KR100554102B1 - 시험관 내 조기난소부전 측정방법 및 그 키트 - Google Patents

시험관 내 조기난소부전 측정방법 및 그 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시험관 내에서 조기난소부전을 측정하는 방법 및 그에 이용되는 키트에 관한 것이다.
본 발명의 시험관내 조기난소부전 측정방법에서는 조기난소부전이 의심되는 여성으로부터 분리한 게놈 DNA에 포함된 마이토콘드리아 DNA와, 내재적 레퍼런스 DNA인 28S rRNA를 각각 주형으로 하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 내재적 레퍼런스 DNA에 대한 mtDNA의 상대적 비율을 확인하고 정상여성의 비율과 비교함을 특징으로 한다.
본 발명의 키트는 mtDNA 및 28S rRNA의 PCR에 사용할 수 있는 프라이머 세트와, 그 각각의 PCR 산물을 표지할 수 있는 프로브들을 포함한다.
본 발명의 측정방법 및 키트는 조기난소부전을 진단하고 그 치료방법을 수립하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

시험관 내 조기난소부전 측정방법 및 그 키트{In vitro deetecting method for premature ovarian failure and the detecting kit}
도 1은 본 발명의 측정방법을 이용하여 실시간 PCR에서 리포터 형광치와 사이클 수의 관계를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 측정방법을 이용하여 정상 대조군과 조기난소부전 환자군에서 mtDNA/28S rRNA 비율을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 3는 본 발명의 측정방법을 이용하여 같은 나이대의 정상 대조군과 조기난소부전 환자군에서 mtDNA/28S rRNA 비율을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 측정방법을 이용하여 정상 대조군과 조기난소부전 환자군에서 mtDNA CT 와 mtDNA/28S rRNA 간의 상관관계를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 측정방법을 이용하여 정상 대조군과 조기난소부전 환자군에서 28S rRNA CT와 mtDNA/28S rRNA 간의 상관관계를 나타낸 도이다.
도 6는 본 발명의 측정방법을 이용하여 정상 대조군과 조기난소부전 환자군에서 연령과 mtDNA/28S rRNA 비율의 상관관계를 나타낸 도이다.
본 발명은 시험관 내에서 조기난소부전을 측정하는 방법 및 그 키트에 관한 것이다.
조기난소부전(premature ovarian failure, POF)은 정상적인 발달을 보인 여성에서 40세 이전에 난소 기능이 정지된 경우로 정의된다.
조기난소부전은 4개월 이상 무월경이 지속되거나 1개월 이상 간격으로 2번 시행한 난포자극 호르몬(FSH) 의 혈청 수치가 40 mIU/㎖ 이상인 40세 미만 여성에서 진단이 가능하며, 희발 월경, 저(低) 에스트로젠증 등 다양한 임상 증상과 소견을 나타낸다.
조기난소부전은 약 1-2 %의 적지 않은 빈도로 확인되고 있으며, 최근에는 스트레스 증가 등의 다양한 요인으로 인해 불임여성이 급속히 증가하고 있으므로 향후 임신 방법에 대한 적절한 조치를 위해 조기난소부전으로의 이행 가능성이 의심되는 젊은 여성을 선별하는 것이 중요한 과제로 대두되고 있다.
그러나 아직까지 조기난소부전의 원인이나 병태 생리가 정확히 밝혀지지 않고 있으며, 혈중 성선자극호르몬 증가 이외에 다른 증상이나 징후가 없는 젊은 여성의 경우에는 조기난소부전 여부를 진단하는 것이 쉽지 않고, 조기난소 진단을 위한 적절한 방법도 마련되어 있지 않아 조기 진단 및 치료에 어려움이 많다.
조기난소부전에 대한 초기의 연구에서는 혈청 FSH가 40 mIU/㎖ 이상으로 나타나는 조기난소부전의 경우, 원시 난포(primordial follicles)의 결여를 동반한 비가역적인 변화로만 여겨져서 영구적인 불임을 나타내는 지표로 생각되었다.
그러나 이후 연구에서 한번의 검사 수치만으로는 난포의 소진을 판단할 수 없다는 것이 밝혀졌고, 동시에 조기난소부전의 징후를 보이는 환자의 일부에서 간헐적이나마 정상 난소 기능이 확인되어 이들 환자에서 보다 적극적인 조기 진단과 처치 계획 수립이 중요하게 대두되게 되었다.
조기난소부전의 원인은 아직까지 완전히 밝혀지진 않았으나, 난포의 노화 및 고사(apoptosis) 등으로 인한 난포 소진(follicle depletion)과 난포 기능 이상(follicle dysfunction)이 주된 인자로 여겨지고 있다.
노화가 진행된 난포에서는 성장 인자의 생성 변화와 함께 과립막 세포 생성의 증가가 관찰되며, 그 결과 스테로이드와 당단백(glycoprotein)의 생성이 감소하여 과립막 세포의 고사가 일어나게 된다.
이러한 과립막 세포의 고사는 마이토콘드리아의 DNA 결손(mtDNA deletion) 증가와 관련이 있으며, 이들은 세포 노화와 직접적인 관계가 있는 것으로 알려져 있다.
세포의 고사에 큰 역할을 하는 것으로 알려진 인간의 mtDNA는 16.6 kbp의 원형 이중가닥 DNA(circular double strand DNA)이며, ATP의 주공급원인 호흡체인복합체(repiratory chain complex)의 13개 필수구성단위(essential subunit)를 암호화한다. mtDNA의 카피 수(copy number)는 해당 세포의 에너지 수요에 따라 매우 큰 차이를 보이며, 태아 발달 단계에서 정교하게 조절된다.
포유류의 체세포는 약 102~104 의 mtDNA 카피 수를 갖는 반면, 인간의 난소는 약 2 ×105 개의 카피 수를 가지는데, 이는 난소 세포의 착상 후 발달을 위해 많은 양의 에너지가 필요하므로 마이토콘드리아의 산화적 인산화 체계(oxidative phosphorylation system)가 잘 확립되어야 하기 때문이다.
또한 난자의 성숙에는 난자의 ATP 양 및 생성 정도가 매우 중요한 요인으로 작용하는데, 마이토콘드리아는 ATP를 생성하는 주된 기관이므로 마이토콘드리아의 생합성과 mtDNA의 복제는 난자의 성장에 직접적으로 관여하는 것으로 여겨진다.
최근에는 난자의 mtDNA 카피 수가 난자의 수정 능력에도 직접적인 영향을 미치는 것으로 보고된 바 있으며, 마이토콘드리아가 고사 조절에 중요하게 작용한다는 사실이 규명되어 있다.
세포 고사시 마이토콘드리아는 전자 운송ㆍ에너지 대사ㆍATP 생성의 방해, 세포의 산화환원 전위(redox potential) 변화, 캐스페이즈 활성 단백(caspase-activating proteins) 분비 등의 기전에 의해 세포 고사를 조절한다.
캐스페이즈는 세포 고사를 위해 특화된 장치의 주구성 요소인 단백분해 체계로, 이들은 시토크롬 c(cytochrome c)나 Bcl-2와 같은 세포고사 전신호(proapoptotic signal)에 반응하여 일단의 단백을 분해하고 궁극적으로 세포를 해체한다. 마이토콘드리아 막 구조에는 Bcl-2 단백이 존재하며, Bcl-XL 도 마이토콘드리아 내막 단백과 교통하여 세포 고사에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
또한 선택적 마이토콘드리아 막 투과성(mitochondrial membrane permeabilization, MMP)이 세포 고사에서 중요한 인자로 대두되고 있는데, MMP의 증가는 세포 고사의 속도 조절 단계(rate-limiting step)임이 확인되었다. 이론적으로 마이토콘드리아 막 전위차의 감소, ATP 생성 장애, 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 의 생성 증가 등에 의해 마이토콘드리아 투과공(permeability transit pore, PT pore)이 열리고, 고장성 기질(hypertonic matrix)이 종창되어 상대적으로 표면적이 작은 외막이 파열되며, 시토크롬 c, 프로 캐스페이즈 2,3,9, AIF(apoptosis-inducing factor) 등이 막간 공간(intermembrane space)으로부터 분비되어 그 결과 세포 고사가 초래되는 것으로 보인다.
또한 마이토콘드리아 투과성 전이(permeability transition, PT)는 mtDNA의 결손이 증가됨에 따라 촉진됨이 보고되었으며, 최근에는 과립막 세포 고사와 mtDNA 결손과의 연관성도 보고되고 있다.
이러한 mtDNA 결손의 축적은 특히 폐경을 전후해서 급격히 증가하는 것으로 보이므로, 최근에는 노화에 따르는 난소 기능장애와의 연관성이 부각되고 있으며, 축적된 산화적 손상(oxidative damage)과 손상된 mtDNA 복구의 효율성 저하 등이 그 기전으로 이해되고 있다.
따라서 조기난소부전의 진단을 위해 mtDNA 카피 수의 변화를 선별할 수 있는 검사방법에 대한 연구가 진행되어 왔으며, 그 예로 중합효소연쇄반응을 이용하는 방법을 들 수 있다.
그러나 고전적인 방법의 중합효소연쇄반응은 시료 조작에 필요한 노력과 그에 따르는 오류의 증가 등의 문제점이 있으며, 반응 후의 최종 산물을 아가로오스 젤(agarose gel)에서 분리해 대략적인 양을 어림잡는데 만족해야만 했으므로 실험 의 민감도나 특이성이 낮다.
또한 이론상 반응 산물은 기하급수적으로 증가하나 실제 실험에서는 여러 제한요인의 영향으로 어느 순간 이후에는 더 이상 반응이 없는 평탄역(平坦域, plateau)이 나타나는 단점도 지적되어 왔다. 이러한 이유에서 반응종결점 분석(end-point analysis)만 가능했던 기존의 방법은 평탄역에 도달하는 시점이 서로 다른 여러 반응 사이의 변별이 명확하지 않게 되므로, 결국 정량적으로는 실제와 매우 다른 결과를 얻게 될 가능성이 크다.
이와 같은 단점을 보완하기 위해 정량적 경쟁 PCR(quantitative competitive PCR) 방법이 새로 개발되어 사용되어 왔으나, 이 방법은 매 PCR 당 가장 적합한 경쟁자(competitor)를 만들어 사용하여야 하고, 목적 유전자와 경쟁자 간의 적절한 비율 범위를 맞추기 위해 여러 농도에서 실험을 해야 하며, 세심한 유효성 검사를 통해 증폭 효율을 검증해야만 하는 등의 문제가 있다. 그 결과 미묘한 효율 차이에도 정량 분석의 정확성이 크게 낮아지고, 각 반응 종료 단계마다 세심한 정량 분석을 위한 까다로운 반응후 조작(post-PCR manipulation)이 필요한 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 마이토콘드리아 DNA에 대해 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction)을 수행하여 마이토콘드리아 DNA의 상대적 정량이 가능하게 함으로써, 조기난소부전을 간편하면서도 정확하게 진단할 수 있는 시험관내 측정 방법 및 그 키트를 발명하여 상기의 문제점들을 해결하였다.
본 발명은 미토콘드리아 DNA(mtDNA)의 카피 수를 상대적으로 정량하여 조기난소부전을 측정하는 방법 및 그 키트를 제공하고자 한다.
본 발명은 시험관 내에서(in vitro) 조기난소부전을 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 시험관내 조기난소부전 측정방법은 1) 조기난소부전이 의심되는 여성으로부터 분리한 게놈(genomic) DNA에 포함된 마이토콘드리아 DNA(mtDNA)와 내재적 레퍼런스 DNA(endogenous reference DNA)를 각각 주형으로 하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 수행하는 단계; 2) 반응사이클마다 신호를 측정하여 각 유전자의 초기량 값 및 역치 사이클 값을 결정하는 단계; 3) 상기 값들로부터 내재적 레퍼런스 DNA에 대한 mtDNA의 상대적 비율을 확인하는 단계; 4) 상기에서 얻은 비율을 정상 여성의 내재적 레퍼런스 DNA에 대한 mtDNA의 상대적 비율과 비교하는 단계로 이루어짐을 특징으로 한다.
본 발명의 측정방법에서 실시간 PCR이란 PCR의 각 사이클(cycle)의 진행상황을 관찰할 수 있는 실험방법으로, 각 사이클에서 존재하는 PCR 반응산물을 프로브 신호에 의해 감지하여 상대적으로 정량하는 실험방법을 의미한다.
본 발명의 측정방법에서 내재적 레퍼런스 DNA란 mtDNA의 상대적 정량을 위한 기준이 되는 임의의 DNA로, 세포 내에서 일정한 농도를 항상 유지하는 유전자라면 모두 가능하다.
본 발명의 측정방법에서 내재적 레퍼런스 DNA는 구체적으로 28S rRNA를 사용 한다.
본 발명의 측정방법에서 제 1)단계의 실시간 중합효소연쇄반응은 mtDNA 및 28S rRNA의 PCR에 사용할 수 있는 프라이머 및 그 각각의 PCR 산물을 표지할 수 있는 프로브들을 이용하여 수행한다.
본 발명의 측정방법에서 mtDNA의 PCR에 사용하는 정방향 프라이머는 구체적으로 서열번호 1의 하기 염기서열을 가지고 역방향 프라이머는 구체적으로 서열번호 2의 하기 염기서열을 가진다.
본 발명의 측정방법에서 28S rRNA의 PCR에 사용하는 정방향 프라이머는 구체적으로 서열번호 3의 하기 염기서열을 가지고 역방향 프라이머는 구체적으로 서열번호 4의 하기 염기서열을 가진다.
본 발명의 측정방법에서 mtDNA의 PCR 산물을 표지할 수 있는 프로브는 구체적으로 서열번호 5의 하기 염기서열을 가지고 28S rRNA의 PCR 산물을 표지할 수 있는 프로브는 구체적으로 서열번호 6의 하기 염기서열을 가진다.
본 발명의 측정방법에서 사용하는 프로브들은 통상적으로 사용되는 리포터 물질을을 추가로 함유함으로써 실시간 PCR 반응시 각 사이클(cycle)의 상태를 신호화한다.
본 발명의 측정방법에서 사용하는 프로브들은 리포터 형광물질(reporter flourescent dye) 또는 소광제(quencher) 등을 추가로 함유할 수 있으며, 구체적으로 5' 쪽에 FAM(5-카복시플로로신 리포터, 5-carboxyfluorescein reporter)를, 3' 쪽에 TAMRA(6-카복시-테트라메틸-로다민 소광제, 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine quencher)를 추가로 함유할 수 있다.
이하 본 발명의 측정방법에 대해 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 측정방법의 제 1) 단계에서는 조기난소부전이 의심되는 여성으로부터 분리한 혈액, 혈장, 혈청 등으로부터 mtDNA와 28S rRNA를 각각 주형으로 하고, 상기의 해당 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 수행한다.
본 발명의 측정방법의 제 2) 단계에서는 PCR 반응이 진행되는 중에 반응사이클마다 프로브에 의해 나타나는 신호를 측정한다.
본 발명의 측정방법에서 사용하는 실시간 PCR은 PCR 반응산물의 정량을 실시간으로 수행할 수 있으므로, 정량을 위해 반응후 조작(post-PCR manipulation)을 필요로 하는 기존의 고전적인 중합효소 연쇄 반응에 비해 시간과 노력을 절약하는 한편 시료의 오염 등으로 인한 오차를 최소화하여 대규모의 임상 연구에서도 효율적으로 이용될 수 있다.
본 발명의 측정방법에서 사용하는 실시간 PCR 방법에서 PCR 산물의 반응특성은 반응완료 후 반응산물의 양(Rn)이 일정기준, 즉 역치(threshold)를 초과하기 시작하는 시점의 사이클 수(CT)로 표현된다. 따라서 목적 DNA(target DNA) 의 양이 많을수록 역치에 도달하기까지의 PCR 사이클 수는 적어진다는 원리 하에, 각 유전자의 초기량 값 및 역치 사이클 값을 결정한다.
본 발명의 측정방법의 제 3)단계에서는 상기 사이클 수의 변화로부터 DNA를 정량하기 위해 비교 CT 법(comparative CT method)을 사용한다.
비교 CT 법은 내재적 레퍼런스 DNA를 이용하여 목적 유전자에 대해 상대적인 정량 분석을 하는 방법으로, 시료를 단계적으로 희석한 표준곡선에 의거하여 정량하는 방법인 표준곡선(standard curve) 법과 비교할 때, 내재적 참고 유전자와 목적 유전자의 증폭 효율이 비슷한 경우에는 분석 효율에 차이가 없으면서도 표준 곡선을 그리지 않아도 되므로 희석 및 곡선 작성에 소요되는 시간과 노력 및 오차를 줄일 수 있으며, 플레이트 당 샘플 양도 늘릴 수 있어 매우 효율적이다.
본 발명에서 내재적 참고 유전자로 사용하는 28S rRNA는 여러 연구를 통해 조직 배양 세포 실험에서 이미 일정한 농도를 유지하는 것으로 확인되어 내재적 참고 유전자로서의 유효성이 잘 검증되어 있다.
본 발명의 측정방법을 mtDNA와 28S rRNA에 각각 적용한 결과 두 경우 모두 반응 시료 양의 log에 대한 ΔCT 의 기울기 절대값이 0.1 보다 작으므로, mtDNA와 28S rRNA의 PCR 효율 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 없다. 따라서 mtDNA와 28S rRNA의 PCR 산물 간의 역치 사이클(CT)을 구한 후 하기 수학식 1에 대입하여, 28S rRNA 양에 대한 mtDNA 양의 비율(mtDNA/28S rRNA)을 확인할 수 있다.
Figure 112003033149401-pat00001
(XN: mtDNA/28s rRNA 비율, X0 : 목적 유전자의 초기량, R0: 비교 유전자의 초기량, CT,X: 목적 유전자 증폭의 역치 사이클, CT,R : 비교 유전자 증폭의 역치 사 이클)
본 발명의 측정방법의 제 4)단계는 측정대상의 mtDNA/28S rRNA 비율이 정상여성에 비해 통계학적으로 유의한 감소를 나타내는지 확인한다.
상기와 같은 본 발명의 측정방법에 따르면, 조기난소부전 환자의 mtDNA/28S rRNA 비는 정상대조군에 비해 통계적으로 유의한 수준의 감소를 나타낸다.
따라서 조기난소부전 환자는 mtDNA 카피 수가 정상인에 비해 감소하는 경향이 있음을 확인할 수 있다.
상기와 같은 분석 결과는 조기난소부전 환자군과 정상대조군 모두에서 mtDNA는 mtDNA/28S rRNA에 대해 유의한 양의 상관관계를 나타내며, 28S rRNA는 mtDNA/28S rRNA에 대해 유의한 음의 상관관계를 나타낸다는 점에서 그 유효성이 뒷받침된다.
또한 조기난소부전 환자군은 채혈시 연령과 mtDNA 양 사이에 통계적으로 유의한 상관관계가 나타난 반면, 정상대조군에서는 아무런 연관성이 확인되지 않는다.
한편 조기난소부전 환자군과 정상 대조군 모두에서 조기 난소부전의 증상 발현부터 채혈까지의 기간과는 연관성이 없다.
따라서 난소 기능이 정상인 경우에는 연령이 mtDNA 양에 미치는 영향을 무시할 수 있으나, 일단 난소 기능이 중단되면 mtDNA 양은 난소 기능 중단 시점부터 경과된 기간보다는 난소 기능 중단 시점의 연령에 의하여 더 큰 영향을 받는 것으로 보인다.
본 발명의 측정방법은 조기난소부전의 조기 선별검사로서 응용될 수 있으며, 본 발명의 측정방법을 통해 조기난소부전으로의 진행이 의심되는 여성은 향후 임신 등을 위한 난자 동결 등 보다 적극적인 처치를 할 수 있는 선택 가능성을 부여할 수 있을 것으로 보인다.
본 발명의 측정방법은 조기난소부전에 대한 적절한 치료방법을 수립하기 위한 연구에도 유용하게 응용될 수 있다. 그 일례로, 정상세포에 비해 mtDNA/28S rRNA 비가 통계학적으로 유의한 차이를 나타내는 세포와 시험대상물질을 반응시킨 후, 본 발명의 측정방법에 의해 상기 시험대상물질이 mtDNA/28S rRNA 비를 정상세포 수준으로 회복시키는지 확인하는 조기난소부전 치료제의 스크리닝 방법을 들 수 있다.
본 발명의 측정방법은 발병시 정상인에 비해 mtDNA 카피 수의 변화를 유발하는 기타 질환의 진단에도 응용될 수 있다.
또한 본 발명은 mtDNA 및 28S rRNA의 PCR에 사용할 수 있는 프라이머 세트와, 그 각각의 PCR 산물을 표지할 수 있는 프로브들을 포함하는 조기난소부전 진단용 키트를 함께 제공한다.
본 발명의 키트는 구체적으로 mtDNA의 PCR에 사용하는 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머, 28S rRNA의 PCR에 사용하는 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머, mtDNA의 PCR 산물 표지에 사용하는 서열번호 5의 프로브, 28S rRNA의 PCR 산물 표지에 사용하는 서열번호 6의 프로브로 이루어진다.
본 발명의 키트가 포함하는 프로브들은 통상적으로 사용되는 리포터 물질을을 추가로 함유함으로써 실시간 PCR 반응시 각 사이클(cycle)의 상태를 신호화한다.
본 발명의 키트가 포함하는 프로브들은 리포터 형광물질(reporter flourescent dye) 또는 소광제(quencher) 등을 추가로 함유할 수 있으며, 구체적으로 5' 쪽에 FAM(5-카복시플로로신 리포터, 5-carboxyfluorescein reporter)를, 3' 쪽에 TAMRA(6-카복시-테트라메틸-로다민 소광제, 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine quencher)를 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 키트가 포함하는 프라이머들은 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 증류수나 적절한 완충액에 용해된 상태로 제공될 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 프라이머들 이외에도, 필요에 따라 PCR 반응에 요구되는 성분들을 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 PCR 반응에 요구되는 성분은 dNTP(deoxynucleotide triphosphate), 내열성 중합효소(polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염 등을 들 수 있다.
본 발명의 키트는 필요에 따라 각 성분들을 혼합하는데 사용될 튜브, 사용방법을 기재한 지시자료 등을 추가로 포함할 수 있다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하되, 하기 실시예에 본 발명의 범위가 국한되는 것은 아니다.
[실시예] 본 발명의 방법에 의한 조기난소부전 환자의 진단
1) 실험군 및 대조군
실험군은 2002년 11월부터 2003년 1월까지 차병원 여성의학 연구소에서 무월경, 안면 홍조, 저 에스트로젠증, 고 성선자극호르몬증 등의 조기 난소부전 증상과 징후를 보이는 40세 이전의 환자들 중 중, 1) 연령이 만 40세 미만이면서, 2) 2회 이상 시행한 혈장 난포자극호르몬(serum FSH) 수치가 각각 40 mIU/㎖ 이상이고, 3) 기왕력 상 수술, 내분비계 이상, 자가면역 질환의 증거가 없고, 4) 이차성 무월경으로 확인되고, 5) 염색체 검사 상 정상 여성 핵형 (46, XX)을 보인 환자 30명을 선별하여 구성하였다.
대조군은 같은 기간 차병원 건강 검진 센터에 정기 종합검진을 위해 내원한 여성들 중, 1) 내원시 연령이 만 40세 미만이고, 2) serum FSH < 40 mIU/㎖ 이면서, 3) 기왕력 상 수술, 내분비계 이상, 자가면역 질환의 증거가 없고, 4) 자연 임신에 이은 2회 이상의 정상 출산이 확인된 30명을 선별하여 구성하였다.
전체 연구 계획은 차병원 윤리 위원회의 허가를 받았으며, 실험은 대상자들의 서면 동의서를 받은 후 시행되었다. 실험군 및 대조군의 평균 나이, FSH 농도, 초경 및 폐경 당시의 나이, 폐경 이후 경과된 시간 등을 표 1에 나타내었다.
특징 대조군 (n = 30) 환자군(n = 30)
샘플링 당시 환자의 나이(년) 37.23 ±1.81 (32 ~ 39) 30.30 ±4.47 (19 ~ 39)
FSH (㎖U/㎖) 6.31 ±2.13 (3.1 ~ 8.9) 71.12 ±20.40 (42.3 ~ 107)
초경 당시 환자의 나이(년) 14.33 ±1.12 (13 ~ 17) 14.11 ±1.32 (12 ~ 17)
폐경 당시 환자의 나이(년) NA 25.23 ±5.64 (16 ~ 37)
폐경 이후 경과된 시간(년) NA 5.07 ±4.77 (1 ~ 18)
2) 혈액 채취
실험군 및 대조군에 대해, 정맥혈에서 유전체 DNA를 추출한 후 실시간 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 nuclear DNA 인 28S rRNA gene 에 대한 mtDNA 카피 수의 비를 산출하고, 이를 대조군 30명과 비교 분석하였다.
혈액 채취는 호르몬 검사시 혈장 난포자극호르몬 수치가 2회 이상 40 mIU/㎖ 이상으로 나타난 환자를 대상으로 시행하였으며, 주관절 앞쪽(antecubital area)에서 정맥 전혈 5㎖를 채취한 후 15 % EDTA를 함유하는 100㎕ 진공 채혈관(vacutainer tube)에 수집하였다.
채취한 정맥혈은 호르몬 검사 및 DNA 추출에 사용되었다.
3) DNA 추출
채취한 정맥혈로부터 DNA를 추출하기 위해, 채취한 정맥혈 5㎖를 15㎖ 원심분리튜브(centrifuge tube)에 담은 후, 10 mM Tris-HCl [pH 7.6], 10 mM KCl, 10 mM MgCl2, 2 mM EDTA가 포함된 저염 완충액(TKM1) 5㎖를 첨가하였다.
non-idet P-40(NP-40, Sigma) 125㎕를 첨가하고 뒤집으면서 잘 섞어 적혈구가 용해되도록 한 후, 실온에서 10분 동안 2,200rpm으로 원심분리하였다. 상등액을 조심스럽게 걷어내고, 튜브의 가장 기저층인 백혈구(WBC)만을 남긴 후 TKM1 완충액 5㎖로 세척하였다.
세척 후 튜브를 실온에서 10분 동안 2,200 rpm 으로 원심분리하고, 10 mM Tris-HCl [pH 7.6], 10 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0.4 M NaCl, 2 mM EDTA가 포함된 고염 완충액(TKM2) 0.8㎖으로 조심스럽게 재현탁(resuspend)하였다. 10 % SDS 50㎕를 첨가한 뒤 피펫(pipet)을 이용하여 전체 현탁액을 골고루 섞고, 37℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다.
반응액을 15㎖ 튜브에 옮긴 후 6M NaCl 0.3㎖를 첨가하고 잘 섞고, 실온에서 미세원심분리기(microcentrifuge)를 이용하여 10분 동안 12,000rpm으로 원심분리하였다. DNA를 포함한 상등액만 남기고 튜브 바닥에 가라앉은 단백질 침전을 제거한 후, 실온에서 전체 양의 2배 부피의 100% 에탄올을 첨가하고 DNA가 침전될 때까지 튜브를 수차례 뒤집어주었다.
침전된 DNA 가닥들을 수확하여 아이스-콜드(ice-cold) 70 % 에탄올 1㎖이 들어있는 미세원심분리기 튜브에 옮긴 후, 4℃에서 5분간 12,000rpm으로 원심분리하였다. 진공건조기(speed-vac)에서 침전물을 건조한 후, DNA를 55℃에서 10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA 완충액에 하룻밤 동안 재현탁하고 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.
4) 실시간 중합효소 연쇄 반응
실시간 중합효소 연쇄 반응에 사용하기 위한 프라이머와 프로브를 제작하였다.
프라이머는 mtDNA의 2981-3245 부분을 증폭할 수 있는 프라이머 세트 및 28S rRNA의 7358-7460 부분을 증폭할 수 있는 프라이머 세트로 준비하였다.
프로브는 mtDNA에 대한 프로브(mtDNA-specific probe)와 28S rRNA에 대한 프로브(28S rRNA-specific probe)를 제작하고, 5' 말단과 3' 말단을 각각 5-카복시플로로신 리포터(5-carboxyfluorescein(FAM) reporter)와 6-카복시-테트라메틸-로다민 소광제((6-carboxy-tetramethyl-rhodamine(TAMRA) quencher)로 표지하였다.
상기 프라이머 및 프로브는 Primer Express software version 2.0 (Applied Biosystems Inc., CA, USA) 을 이용하여 디자인하였으며, mtDNA 프라이머의 염기서열은 Human Mitochondrial DNA Revised Cambridge Reference Sequence를 참조하였다. 각 프라이머의 서열 및 프로브의 서열을 표 2 및 표 3에 각각 나타내었다.
유전자 프라이머 종류 염기서열 서열번호
mtDNA 정방향(mt2981) 5'- ACGACCTCGATGTTGAATC -3' 1
역방향(mt3245) 5'- GCTCTGCCATCTTAACAAACC -3' 2
28S rRNA 정방향(28S-7358) 5'- TTAAGGTAGCCAAATGCCTCG -3' 3
역방향(28S-7460) 5'- CCTTGGCTGTGGTTTCGCT -3' 4
유전자 염기서열 표적염기서열 서열번호
mtDNA 5'-FAM-TTCAGACCGGAGTAATCCAGGTCG-TAMRA-3' nt 3071-3095 5
28S rRNA 5'-FAM-TGAACGAGATTCCCACCTGTCCCTACCTACTATC-TAMRA-3' nt 7408-7440 6
mtDNA와 28S rRNA 에 대하여 각각 독립적으로 PCR을 시행하였다.
각각의 25 ㎕ PCR 반응액의 조성은 Applied Biosystems Inc.(CA, USA)의 지침에 따라 10 pmol 정방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer), 200 nmol/l specific TaqMan 프로브(Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA), 200 nmol/l dATP, 200 nmol/l dCTP, 200 nmol/l dGTP, 400 nmol/l dUTP, 4.5 mmol/l MgCl2, 1.25 U AmpliTaq Gold™ DNA 중합효소(DNA polymerase, Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA), 0.5 U AmpErase 유라실 N-글리코실라아제(Uracil N-glycosylase, UNG), 1 × TaqMan 완충액 A으로 이루어지도록 준비하였다.
TaqMan 중합효소는 5'→3' 엑소뉴클레아제(exonuclease)를 이용하여 목적 서열(target sequence)에 특이적인 내부 형광 프로브(internal fluorogenic probe)를 5' 말단부터 분리시키고, 이 과정에서 5'말단의 리포터 다이(reporter dye)가 3'말단의 소광자 다이(quencher dye)와 분리될 때 나타나는 형광을 감지하여 PCR 산물의 양을 정량할 수 있도록 하였다.
모든 중합효소 연쇄반응은 ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems Inc., CA, USA)을 이용하여 3배수로 진행되었다. 상기 기기는 96개의 광섬유가 부착된 96-웰 장착 가온 사이클러(96-well built-in thermal cycler)로 구성되어 있다. 이들 광섬유를 통하여 전달된 레이저 광선(laser light)이 표본의 형광 색소를 자극하고, 그 결과로 방출된 형광은 다시 광섬유를 통하여 내장된 CCD 카메라에 연결된 스펙트로그래프(spectrograph)로 전달되었다.
각각의 웰에 대해 매 6초마다 형광이 측정되었으며, 이렇게 얻어진 결과는 연결된 실시간 서열 분석 소프트웨어(real-time sequence detection software)에 의해 분석되어, 표준화된 리포터 형광 증감값(ΔRn)과 사이클 수의 관계로 모니터에 표시되었다(도 1).
도 1에 나타난 바와 같이, 리포터 형광이 반응 초기(3~15 사이클)의 배경 신호(background signal)에 의한 기저치 형광(baseline fluorescence)을 통계학적으로 유의한 정도(10 ×SD)로 초과하기 시작하는 사이클을 역치 사이클(threshold cycle, CT)로 정의하여, 역치 사이클과 목적 DNA 서열 카피 수의 로그(log) 값이 정확히 반비례함을 이용하여 시료를 정량분석하였다.
실험에 사용된 프라이머 및 프로브의 양은 가장 높은 리포터 형광과 가장 낮은 역치 사이클을 나타내도록 조절하였다. PCR 시료는 MicroAmp 광학 캡이 달린 MicroAmp 광학 96-웰 반응 플레이트(Applied Biosystems Inc., CA, USA) 에 준비하였다.
PCR 증폭시 우선 50℃에서 2분간 반응시켜 UNG가 활성화되도록 하여, 잠재적인 PCR 오염물(potential contaminant PCR product)를 파괴하였다. AmpliTaq Gold™ DNA 중합효소를 활성화하기 위해 95℃에서 10분간 반응시키고, 증폭을 위해 95℃에서 15초, 60℃에서 1분간 40회 반복하였다.
5) 비교 C T (Comparative C T )법을 이용한 mtDNA 정량
mtDNA content 의 정량 분석을 위해, 비교 분석을 시행하였다.
내재적 비교 유전자에 대한 목적 유전자의 양(mtDNA/28s rRNA 비율, XN)은 수학식 1을 이용하여 구하였다. 상기 식에 의해 실시간 PCR 결과 얻어진 mtDNA의 역치 사이클(mtDNA CT)과 28S rRNA의 역치 사이클(28S rRNA CT)로부터 환자군과 대조군 사이의 mtDNA/28S rRNA 비율을 계산하고, mtDNA CT, 28S rRNA CT, mtDNA/28S rRNA 비율, 연령에 따른 상관 관계를 분석하였다. 환자군 내에서는 채혈시 연령, 난소부전 진단 후 채혈까지의 기간, mtDNA/28S rRNA 비율의 상관 관계도 확인하였다.
6) 통계학적 분석
모든 PCR은 3배수로 시행되었고 결과는 평균 ±표준편차(mean ±SD)로 나타내었다. 통계학적 분석에는 StatView software version 5.0 for Macintosh (Abacus Concepts Inc., CA, USA)를 이용하였다. 환자군과 대조군 간의 비교는 스튜던트 t 테스트(Student's t test)로 분석하였고, 각 군에서의 mtDNA CT, 28S rRNA CT, mtDNA/28S rRNA 비율, 연령 사이의 연관성은 상관관계 Z 테스트(correlation Z test)로 분석하였으며, P < 0.05 미만이면 통계학적 유의성이 있다고 판단하였다.
7) 조기난소부전 환자군과 대조군의 mtDNA/28S rRNA 비율 비교
상기의 방법에 의해 조기난소부전 환자군과 대조군의 mtDNA/28S rRNA 비율을 비교하였다.
조기난소부전 환자군의 평균 연령은 30.30 ±4.47세 (n=30; 19~39세)였고, 대조군의 평균 연령은 37.23 ±1.81 세였다(n=30; 32~39 세).
각 항목의 값들을 평균 ±표준편차로 계산하여 표 4 및 도 2에 나타내었다.
샘플 수 평균 나이 28S rRNA CT mtDNA CT mtDNA/28S rRNA
대조군 30 37.23 ±1.81 (32 ~ 39) 16.50 ±0.57 16.46 ±0.58 1.15 ±0.67
환자군 30 30.30 ±4.47 (19 ~ 39) 17.12 ±0.76** 16.05 ±0.71* 0.58 ±0.38**
(mtDNA/28S rRNA = 2 - D (28S rRNA CT - mtDNA CT), *: P < 0.05, ** P < 0.01)
표 4와 도 2에 나타난 바와 같이, 조기난소부전 환자군의 mtDNA/28S rRNA 비율은 대조군의 mtDNA/28S rRNA 비율에 비해 2배 이하로 저하되는 것을 관찰할 수 있었으며, 상기 차이는 통계학적 유의성을 갖는 것으로 나타났다(0.58 ±0.38 vs. 1.15 ±0.67; P < 0.01).
상기 결과를 재차 확인하는 한편 대조군과 조기난소부전 환자군 간의 연령 차이로 인해 발생할 수 있는 실험적 오차를 제거하기 위해, 조기난소부전 환자군 중 대조군과 동일한 30~39 세 범위에 해당되는 환자만을 선별하여 대조군 환자와 mtDNA/28S rRNA 비율을 비교하였다. 각 항목의 값들을 평균 ±표준편차로 계산하여 도 3 및 표 5에 나타내었다.
샘플 수 28S rRNA CT mtDNA CT mtDNA/28S rRNA
대조군 30 16.50 ±0.57 16.46 ±0.58 1.15 ±0.67
환자군 18 16.59 ±0.75 16.70 ±1.21 0.50 ±0.29**
(mtDNA/28S rRNA = 2 - D (28S rRNA CT - mtDNA CT), ** P < 0.01)
도 3 및 표 5에 나타난 바와 같이, 같은 연령대의 조기난소부전 환자군 및 대조군은 상기 표 4 및 도 2의 결과와 마찬가지로 2배 이상의 차이를 보였으며, 상기 차이는 통계학적 유의성을 가지는 것으로 나타났다(0.50 ±0.29 vs. 1.15 ±0.67; P < 0.01).
이상에서 조기난소부전 환자는 정상인에 비해 mtDNA 카피 수가 감소함을 알 수 있으며, 본 발명의 측정방법 및 그 키트를 통해 조기난소부전 여부를 정확하게 확인할 수 있다.
8) 조기난소부전 환자군 및 정상 대조군에서 mtDNA C T , 28S rRNA C T , mtDNA/28S rRNA 비율 간의 상관관계 확인
조기난소부전 환자군 및 정상 대조군에서 mtDNA CT, 28S rRNA CT, mtDNA/28S rRNA 비율 간의 상관관계를 확인하였다.
정상 대조군 및 조기난소부전 환자군의 mtDNA CT / (mtDNA/28S rRNA) 비율은 도 4a 및 4b에, 정상 대조군 및 조기난소부전 환자군의 28S rRNA CT / (mtDNA/28S rRNA) 비율은 도 5a 및 5b에 각각 나타내었으며, 상기 값들을 표 6에 정리하여 나타내었다.
구분 대조군 환자군
mtDNA CT 28S rRNA CT mtDNA/ 28S rRNA mtDNA CT 28S rRNA CT mtDNA/ 28S rRNA
r P r P r P r P r P r P
mtDNA CT 1.000 -0.183 0.336 0.774 <0.001 1.000 0.207 0.276 0.556 0.001
28S rRNA CT 1.000 -0.677 <0.001 1.000 -0.677 <0.001
도 4 및 표 6에 나타난 바와 같이, 대조군과 환자군 모두에서 mtDNA CT 는 mtDNA/28S rRNA 비율과 유의한 양의 상관관계(positive correlation)를 나타내었다(각각, r = 0.774, P < 0.001; r = 0.556, P = 0.001).
반면 도 5 및 표 6에 나타난 바와 같이, 28S rRNA CT 는 유의한 음의 상관관계(negative correlation)를 나타내었다 (각각, r = -0.677, P <0.001: r = -0.627, P = 0.001).
이러한 상관관계의 경향은 수학식 1에 의거하여 유추할 수 있는 관계와 일치하는 것이다.
따라서, 본 발명의 측정방법에 따른 결과는 유효함을 알 수 있다.
9) 채혈시 연령, 폐경 후 채혈시까지의 기간, mtDNA/28S rRNA 비율 간의 상관관계 확인
채혈시 연령, 폐경 후 채혈시까지의 기간, mtDNA/28S rRNA 비율 간의 상관관계를 확인하고 도 6 및 표 7에 나타내었다.
구분 대조군 환자군
나이 mtDNA/28S rRNA 나이 mtDNA/28S rRNA 폐경 이후 경과된 시간(년)
r P r P r P r P r P
나이 1.000 0.047 0.808 1.000 -0.487 0.006
폐경 이후 경과된 시간(년) -0.099 0.604 1.000
도 6 및 표 7에 나타난 바와 같이, 대조군의 경우 채혈시 연령과 mtDNA/28S rRNA 비율 사이에는 유의한 연관성이 없었으나(r = 0.047, P = 0.808), 환자군의 경우에서는 채혈시 연령이 증가할수록 mtDNA/28S rRNA 비율이 유의하게 감소하였다(r = -0.487, P = 0.006).
그러나 난소부전 진단 후 채혈까지의 기간 사이에는 조기난소부전 환자군과 정상 대조군 모두에서 유의한 연관성이 확인되지 않았다 (r = -0.099, P = 0.604) (Table 7b).
따라서 난소 기능이 정상인 경우에는 연령이 mtDNA 양에 미치는 영향을 무시할 수 있으나, 일단 난소 기능이 중단되면 mtDNA 양은 난소 기능 중단 시점부터 경과된 기간보다는 난소 기능 중단 시점의 연령에 의하여 더 큰 영향을 받는 것으로 보인다.
본 발명의 측정방법 및 그 키트는 조기난소부전에 특징적인 mtDNA 감소를 효율적으로 확인할 수 있게 한다.
따라서 본 발명의 측정방법 및 그 키트는 조기난소부전에 대한 진단을 비롯하여 조기난소부전 치료제의 스크리닝, mtDNA 카피 수의 변화로 인한 기타 질병의 진단에도 유용하게 사용될 수 있다.
<110> LEE, Suk Whan <120> Composition for diagnosis of premature ovarian failure <130> 03P-89 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for mitochondral DNA <400> 1 acgacctcga tgttgaatc 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mitochondral DNA <400> 2 gctctgccat cttaacaaac c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for 28S rRNA <400> 3 ttaaggtagc caaatgcctc g 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for 28S rRNA <400> 4 ccttggctgt ggtttcgct 19 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for mitochondral DNA PCR product <400> 5 ttcagaccgg agtaatccag gtcg 24 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for 28S rRNA PCR product <400> 6 tgaacgagat tcccacctgt ccctacctac tatc 34

Claims (11)

  1. 삭제
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  7. 삭제
  8. mtDNA의 PCR을 수행하기 위한 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머, 28S rRNA의 PCR을 수행하기 위한 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머, mtDNA의 PCR 산물 표지에 사용하는 서열번호 5의 프로브, 28S rRNA의 PCR 산물 표지에 사용하는 서열번호 6의 프로브를 포함하는 조기난소부전 진단용 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 서열번호 5의 프로브 및 서열번호 6의 프로브의 5'에는 5-카복시플로로신 리포터, 3'에는 6-카복시테트라메틸 로다민 소광제가 표지된 조기난소부전 진단용 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 서열번호 5, 6의 프로브는 실시간 중합효소연쇄반응 반응사이클마다 신호를 측정이 가능하여 각 유전자의 초기량 값 및 역치 사이클 값이 결정되는 조기난소부전 진단용 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 각 유전자의 초기량 값 및 역치 사이클 값으로부터 얻어진 mtDNA/28S rRNA에 의하여 조기난소부전 진단이 가능한 조기난소부전 진단용 키트.
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