CN107460241A - 外泌体小分子rna在急性心肌梗死风险评估中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及小分子RNAmiRNA146a‑5p、miRNA3135b和miRNA26b‑5p在评估急性心肌梗死的药物的制备中的用途、在诊断急性心肌梗死的药物的制备中的用途以及用于所述用途的试剂盒。本发明检测外泌体中的稳定的miRNA，而传统方法检测的分子标记物是蛋白多肽。在定量检测方面，miRNA的定量精度和灵敏度非常高，使用RT‑qPCR技术可以达到单分子检测的能力。本发明具有取材方便、操作简单、特异性强、快速准确的优点，为急性心肌梗死患者提供了更为方便快捷的筛查技术。

Description

外泌体小分子RNA在急性心肌梗死风险评估中的应用

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及小分子 RNAmiRNA146a-5p、miRNA3135b和miRNA26b-5p在评估急性心肌梗死的药物的制备中的用途、在诊断急性心肌梗死的药物的制备中的用途以及用于所述用途的试剂盒。

背景技术

急性心肌梗死(AMI)是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。AMI一直是临床关注的重症疾患之一，其进展迅速，后果严重，其发病后1-6小时是溶栓治疗和介入手术治疗的黄金时间，而快速诊断发病6小时内的早期AMI是决定治疗的关键环节。近年来，我国心肌梗死发病率已呈明显上升趋势，每年新发至少50万。根据2015年中国心血管病报告，2002年到2014年AMI死亡率总体呈上升态势，从2005 年开始呈快速上升趋势。2014年中国AMI死亡率城市为55.32/10万，农村为68.6/10万。

急性心肌梗塞发病后1到6小时是溶栓治疗和介入手术治疗的黄金时间，而发病6小时内的快速诊断是决定治疗的关键环节。按照世界卫生组织(WHO)推荐:典型的胸痛、心电图改变和心肌酶异常三项指标中有两项符合，即可诊断AMI。然而，在我国约25％的AMI病人无症状，约30％的病例无典型心绞痛表现；采用心电图诊断AMI的准确性平均约 60％，诊断非Q波心肌梗死缺乏特异性，对不稳定心绞痛和小范围AMI 难以鉴别，而具有确诊意义的病理性Q波常在发病6～8小时以后才出现，因而AMI早期心电图确诊率很低。

心肌损伤生化标志物的检测在急性心肌梗塞的诊断、监测、危险评估、预后和引导治疗等方面都起到了重要作用，目前常用的心肌损伤生化标志物有肌酸激酶同功酶(CK-MB)、肌钙蛋白(cTnI或CTNI)、肌红蛋白(Myoglobin)等。例如,美国心脏病学会规定联合使用肌红蛋白 (Myoglobin),CK-MB和肌钙蛋白Ⅰ(TroponinⅠ)三个标志物作为心肌梗塞检测的常规手段。但是，目前的心肌损伤生化标志物的在急性心肌梗塞早期诊断，尤其是发病6小时以内的早期诊断的敏感性和特异性方面仍有不足。

肌酸激酶同功酶(CK-MB):CK-MB在肌酸激酶的三个同功酶中， CK-MB对于诊断AMI具有高度敏感性,从19世纪80年代至1995年一直被认为是诊断AMI的“金标准”。然而,CK-MB存在于心皿和骨酪肌细胞中，影响诊断特异。CK-MB在胸痛发作之后5～6小时会升高2 倍，12～24小时达到峰值。因此，不能作为早期标志物。

肌钙蛋白：肌钙蛋白(Cardiac troponins，cTn)是横纹肌收缩的主要蛋白。有三个亚单位:Tnc,Tnl和TnT。cTn不能透过细胞膜进入血循环，故健康人血内不含或含极低量的CTNI和cTnI。当心肌缺血或缺氧发生变性坏死，细胞膜破损，cTnI和CTNI进入细胞间质。1989年首次报道检测CTNI，后来在1992年对CTNI的检测进一步描述。由于 CTNI、cTnI对心肌细胞损伤有高度的敏感性和特异性，被人们认为是诊断AMI的“金标准”。但肌钙蛋白在AMI后的早期释放动力学与CK-MB 相似，需要几个小时释放至血液中，才能进行检测，因此这两种肌钙蛋白不能作为早期标志物。

肌红蛋白(Myo):肌红蛋白是19世纪70年代以来用于诊断AMI的第一个非酶蛋白。它的分子量小，发病后1小时能快速释放到血液中，具有高敏感性和阴性预测值，对于早期筛选AMI非常有价值。然而，肌红蛋白不仅大量存在于心肌细胞，还存在于骨骼肌细胞等多种组织中，故炎症、局部缺血、SLE、休克、皮炎等亦可引起MYO升高，其作为AMI 的诊断指标特异性较低。

外泌体(exosome)，是活细胞经过"内吞-融合-外排"等一系列调控过程而形成的膜性囊泡，来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)，直径约为30-150nm，密度在1.13-1.21g/m1，天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。外泌体内含蛋白质、、脂质以及miRNA等成分，可以携带蛋白，运送RNA，在细胞间物质和信息转导中起重要作用。研究表明，来源不同细胞的外泌体含有源细胞最关键的功能分子。不同细胞来源的外泌体所含的蛋白质及miRNA不同，其生物学功能也有差异，血液中的外泌体是一种密度很低的固相成分，被认为携带有丰富的生物标志物信息。并且，在人体体液如血浆、尿液、组织液等中被外泌体的膜所包裹的RNA不会被核酸酶讲解，而且不受蛋白，IgG等高分丰度蛋白的影响。由于来源于细胞，外泌体所含的物质表征着细胞中的部分物质，也就给检测细胞内的某些蛋白质与核酸的变化带来了可能性。目前，可以运用组学手段，通过一定实验和数据分析方法研究样品中的蛋白质、 DNA及RNA，对比正常个体的样品数据，找到疾病特异性的的分子标志物，为疾病的早期诊断、病因分析、治疗靶点、预后情况等提供重要基础和依据。近年来，已经有许多疾病，包括某些肿瘤，可以通过对患者血浆中的外泌体的检测，实现早期诊断，同时为疗效判断和预后提供重要依据。在临床诊断实践中，检测核酸标记物具有灵敏度高、特异性好、可精确定量的特点，很适合作为早期诊断的标志物。

MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小 RNA，几个miRNAs也可以调节同一个基因。可以通过几个miRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。因此，具保守估计，约60％～70％的人类蛋白编码基因受miRNA的调控，单个miRNA分子能够与数百个功能各异的靶mRNA相结合而发挥调节作用，参与了哺乳动物几乎所有的病理和生理活动，如个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等，与许多疾病的发生、发展存在着密切的联系。根据Mitchell等人2008年的研究，miRNA能以一种非常稳定的形式存在于人体血浆中，以保护其免受内源性RNase的降解。同时，Chen等通过高通量测序技术对血浆中 miRNA进行了分析，在男、女性健康人血浆中分别发现了100和90种血浆miRNA，且在恶劣条件(如高温、极低或极高的PH环境、多次冻融)下仍能保持稳定，而此时大多数RNA都已降解。此外，对正常人和不同疾病患者血浆/血浆中miRNA检测结果发现，miRNA广泛存在于正常人和患者的血浆/血浆中，并且随着生理状况、疾病种类和病程不同，miRNA的表达谱将发生特异性变化。如，Lawrie等用实时荧光定量PCR 方法证明miR-15，miR-21在弥散性大B细胞性淋巴瘤DLBCL患者血浆中高表达；Mitchell等研究证明，miR-141在前列腺癌病人的血浆中明显增加，并且与前列腺特异抗原的水平有一定的相关性，可成为检测前列腺癌的标志物。

目前已有研究表明正常心肌组织会释放外泌体，相关实验证明，当心肌梗死后，外周血中的miRNA含量会大量增加，也有些miRNA存在于心脏释放的外泌体中。因此，通过对比分析不同急性心肌梗死患者以及正常人群外周血液中的外泌体miRNA，寻找差异性的外泌体miRNA 靶点，为建立新型急性心肌梗死早筛技术奠定基础，意义重大。

发明内容

本发明的目的在于提供评估急性心肌梗死、诊断急性心肌梗死的简单快捷的方法以及相关药物。

在第一方面，本发明提供了小分子RNA miRNA146a-5p、 miRNA3135b和miRNA26b-5p在受试者中评估/诊断急性心肌梗死的药物的制备中的用途。

在本发明的实施方案中，所述小分子RNAmiRNA146a-5p、 miRNA3135b和miRNA26b-5p是血清中外泌体小体内的miRNA146a-5p、 miRNA3135b和miRNA26b-5p。

在本发明的实施方案中，所述药物用于定量检测所述小分子 RNAmiRNA146a-5p、miRNA3135b和miRNA26b-5p的表达量。

在本发明的实施方案中，所述药物包括基于所述小分子 RNAmiRNA146a-5p、miRNA3135b和miRNA26b-5p设计的引物。

在本发明的实施方案中，所述引物为用于PCR定量或反转录的引物。

在本发明的实施方案中，用于miRNA146a-5p的反转录的所述引物为SEQ ID NO：4。

在本发明的实施方案中，用于miRNA3135bPCR的反转录的所述引物为SEQ ID NO：5。

在本发明的实施方案中，用于miRNA26b-5pPCR的反转录的所述引物为SEQ ID NO：6。

在本发明的实施方案中，用于miRNA146a-5p的PCR定量的所述引物为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。

在本发明的实施方案中，用于miRNA3135bPCR的定量的所述引物为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。

在本发明的实施方案中，用于miRNA26b-5p的PCR定量的所述引物为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。

在第二方面，本发明提供了用于评估/诊断急性心肌梗死的试剂盒，其中所述试剂盒包含定量检测miRNA146a-5p、miRNA3135b和 miRNA26b-5p的表达量进行的试剂。

在本发明的实施方案中，所述小分子RNAmiRNA146a-5p、miRNA3135b和miRNA26b-5p是血清中外泌体小体内的miRNA146a-5p、 miRNA3135b和miRNA26b-5p。

在本发明的实施方案中，所述试剂包括基于所述小分子 RNAmiRNA146a-5p、miRNA3135b和miRNA26b-5p设计的引物。

在本发明的实施方案中，所述引物为用于PCR定量或反转录的引物。

在本发明的实施方案中，用于miRNA146a-5p的反转录的所述引物为SEQ ID NO：4。

在本发明的实施方案中，用于miRNA3135bPCR的反转录的所述引物为SEQ ID NO：5。

在本发明的实施方案中，用于miRNA26b-5pPCR的反转录的所述引物为SEQ ID NO：6。

在本发明的实施方案中，用于miRNA146a-5p的PCR定量的所述引物为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。

在本发明的实施方案中，用于miRNA3135bPCR的定量的所述引物为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。

在本发明的实施方案中，用于miRNA26b-5p的PCR定量的所述引物为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。

有益效果：

1)相对传统的心脏功能检查，如临床指征、超声影像和实验室检查，本发明具有取材方便、操作简单、特异性强、快速准确的优点，为急性心肌梗死患者提供了更为方便快捷的筛查技术。该技术的成功开发，可以解决目前国内对心梗早期诊断的技术单一，漏诊误诊的问题，从而改善心梗患者的预后情况。

2)本发明检测血浆/血浆中的稳定的miRNA，而传统方法检测的分子标记物是蛋白多肽。在定量检测方面，miRNA的定量精度和灵敏度非常高，使用RT-qPCR技术可以达到单分子检测的能力；传统方法检测蛋白质，精准度和灵敏度都较差。

3)本发明采用多个miRNA而并非单一指标来进行检验，比检测单一指标的可靠性高很多。

附图说明

通过以下参照附图对本发明实施例的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优点将更为清楚，在附图中：

图1显示miRNA146a-5p、miRNA3135b和miRNA26b-5p在正常人血浆和AMI患者等量血浆外泌体中的表达差异。

图2显示不同测定标志物在采用通过荧光定量PCR方法评估/诊断心肌梗死中的灵敏度差异。

具体实施方式

以下基于实施例对本发明进行描述，但是本发明并不仅仅限于这些实施例。

实施例1荧光定量PCR(QPCR)验证miRNA的差异表达

所述miRNA146a-5p、miRNA3135b和miRNA26b-5p是血液外泌体来源的miRNA146a-5p、miRNA3135b和miRNA26b-5p，其序列分别为： SEQ ID NO：1UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU；

SEQ ID NO：2GGCUGGAGCGAGUGCAGUGGUG；

SEQ ID NO：3UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU。

选择三组受试者：10例正常人(N，正常对照组)；10例有心绞痛临床表现，但ECG、CTNI和CKMB表达始终均为阴性的患者(DC，疾病对照组)；10例有心绞痛临床表现，ECG、CTNI和CKMB初始表达为阴性，出院诊断为冠心病患者(即CTNI和CKMB住院期间表现为阳性)(AMI，心梗早期组)。每例抽取2ml全血，离心，分离血浆，提取血浆中外泌体，对上述筛选出来的miRNAs进行荧光定量PCR检测，具体操作如下：

(A)RNA提取

1)外泌体的分离与纯化

(1)全血3000*g离心15min，移去细胞和细胞碎片；

(2)取上层液体移入离心管，加入适量exoquick试剂，4℃下反应30min；优选250μl血清中加入63μl exoquick试剂；

(3)1500*g离心混合液30min(外泌体沉于管下)；

(4)吸出上清，离心1500*g 5min吸出所有上清(不能震动离心管)；

(5)用250μl PBS溶解全部沉淀，-80℃保存。

2)总RNA的提取

(1)加入Trizol，剧烈震荡1min，室温保存10min；

(2)加氯仿0.2ml，剧烈震荡1min，充分混匀，室温下放置3min-5min；

(3)4℃，12000rpm高速离心15min后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管中,注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积异丙醇，1-2ul糖原，充分颠倒混匀，于-20℃保存6小时以上 (保持离心管竖直状态)；

(4)4℃，12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液；

(5)按1ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC冷乙醇洗涤沉淀(-20℃保存)，洗涤沉淀物，充分混合均匀，静置10min，4℃，12000rpm高速离心10min，弃掉上清液，重复一遍操作；

(6)室温下放置5min以充分晾干沉淀，加入10ul DEPC水溶解沉淀；

(7)用Nanodrop2000紫外分光光度计测定RNA纯度及浓度，冻存于 -80℃或直接进行下游实验。

(B)反转录获得cDNA：

1)提取上述样品的外泌体中的RNA，作为模板，在去RNase的PCR 管中加入模板(50-150ng)、RT引物(15-20pmol)和RNA free H₂O至总体积12μl。

2)将上述溶液混匀，65℃孵育5min，以打开RNA二级结构，随后立即置于冰上，防止RNA复性恢复二级结构。

3)反转录：

反转录过程中，筛选出的miR-146a-5p、miR-3135b、miR-26b-5p的特异性反转录RT引物序列如表2所示：

表2 miR-146a-5p、miR-3135b和miR-26b-5p的特异性反转录RT 引物序列

4)向上述反应液中依次加入以下试剂：

5)混匀后简短离心，42℃孵育60min。

6)70℃灭活5min，即可获得cDNA。

(2)荧光定量PCR

荧光定量PCR中，筛出的miR-146a-5p、miR-3135b和miR-26b-5p 的荧光定量PCR引物序列如表3。

表3 miR-146a-5p、miR-3135b和miR-26b-5p的荧光定量PCR引物序列

1)按以下反应体系对miR-146a-5p、miR-3135b和miR-26b-5p分别进行荧光定量PCR：

2)荧光定量PCR反应条件：

94℃30s；94℃5s，60℃34s读板40循环；溶解曲线分析：温度 60℃-95℃。

荧光定量PCR结果参见图2，很明显的看出在心梗早期组中，三种 miRNAs均呈现显著地低表达。*p<0.01vs正常组和疾病对照组。

实施例2：分析miRNA对心梗的早期诊断

南山医院胸痛门诊入组50例急诊患者，取血浆，进行心梗三种 miRNAs和cTnI、CKMB的同步快速检测。采血时间控制在胸痛发作2 小时内。

cTnI和CKMB的检测采用化学发光免疫法，应用“双抗体夹心法”原理，样品检测结果查多点定标曲线后计算。参考范围：cTnI>0.04ng/ml 或CK-MB>6.3ng/ml可判断为心肌损伤；

应用上述荧光定量PCR方法，对从血浆exosome里面提取的RNA 进行逆转录，定量检测miRNA146a-5p、miRNA3135b、miRNA26b-5p，获得其Ct值，具体操作同上。同时，我们检测血浆中参照基因(miR-16 和cel-miR-39)的Ct值。以cel-miR-39为参照，求得目的基因再血浆中的相对含量，以PCR检测中经典的2^-△Ct的方式表示血浆中目的基因的水平(△Ct为目标miRNA与参照cel-miR-39的Ct值之差)

以出院诊断为AMI为终点事件，对传统生物标记物(cTnI和CK-MB) 和3种miRNAs(miRNA146a-5p、miRNA3135b、miRNA26b-5p)进行 ROC曲线分析，其结果参见表1。结果显示，cTnI、CK-MB和单一miRNA 对AMI的诊断，均低于3种miRNAs的联合诊断，也就是说使用三种miRNA的组合来预测心梗发生，其敏感性和特异性都比传统生物标记物和单一miRNA更好。

表1

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种改动和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳承启生物科技有限公司

<120> 小分子RNAmiRNA146a-5p、miRNA3135b和miRNA26b-5p在急性心肌梗死风险评

估中的应用

<130> 20170730

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人类

<400> 1

ugagaacuga auuccauggg uu 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人类

<400> 2

ggcuggagcg agugcagugg ug 22

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人类

<400> 3

uucaaguaau ucaggauagg u 21

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacaaccca 50

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccaccac 50

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacacctat 50

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acactccagc tgggtgagaa ctgaattcca 30

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cagtgcaggg tccgaggtat 20

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

acactccagc tgggggctgg agcgagtgca 30

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人类

<400> 10

cagtgcaggg tccgaggtat 20

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acactccagc tgggttcaag taattcagg 29

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cagtgcaggg tccgaggtat 20

Claims (11)

1.小分子RNA miRNA146a-5p、miRNA3135b和miRNA26b-5p在受试者中评估/诊断急性心肌梗死的药物的制备中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述小分子RNAmiRNA146a-5p、miRNA3135b和miRNA26b-5p是血清中外泌体小体内的miRNA146a-5p、miRNA3135b和miRNA26b-5p。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述药物用于定量检测所述小分子RNAmiRNA146a-5p、miRNA3135b和miRNA26b-5p的表达量。

4.根据权利要求1或2所述的用途，所述药物包括基于所述小分子RNAmiRNA146a-5p、miRNA3135b和miRNA26b-5p设计的引物。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述引物为用于PCR定量或反转录的引物。

6.根据权利要求5所述的用途，其中用于miRNA146a-5p的反转录的所述引物为SEQ IDNO：4；

或者，其中用于miRNA3135bPCR的反转录的所述引物为SEQ ID NO：5；

或者，其中用于miRNA26b-5pPCR的反转录的所述引物为SEQ ID NO：6；

或者，其中用于miRNA146a-5p的PCR定量的所述引物为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；

或者，其中用于miRNA3135bPCR的定量的所述引物为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；

或者，其中用于miRNA26b-5p的PCR定量的所述引物为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。

7.一种用于评估/诊断急性心肌梗死的试剂盒，其中所述试剂盒包含定量检测miRNA146a-5p、miRNA3135b和miRNA26b-5p的表达量进行的试剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述小分子RNAmiRNA146a-5p、miRNA3135b和miRNA26b-5p是血清中外泌体小体内的miRNA146a-5p、miRNA3135b和miRNA26b-5p。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其中所述试剂包括基于所述小分子RNAmiRNA146a-5p、miRNA3135b和miRNA26b-5p设计的引物。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述引物为用于PCR定量或反转录的引物。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中用于miRNA146a-5p的反转录的所述引物为SEQID NO：4；

或者，其中用于miRNA3135bPCR的反转录的所述引物为SEQ ID NO：5；

或者，其中用于miRNA26b-5pPCR的反转录的所述引物为SEQ ID NO：6；

或者，其中用于miRNA146a-5p的PCR定量的所述引物为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；

或者，其中用于miRNA3135bPCR的定量的所述引物为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；

或者，其中用于miRNA26b-5p的PCR定量的所述引物为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。