CN113533730A - 一种血浆外泌体标志物组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血浆外泌体标志物组合及其应用，该血浆外泌体标志物组合由差异蛋白和代谢物组成，使用该血浆外泌体标志物组合能够准确的鉴定样品是否可以预测前列腺癌患病风险和去势抵抗性前列腺癌发生风险，特异性强，准确度高，其检测精度要由于传统的PSA检测法，可应用于临床的早期诊断以及临床上的针对性治疗和预防，提高前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌患者的治疗效果和生存获益。

Description

一种血浆外泌体标志物组合及其应用
技术领域
本发明属于分子标记物领域，具体涉及一种血浆外泌体标志物组合及其应用。
背景技术
前列腺癌(PCa)是男性最常见的恶性肿瘤之一，对人体健康威胁性大，具有较高的危害性。在临床中，虽然血清前列腺特异抗原(PSA)被广泛应用于PCa早期筛查，但由于其固有的局限性，不能区分潜伏性肿瘤和侵袭性恶性肿瘤，使其在实际应用中容易导致过度诊断和过度治疗，因此急需探索新的高敏感度的PCa诊断生物标志物。
外泌体是由多种具有磷脂双层结构的细胞分泌的细胞外载体。外泌体中携带有各种分子，如核酸、蛋白质、脂质和代谢物等，是供体细胞与肿瘤微环境沟通的重要介质。由于外泌体在血液中不会被快速降解，从而可以作为潜在的生物标志物，用于相关的检测中。在相关技术中，对于肿瘤来源外泌体的研究主要集中于非编码RNA，无法实现对蛋白质和代谢物实现精确的检测和定量，从而具有较大的检测局限性。
因此，开发一种以血浆外泌体中的蛋白及代谢物组合作为检测标志物的前列腺癌检测方法，对于临床中前列腺癌的诊断、预防及治疗都具有极为重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于区分不同前列腺癌类型的血浆外泌体标志物组合，能够在早期快速检测前列腺癌患者和区分去势抵抗性前列腺癌，具有特异性强，无创、检测速度快等优势，具有重要的临床诊断意义。
本发明的第一个方面，提供一种血浆外泌体标志物组合物，该血浆外泌体标志物组合物中包括血浆外泌体中的差异蛋白或其和代谢物。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述差异蛋白在不同类型的前列腺癌中的表达水平存在显著差异。
与传统的血清学标志物相比，外泌体中或其衍生的蛋白质具有独特的优势。部分外泌体蛋白倾向于释放到细胞外，而且来源于肿瘤细胞的外泌体所含有的蛋白比健康供体中的外泌体蛋白具有更高的特异性。由于外泌体膜上的脂质双分子层的存在，这种天然屏障确保外泌体蛋白质很难被外部蛋白酶和其他酶降解，从而利于作为一种有效的检测标志物。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述代谢物在不同类型的前列腺癌中的消耗或产生水平存在显著差异。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述血浆外泌体标志物组合物中还包括编码上述差异蛋白的核苷酸序列或其对应的核酸分子。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述差异蛋白包括：APOA4、ORM1、CAP1、ApoE、LRG1和ITIH3蛋白中的至少一种。
发明人通过LC-MS/MS分析和蛋白质组学分析发现，APOA4、ORM1、CAP1、ApoE、LRG1和ITIH3蛋白在激素敏感型PCa患者和CRPC患者血浆中存在显著差异性，经过验证发现，这些差异蛋白均可以在一定程度上反映出激素敏感型PCa和CRPC患者的具体病发情况。
CRPC是指经激素治疗后病变复发或持续进展的前列腺癌(PCa)。诊断去势抵抗性前列腺癌需符合两个条件：1.血清睾酮达到去势水平(<50ng/dl或者<1.7nmol/L)；2.间隔两周连续三次前列腺特异抗原持续升高，升高幅度应在基础值以上>50％，且前列腺特异抗原值应>2ng/ml。
在本发明的一些优选实施方式中，所述差异蛋白为APOA4、LRG1和ITIH3蛋白的组合。
发明人通过LC-MS/MS(液相色谱质谱联用)分析和蛋白质组学分析发现，APOA4可以用于区分PCa和BPH，从而或者样品是否为前列腺癌样品，而LRG1和ITIH3蛋白的组合则进一步对前列腺癌的类型进行区分，可以有效鉴别出激素敏感型PCa是否发展为CRPC，具有较好的准确性和检测精度。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述代谢物包括：二氢胸腺嘧啶(Dihydrothymine)、肌酸酐(Creatinine)、羟基辛酸(Hydroxyoctanoic acid)、3-甲基-2-氧基戊酸(3-Methyl-2-oxovaleric acid)和十一烷酸(Undecanoic acid)、羟基辛酸、1-Methylhistamine、十三烷酸(Tridecanoic acid)中的至少一种。
发明人通过LC-MS/MS分析和代谢组学分析发现，二氢胸腺嘧啶、肌酸酐、羟基辛酸、3-甲基-2-氧基戊酸的代谢产物组合和十一烷酸、羟基辛酸、1-Methylhistamine、十三烷酸的代谢产物组合在激素敏感型PCa患者和CRPC患者血浆中存在显著差异性，经过验证发现，这些代谢物均可以在一定程度上反映出激素敏感型PCa和CRPC患者的具体病发情况。
在本发明的一些优选实施方式中，所述代谢物为二氢胸腺嘧啶、肌酸酐、羟基辛酸、3-甲基-2-氧基戊酸的组合和/或十一烷酸、羟基辛酸、1-Methylhistamine、十三烷酸的组合。
发明人通过LC-MS/MS分析和代谢组学分析发现，二氢胸腺嘧啶、肌酸酐、羟基辛酸、3-甲基-2-氧基戊酸的组合和/或十一烷酸、羟基辛酸、1-Methylhistamine、十三烷酸的组合对于区分激素敏感型PCa和CRPC具有最佳的准确性和检测精度。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述前列腺癌包括激素敏感型前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌。
前列腺癌(PCa)是男性中最常见的恶性肿瘤，虽然敏感性极佳的血清PSA被广泛应用于PCa早期筛查，但由于其固有的局限性：不能区分潜伏性肿瘤和侵袭性恶性肿瘤临床应用导致了过度诊断和过度治疗，也不能评估接受雄激素剥夺治疗的患者的临床获益同时PSA诊断也很难影响PCa的总体死亡率。
本发明的第二个方面，提供一种用于区分前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌的检测产品，该检测产品中含有定量检测本发明第一个方面所述的血浆外泌体标志物组合物的试剂。
本发明中的血浆外泌体标志物组合物可以作为一种区分激素敏感型前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌的标志物，用于比对检测样品的指标参数，以判断该样品是否含有前列腺癌细胞或前列腺癌是否发展为去势抵抗性前列腺癌。
本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述的血浆外泌体标志物组合物在制备区分前列腺癌类型的工具中的应用。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述前列腺癌包括激素敏感型前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述区分前列腺癌类型的工具的使用方法，包括如下步骤：
检测待测样品中的ApoE、LRG1和ITIH3蛋白的表达水平；或
检测待测样品中的二氢胸腺嘧啶、肌酸酐、羟基辛酸、3-甲基-2-氧基戊酸、十一烷酸、1-Methylhistamine和十三烷酸的含量，判断待测样品中是否有前列腺癌患病风险以及前列腺癌进展情况；
其中，判断标准为：
若待测样品中的ApoE蛋白相对丰度高于非肿瘤携带者1.7倍或以上，则待测样品中提示前列腺癌患病风险高；
若否，提示前列腺癌患病风险低；
若待测样品中提示前列腺癌患病风险高，且LRG1蛋白的相对丰度高于恶性前列腺癌患者1.5倍或以上，ITIH3蛋白的相对丰度高于恶性前列腺癌患者的2.04倍或以上，则存在前列腺癌发展为去势抵抗性前列腺癌的风险；
若否，则不具有发展为去势抵抗性前列腺癌的风险；
或
若待测样品中的二氢胸腺嘧啶、肌酸酐、羟基辛酸、3-甲基-2-氧基戊酸的含量均大于非肿瘤携带者4.29倍，则待测样品提示前列腺癌患病风险高；
若否，则提示前列腺癌患病风险低；
若待测样品提示前列腺癌患病风险高，且十一烷酸、羟基辛酸、1-Methylhistamine、十三烷酸的含量均大于非肿瘤携带者9.79倍，则存在前列腺癌发展为去势抵抗性前列腺癌的风险；
若否，则不具有发展为去势抵抗性前列腺癌的风险。
在本发明的一些优选实施方式中，所述区分前列腺癌类型的工具的使用方法具体为：
经过外泌体提取和PRM验证后，通过特异性的肽段数，对ApoE、LRG1和ITIH3进行相对定量分析。
比较ApoE表达水平，若检测样品比非肿瘤携带者样品的表达水平高1.7倍或以上，则判定患者有前列腺癌的风险。
同样，若检测样品比激素敏感型PCa患者样品LRG1蛋白的相对丰度高1.5倍或以上，ITIH3蛋白的相对丰度高2.04倍或以上，则判定患者有可能已经发展为CRPC。
经过外泌体提取并进行代谢组分析，通过质谱获得各个代谢物峰面积，进行半定量分析。发明人发现，二氢胸腺嘧啶、肌酸酐、羟基辛酸、3-甲基-2-氧基戊酸的组合可以更好的对前列腺癌进行区分，组合的AUC数值可以达到0.9418，进一步对这四种代谢物的半定量值进行逻辑回归分析，定义待测样品的半定量值与非肿瘤携带者的半定量值的比值为PD值(Prostate cancer diagnostic value)，若PD值大于4.29，则判定患者有患前列腺癌的潜在风险。
同理，前列腺癌细胞，且十一烷酸、羟基辛酸、1-Methylhistamine、十三烷酸的组合可以更好的对激素敏感型PCa和CRPC进行区分，其组合的AUC值为0.9718，定义待测样品的半定量值与激素敏感型PCa患者的半定量值的比值为CD值(castration-resistantprostate cancer diagnostic value)，若CD值大于9.79，则判定为患者可能发展为CRPC。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述区分前列腺癌类型的工具包括检测试剂、检测试剂盒和检测芯片。
本发明的有益效果是：
1.本发明中的血浆外泌体标志物组合由差异蛋白和代谢物组成，使用该血浆外泌体标志物组合能够准确的鉴定患者样品是否罹患前列腺癌风险，并能够进一步判定前列腺癌是否已经发展为去势抵抗性前列腺癌，从而有助于临床上的精准治疗指导。
2.本发明中的血浆外泌体标志物组合由差异蛋白和代谢物组成，特异性强，准确度高，其检测精度要由于传统的PSA检测法，可用于构建于非侵入性液态活检技术应用于临床的早期诊断和精准治疗指导，提高前列腺癌患者的治疗效果和生存获益。
附图说明
图1为本发明实施例中的差异蛋白质热图，其中，A为非肿瘤携带对照组(tumor-free control,TFC)组、PCa组和CRPC组三组对比情况，B为TFC组和PCa组对比情况，C为PCa组和CRPC组对比情况；
图2为本发明实施例中TFC组、PCa组和CRPC组三组对比VENN图；
图3为本发明实施例中PCa和CRPC组患者的差异代谢物热图；
图4为本发明实施例中PCa与TFC组中的差异代谢物热图；
图5为本发明实施例中TFC组、PCa组和CRPC组三组中的差异代谢物含量水平，其中，A为半日花三醇B2(Heliantriol B2)，B为2-甲基戊二酸(2-methylglutaric acid)，C为环桂木黄素(Cycloartocarpin)；
图6为本发明实施例中TFC组、PCa组和CRPC组三组中的差异代谢物含量水平对比图，其中，A为羟基辛酸，B为十一烷酸，C为15-棕榈酸甲酯(15-methylpalmitate)，D为十五烷酸(pentadecanoic acid)，E为三乙醇胺(tromethamine)，F为5-氨基-4-咪唑甲酰胺(5-aminoimidazole-4-carboxamide)，G为月桂酸二乙醇酰胺(Lauroyl diethanolamide)，H为胞嘧啶(cytosine)；
图7为本发明实施例中TFC组、PCa组和CRPC组三组中的差异蛋白对比图，其中，A为PCa/TFC组对比中ApoE蛋白表达水平差异，B为CRPC/PCa组对比中LRG1和ITIH3蛋白表达水平差异；
图8为本发明实施例中45例患者血浆中的差异蛋白对比图，其中，A为PCa/TFC组对比中ApoE蛋白表达水平差异，B为CRPC/PCa组对比中LRG1蛋白表达水平差异，C为CRPC/PCa组对比中ITIH3蛋白表达水平差异；
图9为本发明实施例中的差异蛋白ROC曲线图，其中，A为PCa/TFC组对比中ApoE蛋白，B为CRPC/PCa组对比中LRG1蛋白，C为CRPC/PCa组对比中ITIH3蛋白；
图10为本发明实施例中的差异代谢物ROC曲线图，其中，A为二氢胸腺嘧啶，B为肌酸酐，C为羟基辛酸，D为3-甲基-2-氧基戊酸；
图11为本发明实施例中的差异代谢物组合(二氢胸腺嘧啶、肌酸酐、羟基辛酸和3-甲基-2-氧基戊酸)分析对比图(A)和ROC曲线图(B)；
图12为本发明实施例中的差异代谢物ROC曲线图，其中，A为十一烷酸，B为羟基辛酸，C为1-Methylhistamine，D为十三烷酸；
图13为本发明实施例中的差异代谢物组合(十一烷酸、羟基辛酸、1-Methylhistamine和十三烷酸)分析对比图(A)和ROC曲线图(B)。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
血浆外泌体中用于检测是否存在前列腺癌及其发展情况的蛋白质标志物
用于检测是否存在前列腺癌及其是否发展为CRPC的蛋白质标志物的筛选和鉴定方法为：
(1)分别从非肿瘤携带者(包括前列腺癌增生等)、激素敏感型PCa患者和CRPC患者处抽取血液样品，采用超高速离心法分离血样中的外泌体，具体步骤如下：
取5mL血液样本，在-4℃低速离心分离活细胞(300g/10min)和死细胞(2000g/10min)，混合后以10000g/30min分离细胞碎片，使用0.22μm过滤器过滤，取上清，用TI70转子以100000g/70min超速离心。弃去上清，将纯化的外泌体重悬于PBS中，然后再使用TI70转子以100000g/70min超速离心。弃去上清，得到外泌体微球。
根据初始血液样本体积加入适量PBS重悬外泌体微球，包装后测定蛋白浓度，-80℃保存。
同时，使用免疫印迹(Western blot)法对获得的外泌体微球中的蛋白进行测定，具体步骤如下：
将本实施例中分离得到的外泌体微球从-80℃取出，冰上融化后按4：1的体积比与loading buffer(5×蛋白上样缓冲液(含巯基还原剂DDT)，购于meilunbio)混合，95℃加热变性，取5μg混合液作为上样蛋白质量，确定样品体积后进行上样检测。使用分离胶分离上样样品中的蛋白，转膜，封闭，加入一抗孵育过夜；洗涤，收集一抗。洗膜后，加入相应的二抗进行孵育。洗涤，滴加ECL显影剂观察条带形成情况。
(2)对步骤(1)获得的外泌体微球进行BCA蛋白检测，BCA蛋白检测方法按照本领域常规的BCA检测试剂盒说明书进行操作。
(3)对步骤(1)获得的外泌体微球进行酶解处理，具体步骤如下：
分别从三组：TFC组，PCa组(PCa患者的蛋白质)及CRPC组(CRPC患者的蛋白质))中取等量蛋白质，加入8M尿素，使其调整到等体积。然后在蛋白质尿素混合液中加入二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT，终浓度为5mM)，56℃孵育30min。孵育结束后，冷却至室温(约25℃)，加入碘乙酰胺(Iodoacetamide，IAM，终浓度为11mM)，室温黑暗孵育15min。加入100mM四乙基硼氢化铵(Tetraethylammonium borohydride，TEAB)稀释蛋白样品，最后，以1:50的胰酶与蛋白质质量比添加胰酶，进行第一次消化过夜，再以1:100的胰酶与蛋白质质量比添加胰酶，进行第二次消化4h，得到蛋白质酶解肽段)。
(4)使用液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)非靶向鉴定三组中的蛋白质酶解肽段(以非肿瘤携带者的蛋白质酶解肽段为对照(TFC组)，分别对激素敏感型PCa组(PCa患者的蛋白质酶解肽段)及CRPC组(CRPC患者的蛋白质酶解肽段)，通过分析质谱数据，比较各组样品间特定肽段的信号强度，对肽段对应的蛋白质进行相对定量分析，
(5)为确定非靶向蛋白质组学结果，收集45例患者血浆分别为TFC(n＝12)、PCa(n＝17)和CRPC(n＝16)，进行平行反应监测(PRM)验证，PRM具体操作方法参考本领域中的PRM操作手册。
(6)数据分析：
使用数据库计算各组所检测各个蛋白表达含量与组间表达量的差异，当P<0.05表明具有显著差异。比较CRPC/TFC、PCa/TFC、CRPC/PCa各组间差异并取交集，筛选差异蛋白，并根据其差异性绘制比较图。
结果如图1～2所示。
从图1和图2中，可以看出在TFC组、PCa组及CRPC组中共可鉴定出938个蛋白质，其中534个蛋白质具有定量信息。而且对比PCa组和TFC组，可以发现PCa/TFC的差异性体现在，在PCa组的衍生纯化外泌体中发现了18个上调的差异蛋白和9个下调的差异蛋白。而将PCa组与CRPC组进行对比，可以发现CRPC组中有10个上调蛋白和3个下调蛋白，从而可以说明可能潜在存在既能够指示出前列腺癌又可以有效区分PCa与CRPC的差异蛋白。而从图2中，VENN图显示了CRPC/TFC、PCa/TFC、CRPC/PCa三者比较中蛋白质的数量和重叠部分，从而可以根据该信息进行进一步的筛选出用于区分激素敏感型前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌的蛋白质标志物。
血浆外泌体中用于检测是否存在前列腺癌及其发展情况的代谢物标志物
用于检测是否存在前列腺癌及其是否发展为去势抵抗性前列腺癌的代谢物标志物的筛选和鉴定方法为：
(1)分别从TFC、激素敏感型PCa患者和CRPC患者处抽取血液样品，采用超高速离心法分离血样中的外泌体，具体步骤如下：
取5mL血液样本，在-4℃低速离心分离活细胞(300g/10min)和死细胞(2000g/10min)，混合后以10000g/30min分离细胞碎片，使用0.22μm过滤器过滤，取上清，用TI70转子以100000g/70min超速离心。弃去上清，将纯化的外泌体重悬于PBS中，然后再使用TI70转子以100000g/70min超速离心。弃去上清，得到外泌体微球。
根据初始血液样本体积加入适量PBS重悬外泌体微球。
(2)提取外泌体中的代谢物：
取步骤(1)得到的外泌体微球PBS重悬溶液，加入1000μL提取液(提取液为乙腈、甲醇和水的混合液，按体积比计，乙腈:甲醇:水＝2:2:1)。液氮反复冻融3次后，将各组样品涡旋30秒，超声处理10min(超声功率：480W，频率40K Hz)。然后在-40℃条件下静置l小时，在4℃、12000RPM离心15min。抽取950μL上清液在真空浓缩器中干燥，加入含有同位素标记内标(Trimethylamine-d9 N-Oxide和Hippuric Acid-d5)混合物的提取液(提取液为乙腈、甲醇和水的混合液，按体积比计，乙腈:甲醇:水＝2:2:1)。涡旋30s，超声处理10min(超声功率：480W，频率40K Hz)。在4℃、12000RPM条件下再次离心15min，抽取部分上清用于LC-MS/MS分析。
从所有样品剩余的上清中各抽取等量上清混合，得到质量控制(QC)样品。
(3)LC-MS/MS鉴定分析代谢物：
在本实施例中，LC-MS/MS分析采用UHPLC系统(Vanquish,Thermo FisherScientific)、UPLC BEH Amide柱(2.1mm×100mm，1.7μm)与Q Exactive HFX质谱联用(Orbitrap MS,Thermo)。
流动相为含25mmol/L醋酸铵和25mmol/L氢氧化铵的水溶液(A)和含25mmol/L醋酸铵和25mmol/L氢氧化铵的乙腈溶液(B)。
洗脱梯度为0～0.5min，95％B液；0.5～7.0min，95％～65％B液；7.0～8.0min，65％～40％B液；8.0～9.0min，40％B液；9.0～9.1min，40％～95％B液；9.1～12.0min，95％B液。
柱温控制为30℃，自动进样温度为4℃。ESI源条件设置为：气体流量50Arb，辅助气体流量10Arb，管温度320℃，在NCE模式下全部MS分辨率设置为60000，MS/MS图谱分辨率为7500，碰撞能量为10/30/60，喷涂电压分别为3.5kV(正极)或-3.2kV(负极)。
Q Exactive HFX质谱仪使用信息采集软件，在IDA模式下获得图谱(MS/MS)，在此模式下，信息采集软件连续评估全扫描MS谱。
结果如图3～6所示。
通过LC-MS/MS分析，可以发现激素敏感型PCa和CRPC患者外泌体中存在差异代谢物，在热图中可发现37种代谢物存在显著差异。而且，将PCa组与TFC组比较可以发现19种含量或表达水平存在显著变化的物质。当进一步将PCa组与TFC组之间的19种含量存在显著变化的物质带代入CRPC组中的代谢物进行对比，可以发现19个代谢物中有12个出现表达上调(上调幅度约1.5倍)。其中，代谢物环桂木黄素(Cycloartocarpin，CAS：5912-09-4)在CRPC组中表达水平变化较大，约为PCa组中的表达水平的2.3倍。同时，还可以发现，PCa样品中的代谢物大多呈下降趋势。PCa组的二氢胸腺嘧啶(Dihydrothymine)、肌酸酐(Creatinine)和羟基辛酸(Hydroxyoctanoic acid)含量显著低于非肿瘤携带者组，分别下降了0.39、0.42和0.48倍。在下调的代谢物中，十三烷酸(Tridecanoic acid)、十一烷酸(Undecanoicacid)和羟基辛酸的水平下降到CRPC样品的近一半水平，分别为0.51、0.49和0.34倍。
用于是否存在前列腺癌及其发展情况的代谢物与蛋白质标志物复合物的筛选
为了确定激素敏感型PCa和CRPC患者血浆中蛋白质和代谢物的潜在诊断价值，采用ROC曲线对代谢物与蛋白质标志物进行进一步评估。
(1)外泌体蛋白LRG1和ITIH3在联合诊断CRPC和PCa中的潜在价值：
根据上述实施例中的结果，进一步验证非靶向蛋白质组学结果的准确性并获得能够用于区分激素敏感型前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌的蛋白质标志物，抽取45例前列腺相关疾病患者的血浆作为检测对象进行试验验证。
其中45例前列腺相关疾病患者分别为非肿瘤携带者对照(TFC，包括良性前列腺增生(BPH)等)患者12例，PCa患者17例，CRPC患者16例。
采用上述实施例中的方法分析可用于区分激素敏感型前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌的蛋白质标志物。
结果如图7～9所示。
在PCa vs TFC RPM验证(图7和8)中，可以发现5个差异蛋白的趋势与非靶向蛋白质组学结果相似，其中差异蛋白ApoE比非肿瘤携带组高1.7倍。而在CRPC组和PCa组的验证比较中，在CRPC组的验证试验中，可观察到有15个蛋白具有类似的趋势，可以作为差异蛋白，尤其是LRG1和ITIH3蛋白表达水平可以达到PCa组的1.5倍和2.04倍。
而通过ROC曲线进一步分析(图9)，可以发现，ApoE蛋白的的曲线下面积(AUC)为0.734，而LRG1和ITIH3蛋白在单独区分CRPC和PCa时的AUC值分别为0.834和0.815，LRG1和ITIH3蛋白组合时产生的AUC值为0.842，从而可以说明ApoE以及LRG1、ITIH3组合可能是区分CRPC和PCa的潜在蛋白标志物复合物。
(2)外泌体中的差异代谢物组合在诊断PCa和CRPC中的潜在价值：
根据上述实施例中的结果，进一步验证代谢组学结果的准确性并获得能够用于区分前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌的差异代谢物标志物，抽取45例非肿瘤携带者(TFC)的血浆作为检测对象进行试验验证。
其中45例非肿瘤携带者(包括良性前列腺增生(BPH))患者12例，PCa患者17例，CRPC患者16例。
采用上述实施例中的方法分析可用于区分激素敏感型前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌的差异代谢物标志物。
结果如图10～12所示。
通过ROC曲线分析结果，从PCa和CRPC组中分别选择两组最具潜力的代谢物组合，其中，组合1为二氢胸腺嘧啶(Dihydrothymine)、肌酸酐(Creatinine)、羟基辛酸(Hydroxyoctanoic acid)、3-甲基-2-氧基戊酸(3-Methyl-2-oxovaleric acid)的组合，组合2为十一烷酸、羟基辛酸、1-Methylhistamine、十三烷酸的组合。通过logistic回归分析可以发现，对于PCa诊断，组合1中的代谢物组合的AUC值最高可达到0.9418，高于任一单一代谢物对PCa诊断的准确性。对于CRPC的诊断，组合2中的代谢物组合的预测值为0.9718，理论上远比PSA(前列腺特异抗原)的预测更加准确。因此，这些代谢物的组合可以更好地区分非肿瘤患者、患有PCa以及是否会发展为CRPC等多种不同情况。
综上所述，通过上述实施例的验证，通过对ApoE、LRG1和ITIH3进行相对定量分析，可以有效判定受试者是否前列腺癌的患病风险。而二氢胸腺嘧啶、肌酸酐、羟基辛酸、3-甲基-2-氧基戊酸的组合同样可以判定受试者的前列腺癌患病风险，仅需对这四种代谢物的半定量值进行逻辑回归分析，定义待测样品的半定量值与非肿瘤携带者的半定量值的比值为PD值(Prostate cancer diagnostic value)，若PD值大于4.29，则可以判定其有患前列腺癌的潜在风险。而对于已经患有前列腺癌的患者，十一烷酸、羟基辛酸、1-Methylhistamine、十三烷酸的组合可以更好的对PCa和CRPC进行区分，定义待测样品的半定量值与PCa患者的半定量值的比值为CD值(castration-resistant prostate cancerdiagnostic value)，若CD值大于9.79，则判定为患者可能发展为CRPC。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.血浆外泌体标志物组合物，其特征在于，所述血浆外泌体标志物组合物中包括血浆外泌体中的差异蛋白或代谢物；
其中，所述差异蛋白在不同类型的前列腺癌中的表达水平存在显著差异；
所述代谢物在不同类型的前列腺癌中的消耗或产生水平存在显著差异。
2.根据权利要求1所述的血浆外泌体标志物组合物，其特征在于，所述血浆外泌体标志物组合物中还包括编码所述差异蛋白的核苷酸序列或其对应的核酸分子。
3.根据权利要求1所述的血浆外泌体标志物组合物，其特征在于，所述差异蛋白包括：ApoA4、ORM1、CAP1、ApoE、LRG1和ITIH3蛋白中的至少一种；
所述差异蛋白优选为ApoE、LRG1和ITIH3蛋白的组合。
4.根据权利要求1所述的血浆外泌体标志物组合物，其特征在于，所述代谢物包括：二氢胸腺嘧啶、肌酸酐、羟基辛酸、3-甲基-2-氧基戊酸、十一烷酸、1-Methylhistamine、十三烷酸中的至少一种；
所述代谢物优选为二氢胸腺嘧啶、肌酸酐、羟基辛酸、3-甲基-2-氧基戊酸的组合和/或十一烷酸、羟基辛酸、1-Methylhistamine、十三烷酸的组合。
5.根据权利要求1所述的血浆外泌体标志物组合物，其特征在于，所述前列腺癌包括激素敏感型前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌。
6.一种用于区分激素敏感型前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌的检测产品，其特征在于，所述检测产品中含有定量检测权利要求1～5中任一项所述的血浆外泌体标志物组合物的试剂。
7.权利要求1～5中任一项所述的血浆外泌体标志物组合物在制备区分前列腺癌类型的工具中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述前列腺癌类型包括激素敏感型前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述区分前列腺癌类型的工具的使用方法，包括如下步骤：
检测待测样品中的ApoE、LRG1和ITIH3蛋白的表达水平；或
检测待测样品中的二氢胸腺嘧啶、肌酸酐、羟基辛酸、3-甲基-2-氧基戊酸、十一烷酸、1-Methylhistamine和十三烷酸的含量，判断待测样品是否可以预测前列腺癌患病风险以及前列腺癌进展情况；
其中，判断标准为：
若待测样品中的ApoE蛋白相对丰度高于非肿瘤携带者1.7倍或以上，则提示前列腺癌患病风险高；
若否，则提示前列腺癌患病风险低；
若待测样品中揭示前列腺癌患病风险高，且LRG1蛋白的相对丰度高于恶性前列腺癌患者1.5倍或以上，ITIH3蛋白的相对丰度高于激素敏感型前列腺癌患者的2.04倍或以上，则存在前列腺癌发展为去势抵抗性前列腺癌的风险；
若否，则不具有发展为去势抵抗性前列腺癌的风险；
或
若待测样品中的二氢胸腺嘧啶、肌酸酐、羟基辛酸、3-甲基-2-氧基戊酸的含量均大于非肿瘤携带者4.29倍，则提示前列腺癌患病风险高；
若否，则提示前列腺癌患病风险低；
若待测样品提示前列腺癌患病风险高，且十一烷酸、羟基辛酸、1-Methylhistamine、十三烷酸的含量均大于非肿瘤携带者9.79倍，则存在前列腺癌发展为去势抵抗性前列腺癌的风险；
若否，则不具有发展为去势抵抗性前列腺癌的风险。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述区分前列腺癌类型的工具包括检测试剂、检测试剂盒和检测芯片。
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