CN116926189B - 外泌体lncRNA在检测药源性心肌损伤中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种外泌体lncRNA在检测药源性心肌损伤中的应用。所述外泌体lncRNA的NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT019595.2。所述药源性心肌损伤为外源性化合物盐酸异丙肾上腺素引起的心肌损伤。本发明还公开了一种检测外泌体lncRNA的试剂在制备检测大鼠药源性心肌损伤的产品中的应用，以及一种试剂盒或芯片在制备检测大鼠药源性心肌损伤的产品中的应用。本发明公开的药源性心肌损伤生物标志物外泌体lncRNA检测的敏感度高且检测方法和试剂简单，其检测结果可靠，敏感性为100%，特异性为66.67%，可以单独检测或者联合其他指标共同评价心肌损伤。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种外泌体lncRNA在检测药源性心肌损伤中的应用。
背景技术
心脏通过收缩舒张作用促进血液的流动，完成体内物质运输，是机体非常重要的器官，一旦心脏受到损伤，将产生非常严重的后果。而在人类的生活中存在许多具有心脏毒性的物质如一氧化碳、砷及硝基芳香族化合物等，这些物质能够引发心血管系统损伤，导致心血管疾病。同时，药源性心脏毒性已超过肝毒性成为导致药物撤市及新药研发失败的首要原因。传统的外源性化合物心脏毒性体外研究主要以检测化合物对心肌细胞离子通道或心肌细胞及组织动作电位影响，但是由于种属差异等问题尚不能完全解释心脏毒性的机制，因此急需建立发现和确证新的心肌损伤生物标志物，能够早期发现心肌损伤，并可以反映心肌损伤的改善或加重，甚至能反映损伤的机制。
药物诱导的心脏毒性（Drug Induced Myocardial Injury，DIC）是指由于药物和/或其代谢产物引起的心肌损伤，其可以发生于以往没有心脏病史的健康者或原来就有严重疾病的病人，在使用某种药物后对心血管系统造成多种复杂的病理生理损害，在临床上可发展为心肌炎、心肌病、心律失常、心瓣膜损害、心肌缺血及与心肌梗死等一系列心脏功能和器质性的改变。调查显示45%的药物上市后因心血管不良反应撤市，约30%的新药因心血管毒性被迫终止研发。在临床实践中，抗肿瘤药物是引起心脏毒性最常见的药物，其中蒽环类药物是心脏毒性最为明确、发生率最高、程度最为严重的抗肿瘤药物。
针对DIC可能导致严重的临床不良事件发生，2012年2月，FDA接受O'Brien等人申请，认可血清/血浆中心肌肌钙蛋白T（c Tn T）和肌钙蛋白I（c Tn I）作为药物诱导的心脏毒性生物标志物。此外，国际人用药品注册技术协调会（ICH）早在2005年10月，就发布了非临床（S7B）和临床试验（E14）指南关于如何评估药物诱发QT/QTc间期延长与心律不齐的潜在风险。这两部指南被FDA和多国药政监管机构接受，以帮助医药企在新药研发过程中全面深入地评估DIC的风险。
近半世纪以来，传统的生物标志物一直在临床上用于DIC的检测，如肌酸激酶（CK）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）、乳酸脱氢酶（CK-MB）及乳酸脱氢酶（LDH）等。CK与cTnI存在于心肌细胞内，在药源性心肌损伤的过程中，血清中的CK及cTnI升高，这与心肌细胞的死亡及其释放内容物相关。CK-MB并非为心脏所特有，它在人体骨骼中也有少量存在，在骨骼肌损伤时CK-MB也会出现异常升高。LDH也是如此，广泛存在于各种组织中。然而，尽管现有的心肌损伤生物标志物如肌酸激酶（CK）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）等可标识心肌脏损伤或功能改变，但这些指标因缺乏特异性（其他脏器或组织损伤也可致其活性增加）及其与组织形态学数据的一致性较差导致其已不能满足及早并准确地评估DIC风险。
随着对心肌损伤的逐步研究，发现了一些新的心脏毒性损伤的检测指标，包括心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）、超敏C反应蛋白等。近年，血浆中循环miRNAs作为药物诱导心脏毒性的生物标志物得到深入研究，其中，miRNA-1是心肌中表达最高的miRNAs。
外泌体是细胞外囊泡的一种，细胞外囊泡分为三种：凋亡小体、微泡和外泌体。外泌体的产生过程涉及质膜的双重内陷和含有腔内小泡（ILV）的细胞内多泡体（MVB）的形成。ILV最终通过MVB融合到质膜，经过胞吐作用，以直径为40~160nm的外泌体形式分泌。外泌体的密度为1.15–1.19 g/mL。在其表面发现的四聚体跨膜蛋白CD63、CD9和CD81通常作为外泌体的表面生物标志物。同时，大多数细胞可分泌外泌体，它广泛存在于各种体液中，如血液、唾液、尿液、脑脊液等。外泌体将各种分子从亲代细胞运送到其他细胞，包括蛋白质、DNA、mRNA/miRNA、lncRNA等。外泌体的组成类似于亲代细胞，因此能够提供可追踪的亲本细胞的特异信息。扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜、动态光散射和纳米粒子跟踪分析广泛用于测量外泌体的物理特征，如囊泡的大小、分布和浓度。
长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度超过200个核糖核苷酸的缺乏开放阅读框的非编码RNA分子，没有编码蛋白质的能力，或者编码功能有限。最初发现时被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，没有生物学作用。经过深入研究发现，lncRNA在细胞中参与了重要的调控过程，如：调节细胞分化、衰老、增殖、凋亡、坏死以及肿瘤的发生发展。研究发现，尽管与信使RNA相比，lncRNA比较倾向于以低水平表达，但是lncRNA表达比mRNA表达更具有细胞特异性，表明lncRNA可能是细胞命运的关键调节因子。目前已有大量研究报道，在病理条件下，许多外泌体lncRNA的表达水平与正常对照组显著不同，表明外泌体可以选择性地包装、分泌和运输lncRNA，并特异性地发挥生物学功能。外泌体可以保护lncRNA免受RNA酶的降解，因此它们可以稳定地存在于体液中。
但lncRNA数据库非常庞大（迄今共有172216个），临床检测上尚未开发出与心肌损伤尤其是外源性化合物（例如盐酸异丙肾上腺素）引起的心肌损伤密切相关的lncRNA。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中药源性心肌损伤生物标志物存在敏感度不高、检测方法过于复杂、试剂昂贵、需要联合其他指标共同评价心肌损伤以及不能及时准确地预测药源性心肌损伤等缺陷，提供了一种外泌体lncRNA在检测药源性心肌损伤中的应用。所述应用能够将检测外泌体lncRNA的试剂用于检测药源性心肌损伤的产品的制备，尤其是用来检测外源性化合物引起的心肌损伤，检测的敏感度高且检测方法和试剂简单，能够被广泛应用于及时检测药源性心肌损伤，能在早期及时发现药源性心肌损伤，其检测结果可靠，可以单独检测或者联合其他指标共同评价心肌损伤。
本发明人对心肌损伤进行长期研究，并经过大量实验，意外地发现了可以作为外源性化合物引起的药源性心肌损伤的特异性的外泌体来源的lncRNA生物标志物，在外源性化合物引起的药源性心肌损伤的血浆中高表达，能够发挥其在制备心肌损伤生物标志物中用途，从而检测由外源性化合物引起的心肌损伤。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：一种检测外泌体lncRNA的试剂在制备检测大鼠药源性心肌损伤的产品中的应用，所述外泌体lncRNA的NONCODETRANSCRIPT ID为NONRATT019595.2。
在本发明的一些实施方案中，所述检测外泌体lncRNA的试剂单独使用，或者和常规的检测心肌损伤生物标志物的试剂联合使用。
在本发明的具体实施方案中，所述常规的检测心肌损伤生物标志物为肌酸激酶和/或心肌肌钙蛋白I。
在本发明的一些实施方案中，所述检测外泌体lncRNA的试剂为检测待测样本中所述外泌体lncRNA的转录层面表达水平的试剂，例如通过实时荧光定量PCR检测所述转录层面表达水平。
在本发明的一些实施方案中，所述检测外泌体lncRNA的试剂为特异性识别或扩增所述外泌体lncRNA的试剂，例如为特异性识别所述外泌体lncRNA的探针或特异性扩增所述外泌体lncRNA的引物。
在本发明的具体实施方案中，所述检测外泌体lncRNA的试剂为特异性扩增所述外泌体lncRNA的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示。
在本发明的一些实施方案中，所述待测样本为体液，例如血液、唾液、尿液或脑脊液，或者所述待测样本为心肌。
在本发明的具体实施方案中，所述待测样本为血浆。
在本发明的一些实施方案中，所述药源性心肌损伤为外源性化合物引起的心肌损伤。
在本发明的具体实施方案中，所述外源性化合物为盐酸异丙肾上腺素。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二为：一种试剂盒在制备检测大鼠药源性心肌损伤的产品中的应用，所述试剂盒包括检测外泌体lncRNA的试剂，所述外泌体lncRNA的NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT019595.2，所述检测外泌体lncRNA的试剂如本发明技术方案之一所述的应用中所定义，所述药源性心肌损伤如本发明技术方案之一所述的应用中所定义。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括RNA提取试剂、反转录试剂、定量PCR试剂和使用说明书中的一种或多种。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之三为：一种芯片在制备检测大鼠药源性心肌损伤的产品中的应用，所述芯片上设置包括检测外泌体lncRNA的试剂，所述外泌体lncRNA的NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT019595.2，所述检测外泌体lncRNA的试剂如本发明技术方案之一所述的应用中所定义，所述药源性心肌损伤如本发明技术方案之一所述的应用中所定义。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之四为：一种检测外泌体lncRNA的试剂在制备检测盐酸异丙肾上腺素引起的大鼠心肌损伤的产品中的应用，所述外泌体lncRNA的NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT019595.2。
在本发明的一些实施方案中，所述检测外泌体lncRNA的试剂单独使用，或者和常规的检测心肌损伤生物标志物的试剂联合使用。
在本发明的一些实施方案中，所述常规的检测心肌损伤生物标志物为肌酸激酶和/或心肌肌钙蛋白I。
在本发明的一些实施方案中，所述检测外泌体lncRNA的试剂为检测待测样本中所述外泌体lncRNA的转录层面表达水平的试剂。
在本发明的一些实施方案中，所述检测外泌体lncRNA的试剂为特异性识别所述外泌体lncRNA的探针或特异性扩增所述外泌体lncRNA的引物；和/或，所述待测样本为血浆。
在本发明的一些实施方案中，所述检测外泌体lncRNA的试剂为特异性扩增所述外泌体lncRNA的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之五为：一种试剂盒在制备检测盐酸异丙肾上腺素引起的大鼠心肌损伤的产品中的应用，所述试剂盒包括检测外泌体lncRNA的试剂，所述外泌体lncRNA的NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT019595.2，所述检测外泌体lncRNA的试剂如本发明技术方案之四所述的应用中所定义。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之六为：一种芯片在制备检测盐酸异丙肾上腺素引起的大鼠心肌损伤的产品中的应用，所述芯片上设置检测外泌体lncRNA的试剂，所述外泌体lncRNA的NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT019595.2，所述检测外泌体lncRNA的试剂如本发明技术方案之四所述的应用中所定义。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明公开了能够将外泌体来源的lncRNA应用于心肌损伤生物标志物的制备，尤其是用来检测外源性化合物引起的心肌损伤，检测的敏感度高且检测方法和试剂简单，能够被广泛应用于检测心肌损伤，其检测结果可靠，敏感性为100%，特异性为66.67%，可以单独检测或者联合其他指标共同评价心肌损伤。
附图说明
图1为盐酸异丙肾上腺素给药组大鼠血清CK、cTnI活性的改变，其中﹡代表与溶媒组相比P<0.05。
图2为二次造模中盐酸异丙肾上腺素给药组大鼠和对照组大鼠ROC曲线。
图3为NONRATT019595.2的上、下游引物扩增产物的基因溶解曲线。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1 寻找心肌损伤生物标志物
1.1心肌损伤模型的建立
1.1.1实验试剂和仪器、实验动物
（1）阳性药：盐酸异丙肾上腺素（批号：WXBD4216V，购自Sigma-Aldrich）；
（2）溶媒对照品：0.9％氯化钠注射液（0.9% NaCl）；
CK，cTnI检测试剂盒由日本和光纯药工业株式会社生产；
HITACHI 7060型全自动生化分析仪购于日本日立产业株式会社。
（3）实验动物
雄性SD大鼠12只，雌性大鼠12只，SPF级，体重160~600g，6~16周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2016-0006]。动物采用芯片和笼牌标识，5只/笼，动物饲养于上海益诺思生物技术股份有限公司的SPF级动物房，动物房温度控制在22~26摄氏度，湿度控制在40~70%之间，每分钟通气次数≥15次，12小时/12小时的明暗光照周期，动物自由摄食，经钴60辐照灭菌的SPF大鼠维持饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供，动物通过饮水瓶自由饮用自制的去离子水。
1.1.2实验方法
1.1.2.1 阳性药的配制
盐酸异丙肾上腺素（ISO）的混悬液配制：称取21mg的盐酸异丙肾上腺素，转移至烧杯中并加入适量的0.9％氯化钠注射液。用玻璃棒初步进行搅拌，加入转子，打开磁力搅拌器，充分分散后关机，加入0.9％氯化钠注射液至所需体积（84mL）后将其混匀，以保证上下均一性，2~8℃、避光、放置待用。配制过程需避光，需无菌操作。
1.1.2.2 动物试验剂量设置
采用随机区组设计的分组，将24只大鼠根据体重随机分配到2组：溶媒对照组（0.9% NaCl）和给药组（2.5mg/kg盐酸异丙肾上腺素），详见表1。
表1 实验剂量设计
1.1.2.3给药及观察检查
溶媒对照组和盐酸异丙肾上腺素给药组的给药途径均为尾静脉注射给药，单次给药，给药容量为10 mL/kg。给药体积根据最近一次测得的体重进行计算。
在给药4小时后，采用2-4mL/kg 含37.5mg/mL氯胺酮+2.5mg/mL赛拉嗪的混合制剂麻醉，腹主动脉采集全血少部分置于分离胶真空采血管中用于血清的分离：3500 rpm，4℃，5 min，吸取血清分装于EP管中，保存于-80℃冰箱，用于心肌功能指标的检测。大部分置于EDTA-K2真空采血管中用于分离血浆：800g，4℃，10min，吸取上层血浆分装于EP管中，保存于-80℃冰箱，用于进行外泌体RNA全转录组测序。
1.1.2.4 血清生化检测结果
本实验主要检测了临床前和临床中心肌损伤评价普遍使用的血液学指标肌酸激酶（CK）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）的变化。如图1结果显示，2.5 mg/kg盐酸异丙肾上腺素（ISO）给药4h后，给药组大鼠血清中CK、cTnI与溶媒对照组相比显著性升高（*：P<0.05）。
1.1.2.5组织病理学检查结果
心脏组织病理学检查显示，溶媒对照组大鼠未见明显异常，给药组见不同程度心肌细胞坏死，并伴炎细胞浸润，小叶周边细胞空泡变性，甚至坏死。详细评分见表2所示。
表2 盐酸异丙肾上腺素暴露4 h后心脏组织病理形态学观察结果
“N”代表无明显异常。
“心肌细胞坏死，伴单核细胞浸润”一栏中，“0”代表无心肌细胞坏死，未伴有单核细胞浸润；“1”代表较少心肌细胞坏死，伴有较轻微伴d单核细胞浸润；“2”代表少许心肌细胞坏死，伴有轻微单核细胞浸润；“3”代表中度的心肌细胞坏死，伴有中度单核细胞浸润；“4”代表重度的心肌细胞坏死，伴有重度单核细胞浸润。
“灶性病变”一栏中，“0”代表无灶性病变；“1”代表灶性病变较轻微；“2”代表灶性病变轻微；“3”代表灶性病变中度；“4”代表灶性病变重度。
1.1.2.6 结论
本部分实验采用SD大鼠经尾静脉注射给予2.5 mg/kg盐酸异丙肾上腺素和0.9%氯化钠，4小时后采血进行血清生化检测和组织病理学检查，考察盐酸异丙肾上腺素诱导的心肌损伤情况。
在血清生化检测中，给药4小时后，2.5 mg/kg ISO组动物的CK和cTnI均显著升高。病理组织学检查主要可见不同程度心肌细胞坏死，并伴单核细胞浸润，灶性病变。
综上可见，SD大鼠经尾静脉注射给予盐酸异丙肾上腺素后成功地诱导了大鼠心肌损伤，因此盐酸异丙肾上腺素诱导心肌损伤模型成立，可用于心肌损伤生物标志物的筛选和验证。
1.2 外泌体RNA全转录组测序
1.2.1 外泌体抽提
采用 exoRNeasy Serum/Plasma Maxi kit（Qiagen）试剂盒，根据生产厂商提供的标准操作流程进行操作，分离样本中的外泌体。
步骤如下：
1)500μL 血浆样本-80 ℃取出，25 ℃水浴解冻；
2)13000g， 4℃离心 10 分钟；
3)按照 1:1 的样本体积加入 Buffer XBP，上下颠倒 5 次；
4)样本与 Buffer XBP 混合液转移至 exoEasy spin column，500g 4℃离心1min；弃除底部废液；
5)加入 3.5m 的 Buffer XWP 到 exoEasy spin column 中，5000g 4℃离心 5分钟；弃除底部废液；
6)转移 spin column 到新的收集管中；
7)加入 200μL Buffer XE，5000g 4℃离心 5 分钟收集底部外泌体到 1.5mL 离心管中；
8)外泌体分装，-80℃保存。
1.2.2 外泌体相关指标鉴定
1.2.2.1外泌体标志物 WB 鉴定
取一定量外泌体的PBS重悬液，加入等体积的RIPA（强）裂解液进行裂解提取蛋白，之后进行蛋白浓度测定以及WB检测外泌体标志物。
1.2.2.2外泌体纳米微粒追踪检测（NTA）
1)取冻存样本，25 ℃水浴解冻，冰上放置；
2)取外泌体样本用 1×PBS 进行稀释，直接用于 NTA 检测。
3)测试所用仪器信息
仪器名称：纳米粒度颗粒跟踪分析仪
生产公司：PARTICLE METRIX
仪器型号：ZetaVIEW S/N 17-310
分析用软件版本：ZetaView 8.04.02
1.2.3 RNA质量鉴定
测序实验起始样本为总RNA，外泌体总RNA由QIAGEN exoRNeasy Midi Kit（CatNo./ID: 77144）试剂盒获得，由Agilent 4200 TapeStation进行质检，质检合格的RNA可进行后续的全转录组测序。
1.2.4 文库构建与质检
分离外泌体进而抽提得到的总RNA，用针对外泌体RNA的超高敏微量样本链特异性试剂盒进行建库，构建的文库使用 Qubit® 2.0 Fluorometer 检测浓度，Agilent2100 检测文库大小。
1.2.5 上机测序
质检合格的文库，准备进行 Illumina 测序，测序策略为 PE150。测序基本原理为边合成边测序（SBS，Sequencing by Synthesis）：将携有cluster 的 flow cell上机，并在flow cell 中加入四种荧光标记的 dNTP、DNA 聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的 dNTP 就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。
1.2.6 数据质控
获得测序原始数据（Raw Data）后，首先需要对数据进行过滤、去接头序列及对低质量 reads 进行处理，再对测序质量进行评估，重复检验获得高质量数据（Clean Data）。并将 Clean Data 与参考基因组进行比对，对已知 mRNA 和 lncRNA 进行定量分析；未比对上的 reads 采用 ACFS 分析环状 RNA。
1.2.7 数据预处理
原始测序数据中含有测序接头序列，也有些 reads 中含有质量较低的碱基、reads 末端质量偏低等不合格情况，这些可能影响到后续分析结果的可靠性，故在此先对原始数据进行预处理，去除接头序列、低质量 reads。数据预处理软件使用 Seqtk。
主要步骤如下：
1)去除 reads 中所含有的接头序列；
2)去除 3’端质量 Q 低于 20 的碱基，即碱基错误率小于 0.01，其中，Q=-10log（error_ratio）；
3)去除长度小于 25 的 reads；
4)去除所属物种的 ribosome RNA reads。
经过原始数据预处理后，得到后续分析使用的 clean reads。
1.2.8 比对分析
使用 HISAT2 软件将预处理后的测序序列进行基因组 mapping 分析。通常我们将 clean no RNA reads 比对到基因组，这也是后续分析的基础。HISAT2 采用全局和局部搜索的方法，能够高效进行 mapping，且能够有效比对到 RNA Seq 测序数据中的 splicedreads，参数设置默认参数，参考基因组版本为 Rnor_6.0.95，结果为 BAM 文件。
1.2.9 lncRNA 定量与差异分析
1.2.9.1新lncRNA预测
应用 cufflinks（version:2.1.1）中的 cuffcompare 将 mapping 得到的注释信息与参考注释（NONCODE 和 Ensembl 数据库）进行比较，得到未能与已知注释基因匹配的新转录本，提取{i、u、x}三类转录本进行 lncRNA 预测，具体步骤如下：
1)转录长度大于 200bp 且 exon > 2；
2)覆盖 fragment counts > 3；
3)预测的 ORF < 300；
4)PhyloCSF（目前仅限于人、大小鼠）、Pfam、CPC、CNCI预测，对4种（或3种）预测结果取交集，选择PhyloCSF score <0 & Pfam比对不显著&CPC score<0&CNCI score<0的转录本作为潜在的lncRNA。
5)与已知lncRNA比较，去除与known lncRNA相同的序列。
1.2.9.2 lncRNA表达定量
应用 Stringtie（version:1.3.0）对预测的 novel lncRNA 和 NONCODE 数据库（version: NONCODE 2021；http://www.noncode.org/），以及 Ensembl 数据库中的已知lncRNA 进行表达定量。其中MSTRG开头的ID为novel lncRNA，NON开头的ID为数据库中已知的lncRNA，ENS开头的ID为Ensembl 数据库中已知的 lncRNA。
1.2.9.3 lncRNA差异表达分析
应用 edgeR 进行样本间差异 lncRNA 分析。并对差异的 lncRNA 进行火山图和Heatmap 图绘制展示。
1.2.9.4 lncRNA 靶基因预测与靶基因富集分析
lncRNA与mRNA的相互作用关系分为顺式（cis）与反式（trans），这种与lncRNA发生相互作用关系的mRNA被称为lncRNA的靶基因。
高通量测序得到的差异基因比较多，从几百到上千都有可能。为更好的理解这些差异基因可能在细胞中行使的生物学功能或者可能扰动的信号通路，对差异的基因进行Gene Ontology 及 KEGG 数据库的注释与功能富集。
1.3 全转录组测序结果
1.3.1 概述
利用聚类分析绘制样本中差异有统计学意义（P<0.05）且log2FC（Fold changes，FC）值>2倍以上变化且至少一组count最小值>10的lncRNA。结果显示（表3中列出了部分lncRNA的变化倍数）：与溶媒对照组比较，给药组log2FC（abs，绝对值）2倍以上变化且p<0.05的31条，均为上调的lncRNAs；5倍以上变化且p<0.05的有27条，均为上调的lncRNAs。提示这些差异表达的lncRNA可能与药源性心肌损伤发生，发展及分子调控密切相关。与溶媒对照组相比，其中lncRNA（NONCODE TRANSCRIPT ID: NONRATT019595.2）在给药组大鼠血浆外泌体中的表达量为Inf（无穷大，infinity）。
表3 部分lncRNA的变化倍数
1.3.2 GO分析结果
差异表达基因利用Fisher精确检验进行GO分析。Fisher 精确检验计算得到p-value，并进行多重假设检验校正得到q-value。筛选q-value小于0.05的GO条目作为显著富集的GO条目。GO功能注释分析发现，差异表达的lncRNAs的靶基因mRNAs主要集中在生物学过程：通过剪接体调节选择性mRNA剪接，线粒体翻译，二醇生物合成过程；细胞成分：内质网膜的整体组成部分。
1.3.3 KEGG分析结果
进一步对差异表达的lncRNAs预测靶基因mRNAs进行KEGG分析。与GO分类统计类似，对KEGG各个pathway大类上的差异表达基因数目进行统计。KEGG分析发现差异表达的lncRNAs预测靶基因mRNAs主要集中在机体系统：排泄系统，内分泌系统，消化系统，循环系统；代谢通路：甲状腺激素信号通路；细胞通路：信号传导，折叠、分类和降解。提示差异表达的lncRNAs可能通过调控预测靶基因mRNAs从而参与这些通路的调节。
1.4 实时定量PCR验证
1.4.1 试剂
反转录试剂: TOYOBO ReverTra Ace qPCR RT Kit
定量 PCR 试剂: ABI Power SYBR Green PCR Master Mix
引物合成：上海生工生物工程有限公司
1.4.2 仪器：
定量 PCR 仪: ABI 7500 实时荧光定量 PCR 系统
1.4.3 实验步骤
1.4.3.1 cDNA 第一链合成
1）从-80℃冰箱中取出RNA，在4℃下解冻，然后在0.2 ml PCR管中配制反应溶液，如表4所示，其中X1和X2的值根据不同样品抽提的RNA浓度不同，根据浓度换算取用的体积。
表4 反应溶液体系
2）将PCR管置于PCR仪，运行程序：37℃孵育15 min，98℃变性5 min，4℃，保温。
1.4.3.2 SYBR Green qPCR
1）在0.2ml PCR管中配制反应液，如表5所示，其中X3的值根据不同样品cDNA浓度不同，根据浓度换算取用的体积。
表5 反应溶液体系
在表5中，NONRATT019595.2的上游引物序列为（SEQ ID NO: 1）：CCTACCCTCATGATACCCAGTGTT，NONRATT019595.2的下游引物序列为（SEQ ID NO: 2）：GAGGCTGAATGGCAAGTGTTC。内参基因GAPDH的上游引物序列为（SEQ ID NO: 3）：TGGCCTCCAAGGAGTAAGAAAC，内参基因GAPDH的下游引物序列为（SEQ ID NO: 4）：GGCCTCTCTCTTGCTCTCAGTATC。如图3所示，根据基因的溶解曲线表明，NONRATT019595.2的上、下游引物扩增产物特异性好。
2）将反应液加入96孔板中。
3）将96孔板置于ABI 7500实时荧光定量PCR仪中。运行程序：50 ℃孵育 2min；95℃，10min；40个循环：95℃，15 秒，60℃，1min。
通过上述方法对“1.1心肌损伤模型的建立”中所构建的24只大鼠（即“一次造模”）血浆外泌体中的表达量进行验证，在给药组大鼠血浆外泌体中的表达量是溶媒对照组中的7.5倍（p<0.05）。
此外，还用与“1.1心肌损伤模型的建立”中完全相同的实验方法，另外构建10只大鼠（其中5只为给药组，5只为溶媒对照组，均为雄性，即“二次造模”），并用与本步骤中完全相同的方法进行实时定量PCR验证，以GAPDH为内参，并用2-ΔΔCt表示NONRATT019595.2的相对表达水平。lncRNA（NONCODE TRANSCRIPT ID: NONRATT019595.2）在二次造模中给药组大鼠血浆外泌体中的表达量是溶媒对照组中的5.6451倍（p<0.05），结果如表6所示。
表6 NONRATT019595.2表达水平
1.5 ROC曲线
根据1.4中另外构建的10只大鼠（即“二次造模”）的检测结果，将给药组和对照组大鼠的lncRNA NONCODE TRANSCRIPT ID: NONRATT019595.2的表达量使用GraphPad Prism（version 8.0.1）进行ROC（Receiver operating characteristic curves）曲线的绘制。
结果如图2所示，AUC=0.833，敏感性为100%，特异性为66.67%，由此可见，该lncRNA在区别给药组大鼠和对照组大鼠方面具有显著作用。
1.6 特异性验证
使用对乙酰氨基酚诱导大鼠的肝损伤模型：
1.6.1实验试剂和仪器、实验动物
（1）阳性药：对乙酰氨基酚（批号：D2114266，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；
（2）溶媒对照品：0.5%羧甲基纤维素钠（0.5%CMC-Na）；
CK，cTnI，ALT，AST检测试剂盒由日本和光纯药工业株式会社生产；
HITACHI 7060型全自动生化分析仪购于日本日立产业株式会社。
（3）实验动物
雄性SD大鼠12只，雌性大鼠12只，SPF级，体重160~600g，6~16周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2016-0006]。动物采用芯片和笼牌标识，5只/笼，动物饲养于上海益诺思生物技术股份有限公司的SPF级动物房，动物房温度控制在22~26摄氏度，湿度控制在40~70%之间，每分钟通气次数≥15次，12小时/12小时的明暗光照周期，动物自由摄食，经钴60辐照灭菌的SPF大鼠维持饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供，动物通过饮水瓶自由饮用自制的去离子水。
1.6.2实验方法
1.6.2.1 阳性药的配制
对乙酰氨基酚（APAP）的混悬液配制：分别称量3.75 g对乙酰氨基酚，转移至玻璃瓶中并加入适量的0.5% CMC-Na（W/W）。用玻棒初步进行搅拌，打开匀浆机进行工作，充分分散后关机，加入0.5% CMC-Na至所需体积后将其混匀，配制成1250 mg/kg的混悬液，保证上下均一性，室温、避光、放置待用。配制过程需避光。
1.6.2.2 动物试验剂量设置
采用随机区组设计的分组，将24只大鼠根据体重随机分配到2组：溶媒对照组（0.5%CMC-Na）、给药组（1250mg/kg对乙酰氨基酚），详见表7。
表7 实验剂量设计
1.6.2.3给药及观察检查
溶媒对照组和对乙酰氨基酚给药组的给药途径均为经口灌胃给药，单次给药，给药容量为10 mL/kg。给药体积根据最近一次测得的体重进行计算。
在给药后24小时后，采用2-4mL/kg 含37.5mg/mL氯胺酮+2.5mg/mL赛拉嗪的混合制剂麻醉，腹主动脉采集全血少部分置于分离胶真空采血管中用于血清的分离：3500 rpm，4℃，5 min，吸取血清分装于EP管中，保存于-80℃冰箱，用于心功能和肝功能指标的检测。大部分置于EDTA-K2真空采血管中用于分离血浆：800g，4℃，10min，吸取上层血浆分装于EP管中，保存于-80℃冰箱，用于随后的PCR验证。
1.6.2.4 血清生化检测结果
本实验主要检测了临床前和临床中心肌损伤评价普遍使用的血液学指标CK（肌酸激酶）、cTnI（心肌肌钙蛋白I），和肝损伤评价普遍使用的血液学指标肝ALT（丙氨酸氨基转移酶）、AST（天冬氨酸氨基转移酶）的变化。1250mg/kg对乙酰氨基酚给药24h后，给药组大鼠血清中CK、cTnI与溶媒对照组相比略有升高，但不存在显著性差异；给药组大鼠血清中ALT、AST与溶媒对照组相比显著性升高（*：P<0.05）。说明SD大鼠经口灌胃给予对乙酰氨基酚后成功地诱导了大鼠肝损伤，且说明CK、cTnI可作为心肌损伤生物标志物的特异性。
1.6.2.5 PCR验证
具体过程同1.4
1.7 总结
本实验大鼠血浆外泌体的lncRNA测序结果显示，外泌体中差异表达的lncRNA数量较多，其中lncRNA（NONCODE TRANSCRIPT ID: NONRATT019595.2）在给药组大鼠血浆外泌体中的表达量为Inf，表达差异倍数非常高，说明lncRNA（NONCODE TRANSCRIPT ID:NONRATT019595.2）可以作为一种心肌损伤生物标志物检测外源性化合物引起的心肌损伤。
使用实时荧光定量PCR进行验证，验证结果显示：lncRNA（NONCODE TRANSCRIPTID: NONRATT019595.2）在给药组大鼠血浆外泌体中的表达量是溶媒对照组中的7.5倍（p<0.05），在二次造模中另外构建10只大鼠验证，给药组大鼠血浆外泌体中的表达量是溶媒对照组中的5.6451倍（p<0.05）。这证明了使用NONRATT019595.2作为生物标志物时，能够及时检测，检测结果可靠，说明使用NONRATT019595.2作为生物标志物针对外源性化合物引起的心肌损伤的检测具有良好的特异性。
使用ROC曲线考察lncRNA（NONCODE TRANSCRIPT ID: NONRATT019595.2）能否较好地区别给药组大鼠及对照组大鼠。曲线下面积AUC=0.833，敏感性为100%，特异性为66.67%，显示出该lncRNA具有良好的鉴别能力。
通过使用对乙酰氨基酚建立大鼠肝损伤模型，考察lncRNA（NONCODE TRANSCRIPTID: NONRATT019595.2）的特异性。PCR验证结果显示，该lncRNA未在肝损伤模型中升高，因此，显示出它具有良好的特异性。
Claims (8)
1.一种检测外泌体lncRNA的试剂在制备检测盐酸异丙肾上腺素引起的大鼠心肌损伤的产品中的应用，其特征在于，所述外泌体lncRNA的NONCODE TRANSCRIPT ID为NONRATT019595.2；
所述检测外泌体lncRNA的试剂的待测样本为血浆。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测外泌体lncRNA的试剂单独使用，或者和常规的检测心肌损伤生物标志物的试剂联合使用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述常规的检测心肌损伤生物标志物为肌酸激酶和/或心肌肌钙蛋白I。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测外泌体lncRNA的试剂为检测所述待测样本中所述外泌体lncRNA的转录层面表达水平的试剂。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测外泌体lncRNA的试剂为特异性识别所述外泌体lncRNA的探针或特异性扩增所述外泌体lncRNA的引物。
6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测外泌体lncRNA的试剂为特异性扩增所述外泌体lncRNA的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示。
7. 一种试剂盒在制备检测盐酸异丙肾上腺素引起的大鼠心肌损伤的产品中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括检测外泌体lncRNA的试剂，所述外泌体lncRNA的NONCODETRANSCRIPT ID为NONRATT019595.2，所述检测外泌体lncRNA的试剂如权利要求1~6任一项所述的应用中所定义。
8. 一种芯片在制备检测盐酸异丙肾上腺素引起的大鼠心肌损伤的产品中的应用，其特征在于，所述芯片上设置检测外泌体lncRNA的试剂，所述外泌体lncRNA的NONCODETRANSCRIPT ID为NONRATT019595.2，所述检测外泌体lncRNA的试剂如权利要求1~6任一项所述的应用中所定义。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104404146A (zh) * | 2014-11-25 | 2015-03-11 | 温州医科大学附属第一医院 | 一种心肌缺血再灌注相关的lncRNA的筛选方法及应用 |
| CN106086018A (zh) * | 2016-05-10 | 2016-11-09 | 新疆医科大学第附属医院 | Nr_047662.2及体外检测的试剂、制剂或试剂盒、应用、检测方法 |
| CN112852944A (zh) * | 2019-11-28 | 2021-05-28 | 上海益诺思生物技术股份有限公司 | 长链非编码rna在制备肝损伤生物标志物中的用途 |
| CN113286895A (zh) * | 2018-09-05 | 2021-08-20 | 阿莫内塔诊断股份公司 | 用于诊断和治疗脑疾患，尤其是认知障碍的长的非编码RNA(lncRNA) |
| CN113533730A (zh) * | 2021-07-23 | 2021-10-22 | 南方医科大学深圳医院 | 一种血浆外泌体标志物组合及其应用 |
| CN114854851A (zh) * | 2022-07-08 | 2022-08-05 | 上海益诺思生物技术股份有限公司 | 一种血浆来源的外泌体lncRNA在制备药物性肝损伤生物标志物中的应用 |
-
2023
- 2023-09-12 CN CN202311167224.7A patent/CN116926189B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104404146A (zh) * | 2014-11-25 | 2015-03-11 | 温州医科大学附属第一医院 | 一种心肌缺血再灌注相关的lncRNA的筛选方法及应用 |
| CN106086018A (zh) * | 2016-05-10 | 2016-11-09 | 新疆医科大学第附属医院 | Nr_047662.2及体外检测的试剂、制剂或试剂盒、应用、检测方法 |
| CN113286895A (zh) * | 2018-09-05 | 2021-08-20 | 阿莫内塔诊断股份公司 | 用于诊断和治疗脑疾患，尤其是认知障碍的长的非编码RNA(lncRNA) |
| CN112852944A (zh) * | 2019-11-28 | 2021-05-28 | 上海益诺思生物技术股份有限公司 | 长链非编码rna在制备肝损伤生物标志物中的用途 |
| CN113533730A (zh) * | 2021-07-23 | 2021-10-22 | 南方医科大学深圳医院 | 一种血浆外泌体标志物组合及其应用 |
| CN114854851A (zh) * | 2022-07-08 | 2022-08-05 | 上海益诺思生物技术股份有限公司 | 一种血浆来源的外泌体lncRNA在制备药物性肝损伤生物标志物中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| A rat RNA-Seq transcriptomic BodyMap across 11 organs and 4 developmental stages;Ying Yu等;NATURE COMMUNICATIONS;第5卷;1-11 * |
| 华蟾素注射液心脏毒性评价;李旻等;中国新药杂志;第29卷(第13期);1485-1494 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116926189A (zh) | 2023-10-24 |
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| GR01 | Patent grant | ||
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