CN105987999A

CN105987999A - 用于乳腺癌诊断的联合肿瘤标志物及其试剂盒

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Publication number: CN105987999A
Application number: CN201510073979.XA
Authority: CN
Inventors: 郭方; 王雪枫; 严向明
Original assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Current assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Priority date: 2015-02-12
Filing date: 2015-02-12
Publication date: 2016-10-05

Abstract

本发明公开了一种用于乳腺癌诊断的联合肿瘤标志物及其试剂盒，所述标志物包括：天冬酰胺内肽酶和泛素连接酶TRAF6。该试剂盒包括：检测天冬酰胺内肽酶或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂；以及检测泛素连接酶TRAF6或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂。本发明的AEP和Traf6可以作为一种乳腺癌联合检测标志物，开发商业试剂盒，其用于乳腺癌早、中、晚期诊断；而棉酮牛磺酸钠可作为一种候选药物，以下调AEP及其活化的蛋白为途径，抑制乳腺癌转移，因而，对于乳腺癌药物的开发奠定了基础。

Description

用于乳腺癌诊断的联合肿瘤标志物及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种肿瘤标志物，特别是涉及一种用于乳腺癌诊断的联合肿瘤标志物及其试剂盒。

背景技术

据WHO统计，每年全球新发乳腺癌病例超过100万，全世界每年约有50万人死于乳腺癌，乳腺癌仍然是世界女性肿瘤患者中的首要种类的癌症(Koblinski JE,Ahram M,Sloane BF.Unraveling the role of proteases in cancer.Clinica Chimica Acta 2000；291(2):113-135)。在西欧、北美等发达国家，乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤首位。中国疾病预防控制中心健康教育所最新发布的《中国乳腺癌防治现况报告》显示，乳腺癌已经成为威胁妇女健康的最常见的恶性肿瘤，中国是乳腺癌发病率增长最快的国家之一，中国抗癌协会公布的统计数字显示，我国近年来乳癌发病率正以每年3％的速度递增，成为城市中死亡率增长最快的癌症，发病年龄也呈逐渐年轻化的趋势。

以手术为主，综合治疗乳腺癌虽然取得了较好的疗效，但术后复发和转移仍是影响生存率和死亡率的关键因素。肿瘤的侵袭和转移使恶性肿瘤的主要生物学特征，是影响治疗结果和病人预后的重要因素，一直是肿瘤研究的难点。

天冬酰胺内肽酶(Asparaginyl Endopeptidase，AEP)是新近发现的一种溶酶体蛋白酶，属于半胱氨酸蛋白酶C13家族，其对底物的选择有严格的专一性(Barrett AJ,Rawlings ND,O'Brien EA.The MEROPS database as a protease information system.Journal of StructuralBiology 2001；134(2-3):95-102)。AEP在肿瘤组织中大量表达，而在正常组织中表达量却很低(Clerin V,Shih HH,Deng N,Hebert G,Resmini C,Shields KM,et al.Expression of the cysteineprotease legumain in vascular lesions and functional implications in atherogenesis.Atherosclerosis2008；201(1):53-66)。目前已发现AEP在多种实体瘤(乳腺癌，结肠癌，卵巢癌等)和淋巴瘤中表达上调。前期通过基因表达谱和免疫组织化学实验，我们发现AEP在肿瘤组织的肿瘤相关巨噬细胞中也高表达。并且，在结肠癌、乳腺癌中报道AEP与肿瘤病人预后呈负相关(Gawenda J,Traub F,Luck HJ,Kreipe H,von Wasielewski R.Legumain expression as a prognosticfactor in breast cancer patients.Breast Cancer Research and Treatment 2007；102(1):1-6)，这些都提示该分子是潜在的原癌基因。

TRAF6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)作为一个新发现的重要的泛素E3连接酶，介导K63多聚泛素化修饰。TRAF6作为多种信号途径中的重要接头分子，介导了包括TNF受体超家族和IL-1受体/TLR超家族在内的多条信号通路的激活，对固有免疫，适应性免疫和骨平衡的维持至关重要(Deng L,Wang C,Spencer E,Yang LY,Braun A,et al.Activation of the I kappa B kinase complex by TRAF6requires a dimeric ubiquitin-conjugatingenzyme complex and a unique polyubiquitin chain.Cell 2000；103(2):351-361)。同时有文献报道，TRAF6的功能不仅仅如此，它还参与了与细胞存活和致癌相关的Akt信号途径，这暗示着TRAF6很可能是一个先前未发现的致癌基因(Yang WL,Wang J,Chan CH,Lee SW,CamposAD,et al.The E3 Ligase TRAF6Regulates Akt Ubiquitination and Activation.Science2009；325(5944):1134-1138)。TRAF6的重要性预示着其底物分子的独特性和多样性。和TRAF家族的其他成员不同，TRAF6通过其独特的TRAF-C区域和其他分子相互作用，晶体结构分析表明这些底物分子与TRAF6的结合位点非常保守，即这些底物分子都含有P-X-E-X-X-Y基序(Ye H,Arron JR,Lamothe B,Cirilli M,Kobayashi T,et al.Distinct molecular mechanism forinitiating TRAF6signalling.Nature 2002；418(6896):443-447)。我们初步筛选分析发现天冬酰胺内肽酶AEP同样具有保守的TRAF6结合位点。我们的初步研究表明在肿瘤特殊的微环境下(包括低氧，微酸，低糖等非正常的生理环境等)，TRAF6可以通过调控AEP的活性来影响肿瘤的发生和转移。

因此，研发一种新型乳腺癌检测标志物，开发检测试剂盒，开发以相应标志物为理想靶点的药物，无疑会为肿瘤的临床诊断和治疗带来新的希望。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于乳腺癌诊断的联合肿瘤标志物及其试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明的用于乳腺癌诊断的联合肿瘤标志物，包括：天冬酰胺内肽酶(AEP)和泛素连接酶TRAF6。

另外，本发明还提供一种上述联合肿瘤标志物在制备诊断试剂或试剂盒中的用途，所述诊断试剂或试剂盒用于诊断乳腺癌，如所述诊断试剂或试剂盒用于诊断乳腺癌的发生、侵袭或转移。

所述诊断试剂包括：特异性扩增天冬酰胺内肽酶(AEP)或泛素连接酶TRAF6的编码基因的引物；特异性识别天冬酰胺内肽酶(AEP)或泛素连接酶TRAF6的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗扩增天冬酰胺内肽酶(AEP)或泛素连接酶TRAF6的抗体。

再者，本发明还提供一种用于乳腺癌诊断的试剂盒，其包括：检测天冬酰胺内肽酶(AEP)或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂；以及检测泛素连接酶TRAF6或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂。

所述检测天冬酰胺内肽酶(AEP)或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂，包括：特异性扩增天冬酰胺内肽酶(AEP)的编码基因的引物；特异性识别天冬酰胺内肽酶(AEP)的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗扩增天冬酰胺内肽酶(AEP)的抗体。

所述检测泛素连接酶TRAF6或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂，包括：特异性扩增泛素连接酶TRAF6的编码基因的引物；特异性识别泛素连接酶TRAF6的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗泛素连接酶TRAF6的抗体。

所述用于乳腺癌诊断的试剂盒，还可包括：常规的核酸提取试剂、PCR反应试剂、蛋白免疫印迹试剂或酶链免疫反应试剂。

此外，本发明还提供一种上述联合肿瘤标志物在制备预防或治疗乳腺癌的药物中的应用。

所述预防或治疗乳腺癌的药物包括：预防或治疗乳腺癌的发生、侵袭或转移的药物；如抑制乳腺癌的发生、侵袭或转移的药物。

所述药物包括：如式(I)所示的棉酮牛磺酸钠(ch282-5)，或棉酮牛磺酸钠与药学上可接受的载体。

另外，本发明还提供一种下调上述联合肿瘤标志物表达的化合物在制备预防或治疗乳腺癌的药物中的应用。

所述化合物可包括：棉酮牛磺酸钠。

另外，本发明经研究发现：调查临床数据，分析AEP和Traf6在乳腺癌中高表达情况，说明AEP与Traf6的共同表现，可以作为乳腺癌检测的分子标记物；此外，分子生物学方法证明AEP和Traf6与乳腺癌的侵袭转移高度相关，细胞和动物实验证明AEP和Traf6是抑制乳腺癌转移的理想靶点，以及棉酮牛磺酸钠能够下调AEP，从而抑制乳腺癌转移。

本发明中，因AEP独特的底物专一性和肿瘤特异性，AEP成为肿瘤靶向治疗的理想靶点。我们研究组已发表多篇针对AEP特异性激活释放的前体药物的研究。同时，我们从临床数据分析上建立了AEP与肿瘤的相关性，并且还设计了多种针对AEP的抑制剂。

棉酚衍生物——棉酮牛磺酸钠，能够显著下调AEP以及AEP调控的肿瘤转移相关蛋白，抑制乳腺癌的侵袭和转移。AEP在肿瘤细胞和肾近曲小管细胞中表达，新型棉酚衍生物棉酮牛磺酸钠在肾脏回收利用，但是，动物实验数据并未体现出明显的肾脏损伤。因此，棉酮牛磺酸钠是一种理想的抗乳腺癌转移的潜在化疗药物，依赖于下调AEP和AEP激活的蛋白发挥功能。

棉酮牛磺酸钠有天然棉酚改造而成。天然棉酚分子内部具有两个活性醛基，对动物产生明显的毒副作用，我们将这两个活性醛基改造为酮基，显著降低毒副作用。另外，在R基团引入牛磺酸钠基团，分子量小而水溶性大。经分析，棉酮牛磺酸钠的疏水常数log P为4.63，处于理想的成药水溶特性范围内，作为小分子化合物(分子量804)的棉酮牛磺酸钠具备足够的稳定性，易于制剂化，在体内作用时间长，持续杀灭原位的和转移的乳腺癌细胞。

本发明的有益效果分析如下。

尽管AEP经典报道存在于溶酶体/内涵体组分，但AEP参与cyclins A and E和nucleoplasmic Ca²⁺的表达调控，细胞增殖等，暗示着AEP的功能不仅仅只是溶酶体降解酶那么简单。且AEP被发现存在于溶酶体/内涵提之外，在胞质中参与中风和老年痴呆等病理过程。事实上，蛋白定位网站PSORTⅡ(http://psort.hgc.jp/)预测，AEP可能会存在于细胞内多种位置，包括细胞膜，胞质，囊泡和内质网。先前的研究亦发现AEP在乳腺癌患者肿瘤组织中的不同染色类型，即弥漫性，胞质小点和囊泡型。我们通过免疫电镜和亚细胞组分分离等实验明确AEP在乳腺癌中的定位，即前体形式为主，且和TRAF6共定位于胞质中。根据文献报道，溶酶体酶常以前体形式存在于胞质和分泌于胞外中。譬如，1989年发现的cathepsin-D前体极大的聚集于乳腺癌细胞的胞质中。

我们的数据进一步表明前体AEP和TRAF6直接相互作用，且TRAF6介导AEP的泛素化修饰。有些推测在定位到溶酶体的过程中，蛋白酶因结构异常或其他的修饰，与Man-6-P受体的互作异常，导致后边不在继续往溶酶体走，而分布到其他组分中。综合我们的发现，我们推测前体AEP是在溶酶体途径早期的内质网合成后才进入胞质的。

TRAF6过表达，尤其是在刺激情况下，可促进K63偶联的AEP泛素化修饰，进而促进HSP90α的招募，增加胞内外的AEP水平。进而，我们发现过表达TRAF6可增加内涵体中AEP的量，减少溶酶体中的AEP。并且，用MG132抑制蛋白酶体后，AEP无明显变化，而用NH4Cl或Chloroquine抑制溶酶体功能后，胞内AEP的量明显增加。我们推测K63偶联的泛素化修饰减少了AEP的溶酶体降解。有趣的是，我们检测到80％的分泌型AEP存在于微泡结构中。HSP90α亦和分泌型的AEP有相互作用。AEP的分泌过程和模式需要进一步的研究。

我们发现在乳腺癌病人的血清中存在大量的AEP，但是分泌型的AEP并没有被泛素化；而且，泛素化的前体AEP无法进行自活化，这可能是因为自活化位点(N323)和泛素化位点(K318R)非常接近，多聚泛素链可能覆盖了自活化位点。因为AEP的内切酶活性对其促肿瘤侵袭和转移至关重要，阐明前体AEP的活化过程有待进一步研究。据文献报道，AEP定位于肿瘤细胞的侵袭前缘，与integrins形成复合体，而结合的AEP可活化前体MMP2和cathepsin L。这些下游分子在肿瘤的侵袭转移中有重要作用，可以部分解释AEP促进肿瘤侵袭的现象。进一步寻找更多的AEP底物分子对阐明其功能很有帮助。循环中或分泌的AEP可能被细胞内吞，活化后与integrin形成复合体。我们的数据表明，分泌型的AEP显著促进肿瘤的发生发展，而AEP抑制剂或单克隆抗体可有效抑制肿瘤侵袭和转移。尽管其它半胱氨酸家族的蛋白酶成员多，抑制剂专一性低，AEP是C13家族目前已知的唯一成员。并且，AEP抑制剂(Aza-Asn-epoxides)具有极好的专一性，和其他蛋白酶几乎没有交叉，如chymotrypsin,papain,cathepsin B,cathepsin L或Caspase-3。总而言之，这些结果提示分泌的AEP可作为潜在的血清检测指标，并且AEP抑制剂或单克隆抗体靶向AEP亦是潜在的肿瘤治疗新策略。AEP已发现与肠癌，乳腺癌等的临床病理和预后密切相关,并且TRAF6是潜在的原癌基因，AEP和TRAF6在恶性乳腺癌中高表达且与不良预后正相关，暗示着AEP和TRAF6可作为乳腺癌潜在的诊断指标。

我们的研究揭示了一个全新的AEP调控机制，清晰的阐明了其在乳腺癌侵袭转移中的功能。我们提出AEP可作为潜在的诊断和治疗指标。我们发现了TRAF6促癌的新途径。

综上所述，AEP和Traf6可以作为一种乳腺癌联合检测标志物，开发商业试剂盒，其用于乳腺癌早、中、晚期诊断；而棉酮牛磺酸钠可作为一种候选药物，以下调AEP及其活化的蛋白为途径，抑制乳腺癌转移，因而，对于乳腺癌药物的开发奠定了基础。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是AEP与TRAF6存在直接的结合；其中，图A是分析MCF10A、MCF7、MDA-MB-231培养基和细胞内AEP的分泌和表达量；图B是对比培养基中AEP的前体形式和活化形式比例；图C是分析AEP高表达株转入效率；图D是预测AEP与Traf结合位点；图E是分析转入AEP和Traf6的相互影响情况。

图2是TRAF6增加细胞内外的AEP蛋白水平；其中，图A是转入Traf6和空载质粒后对比培养基内AEP的分泌量；图B是Western blot方法分析转入Traf6和空载质粒后对比细胞内和培养基中AEP的变化；图C是分别敲除AEP和Traf6对比培养基内AEP量的变化；图D是Western blot方法分析敲除AEP和Traf6对比培养基中和细胞内AEP量的变化；图E是转入Traf6和空载质粒后对比细胞内AEP量的变化；图F是分别敲除AEP和Traf6对比细胞内AEP量的变化；图G是转入空载体和Traf6的不同片段，比较培养集中和细胞内AEP量的变化。

图3是TRAF6调节的AEP泛素化修饰增强肿瘤的侵袭转移；其中，图A是以AEP E214A和K318R位点突变的细胞为实验对象，用划痕实验和Transwell实验分析细胞迁移能力变化；图B是用shRNA干扰AEP表达，以及恢复AEP敲除，分析细胞迁移能力变化；图C是划痕实验对比敲除Traf6和AEP的细胞的迁移能力；图D是western blot检查Traf6和AEP敲除和恢复效率；图E是H&E染色分析AEP位点突变，AEP、Traf6敲除和恢复的细胞株在动物体内肺转移能力；图F是分析肺转移灶数目。

图4是分泌型的AEP促进肿瘤侵袭转移；其中，图A是构建AEP过表达质粒，利用划痕实验，以空载质粒转染组为对照比较空载级AEP高表达的细胞，以及在AEP抑制剂作用下的迁移率；图B是利用Transwell实验重复验证上述结论；图C是利用Transwell实验以空载质粒转染组为对照比较AEP高表达的细胞在不同浓度的AEP抑制剂作用下的迁移率；图D是比较不同处理下乳腺癌肺转移情况；图E是H&E染色，比较对照组、AEP过表达组、AEP抗体添加组、AEPI处理组乳腺癌肺转移灶的数目；图F是所使用的AEPI的结构式；图G是比较AEPI处理的老鼠与对照组小鼠荷瘤大小。

图5是过表达AEP和TRAF6与乳腺癌肿瘤病人的预后呈负相关；其中，图A是H&E染色和免疫组化的方法分析Traf6以及AEP在病人肿瘤组织中的表达情况；图B是Westernblot方法分析病人样本内Traf6和AEP存在直接作用关系；图C是Western blot方法分析患者正常组织与肿瘤部位Traf6和AEP的表达情况；图D是统计分析肿瘤患者正常组织和肿瘤内Traf6以及AEP的表达情况；图E是统计分析肿瘤患者不同部位血清内AEP表达情况和浓度；图F是统计分析Traf6与肿瘤病人预后的关系；图G是统计分析AEP与肿瘤病人预后的关系；图H是统计分析AEP与Traf6与肿瘤病人预后的关系。

图6是棉酚衍生物ch282-5下调AEP，抑制乳腺癌侵袭转移。其中，图A是棉酮牛磺酸钠(ch282-5)结构图；图B是Western blot检测不同浓度的ch282-5处理24小时的MDA-MB231、MCF7、4T1细胞内AEP水平的改变；图C是MTS方法检测ch282-5处理72小时后的细胞活力，分析半数抑制率EC₅₀；图D是划痕实验分析ch282-5对于4T1细胞迁移的抑制；图E是统计ch282-5处理的4T1乳腺原位瘤肺转移老鼠的生存率；图F是对比ch282-5处理的老鼠4T1肺转移情况。

具体实施方式

以下实施例中所涉及的试剂、质粒等，如未特别说明，则为商业化产品。其中，实验小鼠：SPF级C57BL/6小鼠、裸鼠购自中国科学院上海实验动物中心〔SYXK(沪)2003-0026，SCXK(沪)2002-003〕。

实施例1针对细胞和乳腺癌样本的实验

(一)实验过程

材料和试剂：胎牛血清购自Gibco公司；细胞培养用青霉素-链霉素、TRIzol RNA提取试剂购自invitrogen公司；RPMI-1640、DMEM培养基购自Hyclone公司；KOD-plus、RealMasterMix(SYBR Green I)试剂盒，反转录试剂盒购自东洋坊公司；限制性内切酶购自Takara公司；T4DNA连接酶、western及IP裂解液购自碧云天公司；质粒大量抽提试剂盒、质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒、DNA产物纯化试剂盒购自Tiangen；Protein InhibitorCocktail、Phosphotase Inhibitor Cocktail购买自Roche公司；硝酸纤维素膜购买自Schleicher andSchuell Bioscience公司；羊多抗AEP购自R&D公司；兔多抗TRAF6和鼠多抗TRAF6购自Santa Cruz公司；Anti–Flag M2Affinity Gel、鼠多抗hemagglutinin、兔多抗Flag和hemagglutinin购自Sigma；Protein G Sepharose^TM 4 Fast Flow购自GE Healthcare公司；鼠多抗Actin抗体购自Sigma公司；多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)购自Sigma公司；磷酸缓冲液(phosphatebufferd saline，PBS)购自Hyclone公司；胰酶Trypsin购自Gibco公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；Phenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF)购自Sigma公司；Bicinchoninic acid(BCA)Protein Assay Kit购自Pierce公司；ECL反应试剂盒SuperSignal West PicoChemiluminescent Substrate购自Pierce公司。

1、免疫共沉淀和免疫印迹分析AEP与TRAF6的关系及分布。

实验涉及的细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-453、MCF7细胞(人乳腺癌细胞)、MCF10a细胞(人正常乳腺上皮细胞)、4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞)、Raw264.7(小鼠巨噬细胞)，均购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。

真核表达载体pcDNA3.1-HA/-FLAG和原核表达载体p-GEX-4T-1由中国科学院上海高等研究院-系统生物学-肿瘤靶向治疗实验室提供，可以分别用来表达HA、FLAG融合蛋白。原核表达载体p-GEX-4T-1用来表达GST融合蛋白。

全细胞蛋白裂解液【20mM Tris-HCl(pH7.5)、137mM NaCl、1.5mM MgCl₂、2mM EDTA、1mM NaF、10mM焦磷酸钠、25mMβ-glycerophosphate、10％(体积百分比)甘油，1％(体积百分比)Triton X-100、1mM正钒酸钠】，置于4℃，用之前现加1mM PMSF(购于Sigma-Aldrich，57mM贮存液溶解于异丙醇)、1×蛋白酶抑制剂cocktail、10mM Okadaic Acid(购于Sigma-Aldrich，30μM贮存液溶解于乙醇)〕。

Immunoblot跑胶缓冲液(25mM Tris base，0.2M Glycine，0.1％SDS)。

Immunoblot转膜缓冲液〔25mM Tris base，0.2M Glycine，20％(V/V)甲醇，置于4℃〕。

10×TBS〔20mM Tris-HCl(pH 7.4)，150mM NaCl〕。

TBST〔1×TBS，0.1％(V/V)Tween-20〕。

Immunoblot封闭液〔1×TBST，5％(W/V)脱脂奶粉〕。

细胞经培养后，细胞PBS洗一遍，弃上清，加入全细胞裂解液，反复吹打。冰上孵育30分钟后，4℃，13200rpm高速离心10分钟，取上清。蛋白浓度用BCA protein assay kit(Pierce,USA)检测。加3×Loading上样缓冲液(含5％二巯基乙醇)，水浴煮沸10分钟，待变性后，静置至室温，-80℃保存或上样电泳。

在免疫沉淀实验中，1mg蛋白与相应的蛋白抗体(终浓度为1μg/ml)混合，温和振摇，4℃过夜，再加25μl Protein G Sepharose 4Fast Flow及抗体或Anti–Flag M2 Affinity Gel(用PBS洗3次)，4℃温和振摇过夜。1000g 4℃离心5分钟，弃上清，所得免疫沉淀复合物用细胞裂解液洗四次，加1×Loading上样缓冲液(含5％二巯基乙醇)，水浴煮沸10分钟，变性后，静置至室温，-80℃保存或上样电泳。

用BIO-RAD垂直电泳槽进行SDS-PAGE分离，分离胶浓度为10％，浓缩胶5％。电泳条件：浓缩胶恒压80V，分离胶恒压120V。待指示剂溴酚蓝泳至凝胶边缘即终止电泳，取出凝胶用于转印。通过Mini(Bio-Rad)转印仪把凝胶上的蛋白质区带转移至0.45μm孔径的PVDF膜(Schleicher&Schuell,Dassel,Germany)上。转印电压100V，4℃转移2h。转印终止后取出转印膜，用脱脂奶粉封闭液室温封闭1h。去离子水洗涤后再用封闭液稀释后的一抗中4℃温和振摇过夜。TBS-T缓冲液洗涤3次后，将膜放入稀释的HRP-二抗中室温作用1h，TBS-T缓冲液洗涤3次，加入Supersignal West Pico化学发光底物(Pierce，USA)作用后，曝光，冲片。所得的X光片用扫描仪扫描。扫描图象用Quantity One软件进行光密度分析。

2、shRNA敲低AEP和Traf6基因

2.1设计shRNA序列如下：

人AEP敲低：5’-GATGGTGTTCTACATTGAA-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

鼠AEP敲低：5’-GCTCCAATGGCTGGTATAATT-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

人TRAF6敲低:5’-GCCACGGGAAATATGTAATATCT-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

鼠TRAF6敲低：5’-CAGAGCTACTATGAGTCTC-3’(如SEQ ID NO.4所示)；

对照引物：5’-GTAGCGCGGTGTATTATAC-3’(如SEQ ID NO.5所示)；

恢复突变序列：AEP：5’-AATGGTATTTTATATCGAG-3’(如SEQ ID NO.6所示)；

TRAF6:5’-GCCACGGGAAATATGTAATATCT-3’(如SEQ ID NO.7所示)。

2.2shRNA敲低序列方法：将细胞提前一夜铺好；细胞长到80％-90％密度时，更换无双抗的培养基；按照每个3.5cm培养皿10μg质粒，添加10μL转染试剂(Lipo2000，Life SCI)的比例转入质粒；6小时候更换培养基；24小时后利用western blot进行表达鉴定。

3、定点突变、划痕实验、侵袭实验以及实验性肺转移模型

3.1定点突变：以待突变的AEP和Traf6质粒(中国科学院上海高等研究院-系统生物学-肿瘤靶向治疗实验室提供)为模板，用设计的引物及KOD-plus酶进行PCR扩增反应，获得目的基因突变。设计点突变引物和恢复突变引物如下：

(I)Flag-AEP(K318R)：

Forward:GAATATGGGGAATACAGATTCTGTTGTATTTAGCACCATTCAACATCCTCCCCGGGATA(如SEQ ID NO.8所示)；

Reverse:TATCCCGGGGAGGATGTTGAATGGTGCTAAATACAACAGAATCTGTATTCCCCATATTC(如SEQ ID NO.9所示)。

(II)Flag-TRAF6(C70A)

Forward:AAATCCAAGTGCGGGGATTCAAAGCACTTTTGCGCGTCTGGCGCTAAGTGGTGGATTAC(如SEQ ID NO.10所示)

Reverse:GTAATCCACCACTTAGCGCCAGACGCGCAAAAGTGCTTTGAATCCCCGCACTTGGATTT(如SEQ ID NO.11所示)

(III)Flag-TRAF6(K124R)

Forward:TTATGATGAGGTCGCTGCAGATCCTGGTTTTAGCGTTATTCAGAATTTTTCAGGGAGCG(如SEQ ID NO.12所示)

Reverse:CGCTCCCTGAAAAATTCTGAATAACGCTAAAACCAGGATCTGCAGCGACCTCATCATAA(如SEQ ID NO.13所示)

提取模板质粒DN A后，按如下样品反应体系(50μl反应体系)：

10×Reaction Buffer 5μl；Sample plasmid 2μl；Sample primer(F)(10pmol/μl)1μl；Sampleprimer(R)(10pmol/μl)1μl；dNTP mixture(each 2.5mM)2μl；dH₂O 38μl；KOD-plus Enzyme1μl。

按如下参数设置PCR扩增条件：1cycle 95℃30sec；20cycle 95℃30sec；55℃1min；68℃1min per plasmid kb。

PCR扩增反应完成后冰育5分钟，然后置于室温(避免反复冻融)。PCR反应结束后使用DpnI酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。准备PCR反应产物，加入1μl(10U/μl)DpnI酶37℃温育1小时，反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口，当把这个质粒DNA转入DH5α，将会被DH5α里面的T4连接酶连接好缺口。将10μl样品加到50μl感受态细胞里，然后放置在冰上30分钟，42℃热激90秒，200rpm复活45分钟，涂板，37℃培养过夜，挑白色单菌落进行测序分析，以便用于后续的分析位点突变而引起的效果变化实验。

3.2划痕实验：细胞接种于6-孔板，当细胞密度长到90％左右，用200μl枪头划痕，并分别拍照记录0小时和24小时的划痕区域，并用公式计算出迁移能力(1-[current woundsize/initial wound size])*100。

3.3侵袭实验：实验前先将细胞用无血清培养基培养12小时。将Matrigel铺于Transwell小孔上室，37℃凝结1小时后，将细胞铺于其上。小孔下室放入200μl含10％FBS的培养基，待24或48小时后，用结晶紫进行细胞染色，拍照并计数穿过的细胞。

3.4实验性肺转移模型：细胞通过尾静脉注射后，随即分组，并给于不同处理(生理盐水,纯化的AEP蛋白(4μg/per mouse/per time),mouse anti-human AEP抗体(2μg/permouse/per time,R&D,MAB2199)或AEP抑制剂)一周两次，连续给药10周。当小鼠(SPF级C57BL/6小鼠)体重明显减轻后，所有的小鼠用CO₂方法处死，取肺，固定。

在解剖显微镜下计数肺转移灶，包括直径小于0.5mm的转移灶。每组包括6-8只小鼠，重复3次。

4、HE染色观察肿瘤转移情况

二甲苯，5min；重复三次；100％酒精，5min；重复一次；95％酒精，5min；重复一次；70％酒精，5min；蒸馏水浸泡5min；苏木精，5min；流水冲洗；氨水，润洗；流水冲洗；伊红，1min；95％酒精，1min；100％酒精，1min；重复一次；二甲苯1min；重复一次；封片。

5、新鲜收集的乳腺癌和癌旁正常组织中检测AEP和TRAF6的表达情况

(1)样本

病人样本采集分析。乳腺癌肿瘤病人的肿瘤组织，癌旁正常组织和外周血样本收集于瑞金医院、上海交通大学医学院。样品的采集均经过病人的知情同意和机构审查委员会批准。所有的样品都病理明确诊断为乳腺癌。

(2)ELISA检测培养上清中的AEP：

按稀释一抗，100μl/孔，室温包板过夜。以洗液(0.05％Tween 20in PBS，400μl/孔)洗板三次后，每孔加入300μl封闭液(1％BSA,5％Sucrose in PBS)，室温封闭1h。

如上洗板三次后，加入细胞培养上清和标准品，室温孵育2h。洗板三次后，按优化浓度加入二抗，100μl/孔，室温孵育2h。洗板三次后，加入streptavidin-HRP，室温避光孵育45min。洗板三次后，加入底物100μl/孔，室温孵育约15min，待标准曲线出现较理想的颜色梯度时，每孔加入1M H₂SO₄50μl终止反应。Sunrise酶标仪以540nm为参考波长，450nm为测量波长检测OD值，计算含量。

(3)免疫组化分析组织表达AEP和Traf6的情况：

烤片65℃，20min；二甲苯，15min；重复三次；100％、95％、80％、70％酒精梯度水化，每次3min，水洗；抗原修复，98℃，10min，冷却至室温；0.3％双氧水(甲醇)放置20min，去除内源的酶活性；PBS洗片三次，每次5min；封闭液封闭30min；Goat anti-human legumainantibody(R&D,AF2199)或mouse anti-TRAF6antibody(Santa Cruz,D-10,sc-8409)1:50稀释，正常goat或mouse IgG(R&D,AB-108-C)作为阴性对照。4℃过夜；PBS洗片三次，每次5min；二抗孵育45min-1小时；PBS洗片三次，每次5min；Vectastain Kit ABC reagent,30min；PBS洗片三次，每次5min；DAB显色；苏木素染色1min；封片。

染色结束后，邀请瑞金医院的3个病理医生进行双盲统计，得出结论。

6、棉酮牛磺酸钠作用

棉酚衍生物降低AEP，抑制乳腺癌转移，延长生存时间。Balb C白鼠乳房接种4T1细胞5×10⁵个/只，待肿瘤体积达到200mm³时，对照组给与10％乙醇，治疗组给与用10％乙醇溶解的ch282-5，统计生存期，解剖对比观察乳腺癌肺转移情况。

(二)实验结果

1、AEP与TRAF6存在直接的结合

在乳腺癌细胞中，主要以前体形式的AEP为主，活性形式仅占很少一部分(图1.A)，蛋白定量分析结果表明，活性形式仅占了AEP蛋白总量的10％(图1.B)，由此可见，肿瘤中AEP有独特的功能和调控方式。通过运用生物信息学方法(http://elm.eu.org/)分析发现人源与鼠源的AEP均有保守的TRAF6结合位点P-X-E-X-X-(Aromatic/Acidic)(图1.D)，提示TRAF6可能是AEP的相互作用蛋白，接下来，构建AEP(HA-AEP)和TRAF6(Flag-TRAF6)表达质粒，共同转染到HEK293T细胞中，当在HEK293T细胞中过表达AEP时，前体和活性两种形式均存在(图1.C)。并且，双向免疫共沉淀实验结果表明HA-AEP和Flag-TRAF6存在相互作用(图1.E)。

2、TRAF6增加细胞内外的AEP蛋白水平

发现当MDA-MB-231(图2.A和图2.B)过表达TRAF6时，细胞内外的AEP蛋白含量显著增加，shRNA敲低TRAF6表达水平时，AEP的蛋白水平显著下降(图2.C和图2.D)。而这些变化并未伴随着mRNA的变化(图2.E和F)，提示AEP的蛋白增加主要是通过翻译后修饰机制。而TRAF6的突变体TRAF6NR(无RING结构域)或单独TRAF6-C域并无法如野生型TRAF6一样促进细胞内外AEP的增加，暗示着TRAF6的泛素E3连接酶功能对AEP蛋白水平的增加是至关重要的(图2.G)。

3、TRAF6调节的AEP泛素化修饰增强肿瘤的侵袭转移

划痕实验和Matrigel-Transwell侵袭实验发现，过表达野生型AEP的MDA-MB-231细胞具有更强的迁移和侵袭能力(图3.A)。反之，敲低AEP或TRAF6显著削弱了MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力(图3B,3C)。我们将MDA-MB-231(肺转移亚克隆-LM2)细胞尾静脉注射于裸鼠，8-9周后观察肺转移情况(图3.D,E和F)。AEP敲低后，肺转移结点灶显著减少，和野生型相比，结点数降低了90％，而用野生型AEP做恢复实验依然可见明显的转移灶结点，而用AEPE214A或AEPK318R恢复，肺转移灶和敲低AEP的相差不大(图3.E、F)，TRAF6的敲低几乎完全抑制了MDA-MB-231的肺转移能力，恢复实验进一步证实TRAF6在肿瘤侵袭和转移中的重要性(图3.D,E和F)。总而言之，细胞水平和动物水平的实验结果均证实TRAF6调节的AEP的多聚泛素修饰对肿瘤侵袭转移的重要性。

4、分泌型的AEP促进肿瘤侵袭转移

ELISA方法检测上述小鼠血清中的AEP蛋白水平发现，循环血中的AEP蛋白含量和肺转移灶数呈正比，暗示着分泌型的AEP极可能是肿瘤转移的重要部分。事实上，在培养基中梯度添加收集自AEP过表达细胞株的富含AEP的上清，肿瘤的迁移和侵袭能力逐步增加(图4.A和B)，直接添加AEP蛋白同样能够促进肿瘤侵袭(图4.C)，表明分泌的AEP可促进肿瘤侵袭和转移。而尾静脉注射AEP蛋白亦显著促进肿瘤转移灶的形成(图4.D和E)。相反，用高亲水的穿膜能力差的AEP抑制剂(Aza-Asn epoxides,AEPI)(图4.F)预处理富含AEP的上清，抑制其内切酶活性之后，细胞的迁移和侵袭能力明显受到抑制(图4.G)。同时，尾静脉注射AEP抑制剂或单克隆抗体以干扰循环系统中的AEP亦显著抑制了肿瘤的发生和发展(图4.A,B,G)。这些结果表明，分泌型的AEP对肿瘤发生发展起着重要作用。

5、过表达AEP和TRAF6与乳腺癌肿瘤病人的预后呈负相关

首先在新鲜收集的乳腺癌和癌旁正常组织中检测AEP和TRAF6的表达情况，发现AEP在乳腺癌组织中高表达(图5,A,B,C)。而病人样本的免疫共沉淀实验分析结果亦证实AEP和TRAF6的相互结合(图5.D)。收集了90例乳腺病人的血清样品，ELISA和免疫印迹实验结果都证实AEP在恶性乳腺癌患者的血清中大量存在，而在健康人和良性的乳腺纤维素瘤中表达很低(P<0.0001)(图5.E)。

收集了313例乳腺癌样本，并做成组织芯片。免疫组化法检测AEP的表达，统计分析表明AEP和TRAF6的表达有极强的相关性。跟踪随访134例肿瘤病人进行存活分析，高表达AEP或TRAF6的肿瘤病人预后明显必低表达的肿瘤病人差，中位生存时间显著降低(图5.F和G)。而AEP和TRAF6均高表达的肿瘤病人预后最差(图5.H)。AEP/TRAF6低表达的肿瘤病人平均存活时间是111个月[95％置信区间:108-115个月]，而高表达AEP/TRAF6的肿瘤病人仅为61个月[95％置信区间:42-79个月]。综上所述，这些结果表明AEP和TRAF6在乳腺癌中高表达，与肿瘤病人不良预后密切相关，是潜在的生物学指标和潜在的治疗靶点。

6、棉酚衍生物ch282-5下调AEP，抑制乳腺癌侵袭转移

发现棉酚衍生物——棉酮牛磺酸钠(ch282-5，图6.A)能够明显下调AEP，抑制乳腺癌细胞增殖和转移(图6.B,C)，划痕实验表明，ch282-5能够明显抑制4T1细胞迁移。

此外，还进行了动物实验检测，对比ch282-5给药物和对照组，我们发现，ch282-5能够明显延长4T1荷瘤小鼠的寿命，降低乳腺癌肺转移(图6.D,E)。这说明，AEP作为一种联合乳腺癌标志物的同时，也成为抑制乳腺癌转移的靶点之一。

Claims

1.一种用于乳腺癌诊断的联合肿瘤标志物，其特征在于，包括：天冬酰胺内肽酶和泛素连接酶TRAF6。

2.一种如权利要求1所述的联合肿瘤标志物在制备诊断试剂或试剂盒中的用途，其特征在于：所述诊断试剂或试剂盒用于诊断乳腺癌。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于：所述诊断试剂或试剂盒用于诊断乳腺癌的发生、侵袭或转移；

所述诊断试剂包括：特异性扩增天冬酰胺内肽酶或泛素连接酶TRAF6的编码基因的引物；特异性识别天冬酰胺内肽酶或泛素连接酶TRAF6的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗扩增天冬酰胺内肽酶或泛素连接酶TRAF6的抗体。

4.一种用于乳腺癌诊断的试剂盒，其特征在于，包括：检测天冬酰胺内肽酶或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂；以及检测泛素连接酶TRAF6或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述检测天冬酰胺内肽酶或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂，包括：特异性扩增天冬酰胺内肽酶的编码基因的引物；特异性识别天冬酰胺内肽酶的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗扩增天冬酰胺内肽酶的抗体；

所述检测泛素连接酶TRAF6或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂，包括：特异性扩增泛素连接酶TRAF6的编码基因的引物；特异性识别泛素连接酶TRAF6的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗泛素连接酶TRAF6的抗体；

所述试剂盒还包括：核酸提取试剂、PCR反应试剂、蛋白免疫印迹试剂或酶链免疫反应试剂。

6.一种如权利要求1所述的联合肿瘤标志物在制备预防或治疗乳腺癌的药物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述预防或治疗乳腺癌的药物包括：预防或治疗乳腺癌的发生、侵袭或转移的药物。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物包括：如式(I)所示的棉酮牛磺酸钠，或棉酮牛磺酸钠与药学上可接受的载体。

9.一种下调如权利要求1所述的联合肿瘤标志物表达的化合物在制备预防或治疗乳腺癌的药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述化合物包括：棉酮牛磺酸钠；

所述预防或治疗乳腺癌的药物包括：预防或治疗乳腺癌的发生、侵袭或转移的药物。