CN108728519A

CN108728519A - RT-qPCR检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平的引物、试剂盒及方法

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Publication number: CN108728519A
Application number: CN201810574469.4A
Authority: CN
Inventors: 唐东红; 王陈芸; 叶尤松; 李哲丽; 马开利; 鲁帅尧; 易红昆; 黄璋琼
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date: 2018-06-06
Filing date: 2018-06-06
Publication date: 2018-11-02
Anticipated expiration: 2038-06-06
Also published as: CN108728519B

Abstract

本发明涉及RT‑qPCR检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平的引物、试剂盒及方法，属于分子生物技术领域。本发明方法以猕猴新鲜肝脏组织提取的总RNA逆转录合成得到的cDNA为模板，利用PCR引物组合进行实时荧光定量PCR扩增，获得PNP基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰、扩增效率，通过常规处理得均一化后的PNP基因倍数表达的ΔΔC(t)值，从而获得PNP基因转录水平相对表达值。本发明为研究猕猴PNP功能以及相关药物对其影响提供了有效途径，同时，本发明适用于实时定量PCR检测，其操作简单，可重复性高，检测成本低、灵敏性高、特异性强，易于推广应用。

Description

RT-qPCR检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平的引物、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，涉及一种检测方法，尤其是一种用实时荧光定量RT-qPCR法检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平的方法。

背景技术

嘌呤核苷磷酸酶（purine nucleoside phosphorylase），简称PNP或PNPase，是参与嘌呤代谢的一种酶。该酶催化次黄嘌呤核苷、黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷转化为次黄嘌呤、黄嘌呤、鸟嘌呤。肌苷（Inosine）是体内尿酸合成的起始原料，经PNP酶的水解作用形成次黄嘌呤再由黄嘌呤氧化酶(XO)氧化形成黄嘌呤进而生成尿酸。

近年来，随着人民生活水平的提高，饮食结构和生活习惯发生了改变，高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）的患病率逐年增高，流行病学研究资料表明高尿酸血症和原发性痛风的发病呈上升趋势，在中国，已经有1.2亿的HUA人群，大约占总人口的10%，中老年及绝经后的妇女为高发人群，近年来发病年龄也呈年轻化的趋势。高尿酸血症与肥胖、高血压、高脂血症、冠状动脉粥样硬化性心脏病、胰岛素抵抗的发生密切相关，已成为识别代谢综合征的早期标志，治疗和控制高尿酸血症已成为代谢性疾病治疗的重要组成部分。无论是药物的筛选，还是致病机制的研究，都需要选择一种科学、合理的动物模型来开展高尿酸血症致病机理的研究及开发相关降血尿酸的药物。

猕猴(Macaca Malatta)，又名恒河猴（rhesus monkey），由于在形态学、生理生化代谢等方面与人类非常相似，是较为理想的实验动物，常用于许多重要的科学研究。其尿酸代谢途径与人类相似，无疑是研究该病的最佳实验动物，为了利用亲缘关系与人类接近的实验动物—猕猴来开展高尿酸血症致病机理的研究及开发相关降血尿酸的药物，需要建立一种猕猴嘌呤核苷磷酸酶PNP mRNA表达的相对定量方法，以研究药物作用猕猴体内PNP mRNA基因的转录水平变化，进而为研究PNP功能及其对机体血清尿酸的影响因素打下基础。因此, 建立RT-qPCR检测猕猴嘌呤核苷磷酸酶PNP mRNA基因转录水平的方法，可对于开展利用动物模型开展的HUA发病机制研究及新药筛选具有重要意义。

实时荧光定量PCR的基因扩增法已被广泛应用于基因转录水平的定量研究。该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、全封闭反应等优点。目前国内外还未见利用猕猴进行PNP转录水平定量检测方法的研究。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种RT-qPCR检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平的引物、试剂盒及方法，以在转录水平上对PNP基因进行定量检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

RT-qPCR检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平的引物，包括猕猴PNP基因表达水平的特异性上、下游引物对和作为内参基因的猕猴GAPDH基因的特异性上、下游引物对；

其中，猕猴PNP基因表达水平的特异性上、下游引物为：

PNP F：5’-gagaccatggagaacggatacac-3’

PNP R：5’-cagacctcctaatccagaaccac-3’

作为内参基因的猕猴GAPDH基因的特异性上、下游引物为：

GAPDH F：5’-agccccatcaccatcttcc-3’

GAPDH R：5’-aatgagccccagccttctc-3’。

本发明同时提供含有上述引物用于检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平的的试剂盒。

进一步，优选的是，所述的试剂盒还包括：SYBR Premix Ex Taq II 酶、猕猴肝脏组织cDNA模板和去离子水。

本发明还提供上述所述的试剂盒在检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平中的应用。

本发明提供一种RT-qPCR检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平的方法，采用上述引物或上述试剂盒，包括如下步骤：

步骤（1），以猕猴新鲜肝脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得猕猴肝脏组织cDNA第一链；

步骤（2），以步骤（1）的猕猴肝脏组织cDNA第一链为cDNA模板，采用上述引物或上述试剂盒，进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得PNP基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰；

步骤（3），将步骤（1）获得的猕猴肝脏组织cDNA第一链分别稀释10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4倍浓度作为cDNA模板，采用上述引物或上述试剂盒，进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得PNP基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值，之后以起始模板量的相对数x为横坐标，以荧光达到设定阈值的循环数Ct值y为纵坐标绘制标准曲线，做出标准曲线方程y＝f(x)，得到PNP基因片段及内参基因GAPDH片段的扩增效率、斜率及R²值；

步骤（4），将步骤（1）获得的猕猴肝脏组织cDNA第一链作为待测样品cDNA模板，采用上述引物或上述试剂盒，进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得PNP基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值，通过步骤（3）得到的PNP基因片段及内参基因GAPDH片段的扩增效率进行计算，实时定量PCR仪器自带CFX软件计算得到均一化后的PNP基因倍数表达的ΔΔC(t)值，从而获得PNP基因转录水平相对表达值。

进一步，优选的是，步骤（2）、步骤（3）和步骤（4）中所述的扩增体系为：

SYBR Premix Ex Taq II酶(2×) 12.5μL，cDNA模板1μL（含有cDNA约500ng），PNP F和PNP R上、下游引物各1μL（10μM），去离子水9.5μL；总计25μL；

SYBR Premix Ex Taq II 酶(2×) 12.5μL，cDNA模板1μL（含有cDNA约500ng），GAPDH F和GAPDH R上、下游引物各1μL（10μM），去离子水9.5μL；总计25μL。

进一步，优选的是，步骤（2）、步骤（3）和步骤（4）中所述的扩增程序为：94℃预变性30s，94℃变性5s、60℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光信号。

本发明检测方法是以用于非诊断目的的RT-qPCR检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平的方法。

本发明获得的PCR扩增产物PNP基因片段及内参基因GAPDH片段分别经过下列验证：

1）通过商业生物公司测序分别得到：

所扩增的猕猴嘌呤核苷磷酸酶PNP基因片段核苷酸序列为：

tttgtagaattagacactgcagatggcttctgtctcacactaagcaccgacctcaagttgcaataatctgtggttctggattaggaggtctag

所扩增的猕猴内参基因gapdh片段核苷酸序列为：

ggcgcgcctttgctggcgctgagtacgtcgtggagtccactggcgtcttcaccaccacggagaaggctggggctcatta

2）再将上述测序所得核苷酸序列分别通过DNAMAN软件与NCBI所报道的猕猴的PNP基因及猕猴GAPDH基因的核苷酸序列进行同源性比对，结果显示：用本发明提供的引物、扩增体系及反应条件进行扩增后的猕猴肝脏组织PNP基因与NCBI猕猴GenBank：NM-001193551的同源性为90.91%；用本发明提供的引物、扩增体系及扩增程序进行扩增后的猕猴肝脏组织中GAPDH与NCBI猕猴GAPDH序列（NM--001195426.1）的同源性为91.14%，证明本发明所扩增出的目的片段分别为：猕猴PNP基因片段及GAPDH基因片段。

使用本发明的引物以及方法进行转录水平定量样品主要为肝脏组织，也适用于其他组织使用。

猕猴作为一种近年来开发的实验动物，以NCBI基因库中猕猴PNP基因的核苷酸序列作为参考，序列号：NM_001193551，用Primer premier 5.0软件设计多对引物，经过RT-PCR扩增，根据引物的特点摸索PCR扩增的最佳退火温度，筛选出上述所述的检测猕猴PNP基因表达的特异性上、下游引物组合及PCR扩增条件，获得了特异的PNP基因片段及内参基因GAPDH片段，并通过对所获得的的特异的PNP基因片段及内参基因GAPDH片段的测序及序列分析，进一步证实了所提供的PCR引物组合的特异性，可应用于实时荧光定量PCR法定量检测猕猴PNP基因转录水平。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

（1）采用本发明技术方案，可较为容易地在转录水平上进行猕猴组织中PNP基因相对定量检测。

（2）本发明所公开的引物是通过本领域技术人员公知的化学合成方法进行DNA 合成后得到的，用该引物序列可实现猕猴PNP基因及内参基因GAPDH 的特异性扩增，对材料中非目的基因没有扩增信号，通过本发明的引物，可对猕猴PNP基因转录水平的变化状况实施定量检测，灵敏度高，方法简单，可重复性高。并且，本发明的引物特异性强，不会受到其他基因的干扰，特异性高，为研究猕猴PNP基因的功能及影响因素提供了有效的相对定量工具。

附图说明

图1为猕猴RNA完整性测定的琼脂糖凝胶电泳图；其中1-肝、2-肝、3-肝为三只不同猕猴的肝脏组织样本所提取的RNA样本检测结果；

图2为猕猴PNP基因溶解峰图；

图3为内参基因GAPDH溶解峰图；

图4为猕猴PNP基因的扩增曲线图；

图5为猕猴PNP基因的标准曲线图；

图6为猕猴GAPDH基因的扩增曲线图；

图7为猕猴GAPDH基因的标准曲线图；

图8为肌苷及别嘌醇对猕猴肾脏组织PNP mRNA表达水平变化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

下述实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料试剂等，如无特殊说明，均为商业途径得到。

本发明除非另有说明，否则百分号为质量百分数。

下述实施例中所使用的实验动物：猕猴，雄性，15只，体重6-10kg。实验用猕猴由中国医学科学院医学生物学研究所提供，普通级别饲养。饲养环境温度20℃～25℃，相对湿度40%～70%，正常饲喂，自由饮水。

实施例中的各种溶液配制原则及方法：

Inosine配制：肌苷（Inosine，Sigma公司），批号：Lot # SLBP5740V，称取不同量的肌苷置于锥形瓶里面，以0.9%生理盐水作为溶剂，在水浴锅上溶解，一般现配现用。根据动物的公斤体重，用药剂量调整配置浓度，控制在每只动物腹腔用药单次体积不大于10ml；

别嘌醇（allopurimol）配制，缩写为ALLO，溶液配制：称取不同量的ALLO置于锥形瓶里面，以0.9%生理盐水作为溶剂，在水浴锅上溶解，一般现配现用。根据动物的公斤体重，用药剂量调整配置浓度，控制在每只动物腹腔用药单次体积不大于10ml。

实施例中的仪器与耗材：CFX 96^TMReal-Time System C1000^TM Thermal Cycler美国bio-rad公司产品，Sigma高速冷冻离心机，Sartoyius公司精密电子天平ME235S；美国bio-rad公司凝胶成像分析系统；美国bio-rad公司PCR仪：；美国bio-rad公司PowerPacBasic电泳仪；日本Tomy公司SS-325高压蒸气灭菌箱；美国DanoDrop公司ND-1000紫外分光光度计。1000μL、200μL、20μL、10μL、2μL的Gilson移液枪；2mL EP管、500μL EP管；1000μL吸头、200μL吸头、10μL吸头。

实施例1

RT-qPCR检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平的引物，包括猕猴PNP基因表达水平的特异性上、下游引物对和作为内参基因的猕猴GAPDH基因的特异性上、下游引物对；

其中，猕猴PNP基因表达水平的特异性上、下游引物为：

PNP F：5’-gagaccatggagaacggatacac-3’

PNP R：5’-cagacctcctaatccagaaccac-3’

作为内参基因的猕猴GAPDH基因的特异性上、下游引物为：

GAPDH F：5’-agccccatcaccatcttcc-3’

GAPDH R：5’-aatgagccccagccttctc-3’。

实施例2

一种用于检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平的的试剂盒，包括实施例1所述的引物，还包括SYBR Premix Ex Taq II 酶、猕猴肝脏组织cDNA模板和去离子水。

实施例3

一种RT-qPCR检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平的方法，包括下列步骤：

（1）设计下列引物：

根据NCBI基因库中猕猴（macaca mμlatta）的PNP核苷酸序列号： NM_001193551，猕猴（macaca mμlatta）的GAPDH核苷酸序列号NM_001195426.1设计引物，以上引物均由上海生物工程有限公司合成：

猕猴PNP基因表达水平的特异性上、下游引物为：

PNP F：5’- gagaccatggagaacggatacac-3’；（SEQ ID NO.1）

PNP R：5’- cagacctcctaatccagaaccac-3’；（SEQ ID NO.2）

作为内参基因的猕猴GAPDH基因的特异性上、下游引物为：

GAPDH F：5’-agccccatcaccatcttcc-3’;（SEQ ID NO.3）

GAPDH R：5’-aatgagccccagccttctc-3’。（SEQ ID NO.4）

猕猴PNP基因表达水平定量用引物序列及片段大小见表1：

表1 引物序列及片段大小（F上游，R下游）

（2）以猕猴新鲜肝脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得猕猴肝脏组织cDNA第一链；具体如下：

（2.1）实验动物的分组及给药：挑选15只猕猴（体重6-15kg），随机分组，每组5只动物，分别第一组腹腔注射inosine 200mg/kg，第二组腹腔注射inosine 100mg/kg + ALLO 2.5mg/kg，第三组对照组腹腔注射生理盐水，给药1h后取肝脏组织约20mg，用于猕猴PNP基因转录水平的检测；

（2.2）猕猴新鲜肝脏组织的取样：

按常规取右肾下脊实质，将所采集的新鲜肝脏组织置于RNA助溶剂（Tripure，Roche公司）用于猕猴PNP基因转录水平的检测；

（2.3）新鲜肝组织总RNA的提取

取新鲜肝脏组织20mg匀浆器中，加入1mL Tripure试剂在室温下充分匀浆，静置5min，再将其转移至1.5mL EP管中静置5min，加入200μL -20℃预冷的氯仿，漩涡震荡充分，静置15min后4℃、12000r/m离心25min，吸取上清液450μL于另一只1.5mL EP管中，等体积加入-20℃预冷的异丙醇，充分混匀静置10min，4℃、12000r/m离心10min，弃上清液，待管内壁稍干，加1mL-20℃预冷的75%乙醇洗涤沉淀，4℃、7500r/m离心5min，弃上清液，待管内壁稍干，加入30μL DEPC水溶解沉淀，65℃水浴10min，所提取的总RNA样品取1μL经Nanodrop-1000超微量核酸测定仪测定浓度及吸光度比值，测定浓度后加DEPC水稀释至1000ng/μL，放入-80℃冰箱备用；

（2.4）RNA完整性检测

随机取2.3步骤所提取的总RNA样品2μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳（120V，400mA）20min，在凝胶成像系统下观察28S，18S和5S条带亮度，分析RNA的完整性。结果可观察到28S，18S和5S三条带，见图1，说明所提取的RNA无降解，完整性好；

（2.5）cDNA的合成

按照逆转录试剂盒PrimeScript™RT reagent Kit说明进行操作。

具体为：每10μL体系中依次加入5×PrimeScript Buffer 2μL，PrimeScript RTEnzyme Mix 0.5μL，Oligo dT Primer 0.5μL，Random 6 mers 0.5μL，总RNA( 浓度稀释为1000 ng /μL) 1μL，RNase Free dH₂O 5.5μL，逆转录条件为：37℃，15min；85℃，5s；4℃，10min，得猕猴肝脏组织cDNA第一链；

（3）以步骤（2）的猕猴肝脏组织cDNA第一链为cDNA模板，以步骤（1）中的PNP F和PNP R上、下游引物以及GAPDH F和GAPDH R上、下游引物为特异性引物，分别在下列PCR扩增体系及反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得PNP基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰；Real-time 荧光定量qPCR目的片段及内参基因特异性通过绘制出的溶解峰来证实，溶解峰为单一峰，无杂峰，说明无非特异性扩增，扩增的特异性好；

所述PCR扩增体系及反应条件如下：

PCR扩增体系即25μL体系：

反应条件：94℃预变性30s，94℃变性5s、60℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光信号；

SYBR Premix Ex TaqⅡ酶为TAKARA生物有限公司生产的荧光定量PCR试剂；

（4）将步骤（2）的猕猴肝脏组织cDNA第一链稀释为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4倍浓度作为cDNA模板，以步骤（1）中的PNP F和PNP R上、下游引物以及GAPDH F和GAPDH R上、下游引物为特异性引物，分别按步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件进行荧光定量PCR扩增，反应结束后根据荧光信号的数据，获得Ct值，通过qPCR仪器自带CFXManager 软件建立PNP基因及内参基因GAPDH的溶解曲线及标准曲线，得到PNP基因片段及内参基因GAPDH片段的扩增效率、斜率及R²值；当PNP基因片段及内参基因GAPDH片段扩增效率分别在80%至120%之间，同时R²接近1，当R²>0.9时，说明结果可信度较高，符合荧光定量PCR 要求，可进一步进行待检样品检测；反之，不符合荧光定量PCR 要求，进一步进行待检样品检测结果可信度达不到要求。

（5）在步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件下，以步骤（2）的猕猴肝脏组织cDNA第一链作为待测样品cDNA模板，进行实时荧光定量PCR扩增，得到对应的Ct值，将该Ct值以及步骤（4）得到的PNP基因及内参基因GAPDH的扩增效率，通过qPCR仪器自带CFX Manager 软件处理，得出均一化后的PNP基因倍数表达的ΔΔC(t)值，从而获得PNP基因转录水平相对表达值。

所述步骤（3）获得的PCR扩增产物PNP基因片段及内参基因GAPDH片段分别经过下列验证：

1）通过商业生物公司测序分别得到：

所扩增的猕猴嘌呤核苷磷酸酶PNP基因片段核苷酸序列为：

tttgtagaattagacactgcagatggcttctgtctcacactaagcaccgacctcaagttgcaataatctgtggttctggattaggaggtctag（SEQ ID NO.5）

所扩增的猕猴内参基因GAPDH片段核苷酸序列为：

ggcgcgcctttgctggcgctgagtacgtcgtggagtccactggcgtcttcaccaccacggagaaggctggggctcatta（SEQ ID NO.6）

2）再将上述测序所得核苷酸序列分别通过DNAMAN软件与NCBI所报道的猕猴的PNP基因及猕猴GAPDH基因的核苷酸序列进行同源性比对，结果显示：用本发明提供的引物、扩增体系及反应条件进行扩增后的猕猴肝脏组织PNP基因与NCBI猕猴GenBank：NM_001193551的同源性为95%；用本发明提供的引物、扩增体系及反应条件进行扩增后的猕猴肝脏组织中GAPDH与NCBI猕猴GAPDH序列（NM_001195426.1）的同源性为91.14%，证明本发明所扩增出的目的片段分别为：猕猴PNP基因片段及GAPDH基因片段。

所述步骤（4）猕猴PNP基因及GAPDH基因的溶解曲线和标准曲线的建立：以Esidilution 梯度稀释逆转录合成的猕猴肝脏cDNA第一链，分别稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4倍浓度，以原始cDNA第一链及稀释后的cDNA为模板，各做2个平行样进行实时荧光定量检测，按步骤（3）荧光定量PCR体系进行实时荧光定量PCR，得到PNP基因和GAPDH基因的溶解曲线和标准曲线。

荧光定量PCR检测肌苷所致的高尿酸血症猕猴肝脏组织PNP mRNA表达水平的变化：

qPCR检测体系为防止混在RNA中的基因组DNA带来的假阳性，排除可能的污染，在实验中每个检测样品做三个重复孔，同时设置以总RNA为模板对照及无模板对照，防止假阳性。利用CFX 96^TM real-time system荧光定量PCR仪自带的CFX Manager软件对结果进行处理分析，以零点作为对照，以样品Ct值软件分析测定均一化后对应得到目的基因的相对表达量。

结果

1、猕猴PNP基因荧光定量PCR反应的溶解曲线

通过real-time RT-PCR实时荧光定量PCR反应，绘制出的PNP溶解峰如图2，GAPDH溶解峰如图3，显示PNP基因及内参基因GAPDH扩增特异性好，溶解峰单一。总RNA为模板对照及无模板对照均无扩增，对照成立。

2、猕猴PNP基因和GAPDH基因的标准曲线

由图5、图7可见，猕猴PNP基因和GAPDH基因的标准曲线R²均大于0.9，接近1，说明以此标准曲线进行相对定量较准确，由于荧光强度均较强，故能保证荧光强度的增加与PCR的扩增相对同步，能准确检测PCR的表达，以GAPDH为内源控制物，得到mRNA表达水平的变化。

反应结束后根据各稀释浓度的Ct值，CFX Manager软件绘制出扩增曲线及标准曲线，见图4~图7，结果显示PNP基因扩增效率为扩增效率为96.4%，斜率-3.41，R²为0.987，y=-3.41x+44.395；GAPDH基因扩增效率为87.2%，斜率-3.671，R²为0.995，y=-3.671x+36.256，目的基因及内参基因扩增效率在80%至120%之间，扩增效率理想，同时R²接近1，结果可信度较高，符合荧光定量PCR要求。

其中，图2-图7为不给药的猕猴的肝脏组织进行试验所得到的结果。

3、别嘌醇对肌苷所致的高尿酸血症猕猴肝脏组织PNP mRNA表达水平的变化的定量检测

以上各组所获得的新鲜肝组织所提取RNA，经荧光定量检测后，软件分析模式测定均一化后的基因表达 normalized expression (ΔΔCq )，相对表达值见图8。结果显示，Inosine给药1h后PNP与正常组相比较基因相对表达水平的平均值上调约2.46倍，统计学分析，组间t检验p<0.001，差异有统计意义，推测机体由于尿酸合成底物的大量增加，PNP基因mRNA表达活跃。Inosine+ALLO药后1h与肌苷组相比较PNP mRNA表达水平均值上调1.22倍，组间t检验p值>0.05，差异无统计学意义。见图8。

5、肌苷(Inosine)，也称为次黄苷、次黄嘌呤核苷等。是由次黄嘌呤于核糖结合而成的核苷类化合物。本药为人体的正常成分，为腺嘌呤的前体，能直接透过细胞膜进入体细胞，参与体内核酸代谢、能量代谢和蛋白质的合成。在嘌呤的从头合成中，肌苷酸(IMP)可以作为合成腺苷酸(AMP)和鸟苷酸(GMP)的前体，Inosine是体内ATP、辅酶A、核糖核酸及脱氧核糖核酸等生命分子基本组成，在体内转变为肌苷酸及三磷酸腺苷，并继而转换为其他多种核苷酸，同时肌苷也是尿酸合成的底物。采用腹腔注射给猕猴一定剂量的尿酸合成底物-肌苷，导致次黄嘌呤在体内的蓄积，最终造成猕猴体内尿酸含量增加，造成高尿酸血症，用于上述实施例可显著上调PNP mRNA 表达；别嘌醇（ALLO）通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性使尿酸生成减少，血中及尿中的尿酸含量降低到溶解度以下的水平，主要用于治疗痛风和防止痛风性肾病、继发性高尿酸血症以及重症癫痫的辅助治疗，用于上述实施例中Inosine+ALLO药后1h与肌苷组相比较PNPmRNA表达水平变化无显著差异，提示别嘌醇对PNP mRNA表达水平影响不显著。本发明可用于PNP mRNA 表达水平的检测，为研究猕猴PNP基因的功能及影响因素提供了有效工具，为高尿酸血症等疾病的研究提供可靠手段。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

SEQ ID NO.1

gagaccatgg agaacggata cac 23

SEQ ID NO.2

cagacctcct aatccagaac cac 23

SEQ ID NO.3

agccccatca ccatcttcc 19

SEQ ID NO.4

aatgagcccc agccttctc 19

SEQ ID NO.5

tttgtagaat tagacactgc agatggcttc tgtctcacac taagcaccga cctcaagttg 60

caataatctg tggttctgga ttaggaggtc tag 93

SEQ ID NO.6

ggcgcgcctt tgctggcgct gagtacgtcg tggagtccac tggcgtcttc accaccacgg 60

agaaggctgg ggctcatta 79

序列表

<110> 中国医学科学院医学生物学研究所

<120> RT-qPCR检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平的引物、试剂盒及方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gagaccatgg agaacggata cac 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

cagacctcct aatccagaac cac 23

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

agccccatca ccatcttcc 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

aatgagcccc agccttctc 19

<210> 5

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tttgtagaat tagacactgc agatggcttc tgtctcacac taagcaccga cctcaagttg 60

caataatctg tggttctgga ttaggaggtc tag 93

<210> 6

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

ggcgcgcctt tgctggcgct gagtacgtcg tggagtccac tggcgtcttc accaccacgg 60

agaaggctgg ggctcatta 79

Claims

1.RT-qPCR检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平的引物，其特征在于，包括猕猴PNP基因表达水平的特异性上、下游引物对和作为内参基因的猕猴GAPDH基因的特异性上、下游引物对；

其中，猕猴PNP基因表达水平的特异性上、下游引物为：

PNP F：5’-gagaccatggagaacggatacac-3’

PNP R：5’-cagacctcctaatccagaaccac-3’

作为内参基因的猕猴GAPDH基因的特异性上、下游引物为：

GAPDH F：5’-agccccatcaccatcttcc-3’

GAPDH R：5’-aatgagccccagccttctc-3’。

2.含有权利要求1所述引物用于检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平的的试剂盒。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括：SYBR Premix Ex Taq II 酶、猕猴肝脏组织cDNA模板和去离子水。

4.权利要求2或3所述的试剂盒在检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平中的应用。

5.RT-qPCR检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平的方法，采用权利要求1所述引物，或者采用权利要求2或3所述试剂盒，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（2），以步骤（1）的猕猴肝脏组织cDNA第一链为cDNA模板，采用权利要求1所述引物，或者采用权利要求2或3所述试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得PNP基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰；

步骤（3），将步骤（1）获得的猕猴肝脏组织cDNA第一链分别稀释10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4倍浓度作为cDNA模板，采用权利要求1所述引物，或者采用权利要求2或3所述试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得PNP基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值，之后以起始模板量的相对数x为横坐标，以荧光达到设定阈值的循环数Ct值y为纵坐标绘制标准曲线，做出标准曲线方程y＝f(x)，得到PNP基因片段及内参基因GAPDH片段的扩增效率、斜率及R² 值；

步骤（4），将步骤（1）获得的猕猴肝脏组织cDNA第一链作为待测样品cDNA模板，采用权利要求1所述引物，或者采用权利要求2或3所述试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得PNP基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值，通过步骤（3）得到的PNP基因片段及内参基因GAPDH片段的扩增效率进行计算，得到均一化后的PNP基因倍数表达的ΔΔC(t)值，从而获得PNP基因转录水平相对表达值。

6.根据权利要求5所述的RT-qPCR检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平的方法，其特征在于，步骤（2）、步骤（3）和步骤（4）中所述的扩增体系为：

SYBR Premix Ex Taq II酶(2×) 12.5μL，cDNA模板1μL，PNP F和PNP R上、下游引物10μM各1μL，去离子水9.5μL；总计25μL；

SYBR Premix Ex Taq II 酶(2×) 12.5μL，cDNA模板1μL，GAPDH F和GAPDH R上、下游引物10μM各1μL，去离子水9.5μL；总计25μL。

7.根据权利要求5所述的RT-qPCR检测猕猴肝脏嘌呤核苷磷酸酶PNP基因转录水平的方法，其特征在于，步骤（2）、步骤（3）和步骤（4）中所述的扩增程序为：94℃预变性30s，94℃变性5s、60℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光信号。