提供可靠手段。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
SEQ ID NO.1
ggaagtggta caccgtaggc 20
SEQ ID NO.2
gtagctgccg tcttcgttca 20
SEQ ID NO.3
agccccatca ccatcttcc 19
SEQ ID NO.4
aatgagcccc agccttctc 19
SEQ ID NO.5
ggaagtggta caccgtaggc ctggcaggga atgcaattca gaaaaaagca gaaggccagg 60
gtaagatgta cactaccacc tacgagctga acgaagacgg cagctac 107
SEQ ID NO.6
ggcacagtca aggctgagaa tgggaagctg gtcatcaacg ggaaacccat caccatcttc 60
caggagcgag atcccgctaa catcaaatgg ggtgatgctg gtgctgagta tgtcgtggag 120
tctactggcg tcttcaccac cat 143
序列表
<110> 中国医学科学院医学生物学研究所
<120> 检测树鼩LCN2基因转录水平的引物、试剂盒及方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ggaagtggta caccgtaggc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gtagctgccg tcttcgttca 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
agccccatca ccatcttcc 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
aatgagcccc agccttctc 19
<210> 5
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ggaagtggta caccgtaggc ctggcaggga atgcaattca gaaaaaagca gaaggccagg 60
gtaagatgta cactaccacc tacgagctga acgaagacgg cagctac 107
<210> 6
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ggcacagtca aggctgagaa tgggaagctg gtcatcaacg ggaaacccat caccatcttc 60
caggagcgag atcccgctaa catcaaatgg ggtgatgctg gtgctgagta tgtcgtggag 120
tctactggcg tcttcaccac cat 143

Claims (7)

1.检测树鼩LCN2基因转录水平的引物，其特征在于，包括树鼩LCN2基因表达水平的特异性上、下游引物和作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物；
其中，树鼩LCN2基因表达水平的特异性上、下游引物序列如下：
LCN2 F：5＇-ggaagtggtacaccgtaggc-3＇；
LCN2 R：5＇-gtagctgccgtcttcgttca-3＇；
作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物序列如下：
GAPDH F：5＇-agccccatcaccatcttcc-3＇；
GAPDH R：5＇-aatgagccccagccttctc-3＇。
2.含有权利要求1所述检测树鼩LCN2基因转录水平的引物的试剂盒。
3.权利要求1所述的引物、权利要求2所述的试剂盒在非诊断目的检测树鼩LCN2基因转录水平的应用。
4.用于非诊断目的检测树鼩LCN2基因转录水平的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），分别以健康和待测树鼩新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，逆转录合成得树鼩肾脏组织cDNA第一链；
步骤（2），建立树鼩GAPDH基因及LCN2基因标准曲线：以Easy dilution梯度稀释步骤（1）得到的健康树鼩肾脏组织cDNA第一链，分别以未稀释cDNA第一链及稀释后的cDNA为模板，进行实时荧光定量检测，并分别以LCN2 F和LCN2 R、GAPDH F和GAPDH R为特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增，分别得到健康树鼩LCN2基因、GAPDH基因的溶解曲线和扩增曲线；
之后以起始模板量拷贝数Log10的对数值为X轴，以Cq值为Y轴进行绘制，分别得到GAPDH基因、LCN2基因的标准曲线；
步骤（3），将步骤（1）得到的待测树鼩肾脏组织cDNA第一链分别以LCN2 F和LCN2 R、GAPDH F和GAPDH R为特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增，扩增体系和扩增程序与步骤（2）相同，分别得到待测树鼩LCN2基因、GAPDH基因的溶解曲线和扩增曲线；
之后根据步骤（2）得到的标准曲线进行计算，得到树鼩LCN2基因转录水平。
5.根据权利要求4所述的用于非诊断目的检测树鼩LCN2基因转录水平的方法，其特征在于，以Easy dilution梯度稀释树鼩肾脏组织cDNA第一链，梯度稀释倍数分别为5倍、25倍、125倍、625倍。
6.根据权利要求4所述的用于非诊断目的检测树鼩LCN2基因转录水平的方法，其特征在于：
实时荧光定量PCR扩增体系下：SYBR Premix Ex Taq II (2x) 5μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA模板0.8μL，去离子水3.4μL，总计10μL，上、下游引物浓度均为10μM。
7.根据权利要求4所述的用于非诊断目的检测树鼩LCN2基因转录水平的方法，其特征在于：
实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性10s、60℃退火30s、40个循环。
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CN108330172A (zh) * 2017-09-29 2018-07-27 中国医学科学院医学生物学研究所 RT-qPCR检测树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法

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