CN108866199A - 一种用于乳腺癌诊断mRNA标志物及其检测试剂盒与应用 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种用于乳腺癌诊断mRNA标志物及其检测试剂盒与应用，2种mRNA可鉴别乳腺癌和健康对照，SMAD2、BAMBI的AUC分别为0.8032、0.7715。SMAD2的敏感性和特异性分别为69.12％和84.62，BAMBI的敏感性和特异性为88.24％和69.23％。将两种mRNA联合(SMAD2+BAMBI)后，曲线下面积增至0.8880，敏感性、特异性分别为88.24％、84.62％。

Description

一种用于乳腺癌诊断mRNA标志物及其检测试剂盒与应用

技术领域

本公开属于生物医学领域，具体涉及一种用于乳腺癌诊断mRNA标志物及其检测试剂盒与应用。

背景技术

这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，在我国占全身恶性肿瘤的7～10％，临床及实验研究发现，在其发生、发展过程中，许多相关基因、蛋白质及细胞因子发生改变，目前关于利用各种生物标志物如组织蛋白、核酸和血浆蛋白，进行乳腺癌早期检测的研究，但其真正的临床应用都很有限。因此，寻找特异性强、灵敏度高、稳定性好、操作方便的生物学指标对乳腺癌临床诊断及治疗具有重要的意义。

mRNA是由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息的能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。有研究证实，与传统的肿瘤相关抗原等检测相比，一些mRNA检测敏感性高、特异性强，为基因水平检测。因此作为潜在的疾病诊断指标显示出良好应用前景。

发明内容

针对以上背景技术，本发明人提供新的用于诊断乳腺癌的mRNA标志物以及用于诊断乳腺癌的相关产品和应用。

本公开采用以下技术方案：

在本公开的第一个方面，提供SMAD2和/或BAMBI作为乳腺癌诊断标志物在制备用于诊断乳腺癌产品和中的应用。

在本公开的第二个方面，提供检测血液中的SMAD2和/或BAMBI的试剂盒或基因芯片在制备用于诊断乳腺癌产品中的应用。

在本公开的第三个方面，提供一种用于诊断乳腺癌的产品，该产品能够通过检测血液中的SMAD2和/或BAMBI表达水平来诊断乳腺癌，高通量检测结果显示SMAD2和/或BAMBI在乳腺癌组表达较正常人显著降低。

在本公开的第四个方面，提供SMAD2和/或BAMBI在制备治疗乳腺癌药物中的应用。

在本公开的第五个方面，提供一种用于鉴定乳腺癌激动剂的方法，所述方法包括鉴定血液中SMAD2和/或BAMBI的表达水平的物质。

与本发明人知晓的相关技术相比，本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：

目前为止，尚未见乳腺癌全血中SMAD2、BAMBI作为标记物的报道。本公开的主要创新点：(1)样本为全血，而非血清血浆或组织细胞；(2)前人有探索SMAD2、BAMBI在乳腺癌中异常表达、作用及机制，而未涉及乳腺癌全血中SMAD2、BAMBI作为标记物的报道。

2种mRNA可鉴别乳腺癌和健康对照，SMAD2、BAMBI的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.8032、0.7715。SMAD2的敏感性和特异性分别为69.12％和84.62，BAMBI的敏感性和特异性为88.24％和69.23％。

将两种mRNA联合(SMAD2+BAMBI)后，曲线下面积增至0.8880，敏感性、特异性分别为88.24％、84.62％。

本公开的乳腺癌mRNA组合的诊断检测试剂盒，其包括RNA提取、反转录、PCR相关试剂，标志物SMAD2、BAMBI和内参GAPDH特异性的正、反向引物。本检测试剂盒可通过RT-PCR技术检测SMAD2、BAMBI在健康对照和乳腺癌患者全血中的表达量，发现差异的效果显著，特异区分健康对照及乳腺癌的效果良好；该乳腺癌mRNA组合的检测特异性和灵敏度高、操作简单、取材方便、安全无创伤及易于大量筛查的特点。

附图说明

构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1：2种mRNA在乳腺癌患者及健康对照全血中进行实时定量PCR验证。

图2：单个mRNA及2个mRNA联合的ROC曲线图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，进一步开发较高灵敏度和特异性的检测乳腺癌的新型非侵入性生物标志物非常重要和紧迫。

有鉴于此，在本公开一个或一些典型的实施方式中，提供一种血液中用于诊断乳腺癌的标志物，所述标志物为mRNA：SMAD2和/或BAMBI。

与健康对照组相比，发现全血中2种mRNA(SMAD2和/或BAMBI)的含量在乳腺癌患者全血中降低。尤其是两者作为联合标志物时，具有较高的敏感性和特异性。

SMAD2和BAMBI的序列信息分别如SEQ ID NO.1和2所示。

具体如下，SMAD2CDS区序列(SEQ ID NO.1)：

atggacacaggctctccagcagaactatctcctactactctttcccctgttaatcatagcttggatttacagccagttacttactcagaacctgcattttggtgttcgatagcatattatgaattaaatcagagggttggagaaaccttccatgcatcacagccctcactcactgtagatggctttacagacccatcaaattcagagaggttctgcttaggtttactctccaatgttaaccgaaatgccacggtagaaatgacaagaaggcatataggaagaggagtgcgcttatactacataggtggggaagtttttgctgagtgcctaagtgatagtgcaatctttgtgcagagccccaattgtaatcagagatatggctggcaccctgcaacagtgtgtaaaattccaccaggctgtaatctgaagatcttcaacaaccaggaatttgctgctcttctggctcagtctgttaatcagggttttgaagccgtctatcagctaactagaatgtgcaccataagaatgagttttgtgaaagggtggggagcagaataccgaaggcagacggtaacaagtactccttgctggattgaacttcatctgaatggacctctacagtggttggacaaagtattaactcagatgggatccccttcagtgcgttgctcaagcatgtcataa。

BAMBI CDS区序列(SEQ ID NO.2)：

atggatcgccactccagctacatcttcatctggctgcagctggagctctgcgccatggccgtgctgctcaccaaaggtgaaattcgatgctactgtgatgctgcccactgtgtagccactggttatatgtgtaaatctgagctcagcgcctgcttctctagacttcttgatcctcagaactcaaattccccactcacccatggctgcctggactctcttgcaagcacgacagacatctgccaagccaaacaggcccgaaaccactctggcaccaccatacccacattggaatgctgtcatgaagacatgtgcaattacagagggctgcacgatgttctctctcctcccaggggtgaggcctcaggacaaggaaacaggtatcagcatgatggtagcagaaaccttatcaccaaggtgcaggagctgacttcttccaaagagttgtggttccgggcagcggtcattgccgtgcccattgctggagggctgattttagtgttgcttattatgttggccctgaggatgcttcgaagtgaaaataagaggctgcaggatcagcggcaacagatgctctcccgtttgcactacagctttcacggacaccattccaaaaaggggcaggttgcaaagttagacttggaatgcatggtgccggtcagtgggcacgagaactgctgtctgacctgtgataaaatgagacaagcagacctcagcaacgataagatcctctcgcttgttcactggggcatgtacagtgggcacgggaagctggaattcgtatga。

在本公开的一个或一些典型的实施方式中，提供血液中的SMAD2和/或BAMBI作为乳腺癌诊断标志物在制备用于诊断乳腺癌产品中的应用。

在本公开的一个或一些典型的实施方式中，提供检测SMAD2和/或BAMBI的试剂盒或基因芯片在制备用于诊断乳腺癌产品中的应用。

在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述试剂盒至少包括：针对SMAD2的正向引物5'-GTTCCTGCCTTTGCTGAGAC-3'和反向引物5'-CTTATCTCCCCTGGCTCCTC-3'、针对BAMBI的正向引物5'-TGCTGGACAGGAGCACTTTA-3'和反向引物5'-TGCAAATAACCCTGGTGACA-3'其中的一种。

本公开筛选得到的上述引物，能够高效特异性扩增SMAD2和/或BAMBI基因，检测特异性好和灵敏度高。

在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述基因芯片至少包括与SMAD2和/或BAMBI的核酸序列杂交的探针。

在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述产品能够通过检测血液中SMAD2和/或BAMBI的表达水平来诊断患者是否患有乳腺癌，SMAD2和/或BAMBI低表达与乳腺癌的发生发展相关。

在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述检测血液中SMAD2和/或BAMBI的表达水平的产品包括：

通过实时定量PCR、RT-PCR、原位杂交、基因芯片或基因测序检测的SMAD2和/或BAMBI至少一种表达水平以诊断乳腺癌的产品。

在本公开的一个或一些典型的实施方式中，提供一种用于诊断乳腺癌的产品，该产品能够通过检测血液中的SMAD2和/或BAMBI表达水平来诊断乳腺癌，高通量检测结果显示SMAD2和/或BAMBI在乳腺癌组表达较正常人显著降低。

在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述产品为芯片或检测试剂盒。

进一步的，所述检测试剂盒，检测体系包括反转录反应体系和qPCR反应体系，所述检测试剂盒包括用于配制反转录反应体系的试剂和用于配制qPCR反应体系的试剂。

更进一步的，用于配制反转录反应体系的试剂至少包括反转录缓冲液、dNTP混合液、RNA酶抑制剂和反转录酶液等。

更进一步的，用于配制qPCR反应体系的试剂至少包括针对SMAD2和/或BAMBI的正向引物液和反向引物液，还包括针对内参基因的正向引物和反向引物，SYBR Green混合液、无核酸酶纯水等。

本公开的检测试剂盒选择了SMAD2和BAMBI两个分子标记物进行组合，检测快速方便、检测特异性好、灵敏度高、成本低廉。

进一步的，所述芯片至少包括一种与SMAD2和/或BAMBI的核酸序列杂交的探针。

在本公开的一个或一些典型的实施方式中，提供SMAD2和/或BAMBI在制备治疗乳腺癌药物中的应用。

在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述药物为SMAD2和/或BAMBI的激动剂，所述SMAD2和/或BAMBI的激动剂是指能够提高SMAD2和/或BAMBI表达水平的产品，该产品包括：SMAD2和/或BAMBI过表达载体、SMAD2和/或BAMBI转录激活型Cas9-VP64-sgRNA共表达载体和提高SMAD2和/或BAMBI表达水平的化合物、组合物或试剂等。其中，SMAD2和/或BAMBI过表达载体(例如慢病毒表达载体、腺病毒表达载体)和转录激活型Cas9-VP64-sgRNA共表达载体已经商业化，也可通过常规的技术手段制备得到。

在本公开的一个或一些典型的实施方式中，提供一种用于鉴定乳腺癌激动剂的方法，所述方法包括鉴定血液中SMAD2和/或BAMBI的表达水平的物质。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

一种用于诊断乳腺癌的检测试剂盒，所述检测试剂盒，检测体系包括反转录反应体系和qPCR反应体系，所述检测试剂盒包括用于配制反转录反应体系的试剂和用于配制qPCR反应体系的试剂。

用于配制反转录反应体系的试剂至少包括反转录缓冲液、dNTP混合液、RNA酶抑制剂和反转录酶液等。

用于配制qPCR反应体系的试剂至少包括针对SMAD2和/或BAMBI的正向引物液和反向引物液，还包括针对内参基因的正向引物和反向引物，SYBR Green混合液、无核酸酶纯水等，相关引物序列见表1。

实施例2

(1)临床样本

2016年6月27日至2017年8月30日，于山东大学齐鲁医院招募了68名乳腺癌患者和13名健康对照者的外周血。所有患者和对照组均为汉族女性。

收集空腹静脉全血(2ml)，并将未处理的全血样品立即储存在液氮中直至进一步分析。所有乳腺癌血样均在手术或任何治疗之前收集。对照组样品收集于过去或现在均无恶性病史或炎症的健康女性。所有参与者均获得书面知情同意书。本研究经山东大学齐鲁医院伦理委员会批准。

(2)RNA抽提

取出全血样品，解冻后取250ul全血液体，转至1.5ml的离心管中，加入750μl的TRIzol LS Reagent试剂和20μl冰醋酸，手动剧烈振荡管体至混匀。匀浆后样品于15到30℃孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每750μl的TRIzol LS Reagent试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12,000×g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的体积大约使匀浆时加入的TRIzol LS Reagent的60％。将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1ml TRIZOL试剂的此时加0.5ml的异丙醇。混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃ 12,000×g离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。移去上清液，每1ml TRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃ 7,500×g离心5分钟。去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，切勿真空离心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA样品A260/280比值将小于1.6。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟。获得的RNA溶液保存于-70℃。

(3)cDNA合成

a.配制退火混合物

混合液在65℃水浴5分钟,冰上放置2分钟。

b.短暂离心后，在离心管中依次加入RT反应液

混合后37℃恒温1分钟。

c.移液枪轻轻吸打几次混合均匀。

d.50℃温育60分钟。

e.70℃温育15分钟使酶失活。

f.cDNA置冰浴待用或-20℃保存。

(4)实时定量PCR

a.将所有cDNA样品分别配置Realtime PCR反应体系。体系配置如下：

轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心。

b.加样：将8ul混合液加到384-PCR板对应的每个孔中。再加入对应的2μl cDNA。小心粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合。在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。

c.将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。所有的指标均按以下程序进行：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)；并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/秒)。

d.GAPDH做为内参将mRNA表达进行标准化，并使用2^-△△Ct法计算。

表1引物序列

(5)统计分析

使用GraphPad Prism 5(San Diego，CA)进行统计学分析。t检验用于分析两组之间的差异。受试者工作特征曲线(ROC)分析用于确定mRNA的诊断价值。双尾P<0.05被认为具有统计学意义。

(6)结果

乳腺癌与健康对照相比血液中2种mRNA表达下调：

实时定量PCR数据显示，与健康对照相比，2种mRNA(SMAD2、BAMBI)在乳腺癌患者血中显著下调(图1，P<0.05)。

差异表达的mRNA的诊断价值：

使用ROC曲线分析并计算受试者工作特征曲线下面积(AUC)来检测差异表达的mRNA的诊断性能。结果显示，2种mRNA可鉴别乳腺癌和健康对照，SMAD2、BAMBI的AUC分别为0.8032、0.7715(图2)。SMAD2的敏感性和特异性分别为69.12％和84.62，BAMBI的敏感性和特异性为88.24％和69.23％。

将两种mRNA联合(SMAD2+BAMBI，即SMAD2的表达量与BAMBI的表达量线性相加，所得数值作为一个新的变量)后，曲线下面积增至0.8880，敏感性、特异性分别为88.24％、84.62％(图2)。

上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学齐鲁医院

<120> 一种用于乳腺癌诊断mRNA标志物及其检测试剂盒与应用

<130> 2018

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 684

<212> DNA

<213> SMAD2 CDS区序列

<400> 1

atggacacag gctctccagc agaactatct cctactactc tttcccctgt taatcatagc 60

ttggatttac agccagttac ttactcagaa cctgcatttt ggtgttcgat agcatattat 120

gaattaaatc agagggttgg agaaaccttc catgcatcac agccctcact cactgtagat 180

ggctttacag acccatcaaa ttcagagagg ttctgcttag gtttactctc caatgttaac 240

cgaaatgcca cggtagaaat gacaagaagg catataggaa gaggagtgcg cttatactac 300

ataggtgggg aagtttttgc tgagtgccta agtgatagtg caatctttgt gcagagcccc 360

aattgtaatc agagatatgg ctggcaccct gcaacagtgt gtaaaattcc accaggctgt 420

aatctgaaga tcttcaacaa ccaggaattt gctgctcttc tggctcagtc tgttaatcag 480

ggttttgaag ccgtctatca gctaactaga atgtgcacca taagaatgag ttttgtgaaa 540

gggtggggag cagaataccg aaggcagacg gtaacaagta ctccttgctg gattgaactt 600

catctgaatg gacctctaca gtggttggac aaagtattaa ctcagatggg atccccttca 660

gtgcgttgct caagcatgtc ataa 684

<210> 2

<211> 783

<212> DNA

<213> BAMBI CDS区序列

<400> 2

atggatcgcc actccagcta catcttcatc tggctgcagc tggagctctg cgccatggcc 60

gtgctgctca ccaaaggtga aattcgatgc tactgtgatg ctgcccactg tgtagccact 120

ggttatatgt gtaaatctga gctcagcgcc tgcttctcta gacttcttga tcctcagaac 180

tcaaattccc cactcaccca tggctgcctg gactctcttg caagcacgac agacatctgc 240

caagccaaac aggcccgaaa ccactctggc accaccatac ccacattgga atgctgtcat 300

gaagacatgt gcaattacag agggctgcac gatgttctct ctcctcccag gggtgaggcc 360

tcaggacaag gaaacaggta tcagcatgat ggtagcagaa accttatcac caaggtgcag 420

gagctgactt cttccaaaga gttgtggttc cgggcagcgg tcattgccgt gcccattgct 480

ggagggctga ttttagtgtt gcttattatg ttggccctga ggatgcttcg aagtgaaaat 540

aagaggctgc aggatcagcg gcaacagatg ctctcccgtt tgcactacag ctttcacgga 600

caccattcca aaaaggggca ggttgcaaag ttagacttgg aatgcatggt gccggtcagt 660

gggcacgaga actgctgtct gacctgtgat aaaatgagac aagcagacct cagcaacgat 720

aagatcctct cgcttgttca ctggggcatg tacagtgggc acgggaagct ggaattcgta 780

tga 783

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gttgaaagta gcccgagcag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgtggcaca gacctctctc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agatgcaagt ggaccaggag 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gatgcactgg acacactgaa a 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggcctccaag gagtaagacc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aggggagatt cagtgtggtg 20

Claims (10)

1.血液中的SMAD2和/或BAMBI作为乳腺癌诊断标志物在制备用于诊断乳腺癌产品中的应用。

2.检测SMAD2和/或BAMBI的试剂盒或基因芯片在制备用于诊断乳腺癌产品中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征是，所述试剂盒至少包括：所述试剂盒至少包括：针对SMAD2的正向引物5'-GTTCCTGCCTTTGCTGAGAC-3'和反向引物5'-CTTATCTCCCCTGGCTCCTC-3'、针对BAMBI的正向引物5'-TGCTGGACAGGAGCACTTTA-3'和反向引物5'-TGCAAATAACCCTGGTGACA-3'其中的一种；所述基因芯片至少包括与SMAD2和/或BAMBI中的一种或多种的核酸序列杂交的探针。

4.如权利要求2所述的应用，其特征是：所述产品能够通过检测血液中SMAD2和/或BAMBI至少一种的表达水平来诊断患者是否患有乳腺癌。

5.如权利要求2所述的应用，其特征是：检测血液中SMAD2和/或BAMBI至少一种的表达水平的产品包括：

通过实时定量PCR、RT-PCR、原位杂交、基因芯片或基因测序检测的SMAD2和/或BAMBI表达水平以诊断乳腺癌的产品。

6.一种用于诊断乳腺癌的产品，该产品能够通过检测血液中的SMAD2和/或BAMBI表达水平来诊断乳腺癌。

7.如权利要求6所述的产品，其特征是：所述产品为芯片或检测试剂盒。

8.如权利要求7所述的产品，其特征是：所述检测试剂盒，检测体系包括反转录反应体系和qPCR反应体系，所述检测试剂盒包括用于配制反转录反应体系的试剂和用于配制qPCR反应体系的试剂。

9.cSMAD2和/或BAMBI在制备治疗乳腺癌药物中的应用，其特征是：所述药物为SMAD2和/或BAMBI的激动剂。

10.一种用于鉴定乳腺癌激动剂的方法，其特征是：所述方法包括鉴定血液中SMAD2和/或BAMBI的表达水平的物质。