CN109825589B - Loc112268236基因的应用、检测甲基化的核酸组合物及其试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种LOC112268236基因的应用、检测甲基化的核酸组合物及其试剂盒和检测方法。该LOC112268236基因作为生物标志物在制备检测肺癌的试剂、试剂盒或装置中的应用，检测为检测所述LOC112268236基因启动子的甲基化状态或甲基化程度。基于上述LOC112268236基因作为生物标志物开发的检测试剂盒对肺癌进行检测的特异性较高。

Description

LOC112268236基因的应用、检测甲基化的核酸组合物及其试 剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种LOC112268236基因的应用、检测甲基化的核酸组合物及其试剂盒和检测方法。

背景技术

肺癌是一种比较常见的恶性肿瘤，并且随着城市人口增多、私家车数量增多、生态植被的破坏以及吸烟的不良习惯的存在而导致空气质量不断下降，肺癌也成为主要的恶性肿瘤死亡原因。同时由于对相关知识的缺乏致使大部分患者确诊肺癌时已经进入中晚期，错过了手术治疗的最佳机会，其5年生存率不足15％。因此，早发现、早诊断、早治疗是提高肺癌患者生存率的有效手段。目前，主要通过癌胚抗原试验对肺癌进行诊断。然而。癌胚抗原试验的特异性较差，不利于肺癌的有效检测。

发明内容

基于此，有必提供一种LOC112268236基因作为生物标志物的应用，基于该LOC112268236基因作为生物标志物开发的检测试剂盒对肺癌进行检测的特异性较高。

此外，还提供一种检测甲基化的核酸组合物及其试剂盒和检测方法。

一种LOC112268236基因作为生物标志物在制备检测肺癌的试剂、试剂盒或装置中的应用，所述检测为检测所述LOC112268236基因启动子的甲基化状态或甲基化程度。

经过在肺癌的生物标志物方面进行了大量的探索，预料不到地发现，位于LOC112268236基因的甲基化突变情况与肺癌具有较高相关性，因此，能够作为生物标志物应用于制备检测肺癌的试剂、试剂盒或检测装置中。经试验验证，将上述LOC112268236基因作为生物标志物研发的检测试剂盒对非小细胞肺癌检测的特异性为90％～98％，有利于肺癌的有效检测。

一种检测甲基化的核酸组合物，包括检测扩增引物对，所述检测扩增引物对用于扩增甲基化的待测基因，所述待测基因含有LOC112268236基因启动子。

其中一个实施例中，所述LOC112268236基因启动子的序列如SEQ ID No.1所示。

其中一个实施例中，所述检测扩增引物对的序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

其中一个实施例中，还包括内参扩增引物对，所述内参扩增引物对用于扩增甲基化的内参基因，所述内参基因选自U6基因、GAPDH基因及actin基因中的至少一种。

其中一个实施例中，所述内参扩增引物对的序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示。

一种检测甲基化的试剂盒，包括上述检测甲基化的核酸组合物。

其中一个实施例中，还包括DNA聚合酶，所述DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.6所示。

其中一个实施例中，还包括DNA提取试剂、亚硫酸盐转化试剂、dNTPs、PCR反应液、Mg²⁺试剂、荧光染料、阳性对照品以及阴性对照品中的至少一种。

其中一个实施例中，所述阳性对照品含有序列如SEQ ID No.1所示的核酸；

及/或，所述阴性对照品含有序列如SEQ ID No.7所示的核酸。

一种DNA聚合酶，所述DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

一种重组载体，所述重组载体含有所述DNA聚合酶的编码序列。

一种重组细胞，所述重组细胞含有编码上述DNA聚合酶的核酸；或，

所述重组细胞含有上述所述的重组载体。

一种检测甲基化的检测方法，包括如下步骤：

提取待测样本中的核酸；

对所述核酸进行亚硫酸盐处理；及

采上述检测甲基化试剂盒对亚硫酸盐处理后的所述核酸进行荧光定量PCR扩增反应，根据反应结果进行检测分析。

附图说明

图1为阳性对照品和阴性对照品的熔解曲线图；

图2为阳性对照品和阴性对照品的扩增曲线图；

图3为待测样品的熔解曲线图；

图4为待测样品的扩增曲线图；

图5为试剂盒1对不同浓度的阳性对照品进行QPCR检测的扩增曲线对比图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

本研究提供一实施方式的LOC112268236基因作为生物标志物在制备检测肺癌的试剂、试剂盒或装置中的应用，检测为检测LOC112268236基因启动子的甲基化状态或甲基化程度。

肺癌是一种比较常见的恶性肿瘤，并且随着城市人口增多、私家车数量增多、生态植被的破坏以及吸烟的不良习惯的存在，导致城镇的空气质量不断下降，肺癌也成为许多国家主要的恶性肿瘤死亡原因。同时由于患者对相关知识的缺乏以及早期诊断不够完善，致使大部分患者确诊肺癌时已经进入中晚期，错过了手术治疗的最佳机会，其5年生存率不足15％。因此，早发现、早诊断、早治疗是提高肺癌患者生存率的有效手段。目前，缺乏高灵敏度、高特异性的肺癌早期诊断生物标志物是临床上亟待解决的重大问题之一。DNA甲基化是在胞嘧啶环5’碳原子甲基化形成5’甲基胞嘧啶的过程。在人体内，主要分为CG型，CHG型和CHH型(H代表CAT三种碱基的可能)。一般DNA的基因或附近区域甲基化，该基因就可能处于沉默状态，不会被表达。同时CG型和CHG型的DNA甲基化在DNA的半保留复制过程中可以被维持，所以甲基化具有遗传性。研究显示，DNA的甲基化与许多肿瘤的发生发展关系密切。DNA甲基化修饰在肿瘤发生早期的异常变化使其对肿瘤的发生具有重要的提示作用，在肺癌的演变过程中也起到重要作用。

本研究意外发现在肺癌病人与健康人的LOC112268236基因启动子的甲基化突变情况存在明显的差异，肺癌病人的LOC112268236基因启动子的甲基化突变频率显著升高。因此，LOC112268236基因能够作为检测早期肺癌的生物标记物，应用于制备检测肺癌的试剂、试剂盒或检测装置中，以用于肺癌早期诊断、预测治疗、病程检测或监测复发等。

具体地，LOC112268236基因启动子的序列如SEQ ID No.1所示。LOC112268236基因的序列如SEQ ID No.8所示。

具体地，如SEQ ID No.1所示的序列为：5’-GTCAGCGAACATCGCCTCCCTCTACCGCTCAATCAGCAAAAGGGACCGCCCTTGAGGACCTCACCCGCCGCTCACTCCCCTCCCAACTTCGCGGGCATCGCCTCCGGTCGCCTCTTCCGAAGGCCTAACGAGCATGTTAGCTGCGAACGGAGGTGAGGAGGCTCCGCTGACTGACCGGTGCCCACGTCCAGGGCACGCACAAACGCCATGACTTGGCTTGGCCTCTCT-3’。

在其中一个实施例中，生物标志物是指可以标记系统、器官、组织及细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标。

在其中一个实施例中，肺癌为非小细胞肺癌。上述LOC112268236基因启动子的甲基化情况与非小细胞肺癌的相关性更大，对非小细胞肺癌检测的特异性更高。

将上述LOC112268236基因作为生物标志物研发的肺癌检测试剂盒，通过检测LOC112268236基因启动子的甲基化情况即可得到对肺癌检测，具有较高特异性和较低假阳性率的结果，操作简单且方便。经试验验证，将上述LOC112268236基因作为生物标志物研发的检测试剂盒对非小细胞肺癌检测的特异性为90％～98％，有利于肺癌的有效检测。

本研究还提供一实施方式的检测甲基化的核酸组合物，包括检测扩增引物对，检测扩增引物对用于扩增甲基化的待测基因，待测基因含有LOC112268236基因启动子。

通过设计扩增甲基化的、含有LOC112268236基因启动子的待测基因的扩增引物对，以对LOC112268236基因启动子的甲基化情况进行检测，以便于对肺癌进行及时有效地诊断。

在一个具体示例中，检测扩增引物对的序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。具体地，如SEQ ID No.2所示的序列为：5’-GTCAGCGAACATCGCCTCCC-3’；如SEQ ID No.3所示的序列为：5’-AGAGAGGCCAAGCCAAGTCA-3’。

在其中一个实施例中，检测甲基化的核酸组合物还包括内参扩增引物对，内参扩增引物对用于扩增甲基化的内参基因。通过包括内参扩增引物对能够提高甲基化检测的准确性。进一步地，内参基因选自U6基因、GAPDH基因及actin基因中的至少一种。需要说明的是，内参基因不限于上述指出的内参基因，也可以为其他内参基因，只要能够起到内参作用即可。

在一个具体实施例中，内参基因为actin基因。内参扩增引物对的序列如SEQ IDNo.4和SEQ ID No.5所示。具体地，如SEQ ID No.4所示的序列为：5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’；如SEQ ID No.5所示的序列为：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’。

需要说明的是，检测甲基化的核酸组合物不限于包括上述物质，还可以包括其他用于检测甲基化的核酸，例如还可以包括与检测扩增引物对对应的甲基化检测探针、与内参扩增引物对对应的内参甲基化检测探针等。

上述检测甲基化的核酸组合物，包括用于扩增甲基化的待测基因的检测扩增引物对，待测基因含有LOC112268236基因启动子，使得采用上述核酸组合物对肺癌检测时特异性较高。经试验验证，含有上述核酸组合物的肺癌检测试剂盒对肺癌的检测的特异性为90％～98％，有利于肺癌的有效检测。

一实施方式的DNA聚合酶具有较高的保真性，能够用于待测基因的甲基化检测、聚合聚合酶链式反应等中，以保证检测或反应的高效性和重复性。

在一个具体示例中，DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。具体地，如SEQID No.6所示的序列为：MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHALHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFKRWTADVEAGKWLQAKGAKPAAKPQETSVADEAPEVTATVISYDNYVTILDEETLKAWIAKLEKAPVFAFDTETDSLDNISANLVGLSFAIEPGVAAYIPVAHDYLDAPDQISRERALELLKPLLEDEKALKVGQNLKYDRGILANYGIELRGIAFDTMLESYILNSVAGRHDMDSLAERWLKHKTITFEEIAGKGKNQLTFNQIALEEAGRYAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE。该DNA聚合酶能够在DNA模板含量为2ng的时候进行完整扩增，具有较高的保真性和高效性，有利于甲基化的准确有效地检测。

本聚合酶参考大肠杆菌DNA聚合酶I的序列，对Taq DNA聚合酶外切酶活性结构域进行重组，再用shuffling技术重排基因进行了改造而成。

此外，提供一种重组载体，重组载体含有上述实施方式的DNA聚合酶的编码序列。

在其中一个实施例中，重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

在其中一个实施例中，重组载体含有纯化标签。通过设置纯化标签，有利于活性肽的分离纯化。进一步地，纯化标签GST标签。需要说明的是，纯化标签不限于上述指出纯化标签，其他常见的纯化标签也可以作用重组载体的纯化标签，例如可以为His标签或SUMO标签。

在其中一个实施例中，重组载体包括基因工程载体。编码上述活性肽的核酸插入基因工程载体中。进一步地，基因工程载体为pGEX-6P-1表达载体。需要说明的是，基因工程载体不限于上述指出基因工程载体，其他常见的基因工程载体也可以作用重组载体的基因工程载体，例如可以为pET-32a载体、pGEX-6P-1载体、pPIC-9K载体或pPIC-Zα载体。

上述重组载体能够较好地保存编码上述实施方式的DNA聚合酶的核酸，有利于DNA聚合酶的表达。

一实施方式的重组细胞能够表达上述实施方式的DNA聚合酶。

在其中一个实施例中，重组细胞含有编码上述实施方式的DNA聚合酶的核酸。

在其中一个实施例中，重组细胞含有上述实施方式的重组载体。

在其中一个实施例中，重组细胞为克隆编码上述实施方式的DNA聚合酶的核酸的细胞。

在其中一个实施例中，重组细胞为表达编码上述实施方式的DNA聚合酶的核酸的细胞。

在其中一个实施例中，重组细胞包括受体细胞。编码上述实施方式的DNA聚合酶的核酸或上述重组载体位于受体细胞内。

在其中一个实施例中，受体细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、动物细胞或植物细胞。进一步地，受体细胞为BL21感受态细胞。需要说明的是，受体细胞不限于上述指出受体细胞，其他常见的受体细胞也可以作用重组细胞的受体细胞。例如可以为大肠杆菌DH5α、大肠杆菌Top10、大肠杆菌Orgami(DE3)、毕赤酵母GS115或毕赤酵母SMD1168。

上述重组细胞能够克隆或表达上述实施方式的DNA聚合酶，使得能够大规模的制备该DNA聚合酶，并且通过重组细胞定向表达该DNA聚合酶，以能够获得纯度较高的DNA聚合酶，进而有利于DNA聚合酶的应用。

一实施方式的检测甲基化的试剂盒，包括上述实施方式的检测甲基化的核酸组合物。该检测甲基化的试剂盒能够检测待测样品中的有LOC112268236基因启动子的甲基化情况，以对肺癌进行有效检测。

在其中一个实施例中，待测样品为全血样本、血浆样本、唾液样本、尿液样本或病理组织样本。需要说明的是，待测样品不限于上述指出的样品，还可以为其他待测样品，例如可以为经过微流控仪器或流式细胞仪收集后的细胞组织。

在其中一个实施例中，检测甲基化的试剂盒还包括DNA聚合酶。进一步地，DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶。

在其中一个实施例中，DNA聚合酶的制备过程为：参考大肠杆菌DNA聚合酶I的序列，对Taq DNA聚合酶外切酶活性结构域进行重组，再用shuffling技术重排基因进行了改造而成。具体地，采用pGEX-6P-1表达载体进行重组表达，得到表达载体，并将表达载体导入到BL21感受态细胞中进行表达，且采用GST标签对DNA聚合酶进行纯化。该DNA聚合酶兼具Taq聚合酶的耐高温特性以及大肠杆菌DNA聚合酶I的外切酶活性，能够在DNA模板含量为2ng的时候进行完整扩增，具有高保真性、高效性。

在一个具体示例中，DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。具体地，如SEQID No.6所示的序列为：MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHALHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFKRWTADVEAGKWLQAKGAKPAAKPQETSVADEAPEVTATVISYDNYVTILDEETLKAWIAKLEKAPVFAFDTETDSLDNISANLVGLSFAIEPGVAAYIPVAHDYLDAPDQISRERALELLKPLLEDEKALKVGQNLKYDRGILANYGIELRGIAFDTMLESYILNSVAGRHDMDSLAERWLKHKTITFEEIAGKGKNQLTFNQIALEEAGRYAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE。该DNA聚合酶能够在DNA模板含量为2ng的时候进行完整扩增，具有较高的保真性和较好的重复性，且具有高效性，有利于甲基化的准确有效地检测。

需要说明的是，DNA聚合酶不限于上述指出的DNA聚合酶，也可以为其他DNA聚合酶，例如可以为TAKARA厂家的高保真DNA聚合酶。

在其中一个实施例中，检测甲基化的试剂盒还包括DNA提取试剂、亚硫酸盐转化试剂、dNTPs、PCR反应液、Mg²⁺试剂、荧光染料、阳性对照品以及阴性对照品中的至少一种。其中，阳性对照品即阳性质控品，阴性对照品即阴性质控品。

在其中一个实施例中，阳性对照品含有序列如SEQ ID No.1所示的核酸。进一步地，阳性对照品中序列如SEQ ID No.1所示的核酸处于甲基化状态。

在其中一个实施例中，阴性对照品含有序列如SEQ ID No.7所示的核酸。

具体地，如SEQ ID No.7所示的序列为：5’-GTTAGTGAATATTGTTTTTTTTTATTGTTTAATTAGTAAAAGGGATTGTTTTTGAGGATTTTATTTGTTGTTTATTTTTTTTTTAATTTTGTGGGTATTGTTTTTGGTTGTTTTTTTTGAAGGTTTAATGAGTATGTTAGTTGTGAATGGAGGTGAGGAGGTTTTGTTGATTGATTGGTGTTTATGTTTAGGGTATGTATAAATGTTATGATTTGGTTTGGTTTTTTT-3’。

亚硫酸盐转化试剂用于将待测基因DNA中未发生甲基化的5’胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的5’胞嘧啶不发生改变，最后得到Bis-DNA。通过将待测基因DNA中的胞嘧啶(C)可转化为尿嘧啶(U)，而5-甲基胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶的概率极低，因此，经亚硫酸氢盐处理后的DNA样本中的胞嘧啶只能来至于5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化后，由于5-甲基胞嘧啶的存在并不影响碱基的配对，因此相较于传统的聚合酶链式反应(polymerasechain reaction PCR)扩增过程会丢失甲基化信息，通过亚硫酸盐转化能够有效地保留DNA甲基化信息。

在其中一个实施例中，亚硫酸盐转化试剂包括重亚硫酸钠、异戊醇和醋酸钠。

上述检测甲基化的试剂盒包括上述实施方式的检测甲基化的核酸组合物，对肺癌检测的特异性较高，假阳性率较低，准确性较高，特异性较强，能够用于对肺癌进行筛查和诊断。

再者，上述检测甲基化的试剂盒能够通过对患者血液样本的检测，即可对患者是否罹患肺癌进行早期诊断，避免手术取病理组织样本或内镜检查对患者造成的创伤。

进一步地，上述检测甲基化的试剂盒还包括亚硫酸盐转化试剂，以对待测样品中的DNA进行亚硫酸盐转化处理，再使用试剂盒提供的特异性地扩增引物对进行荧光定量PCR，根据结果能够直接判断LOC112268236基因启动子是否发生甲基化，从而判断患者是否有罹患肺癌，检测过程操作简便，耗时短，并且成本低。

最后，当DNA模板浓度低至2ng时，目前市面上产品一般都无法进行完整扩增，基本都需要DNA模板浓度达到10ng时才能完整扩增，而上述实施方式的检测甲基化的试剂盒还包括DNA聚合酶，DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，能够在DNA模板含量为2ng的时候进行完整扩增，具有高保真性和高效性，重复性可达99.99％。

因此，本研究一实施方式还提供一种甲基化的检测方法，能够对目的基因的甲基化进行非疾病的诊断和治疗性的检测。具体地，上述检测方法包括如下步骤S110～S130：

S110、提取待测样本中的核酸。

在其中一个实施例中，待测样本的实验用血液制品。

在一个具体示例中，待测样本的核酸含有LOC112268236基因。

需要说明的是，待测样本为核酸时，S110的步骤可以省略。

S120、对核酸进行亚硫酸盐处理。

通过对核酸进行亚硫酸盐处理，以将核酸中未发生甲基化的5’胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的5’胞嘧啶不发生改变，最后得到Bis-DNA。通过将待测基因DNA中的胞嘧啶(C)可转化为尿嘧啶(U)，而5-甲基胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶的概率极低，因此，经亚硫酸氢盐处理后的核酸中的胞嘧啶只能来至于5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化后，由于5-甲基胞嘧啶的存在并不影响碱基的配对，因此相较于传统的聚合酶链式反应(polymerase chainreaction PCR)扩增过程会丢失甲基化信息，通过亚硫酸盐转化能够有效地保留核酸甲基化信息。

在其中一个实施例中，对核酸进行亚硫酸盐处理的步骤包括：将4.5mg～5.5mg的核酸与4.5mol/L～5.5mol/L的重亚硫酸钠水溶液混合，于25℃孵育18min～22min；加入1mL的异丙醇和0.1mL、2mol/L的醋酸钠水溶液，于-20℃沉淀28min～32min，固液分离，得到亚硫酸盐处理后的核酸。进一步地，固液分离的方式为离心。更进一步地，固液分离的操作条件为：12000rpm离心10min。

S130、采用上述实施方式的检测甲基化试剂盒对亚硫酸盐处理后的核酸进行荧光定量PCR扩增反应，根据反应结果进行检测分析。

在其中一个实施例中，进行荧光定量PCR扩增反应的反应体系为：12.5μL 2×PCR反应液、1.5μL质量百分含量为2mmol/L的MgCl₂水溶液、1μL的扩增引物对、3μLdNTPs、1μL的DNA聚合酶、1μL(即2ng～100ng)的DNA模板、5μL的SYBR Green I染料，总体积为25μL或者50μL。DNA模板为亚硫酸盐处理后的核酸。

在其中一个实施例中，荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，45个循环。

在其中一个实施例中，S130包括如下步骤S131～S133：

S131、采用上述实施方式的检测甲基化试剂盒对亚硫酸盐处理后的核酸进行荧光定量PCR扩增反应，获得待测样品的熔解曲线或扩增曲线。

S132、采用上述实施方式的检测甲基化试剂盒对阳性对照品进行荧光定量PCR扩增反应，获得阳性对照品的熔解曲线或扩增曲线。

S133、将待测样品的熔解曲线或扩增曲线与阳性对照的熔解曲线或扩增曲线进行比对，若待测样品的熔解曲线或扩增曲线与阳性对照的熔解曲线或扩增曲线一致，则待测样品呈甲基化阳性。

在其中一个实施例中，S130还包括S134～S135：

S134、采用上述实施方式的检测甲基化试剂盒对阴性对照品进行荧光定量PCR扩增反应，获得阴性对照品的熔解曲线或扩增曲线。

S135、将待测样品与阴性对照品的熔解曲线或扩增曲线进行比对，若待测样品的熔解曲线或扩增曲线与阴性对照品的熔解曲线或扩增曲线一致，则待测样品呈甲基化阴性。

上述甲基化的检测方法，能够准确检测LOC112268236基因的甲基化程度，检测假阳性率较低，准确性较高，特异性较强，能够用于对LOC112268236基因的甲基化情况进行非疾病的治疗和诊断性的检测，以研究不同样本中LOC112268236基因的甲基化情况，以深入研究LOC112268236基因。

一些研究采用甲基化特异性寡核苷酸芯片法进行甲基化检测，即将待测DNA变性后孵育到芯片上，以使待测DNA与芯片探针进行结合，再扫描芯片每个微孔的发光情况，进行结果统计分析以获得待测DNA甲基化。然而，芯片价格较高，不利于广泛的推广和使用。另一些研究采用重亚硫酸盐修饰与测序法进行甲基化检测，即采用重亚硫酸盐处理样本DNA，将DNA打碎成20bp～50bp的序列，进行建库，再进行DNA测序。然而，测序操作需要专业的编程知识进行编程以将DNA序列拼成完整序列，对编程技术要求较高，不利于广泛的推广。还有些研究采用重亚硫酸盐变性处理的限制酶解分析法进行甲基化检测，即使用重亚硫酸盐处理待测DNA，再根据目的基因的序列选择甲基化敏感DNA限制性内切酶酶切2h-4h，酶切完成后回收，用发光探针去杂交酶切产物，根据杂交情况可以了解DNA酶切情况，最后判断DNA的甲基化情况。该方法需要根据不同的检测基因选择不同的内切酶，成本较高，不利于广泛推广。实时荧光定量PCR(QPCR，Quantitative Real-time PCR)即一种在DNA扩增反应中加入荧光化学物质，通过检测实时相应的荧光信号，再与内参或者外参比较，对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。本实施方式采用QPCR进行目的基因的甲基化情况的定量分析，操作简单，成本较低，能够广泛用于甲基化检测。

以下为具体实施例部分。

实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。

实施例1

检测甲基化的试剂盒

检测甲基化的试剂盒共有两种，分别为试剂盒1和试剂盒2。

(1)试剂盒1包括核酸组合物、阳性对照品、阴性对照品、空白质控品、DNA聚合酶、PCR反应液、MgCl₂、SYBR Green I染料、亚硫酸盐转化试剂、dNTPs；

核酸组合物如表1所述，核酸组合物包括检测扩增引物对和内参扩增引物对；检测扩增引物对用于扩增甲基化的待测基因，待测基因为LOC112268236基因启动子，LOC112268236基因的序列如SEQ ID No.8所示，LOC112268236基因启动子的序列如SEQ IDNo.1所示；内参扩增引物对用于扩增甲基化的内参基因，内参基因为actin基因；

表1核酸组合物

阳性对照品为序列如SEQ ID No.1所示的DNA；

阴性对照品为序列如SEQ ID No.7所示的DNA；

DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；

PCR反应液购于TAKARA公司。

(2)试剂盒2与试剂盒1的组成大致相同，不同之处在于，试剂盒2的DNA聚合酶为TAKARA公司的高保真DNA聚合酶。

实施例2

对待测样本的甲基化情况进行检测

(1)选取20例待测样品，包括10例确诊为非小细胞肺癌患者的血液样本(即病人样本)和10例健康人的血液样本(即健康人样本)。

(2)采用天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取试剂盒并按照其操作说明提取待测样品中的DNA。

(3)对待测样品中的DNA进行亚硫酸盐处理，具体步骤为：将5mg的DNA与5mol/L的重亚硫酸钠水溶液混合，于25℃孵育20min；加入1mL的异丙醇和0.1mL、2mol/L的醋酸钠水溶液，于-20℃沉淀30min，12000rpm离心10min，得到亚硫酸盐处理后的DNA，即DNA模板。同时，按照上述方式对actin基因进行亚硫酸盐处理，得到亚硫酸亚处理后的DNA，即为DNA模板。

(4)采用实施例1的试剂盒1对各DNA模板进行多重荧光定量PCR检测，获得对应的熔解曲线和扩增曲线。同时，采用实施例1的试剂盒1分别对阳性对照品、阴性对照品进行多重荧光定量PCR检测，获得对应的熔解曲线和扩增曲线。待测样品中的DNA、阳性对照品和阴性对照品的DNA模板采用检测扩增引物对进行荧光定量PCR扩增，actin基因的DNA模板采用内参扩增引物对进行荧光定量PCR扩增。多重荧光定量PCR反应的体系如表2所示。多重荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，45个循环。阳性对照品和阴性对照品重复测定三次。检测结果详见图1～4。图1为阳性对照品和阴性对照品的熔解曲线图，且箭头(1-1)所指的曲线为阳性对照品的溶解曲线，箭头(1-2)所指的曲线为阴性对照品的溶解曲线。图2为阳性对照品和阴性对照品的扩增曲线图，且箭头(2-1)所指的曲线为阳性对照品的扩增曲线，箭头(2-2)所指的曲线为阴性对照品的扩增曲线。图3为待测样品的溶解曲线图，且箭头(3-1)所指的曲线为病人样本的溶解曲线，箭头(3-2)所指的曲线为健康人样本的溶解曲线。图4为待测样品的扩增曲线图，且箭头(4-1)所指的曲线为病人样本的扩增曲线，箭头(4-2)所指的曲线为健康人样本的扩增曲线。图1和图3中的“RFU”表示Relative fluorescence units，即相对荧光单元；图2和图4中的“FLUORESCENCE”表示荧光值；图1～4的纵坐标为循环阈值。

表2多重荧光定量PCR反应的体系

(5)结果分析：

将待测样品与阳性对照品、阴性对照品的熔解曲线或扩增曲线进行比对。若待测样品的熔解曲线或扩增曲线与阳性对照品的熔解曲线或扩增曲线一致，则待测样品呈甲基化阳性；若待测样品的熔解曲线或扩增曲线与阴性对照品的熔解曲线或扩增曲线一致，则待测样品呈甲基化阴性。

从图1和图3可以看出，10例病人样本的溶解曲线几乎完全重叠，且与阳性对照品的溶解曲线一致，10例健康人的溶解曲线几乎完全重叠，且与阴性对照品的溶解曲线一致；从图2和图4可以看出，10例病人样本的扩增曲线几乎完全重叠，且与阳性对照品的扩增曲线一致，10例健康人的扩增曲线几乎完全重叠，且与阴性对照品的扩增曲线一致；说明上述10例病人样本均为甲基化阳性，10例健康人样本均为甲基化阴性，说明上述实施方式的检测甲基化的试剂盒的特异性较高，氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA聚合酶具有较好的保真性和较高的重复性，经计算，重复性高达99.9％。

实施例3

DNA聚合酶的高效性

对阳性对照品进行梯度稀释(即50ng、20ng、10ng、5ng、2ng和1ng)，得到对应浓度的阳性待测品。采用试剂盒1和试剂盒2分别对各梯度下的阳性待测品进行多重荧光定量PCR检测。同时采用试剂盒1和试剂盒2对actin基因进行多重荧光定量PCR检测。多重荧光定量PCR反应的体系和多重荧光定量PCR反应的反应条件均与实施例2相同。检测结果如图5。图5为试剂盒1对不同浓度的阳性对照品进行QPCR检测的扩增曲线对比图。图5中，“FLUORESCENCE”表示荧光值；图5的纵坐标为循环阈值；箭头(5-1)所指的曲线为DNA浓度为50ng的阳性待测品的扩增曲线；箭头(5-2)所指的曲线为DNA浓度为20ng的阳性待测品的扩增曲线；箭头(5-3)所指的曲线为DNA浓度为10ng的阳性待测品的扩增曲线；箭头(5-4)所指的曲线为DNA浓度为5ng的阳性待测品的扩增曲线；箭头(5-5)所指的曲线为DNA浓度为2ng的阳性待测品的扩增曲线；箭头(5-6)所指的曲线为DNA浓度为1ng的阳性待测品的扩增曲线。

从图5可以看出，当DNA模板浓度为50ng、20ng、10ng、5ng、2ng时都能够进行完整扩增；并且经检测，试剂盒2在DNA模板浓度为50ng、20ng、10ng时均能够进行完整扩增，当DNA模板浓度低至5ng时无法进行完整扩增；说明氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA聚合酶具有高效性，当待测样本中含有少量甲基化的LOC112268236基因也能够进行检测。

实施例4

(1)选取100例待测样本，包括50例确诊为非小细胞肺癌患者Ⅳ期的血液样本和50例健康人血液样本。

(2)参照实施例2的操作，采用天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取试剂盒并按照其操作说明提取待测样品中的DNA。

(3)按照实施例2的操作对待测样品中的DNA进行甲基化处理，得到待测DNA。同时，按照上述方式对actin基因进行亚硫酸盐处理，得到亚硫酸亚处理后的DNA，即为DNA模板。

(4)采用实施例1的试剂盒1、试剂盒2分别对待测DNA进行荧光定量PCR检测。同时采用上述各试剂盒对内参基因进行多重荧光定量PCR检测。反应体系和反应条件均参照实施例2。同时，采用对照试剂盒并按照对照试剂盒的操作说明对待测样品进行甲基化检测，对照试剂盒为深圳市新产业生物医学工程股份有限公司的ELISA(即酶联免疫吸附实验)检测试剂盒。测定结果详见表3。计算敏感度、特异性和假阳性：

灵敏度＝检测结果为阳性的肺癌样本数/总的肺癌样本数；

特异性＝检测结果为阴性的肺癌样本数/总的正常样本数；

假阳性率＝检测结果为假阳性的肺癌样本数/总的正常样本数。

表3 100例待测样本的检测结果

从表3可以看出，试剂盒1和试剂盒2的灵敏度和特异性在90％以上，均高于对照试剂盒，且试剂盒1和试剂盒2的假阳性率在10％以下，均％低于对照试剂盒，说明将LOC112268236基因作为生物标志物研发的检测试剂盒对非小细胞肺癌检测的灵敏度和特异性均较高，假阳性率较低，有利于肺癌的有效检测。其中，试剂盒1的灵敏度和特异性高于试剂盒2，而试剂盒1的假阳性率低于试剂盒2，说明氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA聚合酶更有利于提高检测的灵敏度和特异性，降低检测的假阳性率。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司

<120> LOC112268236基因的应用、检测甲基化的核酸组合物及其试剂盒和检测方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 228

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

gtcagcgaac atcgcctccc tctaccgctc aatcagcaaa agggaccgcc cttgaggacc 60

tcacccgccg ctcactcccc tcccaacttc gcgggcatcg cctccggtcg cctcttccga 120

aggcctaacg agcatgttag ctgcgaacgg aggtgaggag gctccgctga ctgaccggtg 180

cccacgtcca gggcacgcac aaacgccatg acttggcttg gcctctct 228

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcagcgaac atcgcctccc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agagaggcca agccaagtca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctccatcctg gcctcgctgt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctgtcacct tcaccgttcc 20

<210> 6

<211> 922

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu

1 5 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly

20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala

35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val

50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly

65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu

85 90 95

Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu

100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys

115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp

130 135 140

Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Ala Leu His Pro Glu Gly

145 150 155 160

Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn

180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu

195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu

210 215 220

Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys

225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val

245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe

260 265 270

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Lys Arg Trp Thr Ala Asp Val Glu Ala Gly

275 280 285

Lys Trp Leu Gln Ala Lys Gly Ala Lys Pro Ala Ala Lys Pro Gln Glu

290 295 300

Thr Ser Val Ala Asp Glu Ala Pro Glu Val Thr Ala Thr Val Ile Ser

305 310 315 320

Tyr Asp Asn Tyr Val Thr Ile Leu Asp Glu Glu Thr Leu Lys Ala Trp

325 330 335

Ile Ala Lys Leu Glu Lys Ala Pro Val Phe Ala Phe Asp Thr Glu Thr

340 345 350

Asp Ser Leu Asp Asn Ile Ser Ala Asn Leu Val Gly Leu Ser Phe Ala

355 360 365

Ile Glu Pro Gly Val Ala Ala Tyr Ile Pro Val Ala His Asp Tyr Leu

370 375 380

Asp Ala Pro Asp Gln Ile Ser Arg Glu Arg Ala Leu Glu Leu Leu Lys

385 390 395 400

Pro Leu Leu Glu Asp Glu Lys Ala Leu Lys Val Gly Gln Asn Leu Lys

405 410 415

Tyr Asp Arg Gly Ile Leu Ala Asn Tyr Gly Ile Glu Leu Arg Gly Ile

420 425 430

Ala Phe Asp Thr Met Leu Glu Ser Tyr Ile Leu Asn Ser Val Ala Gly

435 440 445

Arg His Asp Met Asp Ser Leu Ala Glu Arg Trp Leu Lys His Lys Thr

450 455 460

Ile Thr Phe Glu Glu Ile Ala Gly Lys Gly Lys Asn Gln Leu Thr Phe

465 470 475 480

Asn Gln Ile Ala Leu Glu Glu Ala Gly Arg Tyr Ala Gly Glu Arg Ala

485 490 495

Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu Trp Gly Arg Leu Glu Gly

500 505 510

Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu Val Glu Arg Pro Leu Ser

515 520 525

Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly Val Arg Leu Asp Val Ala

530 535 540

Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala Glu Glu Ile Ala Arg Leu

545 550 555 560

Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser

565 570 575

Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu Pro Ala

580 585 590

Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val

595 600 605

Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln

610 615 620

Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile Asp Pro Leu Pro

625 630 635 640

Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln

645 650 655

Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln

660 665 670

Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe

675 680 685

Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile

690 695 700

Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg

705 710 715 720

Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr Glu Thr Ala Ser Trp Met

725 730 735

Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala

740 745 750

Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu

755 760 765

Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu Ala Gln Ala Phe Ile Glu

770 775 780

Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr

785 790 795 800

Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg

805 810 815

Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu

820 825 830

Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala

835 840 845

Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu Phe Pro Arg Leu Glu Glu

850 855 860

Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Val Leu Glu

865 870 875 880

Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala Arg Leu Ala Lys Glu Val

885 890 895

Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly

900 905 910

Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu

915 920

<210> 7

<211> 228

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

gttagtgaat attgtttttt tttattgttt aattagtaaa agggattgtt tttgaggatt 60

ttatttgttg tttatttttt ttttaatttt gtgggtattg tttttggttg ttttttttga 120

aggtttaatg agtatgttag ttgtgaatgg aggtgaggag gttttgttga ttgattggtg 180

tttatgttta gggtatgtat aaatgttatg atttggtttg gttttttt 228

<210> 8

<211> 2899

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

ggagagacac tctcgagtgt gaaagaaaaa catgaggggg tgtgaggata aggcgacttt 60

aggacagaaa aaacaaagag acaaggaagc cacgtaaacg ttttcgggta ggcgtgaggc 120

gatgtcagtt ttgaaccccg tttatgttag gtagagagcg cagccctctt ctagcacaaa 180

caccgtttcc cacattgaag aaatcacaga gatcagcaac tctagagtgc gatgaagaag 240

cttcactctg ggagaacccc cttcgtgacc acggtctctt tcctgccagg taagtgggaa 300

tgagcgcatg ccctgcaggg acagcacagc gtcctcgccc tggtcggacg ctcagggtca 360

ccaccctacc cactgccccc ttcgccattc ttccaaacca ctctctgcca aagattccac 420

cgacagtcac cccacacgac aacgcaggcc gcctttcagc agtggctccc gccccgcaac 480

cacgcgccct ctcacccccg cggttctgcc cgccgcctct gtccagtctg tgcacttcac 540

ctccctggct cccgctctcc cctgagctta cagtggacgc ggggttcttc caaacccctc 600

ttgggaatac tgaatggaaa agggggagcg tgcgcaagtg cttggtagag tgtagacatt 660

gtgggatttg actgtggtac catcgctttg acgtcctagt gctgattttt acacctgcat 720

tctgcttagg gcactggcaa cagttttccg tttgtgccta ctccacctgc tgtctttgtt 780

gggtcagcga acatcgcctc cctctaccgc tcaatcagca aaagggaccg cccttgagga 840

cctcacccgc cgctcactcc cctcccaact tcgcgggcat cgcctccggt cgcctcttcc 900

gaaggcctaa cgagcatgtt agctgcgaac ggaggtgagg aggctccgct gactgaccgg 960

tgcccacgtc cagggcacgc acaaacgcca tgacttggct tggcctctct cttagttatt 1020

cacagctcag cccgataggc acctctgggg cggcgacggc aaagagggtg cgcttattaa 1080

gtgcagctcc acggggactg gcctctctgc acggctgtgt acacctgagc gagacgctca 1140

gtcgctctct aaagccgctt ctgcggatga cagacacgga gataaacgtg agaggtggcc 1200

caccacgact tgccctcctt tgcccgggtt tgcccctcgc tgcggaggct gttctacatc 1260

tggcccttgg agcaggccgg ctgacagcgt ggtaaaggaa gatttctgcg ggagggcggc 1320

cagtgcaaaa caattccctg accgggaatc gaacccgggc cgtggcgctt tcagcaccga 1380

atcctagcca ctagacaacc atgcagatgc ggaaagctgc tttctctccc ttcttcgacc 1440

tgaagcgaca ctttcctgtg ctctaggagg acttgggtct tgtgagagtc gccctttgct 1500

cctggagtcg tctcacaagg ccgttcactc cctgctttct tcaaaaaaag aacctgcagg 1560

cgacacacca aggactccac gagggagtcc tgagtactgg agcgagttgc ggccacgcgg 1620

ccgcagctca ccactggcct agagatgccc tttgcgaggc ggcagcaact gacaagatgg 1680

tcgcgggtcg ccgggtccgg agccgcccac caggttgcca ggaggaggcg ggagcgggga 1740

ggcgcccgag gtgagacagg ggcaccctct gcatcataaa ggacccagac cccggcaccc 1800

tcaacatcat aaggaatcag acggatgcgg aaaccgagac gggctggata ggaaactctt 1860

tccaggaagg ctccggggca ctcaactggt ctccaacctt cccctgcaac ctgtgacgcc 1920

tgccattttc ccattttagg cgatggcaac gcaacccctc cgtttgctct gggcaaaact 1980

tcgagagttc cctctgaagc tggagctttt tcctcagatc caagatccaa ttggtcacca 2040

attcgtgatt tccgtcggcc aagtgcgtgg gcattgatct acacgcgagt ttctccacct 2100

ctgccgaatg gctacttcgg ggtgggggag gggccctccc gccgtggatt gcaaggtgtt 2160

tagcagcatc tgtctcctcc gctgactaga cacatgccag ggggataaca ttctccctcc 2220

cgcttccccc agccgcggcc tagtgtccca gcggggttgg gagaggcatg tgagggcgaa 2280

gttgccccct gttgagaacc attgctgcgc gtagtccttc tctctgaact tgtgcagagg 2340

actctccagg tgaaggctca agggtggatc cagctcgaga caccctcgct ccccctcaca 2400

gtcggacctt aggatttagg ctttaacatc tccacatcat gagattcgaa acctttaggt 2460

cttgtcttcc gttctgtcct ccaaatcggc ctcttccgag cctgttgacc agggccagcc 2520

gggcagaggg ctgggctcgc tcaacgaggc tcctctcgca cctcctggag cttcaggctt 2580

ctttccgttg cagagaagct ttatgggcca attcgttcgg catccccggg ggcaggtgcg 2640

cggtgcgcgg ggaagaagag gatttgactg cggttctcca cccccggcgc ccaacctcca 2700

ccccggtgcg cgcgctcttc caggctcctg ctggtcccac ttgccaggag ttaggtctca 2760

ggtcagcctg agctcctgag acgcccaggc ccggaaagac acgtagggga aaccatctgc 2820

tcacttctgt cctgtccgga agggatccct ttctgacggg aaagaaaggc ggtgagtcct 2880

gtcctgttga gtaggcgga 2899

Claims (10)

1.检测LOC112268236基因启动子的甲基化状态或甲基化程度的试剂在制备检测非小细胞肺癌的试剂、试剂盒或装置中的应用，所述LOC112268236基因启动子的序列如SEQ IDNo.1所示。

2.一种检测甲基化的核酸组合物，其特征在于，包括检测扩增引物对，所述检测扩增引物对用于扩增LOC112268236基因启动子，所述LOC112268236基因启动子的序列如SEQ IDNo.1所示。

3.根据权利要求2所述的检测甲基化的核酸组合物，其特征在于，所述检测扩增引物对的序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

4.根据权利要求2所述的检测甲基化的核酸组合物，其特征在于，还包括内参扩增引物对，所述内参扩增引物对用于扩增甲基化的内参基因，所述内参基因选自U6基因、GAPDH基因及actin基因中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的检测甲基化的核酸组合物，其特征在于，所述内参扩增引物对的序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示。

6.一种检测甲基化的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2～5任一项所述的检测甲基化的核酸组合物。

7.根据权利要求6所述检测甲基化的试剂盒，其特征在于，还包括DNA聚合酶，所述DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

8.根据权利要求6所述的检测甲基化的试剂盒，其特征在于，还包括DNA提取试剂、亚硫酸盐转化试剂、dNTPs、PCR反应液、Mg²⁺试剂、荧光染料、阳性对照品、阴性对照品中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的检测甲基化的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品含有序列如SEQ ID No.1所示的核酸；

及/或，所述阴性对照品含有序列如SEQ ID No.7所示的核酸。

10.一种非诊断目的的甲基化的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

提取待测样本中的核酸；

对所述核酸进行亚硫酸盐处理；及

采用权利要求6～9任一项所述的检测甲基化试剂盒对亚硫酸盐处理后的所述核酸进行荧光定量PCR扩增反应，根据反应结果进行检测分析。

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