CN116904585A - 一种检测外泌体lncRNA的试剂在制备检测肾损伤的诊断剂中的应用 - Google Patents

一种检测外泌体lncRNA的试剂在制备检测肾损伤的诊断剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测外泌体lncRNA的试剂在制备检测肾损伤的诊断剂中的应用，其中，所述lncRNA包括NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT004088.2的lncRNA。本发明公开了能够将lncRNA应用于肾损伤生物标志物的制备，尤其是用来检测外源性化合物（例如庆大霉素硫酸盐）引起的肾损伤，检测的敏感度高且检测方法和试剂简单，能够被广泛应用于检测药物性肾损伤，其检测结果可靠，可以单独检测或者联合其他指标共同评价肾损伤。

Description

一种检测外泌体lncRNA的试剂在制备检测肾损伤的诊断剂中 的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测外泌体lncRNA的试剂在制备检测肾损伤的诊断剂中的用途。
背景技术
药物诱导的肾损伤是目前导致药物开发失败或者市售药品撤市的主要因素之一。肾脏容易受到药物损伤，原因如下：1）肾脏接受20–25%的静息心输出量，这使其比其他器官系统暴露于更多的循环药物，2）肾小管浓缩滤液，从而暴露于更高浓度的药物，3）转运体可进一步增加药物的细胞内浓度，4）肾小管具有较高的能量需求，使其容易受到肾毒性损伤。因此，药物引起的肾损伤在药物开发过程中很常见。不幸的是，传统的肾损伤血清标志物，如肌酐或尿素氮等，敏感性或特异性不高。比如肌酐的测定受非肌酐物质的影响，包括葡萄糖、尿酸、酮体、血红蛋白等，这可能导致血清肌酐值出现假阳性升高。血清肌酐还可能因独立于肾功能的非肾性因素而改变，如年龄、性别、肌肉质量、营养状况等。摄入肌酸补充剂或熟肉可导致血清肌酐升高，限制蛋白质饮食可导致血清肌酐降低。剧烈运动可以通过增加肌肉分解增加肌酐。此外，血清肌酐对肾脏储备的丧失不敏感，一个肾脏丧失或捐赠后，血清肌酐变化很小。BUN也会被非肾因素改变，如蛋白质摄入、分解代谢状态、上消化道出血、血容量状态等。
为了解决传统生物标志物灵敏性和特异性不足的问题，预测安全测试联盟（PSTC）组织了药物诱导肾损伤生物标志物研究，PSTC肾毒性工作组向FDA和欧洲药品管理局（EMEA）提交药物毒性研究和生物标志物性能分析后，7种肾脏损伤生物标志物已被限定用于非临床和临床药物开发，以帮助指导安全性评估。肾损伤分子-1（KIM-1）、白蛋白、总蛋白、B2M、Clusterin、TFF-3和胱抑素C被FDA和EMEA视为高度敏感和特异的尿生物标志物，用于在临床前研究和临床试验中监测药物诱导的肾损伤。然而，上述肾脏生物标志物均是在脏器出现损伤后才会有较明显的升高，进而达到诊断损伤的作用，但是，有时损伤较重时可能导致非常严重事件发生，尤其是对于心肌损伤而言，很多损伤是不可逆的，因此探索新的灵敏度和特异性更高，且能早期发现肾脏损伤的生物标志物尤为关键。
外泌体是细胞外囊泡的一种，细胞外囊泡分为三种：凋亡小体、微泡和外泌体。外泌体的产生过程涉及质膜的双重内陷和含有腔内小泡（ILV）的细胞内多泡体（MVB）的形成。ILV最终通过MVB融合到质膜，经过胞吐作用，以直径为40~160nm的外泌体形式分泌。外泌体的密度为1.15–1.19 g/mL。在其表面发现的四聚体跨膜蛋白CD63、CD9和CD81通常作为外泌体的表面生物标志物。同时，大多数细胞可分泌外泌体，它广泛存在于各种体液中，如血液、唾液、尿液、脑脊液等。外泌体将各种分子从亲代细胞运送到其他细胞，包括蛋白质、DNA、mRNA/miRNA、lncRNA等。外泌体的组成类似于亲代细胞，因此能够提供可追踪的亲本细胞的特异信息。扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜、动态光散射和纳米粒子跟踪分析广泛用于测量外泌体的物理特征，如囊泡的大小、分布和浓度。
长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200个核糖核苷酸的缺乏开放阅读框的非编码RNA分子，没有编码蛋白质的能力，或者编码功能有限。最初发现时被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，没有生物学作用。经过深入研究发现，lncRNA在细胞中参与了重要的调控过程，如：调节细胞分化、衰老、增殖、凋亡、坏死以及肿瘤的发生发展。研究发现，尽管与信使RNA相比，lncRNA比较倾向于以低水平表达，但是lncRNA表达比mRNA表达更具有细胞特异性，表明lncRNA可能是细胞命运的关键调节因子。同时有研究显示，lncRNA与肾脏相关疾病和损伤密切相关。但lncRNA数据库非常庞大（迄今共有172,216个），临床检测上尚未开发出与肾损伤尤其是外源性化合物（例如庆大霉素硫酸盐）引起的肾损伤密切相关的lncRNA。
目前已有大量研究报道，在病理条件下，许多外泌体lncRNA的表达水平与正常对照组显著不同，表明外泌体可以选择性地包装、分泌和运输lncRNA，并特异性地发挥生物学功能。外泌体可以保护lncRNA免受RNA酶的降解，因此它们可以稳定地存在于体液中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中药物性肾损伤生物标志物存在敏感度不高、检测方法过于复杂、试剂昂贵、需要联合其他指标共同评价肾损伤以及不能及时准确地预测药物性肾损伤等缺陷，提供了一种外泌体来源的长链非编码RNA（lncRNA）在制备检测肾损伤诊断剂中的用途及含其的试剂盒，以及检测外泌体来源的长链非编码RNA（lncRNA）的试剂在制备检测肾损伤诊断剂中的用途，及包含所述试剂的试剂盒或芯片的应用。所述的用途能够将lncRNA作为肾损伤生物标志物，尤其是用来检测外源性化合物（例如庆大霉素硫酸盐）引起的肾损伤，检测的敏感度高且检测方法和试剂简单，能够被广泛应用于及时检测药物性肾损伤，能在早期及时发现药物性肾损伤，其检测结果可靠，可以单独检测或者联合其他指标共同评价肾损伤。
本发明人对肾损伤进行长期研究，并经过大量实验，意外地发现一些外泌体来源的lncRNA可以作为外源性化合物（例如庆大霉素硫酸盐）引起的药物性肾损伤的特异性的生物标志物，在外源性化合物引起的药物性肾损伤的血浆中高表达，能够发挥其在制备肾损伤生物标志物中用途，从而检测由外源性化合物引起的肾损伤。
为了解决上述技术问题，本发明的一方面提供了一种血浆来源的外泌体lncRNA在制备检测肾损伤的诊断剂中的应用，所述lncRNA包括NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT004088.2的lncRNA。
在某些实施方案中，所述lncRNA作为唯一的肾损伤的生物标志物，或者所述lncRNA和常规的肾损伤的生物标志物联合使用。
在某些实施方案中，所述常规的肾损伤的生物标志物选自血清肌酐（CREA）、尿素氮（BUN）、肾损伤分子-1（Kim-1）。
在某些实施方案中，所述生物标志物通过检测样本中所述lncRNA的转录水平来定性和/或定量。
按照本领域常规，本发明所述转录水平的检测可以为RNA全转录组测序、实时荧光定量PCR检测或表达谱芯片。
在某些实施方案中，所述检测使用RNA全转录组测序；和/或，所述样本为血浆。
在某些实施方案中，所述肾损伤为外源性化合物引起的肾损伤。
在某些实施方案中，所述外源性化合物是庆大霉素硫酸盐。
本发明的另一方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包括检测lncRNA的试剂；所述lncRNA包括NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT004088.2的lncRNA。
在某些实施方案中，所述的试剂盒还包括微孔滤膜、氯化钠和庆大霉素硫酸盐中的至少一种。
在某些实施方案中，所述试剂为检测样本中所述lncRNA的转录水平的试剂。
本发明的另一方面提供一种芯片，所述芯片上设置包括检测lncRNA的试剂；所述lncRNA包括NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT004088.2的lncRNA。
在某些实施方案中，所述试剂为检测样本中所述lncRNA的转录水平的试剂。
本发明的另一方面提供用于检测NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT004088.2的lncRNA转录层面表达水平的试剂、如本发明方面所述的试剂盒或如本发明方面所述的芯片在制备用于检测肾损伤的产品中的应用。
在某些实施方案中，所述肾损伤为外源性化合物引起的肾损伤。
在某些实施方案中，所述外源性化合物是庆大霉素硫酸盐。
本发明的另一方面提供一种非诊断目的的检测肾损伤的方法，所述方法包括检测待测样本中的lncRNA的转录水平，所述lncRNA包括NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT004088.2的lncRNA。
本发明的另一方面提供一种用于肾损伤风险的预测系统，所述预测系统包括检测模块和分析判断模块；所述检测模块检测待测样本中的lncRNA的转录水平，并将转录水平数据传输至所述分析判断模块；所述分析判断模块通过使用PCR处理得到的所述转录水平数据，构建预测模型，分别预测样本肾损伤的概率和非肾损伤的概率，判断所述转录水平数据是否符合预设的判断条件，以预测样本肾损伤的风险，并输出预测结果；所述判断条件为肾损伤的概率非肾损伤的概率；
当所述转录水平数据满足所述判断条件时，输出预测结果为“具有肾损伤风险”；当所述转录水平数据不满足所述判断条件时，即肾损伤的概率小于非肾损伤的概率，输出预测结果为“不具有肾损伤风险”；
所述的标志物包括NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT004088.2的lncRNA。
在某些实施方案中，所述肾损伤为外源性化合物引起的肾损伤。
在某些实施方案中，所述外源性化合物是庆大霉素硫酸盐。
本发明的另一方面提供一种计算机可读存储介质，其存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时，可实现如本发明所述的方法的步骤，或实现如本发明所述的预测系统的功能。
本发明的另一方面提供一种电子设备，其包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序，所述处理器用于执行所述计算机程序以实现如本发明所述的方法的步骤，或实现如本发明所述的预测系统的功能。
为了解决上述技术问题，本发明的另一方面提供了一种检测的外泌体lncRNA的试剂在制备检测肾损伤的诊断剂中的应用，所述lncRNA包括NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT004088.2的lncRNA，所述肾损伤为庆大霉素硫酸盐引起的肾损伤。
在某些实施方案中，所述lncRNA作为唯一的肾损伤的生物标志物，或者所述lncRNA和常规的肾损伤的生物标志物联合使用。
在某些实施方案中，所述常规的肾损伤的生物标志物选自血清肌酐（CREA）、尿素氮（BUN）、肾损伤分子-1（Kim-1）。
在某些实施方案中，所述生物标志物通过检测样本中所述lncRNA的转录水平来定性和/或定量。
按照本领域常规，本发明所述转录水平的检测可以为RNA全转录组测序、实时荧光定量PCR检测或表达谱芯片。
在某些实施方案中，所述检测使用RNA全转录组测序；和/或，所述样本为血浆。
在某些实施方案中，所述试剂为特异性扩增所述外泌体lncRNA的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示。
本发明的另一方面提供一种芯片在制备用于检测肾损伤的产品中的应用，所述肾损伤为庆大霉素硫酸盐引起的肾损伤，所述芯片上设置如本发明前述的检测外泌体lncRNA的试剂。
本发明的另一方面提供一种芯片在制备用于检测肾损伤的产品中的应用，所述肾损伤为庆大霉素硫酸盐引起的肾损伤，所述芯片上设置如本发明前述的检测外泌体lncRNA的试剂。
本发明的另一方面提供一种用于肾损伤风险的预测系统，所述预测系统包括检测模块和分析判断模块；所述检测模块检测待测样本中的lncRNA的转录水平，并将转录水平数据传输至所述分析判断模块；所述分析判断模块通过使用PCR处理得到的所述转录水平数据，构建预测模型，分别预测样本肾损伤的概率和非肾损伤的概率，判断所述转录水平数据是否符合预设的判断条件，以预测样本肾损伤的风险，并输出预测结果；所述判断条件为肾损伤的概率非肾损伤的概率；
当所述转录水平数据满足所述判断条件时，输出预测结果为“具有肾损伤风险”；当所述转录水平数据不满足所述判断条件时，即肾损伤的概率小于非肾损伤的概率，输出预测结果为“不具有肾损伤风险”；
所述的lncRNA包括NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT004088.2的lncRNA。
本发明的另一方面提供一种计算机可读存储介质，其存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时，可实现如本发明所述的预测系统的功能，
或实现检测肾损伤的方法的步骤，所述方法包括检测待测样本中的lncRNA的转录水平，所述lncRNA包括NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT004088.2的lncRNA，所述肾损伤为庆大霉素硫酸盐引起的肾损伤。
本发明的另一方面提供一种电子设备，其包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序，所述处理器用于执行所述计算机程序以实现如本发明所述的预测系统的功能，
或实现检测肾损伤的方法的步骤，所述方法包括检测待测样本中的lncRNA的转录水平，所述lncRNA包括NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT004088.2的lncRNA，所述肾损伤为庆大霉素硫酸盐引起的肾损伤。
本发明的另一方面提供一种特异性扩增lncRNA的引物，所述lncRNA的NONCODETRANSCRIPT ID为NONRATT021116.2，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示。
在某些实施方案中，所述lncRNA为外泌体来源的lncRNA。
在符合本领域常识的基础上，上述各条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明公开了能够将外泌体来源的lncRNA应用于肾损伤生物标志物的制备，尤其是用来检测外源性化合物（例如庆大霉素硫酸盐）引起的肾损伤，检测的敏感度高且检测方法和试剂简单，能够被广泛应用于检测肾损伤，其检测结果可靠，可以单独检测或者联合其他指标共同评价肾损伤。
附图说明
图1为lncRNA的ROC曲线图。
图2为第一次大鼠肾损伤模型中，庆大霉素硫酸盐给药组大鼠血清肌酐、尿素氮、Kim-1活性的改变，其中﹡代表与溶媒组相比P<0.05。
图3为预测肾损伤风险的系统的结构示意图。
图4为电子设备的结构示意图。
图5为第二次大鼠肾损伤模型中，庆大霉素硫酸盐给药组大鼠血清肌酐、尿素氮、Kim-1活性的改变，其中﹡代表与溶媒组相比P<0.05。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1 寻找肾损伤生物标志物
1.1肾损伤模型的建立
1.1.1实验试剂和仪器、实验动物
（1）阳性药：庆大霉素硫酸盐（批号：WXBD5416V，购自Sigma-Aldrich）；
（2）溶媒对照品：0.9%氯化钠溶液（批号：21111304B，购自安徽双鹤药业有限责任公司）；
CREA、BUN检测试剂盒由日本和光纯药工业株式会社生产
Kim-1检测试剂盒由r&d systems生产；
HITACHI 7060型全自动生化分析仪购于日本日立产业株式会社。
（3）实验动物
雄性SD大鼠10只，雌性大鼠10只，SPF级，体重180~320g，6~15周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2021-0011]。动物采用芯片和笼牌标识，5只/笼，动物饲养于上海益诺思生物技术股份有限公司的SPF级动物房，动物房温度控制在22~26摄氏度，湿度控制在40~70%之间，每分钟通气次数≥15次，12小时/12小时的明暗光照周期，动物自由摄食，经钴60辐照灭菌的SPF大鼠维持饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供，动物通过饮水瓶自由饮用自制的去离子水。
1.1.2 实验方法
1.1.2.1 阳性药的配制
庆大霉素硫酸盐溶液配制：称量480mg庆大霉素硫酸盐，转移至烧杯中并加入适量的0.9％氯化钠注射液。用玻璃棒初步进行搅拌，加入转子，打开磁力搅拌器，充分分散后关机，加入0.9％氯化钠注射液至所需体积（12mL）后将其混匀，以保证上下均一性，随后使用0.22μm的微孔滤膜过滤保证无菌。2~8℃、避光、放置待用。配制过程需避光。
1.1.2.2 动物试验剂量设置
采用随机区组设计的分组，将20只大鼠根据体重随机分配到2组：溶媒对照组（0.9%氯化钠溶液）、给药组（80mg/kg庆大霉素硫酸盐），详见表1。
表1 实验剂量设计
1.1.2.3 给药及观察检查
溶媒对照组和庆大霉素硫酸盐给药组的给药途径均为经口灌胃给药，单次给药，给药容量为10 mL/kg。给药体积根据最近一次测得的体重进行计算。
在给药后14天后，采用40mg/mL舒泰+5mg/mL赛拉嗪注射液混合制剂麻醉，腹主动脉采集全血少部分置于分离胶真空采血管中用于血清的分离：3500 rpm，4℃，5 min，吸取血清分装于EP管中，保存于-80℃冰箱，用于肾功能指标的检测。大部分置于EDTA-K2真空采血管中用于分离血浆：800g，4℃，10min，吸取上层血浆分装于EP管中，保存于-80℃冰箱，用于进行外泌体RNA全转录组测序。
1.1.2.4 血清生化检测结果
本实验主要检测了临床前和临床中肾损伤评价普遍使用的血液学指标血清肌酐（CREA）、尿素氮（BUN）、肾损伤分子-1（Kim-1）的变化。如图2结果显示，80 mg/kg庆大霉素硫酸盐给药14天后，给药组大鼠血清中血清肌酐（CREA）、尿素氮（BUN）、肾损伤分子-1（Kim-1）与溶媒对照组相比显著性升高（*：P<0.05）。
1.1.2.5 组织病理学检查结果
肾脏组织病理学检查显示，溶媒对照组大鼠未见明显异常，给药组雌雄大鼠可见局灶性炎细胞浸润和不同程度的嗜碱性小管及肾小管管型。
1.1.2.6 结论
本部分实验采用SD大鼠肌肉注射给予80 mg/kg庆大霉素硫酸盐和0.9%氯化钠，14天后采血进行血清生化检测和组织病理学检查，考察庆大霉素硫酸盐诱导的肾损伤情况。
在血清生化检测中，给药14天后，80 mg/kg APAP组动物的CREA、BUN、Kim-1均显著升高。病理组织学检查主要可见不同程度肾细胞坏死，并伴炎细胞浸润，嗜碱性小管病变。
综上可见，SD大鼠肌肉注射给予庆大霉素硫酸盐后成功地诱导了大鼠肾损伤，因此庆大霉素硫酸盐诱导肾损伤模型成立，可用于肾损伤生物标志物的筛选和验证。
1.2 外泌体RNA全转录组测序
1.2.1 外泌体抽提
采用 exoRNeasy Serum/Plasma Maxi kit （Qiagen） 试剂盒，根据生产厂商提供的标准操作流程进行操作，分离样本中的外泌体。
步骤如下：
1)500uL 血浆样本-80 ℃取出，25 ℃水浴解冻；
2)13000g， 4℃离心 10 分钟
3)按照 1:1 的样本体积加入 Buffer XBP，上下颠倒 5 次；
4)样本与 Buffer XBP 混合液转移至 exoEasy spin column，500g 4℃离心1min；弃除底部废液；
5)加入 3.5m 的 Buffer XWP 到 exoEasy spin column 中，5000g 4℃离心 5分钟；弃除底部废液；
6)转移 spin column 到新的收集管中；
7)加入 200uL Buffer XE，5000g 4℃离心 5 分钟收集底部外泌体到 1.5mL 离心管中；
8)外泌体分装，-80℃保存。
1.2.2 外泌体相关指标鉴定
1.2.2.1 外泌体标志物 WB 鉴定
取一定量外泌体的PBS重悬液，加入等体积的RIPA（强）裂解液进行裂解提取蛋白，之后进行蛋白浓度测定以及WB检测外泌体标志物。
1.2.2.2 外泌体纳米微粒追踪检测（NTA）
1)取冻存样本，25 ℃水浴解冻，冰上放置；
2)取外泌体样本用 1×PBS 进行稀释，直接用于 NTA 检测。
3)测试所用仪器信息
仪器名称：纳米粒度颗粒跟踪分析仪
生产公司：PARTICLE METRIX
仪器型号：ZetaVIEW S/N 17-310
分析用软件版本：ZetaView 8.04.02
1.2.3 RNA质量鉴定
测序实验起始样本为总RNA，外泌体总RNA由QIAGEN exoRNeasy Midi Kit（CatNo./ID: 77144）试剂盒获得，由Agilent 4200 TapeStation进行质检，质检合格的RNA可进行后续的全转录组测序。
1.2.4 文库构建与质检
分离外泌体进而抽提得到的总RNA，用针对外泌体 RNA 的超高敏微量样本链特异性试剂盒进行建库，构建的文库使用 Qubit® 2.0 Fluorometer 检测浓度，Agilent2100检测文库大小。
1.2.5 上机测序
质检合格的文库，准备进行 Illumina 测序，测序策略为 PE150。测序基本原理为边合成边测序（SBS，Sequencing by Synthesis）：将携有 cluster 的 flow cell 上机，并在 flow cell 中加入四种荧光标记的 dNTP、DNA 聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的 dNTP 就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。
1.2.6 数据质控
获得测序原始数据（Raw Data）后，首先需要对数据进行过滤、去接头序列及对低质量 reads 进行处理，再对测序质量进行评估，重复检验获得高质量数据（Clean Data）。并将 Clean Data 与参考基因组进行比对，对已知 mRNA 和 lncRNA 进行定量分析；未比对上的 reads 采用 ACFS 分析环状 RNA。
1.2.7 数据预处理
原始测序数据中含有测序接头序列，也有些 reads 中含有质量较低的碱基、reads 末端质量偏低等不合格情况，这些可能影响到后续分析结果的可靠性，故在此先对原始数据进行预处理，去除接头序列、低质量 reads。数据预处理软件使用 Seqtk。
主要步骤如下：
1)去除 reads 中所含有的接头序列；
2)去除 3’端质量 Q 低于 20 的碱基，即碱基错误率小于 0.01，其中，Q=-10log（error_ratio）；
3)去除长度小于 25 的 reads；
4)去除所属物种的 ribosome RNA reads。
经过原始数据预处理后，得到后续分析使用的 clean reads。
1.2.8 比对分析
使用 HISAT2 软件将预处理后的测序序列进行基因组 mapping 分析。通常我们将 clean no RNA reads 比对到基因组，这也是后续分析的基础。HISAT2 采用全局和局部搜索的方法，能够高效进行 mapping，且能够有效比对到 RNA Seq 测序数据中的 splicedreads，参数设置默认参数，参考基因组版本为 Rnor_6.0.95，结果为 BAM 文件。
1.2.9 lncRNA 定量与差异分析
1.2.9.1 新lncRNA预测
应用 cufflinks（version:2.1.1）中的 cuffcompare 将 mapping 得到的注释信息与参考注释（NONCODE 和 Ensembl 数据库）进行比较，得到未能与已知注释基因匹配的新转录本，提取{i、u、x}三类转录本进行 lncRNA 预测，具体步骤如下：
1)转录长度大于 200bp 且 exon > 2；
2)覆盖 fragment counts > 3；
3)预测的 ORF < 300；
4)PhyloCSF（目前仅限于人、大小鼠）、Pfam、CPC、CNCI预测，对4种（或3种）预测结果取交集，选择PhyloCSF score <0 & Pfam比对不显著&CPC score<0&CNCI score<0的转录本作为潜在的lncRNA。
5)与已知lncRNA比较，去除与known lncRNA相同的序列。
1.2.9.2 lncRNA表达定量
应用 Stringtie（version:1.3.0）对预测的 novel lncRNA 和 NONCODE 数据库（version: NONCODE 2016；http://www.noncode.org/），以及 Ensembl 数据库中的已知lncRNA 进行表达定量。其中MSTRG开头的ID为novel lncRNA，NON开头的ID为数据库中已知的lncRNA，ENS开头的ID为Ensembl 数据库中已知的 lncRNA。
1.2.9.3 lncRNA差异表达分析
应用 edgeR 进行样本间差异 lncRNA 分析。并对差异的 lncRNA 进行火山图和Heatmap 图绘制展示。
1.2.9.4 lncRNA 靶基因预测与靶基因富集分析
lncRNA与 mRNA的相互作用关系分为顺式（cis）与反式（trans），这种与lncRNA发生相互作用关系的mRNA被称为lncRNA的靶基因。
高通量测序得到的差异基因比较多，从几百到上千都有可能。为更好的理解这些差异基因可能在细胞中行使的生物学功能或者可能扰动的信号通路，我们对差异的基因进行 Gene Ontology 及 KEGG 数据库的注释与功能富集。
1.3 全转录组测序结果
1.3.1 概述
利用聚类分析绘制样本中差异有统计学意义（P<0.05）且log2FC（Fold changes，FC）值>2倍以上变化且至少一组count最小值>10的lncRNA。结果显示（表2中列出了部分lncRNA的变化倍数）：与溶媒对照组比较，给药组log2FC（abs，绝对值）3倍以上变化且p<0.05的有15条，均为上调的lncRNAs；5倍以上变化且p<0.05的有5条，均为上调的lncRNAs。提示这些差异表达的lncRNA可能与药物性肾损伤发生，发展及分子调控密切相关。其中lncRNA（NONCODE TRANSCRIPT ID: NONRATT004088.2）在给药组大鼠血浆外泌体中的表达量是溶媒对照组中的12.72倍。
表2 部分lncRNA的变化倍数
1.3.2 GO分析结果
差异表达基因利用 Fisher 精确检验进行GO分析。Fisher 精确检验计算得到 p-value，并进行多重假设检验校正得到q-value。筛选 q-value 小于 0.05的 GO 条目作为显著富集的GO条目。GO功能注释分析发现，差异表达的lncRNAs的靶基因mRNAs主要集中在生物学过程：脂肪酸的稳态；分子功能：tRNA甲基转移酶活性，SNAP受体活性。
1.3.3 KEGG分析结果
进一步对差异表达的lncRNAs预测靶基因mRNAs进行KEGG分析。与GO分类统计类似，对KEGG各个pathway大类上的差异表达基因数目进行统计。KEGG分析发现差异表达的lncRNAs预测靶基因mRNAs主要集中在机体系统：免疫系统，内分泌系统；代谢通路：整体代谢通路；细胞通路：信号传导，运输和分解。提示差异表达的lncRNAs可能通过调控预测靶基因mRNAs从而参与这些通路的调节。
1.4大鼠肾损伤模型的二次建立
另取雄性SD大鼠10只，雌性大鼠10只，SPF级，体重180~320g，6~15周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2021-0011] ，按照前述步骤1.1的方法进行二次大鼠肾损伤模型的建立。
1.4.1给药及观察检查
溶媒对照组和庆大霉素硫酸盐给药组的给药途径均为经口灌胃给药，单次给药，给药容量为10 mL/kg。给药体积根据最近一次测得的体重进行计算。
在给药后14天后，采用40mg/mL舒泰+5mg/mL赛拉嗪注射液混合制剂麻醉，腹主动脉采集全血少部分置于分离胶真空采血管中用于血清的分离：3500 rpm，4℃，5 min，吸取血清分装于EP管中，保存于-80℃冰箱，用于肾功能指标的检测。大部分置于EDTA-K2真空采血管中用于分离血浆：800g，4℃，10min，吸取上层血浆分装于EP管中，保存于-80℃冰箱，用于进行外泌体RNA全转录组测序。
1.4.2 血清生化检测结果
本实验主要检测了临床前和临床中肾损伤评价普遍使用的血液学指标血清肌酐（CREA）、尿素氮（BUN）、肾损伤分子-1（Kim-1）的变化。如图5结果显示，80 mg/kg庆大霉素硫酸盐给药14天后，给药组大鼠血清中血清肌酐（CREA）、尿素氮（BUN）、肾损伤分子-1（Kim-1）与溶媒对照组相比显著性升高（*：P<0.05）。
1.4.3组织病理学检查结果
肾脏组织病理学检查显示，溶媒对照组大鼠未见明显异常，给药组雌雄大鼠可见局灶性炎细胞浸润和不同程度的嗜碱性小管及肾小管管型。
1.4.4 结论
本部分实验采用SD大鼠肌肉注射给予80 mg/kg庆大霉素硫酸盐和0.9%氯化钠，14天后采血进行血清生化检测和组织病理学检查，考察庆大霉素硫酸盐诱导的肾损伤情况。
在血清生化检测中，给药14天后，80 mg/kg 庆大霉素硫酸盐组动物的CREA、BUN、Kim-1均显著升高。病理组织学检查主要可见不同程度肾细胞坏死，并伴炎细胞浸润，嗜碱性小管病变。
综上可见，SD大鼠肌肉注射给予庆大霉素硫酸盐后成功地诱导了大鼠肾损伤，因此庆大霉素硫酸盐诱导肾损伤模型成立，可用于肾损伤生物标志物的验证。
1.5 实时定量PCR验证
验证时使用样品为上述二次造模后采集的血浆，使用QIAGEN exoRNeasy MidiKit（Cat No./ID: 77144）试剂盒获得外泌体总RNA。
1.5.1 试剂
反转录试剂: TOYOBO ReverTra Ace qPCR RT Kit
定量 PCR 试剂: ABI Power SYBR Green PCR Master Mix
引物合成：上海生工生物工程有限公司
1.5.2 仪器：
定量 PCR 仪: ABI 7500 实时荧光定量 PCR 系统
1.5.3 实验步骤
1.5.3.1 cDNA 第一链合成
1）从-80℃冰箱中取出RNA，在4℃下解冻，然后在0.2 ml PCR管中配制反应溶液，如表3所示，其中X1和X2的值根据不同样品抽提的RNA浓度不同，根据浓度换算取用的体积。
表3 反应溶液体系
2）将PCR管置于PCR仪，运行程序：37℃孵育15 min，98℃变性5 min，4℃，保温。
1.5.3.2 SYBR Green qPCR
1）在 0.2ml PCR 管中配制反应液，如表4所示，其中X3的值根据不同样品cDNA浓度不同，根据浓度换算取用的体积。
表4 反应溶液体系
在表4中，NONRATT004088.2的上游引物序列为（SEQ ID NO: 1）：CTCACAGTGGCCTTTCTTGCTTA，NONRATT004088.2的下游引物序列为（SEQ ID NO: 2）：CCACCAGCACATCCCAAAC。内参基因GAPDH的上游引物序列为（SEQ ID NO: 3）：TGGCCTCCAAGGAGTAAGAAAC，内参基因GAPDH的下游引物序列为（SEQ ID NO: 4）：GGCCTCTCTCTTGCTCTCAGTATC。
2）将反应液加入 96 孔板中
3）将96孔板置于 ABI 7500 实时荧光定量 PCR 仪中。运行程序：50 ℃孵育2min；95℃，10min；40个循环：95℃，15 秒，60℃，1min。
1.6 ROC曲线
使用MedCalc （version 20.2）进行ROC（Receiver operating characteristiccurves）曲线的绘制。lncRNA的ROC曲线图如图1所示。
AUC=0.500，敏感性为50%，特异性为83.33%，由此可见，该lncRNA在区别给药组大鼠和对照组大鼠方面具有一定意义。
1.7 特异性验证
1.7.1 实验试剂和仪器、实验动物
（1）阳性药：对乙酰氨基酚（批号：D2114266，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；
（2）溶媒对照品：0.5%羧甲基纤维素钠（0.5%CMC-Na）；
CREA、BUN检测试剂盒由日本和光纯药工业株式会社生产
Kim-1检测试剂盒由r&d systems生产；
HITACHI 7060型全自动生化分析仪购于日本日立产业株式会社。
（3）实验动物
雄性SD大鼠10只，雌性大鼠10只，SPF级，体重180~320g，6~9周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2021-0011]。动物采用芯片和笼牌标识，5只/笼，动物饲养于上海益诺思生物技术股份有限公司的SPF级动物房，动物房温度控制在22~26摄氏度，湿度控制在40~70%之间，每分钟通气次数≥15次，12小时/12小时的明暗光照周期，动物自由摄食，经钴60辐照灭菌的SPF大鼠维持饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供，动物通过饮水瓶自由饮用自制的去离子水。
1.7.2 实验方法
1.7.2.1 阳性药的配制
对乙酰氨基酚（APAP）的混悬液配制：分别称量3.75 g对乙酰氨基酚，转移至玻璃瓶中并加入适量的0.5% CMC-Na（W/W）。用玻棒初步进行搅拌，打开匀浆机进行工作，充分分散后关机，加入0.5% CMC-Na至所需体积后将其混匀，配制成1250 mg/kg的混悬液，保证上下均一性，室温、避光、放置待用。配制过程需避光。
1.7.2.2 动物试验剂量设置
采用随机区组设计的分组，将20只大鼠根据体重随机分配到2组：溶媒对照组（0.5%CMC-Na）、给药组（1250mg/kg对乙酰氨基酚），详见表5。
表5 实验剂量设计
1.7.2.3 给药及观察检查
溶媒对照组和对乙酰氨基酚给药组的给药途径均为经口灌胃给药，单次给药，给药容量为10 mL/kg。给药体积根据最近一次测得的体重进行计算。
在给药后24小时后，采用40mg/mL舒泰+5mg/mL赛拉嗪注射液混合制剂麻醉，腹主动脉采集全血少部分置于分离胶真空采血管中用于血清的分离：3500 rpm，4℃，5 min，吸取血清分装于EP管中，保存于-80℃冰箱，用于肝功能指标的检测。大部分置于EDTA-K2真空采血管中用于分离血浆：800g，4℃，10min，吸取上层血浆分装于EP管中，保存于-80℃冰箱，用于随后的PCR验证。
1.7.2.4 血清生化检测结果
本实验主要检测了临床前和临床中肾损伤评价普遍使用的血液学指标血清肌酐（CREA）、尿素氮（BUN）、肾损伤分子-1（Kim-1）。1250 mg/kg对乙酰氨基酚给药24 h后，给药组大鼠血清中CREA、BUN、Kim-1与溶媒对照组相比略有升高，但不存在显著性差异。
1.7.2.5 PCR验证
具体过程同1.5。PCR验证结果显示，该lncRNA未在肝脏损伤模型中升高，因此，显示出它具有良好的特异性。
1.8 总结
本实验大鼠血浆外泌体的lncRNA测序结果显示，外泌体中差异表达的lncRNA数量较多，通过log2FC选择下一步研究对象时，比log2FC值大的部分lncRNA，由于设计引物技术限制，在众多设计平台中无法获得引物结果或得到计算机设计的引物但在实际实验中验证失败。其中lncRNA（NONCODE TRANSCRIPT ID: NONRATT004088.2）在给药组大鼠血浆外泌体中的表达量是溶媒对照组中的12.73倍，表达差异倍数非常高，说明lncRNA（NONCODETRANSCRIPT ID: NONRATT004088.2）可以作为一种肾损伤生物标志物检测外源性化合物（例如庆大霉素硫酸盐）引起的肾损伤。
二次造模后使用实时荧光定量PCR进行验证，验证结果显示：lncRNA（NONCODETRANSCRIPT ID: NONRATT004088.2）在给药组大鼠血浆外泌体中的表达量是溶媒对照组中的3.08倍（p<0.05）。这证明了使用NONRATT004088.2作为生物标志物时，能够及时检测，检测结果可靠，说明使用NONRATT004088.2作为生物标志物针对外源性化合物（例如庆大霉素硫酸盐）引起的肾损伤的检测具有良好的特异性。
使用ROC曲线考察lncRNA（NONCODE TRANSCRIPT ID: NONRATT004088.2）能否较好地区别给药组大鼠及对照组大鼠。曲线下面积AUC=0.500，显示出该lncRNA具有一定的鉴别能力。除前述无法设计出引物的lncRNA和lncRNA（NONCODE TRANSCRIPT ID:NONRATT004088.2）外，其他备选lncRNA的AUC数值大都低于0.500，NONRATT004088.2为差异表达倍数较高同时AUC较大的lncRNA，在本批次筛选的lncRNA中最具有成为诊断标志物的潜力。
通过使用对乙酰氨基酚建立大鼠肝脏损伤模型，考察lncRNA（NONCODETRANSCRIPT ID: NONRATT004088.2）的特异性。PCR验证结果显示，该lncRNA未在肝脏损伤模型中升高，因此，显示出它具有良好的特异性。
实施例2 预测肾脏损伤风险的系统
预测肾脏损伤风险的系统61：数据处理模块52和判断并输出模块53，还包括数据收集模块51（图3）。
数据收集模块51用于收集患者肾脏损伤组织样本中所述生物标志物组合的表达水平数据，并将其传输给数据处理模块。
数据处理模块52用于将接收或输入生物标志物组合的表达水平数据按如实施例4所述的数据分析方法进行分析，得到计算结果。其中，所述生物标志物组合的表达水平数据可通过数据收集模块51进行收集，亦可从其他来源获取所述生物标志物组合的表达水平数据。
判断并输出模块53用于判断所述的计算结果是否符合预设的判断条件，即患肾脏损伤风险概率大于或等于不患肾脏损伤风险预测概率，以预测肾脏损伤风险，并输出预测结果；其中，在所述判断并输出模块中，当所述表达水平数据满足所述判断条件患肾脏损伤风险概率大于或等于不患肾脏损伤风险预测概率时，输出预测结果为“具有肾脏损伤风险”；当所述表达水平数据不满足所述判断条件患肾脏损伤风险概率小于不患肾脏损伤风险预测概率时，输出预测结果为“不具有肾脏损伤风险”。
实施例3 电子设备
本实施例提供了一种电子设备，电子设备可以通过计算设备的形式表现（例如可以为服务器设备），包括存储器、处理器及存储在存储器上并可在处理器上运行的计算机程序，其中处理器执行计算机程序时可以实现本发明实施例1中预测肾脏损伤风险的方法。
图4示出了本实施例的硬件结构示意图，电子设备4具体包括：
至少一个处理器91、至少一个存储器92以及用于连接不同系统组件（包括处理器91和存储器92）的总线93，其中：
总线93包括数据总线、地址总线和控制总线。
存储器92包括易失性存储器，例如随机存取存储器（RAM）921和/或高速缓存存储器922，还可以进一步包括只读存储器（ROM）923。
存储器92还包括具有一组（至少一个）程序模块924的程序/实用工具925，这样的程序模块924包括但不限于：操作系统、一个或者多个应用程序、其它程序模块以及程序数据，这些示例中的每一个或某种组合中可能包括网络环境的实现。
处理器91通过运行存储在存储器92中的计算机程序，从而执行各种功能应用以及数据处理，例如本发明实施例1的数据分析方法。
电子设备9进一步可以与一个或多个外部设备94（例如键盘、指向设备等）通信。这种通信可以通过输入/输出（I/O）接口95进行。并且，电子设备9还可以通过网络适配器96与一个或者多个网络（例如局域网（LAN），广域网（WAN）和/或公共网络，例如因特网）通信。网络适配器96通过总线93与电子设备9的其它模块通信。应当明白，尽管图中未示出，可以结合电子设备9使用其它硬件和/或软件模块，包括但不限于：微代码、设备驱动器、冗余处理器、外部磁盘驱动阵列、RAID（磁盘阵列）系统、磁带驱动器以及数据备份存储系统等。
应当注意，尽管在上文详细描述中提及了电子设备的若干单元/模块或子单元/模块，但是这种划分仅仅是示例性的并非强制性的。实际上，根据本申请的实施方式，上文描述的两个或更多单元/模块的特征和功能可以在一个单元/模块中具体化。反之，上文描述的一个单元/模块的特征和功能可以进一步划分为由多个单元/模块来具体化。
实施例4 计算机可读存储介质
本发明实施例提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，程序被处理器执行时实现本发明实施例1中预测肾脏损伤风险的方法的步骤。
其中，可读存储介质可以采用的更具体可以包括但不限于：便携式盘、硬盘、随机存取存储器、只读存储器、可擦拭可编程只读存储器、光存储器件、磁存储器件或上述的任意合适的组合。
在可能的实施方式中，本发明还可以实现为一种程序产品的形式，其包括程序代码，当所述程序产品在终端设备上运行时，所述程序代码用于使所述终端设备执行实现本发明实施例1中预测肾脏损伤风险的方法的步骤。
其中，可以以一种或多种程序设计语言的任意组合来编写用于执行本发明的程序代码，所述程序代码可以完全地在用户设备上执行、部分地在用户设备上执行、作为一个独立的软件包执行、部分在用户设备上部分在远程设备上执行或完全在远程设备上执行。

Claims (11)

1.一种检测外泌体lncRNA的试剂在制备检测肾损伤的诊断剂中的应用，其特征在于，所述lncRNA包括NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT004088.2的lncRNA，所述肾损伤为庆大霉素硫酸盐引起的肾损伤。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述lncRNA作为唯一的肾损伤的生物标志物，或者所述lncRNA和常规的肾损伤的生物标志物联合使用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述常规的检测肾损伤生物标志物选自血清肌酐、尿素氮、肾损伤分子-1中的至少一个。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测生物标志物通过样本中所述lncRNA的转录水平来定性和/或定量。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测使用RNA全转录组测序；和/或，所述样本为血浆。
6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂为特异性扩增所述外泌体lncRNA的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示。
7.一种试剂盒在制备用于检测肾损伤的产品中的应用，其特征在于，所述肾损伤为庆大霉素硫酸盐引起的肾损伤，所述试剂盒包括如权利要求1-6任一项中所定义的检测外泌体lncRNA的试剂。
8.一种芯片在制备用于检测肾损伤的产品中的应用，其特征在于，所述肾损伤为庆大霉素硫酸盐引起的肾损伤，所述芯片上设置如权利要求1-6任一项中所定义的检测外泌体lncRNA的试剂。
9.一种用于肾损伤风险的预测系统，其特征在于，所述预测系统包括检测模块和分析判断模块；所述检测模块检测待测样本中的lncRNA的转录水平，并将转录水平数据传输至所述分析判断模块；所述分析判断模块通过使用PCR处理得到的所述转录水平数据，构建预测模型，分别预测样本肾损伤的概率和非肾损伤的概率，判断所述转录水平数据是否符合预设的判断条件，以预测样本肾损伤的风险，并输出预测结果；所述判断条件为肾损伤的概率非肾损伤的概率；
当所述转录水平数据满足所述判断条件时，输出预测结果为“具有肾损伤风险”；当所述转录水平数据不满足所述判断条件时，即肾损伤的概率小于非肾损伤的概率，输出预测结果为“不具有肾损伤风险”；
所述的lncRNA包括NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT004088.2的lncRNA，所述肾损伤为庆大霉素硫酸盐引起的肾损伤。
10.一种计算机可读存储介质，其存储有计算机程序，其特征在于，所述计算机程序被处理器执行时，可实现如权利要求9所述的预测系统的功能，
或实现检测肾损伤的方法的步骤，所述方法包括检测待测样本中的lncRNA的转录水平，所述lncRNA包括NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT004088.2的lncRNA，所述肾损伤为庆大霉素硫酸盐引起的肾损伤。
11.一种电子设备，其包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序，其特征在于，所述处理器用于执行所述计算机程序以实现如权利要求9所述的预测系统的功能，
或实现检测肾损伤的方法的步骤，所述方法包括检测待测样本中的lncRNA的转录水平，所述lncRNA包括NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT004088.2的lncRNA，所述肾损伤为庆大霉素硫酸盐引起的肾损伤。
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