CN107523647A - 检测早期食管癌预后情况的LncRNA组合及含有该组合的试剂盒 - Google Patents

检测早期食管癌预后情况的LncRNA组合及含有该组合的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测早期食管癌预后情况的LncRNA组合及含有该组合的试剂盒，本发明利用荧光定量PCR鉴定食管癌病人样本(样本可以是组织/血浆血清等)及对应的癌旁组织/参考样本中一组LncRNA表达量的差异变化，及早准确评估食管癌复发或转移的风险。本发明的试剂盒可对早期食管癌转移潜能进行准确检测，从而能对术后食管癌患者转移或复发风险进行准确的预测和评估，对高风险患者进行重点监测和有效干预，减少食管癌的复发或转移，进一步改善患者预后。本发明采用一组预后不良相关的lncRNA组合，避免仅采用单一lncRNA作为肿瘤标志物试剂盒引起的敏感度和特异度较低而导致食管癌诊断的错诊率和漏诊率大大增加的缺陷。

Description

检测早期食管癌预后情况的LncRNA组合及含有该组合的试 剂盒
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及检测早期食管癌预后情况的LncRNA组合及含有该组合的试剂盒。
背景技术
食管癌是常见的消化道恶性肿瘤。主要有两种病理类型：食管鳞状细胞癌(ESCC)和食管腺癌(EAC)，在西方国家主要以腺癌为主，在我国95％以上以鳞癌为主，占据我国癌症死因第四位。ESCC发病是一个多因素、多基因、多步骤相互叠加的复杂过程，具有高度侵袭性，晚期ESCC治疗后的总体生存率仅 15%～20%，而早期ESCC术后5年生存率可达到80%以上。早期ESCC临床症状不典型，多依赖内镜下组织活检明确诊断，但受内镜操作、病变组织范围小等因素影响，活检取材仍有可能难以抓取到足够的肿瘤组织明确病理类型，导致假阴性结果而漏诊，出现部分患者早期淋巴结转移和局部复发，显示出较差的预后。因此，有必要探寻更敏感的组织诊断标志物，与组织学检查一起，在早发现的基础上尽早干预，提高患者ESCC转移和复发的诊断率，减少不良预后。
肿瘤异质性包括时间和空间的异质性：同一肿瘤的不同区域，同种肿瘤的不同患者以及同一患者的不同治疗阶段，肿瘤均存在不同的生物学特征。由于恶性肿瘤异质性存在，使肿瘤组织内部出现不同亚型的肿瘤细胞株，导致肿瘤在演进过程中的高度复杂性和多样性，其差异可使患者对化学药物敏感性或对放疗敏感性存在差异；此外也会使肿瘤的浸润和转移、生长速度、侵袭能力等表型方面存在差异。肿瘤异质性的存在往往给肿瘤的个体化诊断和治疗带来极大的困难。由于检测标记物在肿瘤中异质性表达，目前大多数研究专注于单因素研究模式，仅探索一个或某几个基因与预后的相关性，不能全面地反映早期食管鳞癌准确的分子生物学特征，难以反映复杂转移过程，可能导致对病情进展了解不全面，这也是现今肿瘤精准治疗的不够理想的主要原因。肿瘤异质性的发生机制虽未完全阐明，但基因不稳定性所起的作用则无庸置疑。基因检测作为研究热点，其在肿瘤的发生、发展、转移及预后等判断方面具有一定的优势。目前，国内外关于ESCC发病机制的研究已在编码蛋白的基因mRNA、蛋白质以及非编码RNA领域取得了一系列成果。过去几十年，人们大多把注意力集中在编码蛋白的基因上，但编码蛋白的基因仅占基因组序列的2%，随着非编码RNA 作为肿瘤标志物的出现，提示在肿瘤发生发展过程中，非编码 RNA 比受体、蛋白等出现得更早，而这对肿瘤的诊断尤为重要。近年来，随着分子生物学的发展，全基因组测序分析发现越来越多的长链非编码RNAs (Long noncoding RNAs，lncRNAs) 其致癌和抑癌作用在肿瘤的发生、发展、浸润转移以及对化疗的敏感性等多个过程中显示出的独特的生物学功能。
lncRNA作为新型的肿瘤标志物用于肿瘤辅助诊断和预后判断指标已被广泛报道。事实上IncRNA的功能和它们的丰度之间可能存在一定的关联。lncRNA与食管鳞癌的发生发展有着密切的关系，可以在组织中稳定存在并被检测，符合临床标志物的要求。已有发明申请号CN201410118190.7、申请号CN201410118222.3和申请号CN201410118211.5只采用单个lncRNA作为诊断标记物，通过芯片和RT-qPCR验证了芯片结果，分析得知这几条lncRNA在食管鳞癌中表达上调，可作为预后指标和药物靶点，但并没有进一步说明与转移复发是否相关。随着对肿瘤异质性的深入研究，上述几种方案也已无法避免肿瘤异质性可能带来的误诊，影响对病程的判断。此外，申请号CN201611222527.4 选取与食管鳞癌相关的32个蛋白编码基因标志物BCL-2，BIRC5(survivin)，STAT3等作为诊断标记物，据本专利作者先前文章综述：相关的32个基因标记物可能作为下游靶基因被部分lncRNA调控，且32个基因共同检测，检测过程相对繁琐，增加成本。由于IncRNA缺乏蛋白质的编码能力，因此更适合作为生物标志物。因此，在目前循证医学的时代背景下，本发明通过文献查阅，纳入全部出自中国的食管鳞癌临床研究报道，并对研究数据筛选验证出与食管鳞癌转移或不良预后相关的10条lncRNA，并建立区分早期食管鳞癌患者预后情况的诊断试剂盒，该试剂盒针对中国大陆患者的食管癌临床的研究数据，可以从转录水平全面提高对中国大陆患者食管鳞癌预后复发及转移预测的准确度。
鉴于目前对食管鳞癌预后诊断及治疗不全面的现状。本发明在转录水平上检测生物标志物的表达水平，增加检测标记物，避免肿瘤异质性带来的误诊，对食管鳞癌预后诊断和治疗具有重要的临床指导意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述问题，提供一种增加检测标记物、提高检测准确度、减少误诊率的预测中国大陆早期食管癌预后情况的LncRNA组合及含有该组合的试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供了检测早期食管癌预后情况的LncRNA组合，包括LOC285194、AFAP1-AS1、UCA1、BANCR、MALAT1、ZEB1-AS1、HOTAIR、PCAT-1、NEAT1、CCAT2分子中的一条或多条。
优选的，所述LncRNA组合包括AFAP1-AS1、UCA1、BANCR、MALAT1、ZEB1-AS1、HOTAIR、PCAT-1、NEAT1、CCAT2分子中的一条或多条表达上调，且表达差异高于参考范围，提示lncRNA在食管癌中呈高表达并与食管癌患者的预后呈负相关，高表达提示患者的生存期（OS）可能较短，是ESCC预后的危险因素，说明食管癌患者预后不良，可能复发或转移（见表3）。
优选的，所述LncRNA组合包括LOC285194分子表达下调， 且表达差异低于参考范围，提示lncRNA在食管癌中呈低表达并与食管癌患者的预后呈正相关，低表达提示患者的生存期可能较短，是ESCC预后的危险因素，说明食管癌患者预后不良，可能复发或转移（见表3）。
检测食管癌预后情况的方法，包含以下步骤：
1）测定离体样本中异常表达的LncRNA表达水平；
2）比较被测定离体样本中与参考样本/配对的癌旁组织中的LncRNA 分子是否存在差异表达，表达差异与食管癌患者预后复发或转移具有相关性。
优选的，所述方法采用PCR扩增法。
优选的，步骤2）中所述差异表达的主要分析对象包括患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、组织分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期及5年生存率等临床病理特征（见表2）。
优选的，所述食管癌患者预后不良相关的lncRNA组合的参考范围见表5。
优选的，所述的食管癌离体样本是食管癌组织样本或血液/血浆。
用于检测早期食管癌预后情况的试剂盒，包含用于检测上述lncRNA组合在组织中或血液/血浆中的表达量高低的组分。
优选的，所述组分包括RNA提取系统、逆转录试剂及PCR扩增试剂。
优选的，所述RNA提取系统包括裂解液、RNA吸附柱和RNA漂洗液。
优选的，所述逆转录试剂为5× iScript Reaction Mix、iScript ReverseTranscriptase和DEPC水。
优选的，所述试剂盒包括特异性扩增用于检测所述LOC285194、AFAP1-AS1、UCA1、BANCR、MALAT1、ZEB1-AS1、HOTAIR、PCAT-1、NEAT1、CCAT2的上下游引物序列以及内参GAPDH的上下游引物序列。
优选的，所述试剂盒还含有60例食管癌组织样本提取的总RNA混合后，逆转录并稀释的cDNA，作为检测所述引物序列的可行性的阳性模板和健康人癌旁组织样本提取的总RNA，逆转录并稀释的cDNA的阴性模板。
优选的，所述PCR扩增试剂为5× FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)和DEPC水。
优选的，通过检测lncRNA组合可对食管癌预后不良起到提前预警作用，患者所在区域为中国大陆，即检测对象限制为中国大陆居民。
通过检测lncRNA组合可对食管癌预后不良起到提前预警作用，临床医生能判断食管癌对治疗的反应，预测食管癌预后不良的风险，通过及时监测，早期发现，提高患者的生存率。
本发明中所述食管癌为食管鳞状细胞癌。
本发明采用了食管鳞癌预后相关异常表达lncRNAs组合，有上调分子和下调分子可避免因肿瘤异质性（同一个体/不同个体）或单一lncRNA导致食管癌诊断的错诊率和漏诊率的缺陷，可有效提高早期食管鳞癌复发和转移的检测准确率。
lncRNA组合与ESCC预后的关系，见表3：
loc285194低表达与患者的预后正相关，是ESCC患者预后不良的危险因素；loc285194低表达与肿瘤大小，TNM分期，淋巴结转移和远处转移显著负相关，与患者年龄性别，年龄，肿瘤位置无关；loc285194低表达提示患者的生存期可能较短。
UCA1高表达与患者的预后负相关，是ESCC患者预后不良的危险因素；UCA1高表达与肿瘤分级，淋巴转移,临床分期，显著正相关，与患者年龄性别，肿瘤位置无关；UCA1高表达提示患者的生存期可能较短。
ZEB1-AS1高表达与患者的预后负相关，是ESCC患者预后不良的危险因素；ZEB1-AS1高表达与肿瘤分级、浸润深度、淋巴转移显著正相关、与患者年龄性别、肿瘤大小、位置无关；ZEB1-AS1高表达提示患者的生存期可能较短。
BANCR高表达与患者的预后负相关，是ESCC患者预后不良的危险因素；BANCR高表达与组织学分级、TNM分期及淋巴结转移显著正相关、与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置无关；高表达BANCR提示患者的生存期可能较短。
MALAT1高表达与患者的预后负相关，是ESCC患者预后不良的危险因素； MALAT1高表达与淋巴结转移、远处转移显著正相关，与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置无关；高表达MALAT1提示患者的生存期可能较短。
AFAP1-AS1高表达与患者的预后负相关， 是ESCC患者预后不良的危险因素；AFAP1-AS1高表达与肿瘤分级、浸润深度、TNM分期、淋巴转移显著正相关，与患者年龄、性别、组织学分级、肿瘤大小、位置、吸烟、饮酒等无关；高表达AFAP1-AS1提示患者的生存期可能较短。
NEAT1高表达与患者的预后负相关，是ESCC患者预后不良的危险因素；NEAT1高表达与临床分期、淋巴转移、肿瘤大小显著正相关，与患者年龄、分化、肿瘤位置、远处转移无关；高表达NEAT1提示患者的生存期可能较短。
PCAT-1高表达与患者的预后负相关，是ESCC患者预后不良的危险因素；PCAT-1高表达与淋巴结转移、肿瘤分期，、预后差显著正相关，与患者年龄、性别、吸烟、饮酒等无关；高表达PCAT-1提示患者的生存期可能较短。
HOTAIR高表达与患者的预后负相关， 是ESCC患者预后不良的危险因素；HOTAIR高表达与肿瘤的淋巴结转移、TNM分期显著正相关；与患者年龄、性别、吸烟、饮酒无相关性；高表达HOTAIR提示患者的生存期可能较短。
CCAT2高表达与患者的预后负相关，是ESCC患者预后不良的危险因素；高表达与肿瘤浸润程度、临床分期、TNM分期、淋巴结转移、患者是否吸烟呈正相关；与患者年龄、性别无相关性；高表达CCAT2提示患者的生存期可能较短。
本发明的有益效果是：
1)通过RT-qPCR验证筛选的一组在食管癌和对应癌旁有表达差异的 LncRNA，筛选出的lncRNA组合可以评估中国食管癌患者预后癌细胞的增殖和侵袭和转移能力，进一步指导临床治疗。
2)将筛选出一组的 LncRNA 作为食管癌检测预后情况的分子标记物，制备通过采用荧光定量方法来用于食管癌预后检测的试剂盒或生物芯片，能够避免食管癌肿瘤异质性带来的检测误差，提高了诊断的准确性。
3)采用一组 LncRNA 作为新的判断食管癌预后情况的标记物，将改进单一的标记物所难以克服的由于肿瘤异质性所带来的低差异和低灵敏性，并早于常规影像学检查数周乃至数月发现肿瘤的复发或转移，可有效提高食管癌病人人预后效果评价从而指导临床治疗指南。
4)其检测的是一系列食管癌相关标记物的诊断参考范围与临床病理特征和预后生存期具有相关性，可以单一看也可联合看，对食管癌预后复发或转移的风险进行评估。
附图说明
图1是实施例1中荧光定量PCR法检测 lncRNA组合在食管鳞癌组织及对照旁癌组织之间的相对表达水平差异分析示意图；
图2是实施例2中荧光定量PCR法检测 lncRNA组合在食管鳞癌血清与健康人血清之间的相对表达水平差异分析示意图。
具体实施方式
为了评价LncRNA在食管鳞癌预后情况的检测作用，推广lncRNA在临床的应用，本发明通过循证医学的方法搜集证据，通过检索Pubmed、Embase、Medline、中国知网、万方数据库等数据库，筛选有关lncRNA用于食管鳞癌预后情况的相关性的文献。
文献质量评价通过nosgen标准对纳入的研究进行文献质量评估。根据纳入和排除标准，共纳入从2013年1月至2016年12月共10 篇对照研究。最终纳入文献归类整理，提取原始有效数据后进行汇总，入选的文章进行数据提取，包括1143例食管鳞癌患者的癌和癌旁组织，样本全部来自中国患者（见表1）。
用 Stata 12.0 软件进行数据分析，通过合并纳入研究的风险比(HR)及其 95%CI 评价lncRNAs 表达与食管鳞癌患者预后情况的关系。对纳入的各项研究进行齐性检验，计算统计量评估各研究间的异质性，敏感性分析，并绘制漏斗图描述发表偏倚。P ＜0. 05为差异有统计学意义。
筛选出了能够检测食管鳞癌预后情况的lncRNA组合包括10条lncRNA分子，分别为LOC285194、AFAP1-AS1、UCA1、BANCR、MALAT1、ZEB1-AS1、HOTAIR、PCAT-1、NEAT1、CCAT2表达存在差异。在食管鳞癌复发或转移患者组织样本中，其中1条lncRNA—LOC285194可能出现下调表达；另9条lncRNA可能出现上调表达，分别为：AFAP1-AS1、UCA1、BANCR、MALAT1、ZEB1-AS1、HOTAIR、PCAT-1、NEAT1、CCAT2。
用于食管鳞癌预后情况的检测的lncRNA组合及试剂盒的制作 LncRNA试剂盒的制作和操作流程基于lncRNA RT-qPCR法和RT-dPCR法。试剂盒包括lncRNA引物（见表4）、组织RNA提取试剂、RT试剂、PCR试剂、健康人cDNA对照品、阳性cDNA对照品。此试剂盒通过qPCR法测lncRNA的变化趋势，再通过该趋势辅助评估食管鳞癌复发或转移的风险，不仅稳定，检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导临床准确做出诊断。
本发明要解决的技术问题是根据个体样本中异常表达的lncRNA 的表达水平进行早期食管鳞癌复发或转移的诊断。本发明要解决的问题还涉及提供用于早期食管鳞癌复发或转移的诊断方法及相应诊断试剂。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明所使用的DNA寡聚核酸由上海生工合成，所使用的 RNA 寡聚核酸由上海吉玛生物科技有限公司合成。
本发明通过分析组合中的lncRNA的差异表达可作为食管鳞癌预后指标，评估患者临床病理特征：淋巴结转移（1ymph node metastasis，LNM）、远处转移（distantmetastasis，DM）、肿瘤大小（tumor size）、TNM分期、临床分期(clinical stage)等。
lncRNA表达量与患者生存期（风险比[hazard ratio，HR]=1.92，95％置信区间[confidence interval，CI]= 1.34-2.77，P＜0.01，并与具有较高的淋巴结转移率（HR =1.3809，95％CI=[0.7585; 2.5141]，p＜0.001）显著相关。分析结果提示此组lncRNAs可作为食管鳞癌预测预后不良的重要生物标志物。
此组lncRNA可作为食管鳞癌预后不良指标，可以用来评估患者预后生存期。
本发明经过广泛而深入的研究，筛选出可做为食管鳞癌肿瘤转移标志物的LncRNA：该异常表达的 LncRNA组合中有上调表达和下调表达。上调的lncRNA在正常组织或者癌旁组织中不表达或表达量很低，在食管鳞癌组织中比正常组织或者癌旁组织中表达量升高。下调的LncRNA在食管鳞癌组织中与正常组织或者癌旁组织相比表达下调，在此基础上完成了本发明。
如果与参考样本/配对的癌旁组织，被测定样本中 LncRNA 分子有表达变化：9条lncRNA(AFAP1-AS1、UCA1、BANCR、MALAT1、ZEB1-AS1、HOTAIR、PCAT-1、NEAT1、CCAT2的一条或多条有表达上调，且表达差异高于参考范围；或者1条LOC285194 表达下调，且表达差异低于参考范围，说明食管鳞癌预后不良，可能存在复发或转移。
本发明还提供了lncRNA的PCR引物，如表4所示。
实施例 1.运用RT-qPCR技术检测lncRNA组合在食管鳞状细胞癌的癌组织和癌旁组织中的差异表达 1.核酸纯化柱提取食管鳞癌组织及对应癌旁组织总 RNA
预处理：在较少RNase干扰的清洁区(所有用具均用1‰ DEPC水擦拭)，研钵需200℃灭菌5h并冷却4h。
2.组织裂解：
1) 称取离体食管鳞癌癌组织及癌旁组织样本约20mg分别至已倒有液氮预冷的研钵中，用杵棒研磨至粉末状 (研磨不彻底则会严重影响的 RNA 的产量) ； 2) 加入700μlQIAzol 裂解液至研钵中，继续研磨至无明显组织块的均匀液体，然后转移至无RNA 酶的1.5ml eppendorf 管中； 3) 冷冻离心机4℃，12000 rpm，离心10min 以除去溶液中未裂解完全组织及细胞碎片； 4) 小心吸取离心后的上清液，移至另一新的eppendorf 管，切勿吸取下层细胞碎片残渣沉淀； 5) 加入140μl 氯仿，上下颠倒，剧烈振荡后静置2min； 6) 冷冻离心机4℃离心，12000 rpm，15min，并将上层清液转移至一新的无 RNA 酶eppendorf 管中； 7) 加入 1.5 倍无水乙醇，涡旋混匀； 3. RNA 吸附： 1) 将所有液体全部转移至吸附柱中，并将吸附柱置于2ml的收集管内，8000 rpm离心15s，弃收集管中的滤液； 2) 取700μl的RWT溶液至吸附柱中，8000 rpm离心15s，弃滤液； 4.RNA 洗涤和洗脱
1) 取 500μl的buffer RPE至吸附柱中洗涤，8000 rpm 离心15s，弃滤液；
2) 再次用500μl 的buffer RPE洗涤吸附柱，8000 rpm 离心2min，弃滤液及下层收集套管； 3) 将吸附柱转移至一个新的2ml收集管中，全速离心1min；
4) 弃下层收集管，把吸附柱移入新的1.5ml eppendorf 管中，加入45μlRNase-freewater 洗脱吸附膜，静置1min，8000 rpm离心1min； 5) 再次全速离心1min。 5. 总 RNA 的定量和质量检测
1) 利用Nanodrop 2000检测食管鳞癌组织RNA样本的含量，经OD值定量测定，以便计算LncRNA反转录时所需要的RNA溶液的体积；
2) 经定性检测排除已降解的和DNA污染较严重的RNA样本，以保证后续实验的特异性；
3) 具体检测方法如下：
总RNA定量：在紫外分光光度计上测定260nm 和280nm 的OD值，并得出 A260/A280，当其数值在 1.8～2.0之间说明总 RNA 的纯度较好；当小于2.0说明有残余的盐离子和小分子杂志的污染，当大于2.0 则说明可能总 RNA 的降解。
总RNA的完整性检测：1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离总RNA中的核糖体RNA(rRNA)，最大的两条条带28s RNA和18s RNA的亮度大致比为2:1时，说明RNA 的完整性较好，未出现降解现象。
6. 第一链cDNA的合成：反转录反应体系见表6。样品充分混匀后短离心使液体至于管底，PCR仪中进行第一步反应，65℃ 5 min，4℃ 降温, 42℃ 60 min，70℃ 15 min，4℃保存。合成的第一条链cDNA取出后，-20℃长期保存备用。CDNA第一链的合成：在无RNA酶的PCR管中依次加入以下组分：
7.Q-PCR分析相关LncRNA的表达量
cDNA检测：GAPDH基因做内参，进行PCR扩增检测模板质量，反应体系见表7。Q-PCR反应检测仪为Bio-Rad公司的CFX96系统，反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循环，溶解曲线在65~95℃之间。Q-PCR采用相对定量法，基因表达分析软件为Bio-Rad CFX manager 2.0，每一样品重复三次，利用2−△△Ct方法进行分析，反应体系见表8。
8.检测结果与结论
检测结果见表8和图1，与癌旁组织相比，被测定样本中有LncRNA分子出现表达差异：UCA1、AFAP1-AS1、MALAT1、HOTAIR、BANCR、PCAT-1、CCAT2为上调表达，其中UCA1、 MALAT1、HOTAIR、CCAT2的表达差异高于参考范围；LOC285194表达下调，且表达差异低于参考范围，这说明患者该食管鳞癌预后不良，可能存在复发或转移，该结果同时提示食管鳞癌患者的无进展生存期或总生存期可能较短。
实施例2.运用RT-qPCR技术检测lncRNA组合在食管鳞状细胞癌患者血清和健康人血清中的差异表达
1.血清RNA提取 本发明采用离心柱型RNA快速提取试剂盒提取，具体步骤如下： 1) 取0 .25ml血清，加入0 .75ml裂解液RLS，将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30℃条件下孵育5分钟以使蛋白体完全分解； 2) 4℃，12000rpm的条件下离心10min，小心取上清转入一个新的RNase free的离心管中； 3) 加入0.15ml氯仿，盖紧样品管盖，剧烈振荡15s并将其在室温下孵育3min； 4) 于4℃，12000rpm下离心10min，样品会分成三层：下层为有机相，中间层和上层为无色的水相，RNA存在于水相中，水相层的容量大约为所加裂解液RLS体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作； 5) 加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)； 6)10000rpm离心45s，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管； 7) 加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s，弃掉废液； 8) 加入700μl漂洗液RW，12000rpm离心60s，弃掉废液； 9)加入500μl漂洗液RW，12000rpm离心60s，弃掉废液； 10) 将吸附柱RA放回空收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液 ,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
11)取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中 ，吸附膜的中间部位加40μl RNasefree water(事先在65-70℃水浴中加热)，室温放置2min，然后在12000rpm下离心1min；12) 将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1min，得到的RNA溶液置于-80℃中保存备用。
2. 第一链cDNA的合成：如实施例1所示。
3. Q-PCR分析相关LncRNA的表达差异：如实施例1所示。
4.检测结果与结论
检测结果见表9和图2，与参考样本（健康人血清）相比，被测定样本中有LncRNAs分子出现表达差异： UCA1、BANCR、MALAT1、NEAT1、HOTAIR、CCAT2为上调表达，其中UCA1、MALAT1、NEAT1、HOTAIR、CCAT2表达差异高于参考范围，说明该患者食管鳞癌预后不良，可能存在复发或转移，该结果同时提示患者的无进展生存期或总生存期可能较短。
备注：可能由于肿瘤特异性，该患者血浆样本中未检测到LOC285194， ZEB1-AS1，PCAT-1表达。

Claims (10)

1.检测早期食管癌预后情况的LncRNA组合，其特征在于，所述LncRNA组合包括LOC285194、AFAP1-AS1、UCA1、BANCR、MALAT1、ZEB1-AS1、HOTAIR、PCAT-1、NEAT1、CCAT2分子中的一条或多条。
2.根据权利要求1所述检测早期食管癌预后情况的LncRNA组合，其特征在于，所述LncRNA组合包括AFAP1-AS1、UCA1、BANCR、MALAT1、ZEB1-AS1、HOTAIR、PCAT-1、NEAT1、CCAT2分子中的一条或多条。
3.根据权利要求1所述检测早期食管癌预后情况的LncRNA组合，其特征在于，所述LncRNA组合包括LOC285194分子。
4.用于检测早期食管癌预后情况的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测权利要求1所述lncRNA组合在组织中或血液/血浆中的表达量高低的组分。
5.根据权利要求4所述用于检测早期食管癌预后情况的试剂盒，其特征在于，所述组分包括RNA提取系统、逆转录试剂及PCR扩增试剂。
6.根据权利要求5所述用于检测早期食管癌预后情况的试剂盒，其特征在于，RNA提取系统包括裂解液、RNA吸附柱和RNA漂洗液。
7.根据权利要求5所述用于检测早期食管癌预后情况的试剂盒，其特征在于，所述逆转录试剂为5× iScript Reaction Mix、iScript Reverse Transcriptase和DEPC水。
8.根据权利要求4所述用于检测早期食管癌预后情况的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性扩增用于检测权利要求1所述LOC285194、AFAP1-AS1、UCA1、BANCR、MALAT1、ZEB1-AS1、HOTAIR、PCAT-1、NEAT1、CCAT2的上下游引物序列以及内参GAPDH的上下游引物序列。
9.根据权利要求4所述用于检测早期食管癌预后情况的试剂盒，其特征在于，还含有60例食管癌组织样本提取的总RNA混合后，逆转录并稀释的cDNA，作为检测权利要求8中所述的引物序列的可行性的阳性模板和癌旁组织样本提取的总RNA，逆转录并稀释的cDNA的阴性模板。
10.根据权利要求5所述用于检测早期食管癌预后情况的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂为5× FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)和DEPC水。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108342487A (zh) * 2018-05-10 2018-07-31 山东大学第二医院 基于血清exosomallncRNAs的食管癌诊断特异性表达图谱及检测分析系统
CN109576369A (zh) * 2018-12-17 2019-04-05 河南医学高等专科学校 一种prr11在食管癌组织及食管癌细胞系中使用方法
CN109735622A (zh) * 2019-03-07 2019-05-10 天津市第三中心医院 与结直肠癌相关的lncRNA及其应用
CN110066872A (zh) * 2019-03-01 2019-07-30 浙江理工大学 lncRNA UCA1在作为卵巢癌诊断或预后效果检验的生物标记物中的应用
CN111304322A (zh) * 2019-12-19 2020-06-19 徐州市肿瘤医院 四个novel circRNA联合检测食管癌的试剂盒的制备方法
CN112359113A (zh) * 2020-11-26 2021-02-12 中国人民解放军总医院第一医学中心 LncRNA18q21.2在作为诊断食管癌的标志物中的应用、引物对和试剂盒
CN112921098A (zh) * 2021-04-27 2021-06-08 深圳市人民医院 一种用于三阴性乳腺癌检测的标志物及其检测试剂和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104762368A (zh) * 2014-01-02 2015-07-08 中国医学科学院肿瘤医院 一种用于辅助预测食管鳞癌患者术后生存时间的试剂盒
WO2016187578A1 (en) * 2015-05-20 2016-11-24 Indiana University Research And Technology Corporation Inhibition of lncrna hotair and related materials and methods
CN106498085A (zh) * 2016-12-27 2017-03-15 江苏省人民医院 一种预测早期可手术食管鳞癌患者复发与转移风险的试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104762368A (zh) * 2014-01-02 2015-07-08 中国医学科学院肿瘤医院 一种用于辅助预测食管鳞癌患者术后生存时间的试剂盒
WO2016187578A1 (en) * 2015-05-20 2016-11-24 Indiana University Research And Technology Corporation Inhibition of lncrna hotair and related materials and methods
CN106498085A (zh) * 2016-12-27 2017-03-15 江苏省人民医院 一种预测早期可手术食管鳞癌患者复发与转移风险的试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAN-YU DENG等: "Long noncoding RNAs are novel potential prognostic biomarkers for esophageal squamous cell carcinoma: an overview", 《JOURNAL OF THORACIC DISEASE》 *
ZIHAO LIU等: "Upregulation of the long non-coding RNA BANCR correlates with tumor progression and poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma", 《BIOMEDICINE & PHARMACOTHERAPY》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108342487A (zh) * 2018-05-10 2018-07-31 山东大学第二医院 基于血清exosomallncRNAs的食管癌诊断特异性表达图谱及检测分析系统
CN108342487B (zh) * 2018-05-10 2020-07-28 山东大学第二医院 基于血清exosomal lncRNAs的食管癌诊断特异性表达图谱及检测分析系统
CN109576369A (zh) * 2018-12-17 2019-04-05 河南医学高等专科学校 一种prr11在食管癌组织及食管癌细胞系中使用方法
CN110066872A (zh) * 2019-03-01 2019-07-30 浙江理工大学 lncRNA UCA1在作为卵巢癌诊断或预后效果检验的生物标记物中的应用
CN109735622A (zh) * 2019-03-07 2019-05-10 天津市第三中心医院 与结直肠癌相关的lncRNA及其应用
CN111304322A (zh) * 2019-12-19 2020-06-19 徐州市肿瘤医院 四个novel circRNA联合检测食管癌的试剂盒的制备方法
CN112359113A (zh) * 2020-11-26 2021-02-12 中国人民解放军总医院第一医学中心 LncRNA18q21.2在作为诊断食管癌的标志物中的应用、引物对和试剂盒
CN112921098A (zh) * 2021-04-27 2021-06-08 深圳市人民医院 一种用于三阴性乳腺癌检测的标志物及其检测试剂和应用

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