CN115287347B - 犬无症状二尖瓣粘液瘤样病变生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了犬无症状二尖瓣粘液瘤样病变生物标志物及其应用，属于医学分子诊断领域。本发明公开了生物标志物在制备用于确定受试者是否患有无症状二尖瓣粘液瘤样病变的产品中的应用，所述生物标志物包括如下基因和/或蛋白中的至少一种：HSPD1、IDH3A、CANX、HK2、SERPINH1和ATRN。本发明将有参转录组学和蛋白质组学测序结果进行关联分析，联合qPCR和受试者工作特征曲线(ROC)算法筛选犬无症状二尖瓣粘液瘤样病变血浆生物标志物。该生物标志物能够实现无症状二尖瓣粘液瘤样病变的早发现、早诊断和早治疗，大大提升患犬的预后。

Description

犬无症状二尖瓣粘液瘤样病变生物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及医学分子诊断领域，特别是涉及犬无症状二尖瓣粘液瘤样病变生物标志物及其应用。

背景技术

犬二尖瓣粘液瘤样病变(Myxomatous Mitral Valve Disease,MMVD)，也称为退行性或慢性瓣膜性心脏病，是犬最常见的后天性心脏病，约占心脏病病例的75％。MMVD的患病率和严重性随着年龄的增长而显著增加，超过10岁的小型犬约有1/3患有此病，其中查理斯王小猎犬、雪纳瑞、博美、贵宾犬、马尔济斯等均为本病的高发品种。二尖瓣组织呈进行性、弥漫性纤维化性病变。具体表现为瓣膜结构渐进性的发生增厚、脱垂、卷曲甚至腱索断裂，造成二尖瓣闭锁不全，导致二尖瓣病理性反流，进而发展为左心的充血性心力衰竭。美国兽医内科学会(Veterinary Internal Medicine,ACVIM)指南依据影像学检查将犬MMVD进行临床分类，将MMVD分为四个阶段：A期、B期(B1和B2)、C期和D期。其中A、B1期由于心脏结构无或有轻微改变，无需药物以延缓心力衰竭的发生。然而，MMVD的B2期，也称为无症状MMVD，该时期由于二尖瓣关闭不全加重，累计左心房和左心室发生明显结构变化，该时期的及时用药将有效延缓疾病的进程。因此，无症状MMVD就像一个重要的分水岭，及时诊断无症状MMVD显得尤为重要。

目前MMVD的诊断主要依据临床症状和影像学检查，无症状MMVD属于疾病的早期，一方面由于该时期并无明显临床症状，另一方面受制于兽医影像学诊断水平的影响，从而无症状MMVD在兽医临床常被误诊和漏诊。目前兽医临床实践中，常将心肌肌钙蛋白-I(cTNI)和利钠肽(NT-ProBNP)的血清浓度作为心脏损伤的生物标记物，但已有研究证明这两种蛋白分别被用作犬心脏病心肌损伤和心室壁应力的生物标志物，而非MMVD的标志物，因而特异性和敏感性相对较低，限制其在疾病诊断、预后评估和治疗反应方面的应用。因此，探索和建立临床易操作、敏感度和特异性均高的分子生物标记物已成为提高临床诊断无症状MMVD的重点和难点。

随着高通量测序技术的发展，整合多组学数据能够实现对生物系统的全面了解。其中，转录组学和蛋白质组学是研究生理病理状态的有用工具。从生物学角度上看，mRNA水平代表基因表达的中间状态，能代表潜在蛋白质表达情况。蛋白质是直接的功能执行体，因而对于蛋白质表达水平的研究有着不可替代的优势。两个组学的联合分析，不仅能在不同组学层面上透视生命活动的规律和本质，还能揭示二者之间的相互调控作用或者关联。转录组学和蛋白组学的关联分析提供了一种高分辨率和高精度的方法，为挖掘犬无症状二尖瓣粘液瘤样病变的生物标志物的开发提供研究基础和可行性指导。

发明内容

本发明的目的是提供犬无症状二尖瓣粘液瘤样病变生物标志物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过采用转录组学及蛋白质组学的多组学测序方法，结合数据分析及样本队列数据库验证，寻找无症状MMVD相关的特异性、普适性的血浆生物标志物。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供生物标志物在制备用于确定受试者是否患有无症状二尖瓣粘液瘤样病变的产品中的应用，所述生物标志物包括如下基因和/或蛋白中的至少一种：HSPD1、IDH3A、CANX、HK2、SERPINH1和ATRN。

上述生物标志物具体信息如下：

HSPD1:(heat shock protein family D(Hsp60)member 1，也称为HSP-60，属于热休克蛋白家族成员。Gene-ID为ENSCAFG00000010865，Prot-ID为XP_013966511.1。

IDH3A:1isocitrate dehydrogenase(NAD(+))3catalytic subunit alpha)异柠檬酸脱氢酶(NAD(+))3催化亚基。Gene-ID为ENSCAFG00000014166，Prot-ID为XP_536213.2。

CANX:钙连蛋白。Gene-ID为ENSCAFG00000010865，Prot-ID为NP_001003232.1。

HK2:(hexokinase 2，己糖激酶2)。Gene-ID为ENSCAFG00000000348，Prot-ID为XP_022260486.1。

SERPINH1:(serpin family H member 1)SERPIN超家族的主要功能是中和过度表达的丝氨酸蛋白酶活性，从而参加血凝，纤维蛋白溶解，补体激活，炎症反应，组织重建等功能，维持机体内环境的稳定。Gene-ID为ENSCAFG00000005386，Prot-ID为NP_001159360.1。

ATRN:Gene-ID为ENSCAFG00000006278，Prot-ID为XP_534360.2。大多数情况下，ATTRACTNI蛋白在血浆中的含量保持在一定的水平。当机体发生炎症反应时，巨噬细胞首先与细菌作用，同时将信号传给T细胞，血浆中的膜型ATTRACITN蛋白迅速附着在活性T细胞表面，在此改变编码，由膜型变成分泌型并释放于血清中。分泌型ATTRACITN再分泌细胞因子(eytokines)和趋化因子(chemokines)诱导巨噬细胞和T细胞的聚集。

本发明还提供用于检测生物标志物表达水平的试剂在制备用于确定受试者是否患有无症状二尖瓣粘液瘤样病变的产品中的应用，所述生物标志物包括如下基因和/或蛋白中的至少一种：HSPD1、IDH3A、CANX、HK2、SERPINH1和ATRN。

优选的是，所述受试者为犬。

优选的是，所述生物标志物为如下基因和/或蛋白组合：HSPD1、IDH3A、CANX、HK2、SERPINH1和ATRN。

优选的是，所述产品为试剂或者试剂盒。

本发明公开了以下技术效果：

本发明将有参转录组学和蛋白质组学测序结果进行关联分析，联合qPCR和受试者工作特征曲线(ROC)算法筛选犬无症状二尖瓣粘液瘤样病变血浆生物标志物。所选的差异基因在无症状的二尖瓣粘液瘤样病变和健康对照犬进行精准分类，可弥补临床上无症状二尖瓣粘液瘤样病变筛查方法敏感度和特异性不足的缺点。同时亦可以作为辅助诊断手段结合临床其他检查结果进行进一步临床决策，实现无症状二尖瓣粘液瘤样病变的早发现、早诊断和早治疗，大大提升患犬的预后。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明整体试验方案技术路线；

图2为血液样品预处理步骤；

图3为差异表达基因火山图；

图4为差异表达基因聚类热图；

图5为差异蛋白聚类热图；

图6为转录组和蛋白质组表达调控维恩图；

图7为转录组和蛋白质组基因(蛋白)GO功能富集关联分析；

图8为转录组和蛋白质组基因(蛋白)KEGG通路富集聚类热图；

图9为转录组和蛋白质组表达差异基因(蛋白)GO富集分析；

图10为转录组和蛋白质组表达差异基因(蛋白)KEGG富集分析；

图11为候选标志物qPCR验证结果；

图12为ROC验证候选标志物结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

血浆作为一种特殊的结缔组织，有营养组织，调节器官活动和防御有害物质的作用，是个体的状态或表型进行普遍反映。因此，血浆的临床分析是医学中最普遍的诊断程序，也是研究无症状MMVD的理想样品。因此本发明基于ACVIM对于犬MMVD的诊断指南，在临床收集自发性无症状MMVD患犬的血浆，采用转录组学及蛋白质组学的多组学测序方法，通过数据分析及样本队列数据库验证，寻找无症状MMVD相关的特异性、普适性的血浆生物标志物，其具体流程图见图1。

实施例1犬无症状二尖瓣粘液瘤样病变血浆生物标志物群的确定方法

1、实验动物

根据美国兽医内科学会对二尖瓣粘液瘤样病变的分级指南，按以下标准进行动物的入选，入选动物基本信息见表1。

表1入选动物基本信息总结表

(1)健康组(Normal Contrast,NC)动物筛选标准如下：

1年龄≥3岁；

2品种为泰迪犬或贵宾犬；

3常规免疫以及驱虫；临床检查无异常；超声、X线检查及心脏听诊无异常。

(2)患病组(MMVD Stage B2 Group,BG)动物筛选标准如下：

1年龄≥3岁；

2品种为泰迪犬或贵宾犬；

3常规免疫以及驱虫；未见明显心脏疾病症状(仅表现偶有心源性咳嗽或夜间咳嗽，运动轻微不耐受)；

4听诊：心杂音≥3级；

5X线检查：心脏锥体比分(VHS)≥10.5；

6心脏超声检查：LA/AO≥1.6(右侧短轴位舒张早期，主动脉内径与左心房内径比值)；LVIDDN≥1.7(体重校正后舒张早期左心室内径)。

2、血液样品测序前处理

符合动物入选标准的血液(3只健康犬和5只患病犬血液样品)，根据不同组学样品预处理的方法不同，对样本进行预处理，具体步骤见图2。

实施例2犬无症状二尖瓣粘液瘤样病变血浆转录组学分析

转录组测序是基于Illumina测序平台，研究特定组织或细胞在某个时期转录出来的所有mRNA，是基因功能与结构研究的基础，对理解生物体的发育和疾病的发生具有重要作用。RNA-seq技术流程主要包含两个部分：建库测序和生物信息分析，具体步骤如下。

1、转录组建库测序

1.1RNA提取与检测

RNA提取与检测步骤，如下：

(1)向完全解冻的血液与TRIzol的混合液中加入1ml氯仿，剧烈震荡15秒，在4℃12000rpm的条件下离心15min；

(2)小心吸取上层水相至一个新的无酶EP的离心管中，加入等体积的异丙醇。上下颠倒30次，混匀后室温静置10min，再4℃12000rpm的条件下离心15min；

(3)弃去上清，加入1ml用DEPC水配制的75％乙醇。充分洗涤管盖和管壁，并轻弹管底，让沉淀悬浮起来，7500r 4℃5min，重复两次。每使用1ml Total RNA ExtractionReagent用1ml 75％乙醇对沉淀进行洗涤；

(4)在12,000rpm室温或4℃离心3min，弃去上清，注意不要丢失RNA沉淀；

(5)室温放置2-3min，晾干。加入30ul RNase free water(DEPC水)，待完全溶解后，取少量进行检测，对其编号，封口膜封口，其余分管-80℃保存；

(6)随后对RNA样品进行严格质控，质控方式主要是通过Agilent2100bioanalyzer精确检测RNA完整性。

1.2文库构建与质检

建库起始RNA为total RNA，通过Oligo(dT)磁珠富集带有polyA尾的mRNA，随后在Fragmentation Buffer中用二价阳离子将得到的mRNA随机打断。以片段化的mRNA为模版，随机寡核苷酸为引物，在M-MuLV逆转录酶体系(反应体系见表2)，在42℃，30分钟条件下合成cDNA第一条链，随后用RNaseH降解RNA链，并在DNA polymerase I体系下，以dNTPs为原料合成cDNA第二条链(反应体系见表3)，反应程序为，首先在20℃，保持30分钟，之后在65℃，保持30分钟，最后缓慢降温并保存于4℃。纯化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP beads筛选370～420bp左右的cDNA，采用上述一样的随机引物进行PCR扩增，其扩增体系见表4，反应程序见表5。并再次使用AMPure XP beads纯化PCR产物，最终获得文库。文库构建完成后，先使用Qubit2.0 Fluorometer进行初步定量，稀释文库至1.5ng/ul，随后使用Agilent 2100bioanalyzer对文库的insert size进行检测，insertsize符合预期后，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量(文库有效浓度高于2nM)，以保证文库质量。

表2合成cDNA第一条链体系

表3合成cDNA第二条链体系

表4 PCR扩增体系

表5 PCR扩增反应程序

1.3上机测序

库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina NovaSeq6000测序，并产生150bp配对末端读数。测序的基本原理是边合成边测序(Sequencing by Synthesis)。在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放相对应荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。

2.犬无症状二尖瓣粘液瘤样病变血浆转录组学生信分析

2.1转录组学数据质控分析

测序片段被高通量测序仪测得的图像数据经CASAVA碱基识别转化为序列数据(reads)，其中主要包含测序片段的序列信息以及其对应的测序质量信息。测序获得的原始数据中包含少量带有测序接头或测序质量较低的reads。为了保证数据分析的质量及可靠性，需要对原始数据进行过滤。主要包括去除带接头(adapter)的reads、去除含N(N表示无法确定碱基信息)的reads、去除低质量reads(Qphred<＝20的碱基数占整个read长度的50％以上的reads)。同时，对clean data进行Q20，Q30和GC含量计算。后续所有分析均是基于clean data进行的高质量分析。经过上述的原始数据过滤、测序错误率检查和GC含量分布检查，获得后续分析使用的clean reads，汇总数据如表6所示。

表6高质量测序数据结果

2.2转录组学参考基因组比对分析

测序片段(fragments)是mRNA随机打断的，为了确定这些一段由哪些基因转录来，需要将质控后的clean reads比对到参考基因组上。使用HISAT2软件将Clean Reads与参考基因组进行快速精确的比对，获取Reads在参考基因组上的定位信息。本次比对结果如表7所示

表7参考基因组比对结果

2.3基因表达水平定量分析

根据基因比对在参考基因组上的位置信息，从而统计每个基因从起始到终止范围内覆盖的reads数。分别过滤比对质量值低于10的reads，非成对比对上的reads，比对到基因组多个区域的reads。该部分分析采用subread软件中的feature Counts工具。使用featureCounts(1.5.0-p3)计算映射到每个基因的读数，然后根据基因的长度计算每个基因的FPKM，并计算映射到该基因的读数。

2.4转录组学差异表达分析

基因表达定量完成后，需要对其表达数据进行统计学分析，筛选样本在不同状态下表达水平显著差异的基因。差异分析主要分为三个步骤。首先对原始的read count进行标准化(normalization)，主要是对测序深度的校正，然后统计学模型进行假设检验概率(p-value)的计算，最后进行多重假设检验校正，得到FDR值(错误发现率)。差异基因的筛选标准是|log2(Fold Change)|>＝1和padj<＝0.05。

2.5转录组学差异基因统计分析

火山图可直观展示每个比较组合的差异基因分布情况，如下图3所示。图中横坐标表示基因在处理和对照两组中的表达倍数变化(log2FoldChange)，纵坐标表示基因在处理和对照两组中表达差异的显著性水平(-log10padj或-log10pvalue)。为上调基因用红色点表示，下调基因用绿色点表示，与健康对照组比较，无症状MMVD中有407个上调基因和583个下调基因。

2.6转录组学差异基因聚类分析

将所有比较组的差异基因取并集之后作为差异基因集。两组以上的实验，可对差异基因集进行聚类分析，将表达模式相近的基因聚在一起。我们采用主流的层次聚类对基因的FPKM值进行聚类分析，对行(row)进行均一化处理(Z-score)。热图中表达模式相近的基因或样本会被聚集在一起，每个方格中的颜色反映的不是基因表达值，而是表达数据的行进行均一化处理后得到的数值(一般在-2到2之间)，所以热图中的颜色只能横向比较(同一基因在不同样本中的表达情况)，不能纵向比较(同一样本不同基因的表达情况)，由图4的差异基因的聚类热图可见，健康对照犬与无症状MMVD犬基因表达模式存在明显差异。

实施例3犬无症状二尖瓣粘液瘤样病变血浆蛋白质组学分析

1、犬无症状二尖瓣粘液瘤样病变血浆蛋白质组学质谱测序

从血浆样品到最终数据获得的过程中，蛋白的提取、定量、检测、酶切与除盐、标记(适用于iTRAQ和TMT)、修饰肽段富集(适用于修饰蛋白质组)、馏分分离和质谱检测。每一个环节都会对数据质量和数量产生影响，而数据质量又会直接影响后续信息分析的结果，具体步骤如下。

1.1总蛋白提取

从-80℃冰箱取出血浆样品，低温研磨成粉，迅速转移至液氮预冷的离心管，加入适量蛋白裂解液(100mM碳酸氢铵、8M尿素、0.2％SDS，pH＝8)，振荡混匀，冰水浴超声5min使充分裂解。于4℃、12000g离心15min，取上清，加入终浓度10mM DTTred于56℃反应1小时，之后加入足量IAM，于室温避光反应1小时。加入4倍体积的-20℃预冷丙酮于-20℃条件下沉淀至少2小时，于4℃、12000g离心15min，收集沉淀。之后加入1mL-20℃预冷丙酮重悬并清洗沉淀，于4℃、12000g离心15min，收集沉淀，风干，加入适量蛋白溶解液(6M尿素、100mM TEAB，pH＝8.5)溶解蛋白沉淀。(注：此处使用ProteoMiner蛋白质浓缩试剂盒)。

1.2蛋白质检

使用Bradford蛋白质定量试剂盒，按照说明书配制BSA标准蛋白溶液，浓度梯度范围为0-0.5μg/μL。分别取不同浓度梯度的BSA标准蛋白溶液及不同稀释倍数的待测样品溶液加入96孔板中，补足体积至20μL，每个梯度重复3次。迅速加入180μL G250染色液，室温放置5min，测定595nm吸光度。用标准蛋白液吸光度绘制标准曲线并计算待测样品的蛋白浓度。各取20μg蛋白待测样品进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，其中浓缩胶电泳条件为80V、20min，分离胶电泳条件为120V、90min。电泳结束后进行考马斯亮蓝R-250染色，脱色至条带清晰。

1.3TMT标记

各取120μg蛋白样品，加入蛋白溶解液补足体积至100μL，加入1.5μg胰酶和500μL100mM TEAB缓冲液，混匀后于37℃酶切4h。再加入1.5ug胰酶和CaCl₂酶切过夜。加入甲酸调节pH小于3，混匀后于室温、12000g离心5min，取上清缓慢通过C18除盐柱，之后使用清洗液(0.1％甲酸、3％乙腈)连续清洗3次，再加入适量洗脱液(0.1％甲酸、70％乙腈)，收集滤液，冻干。加入100μL 0.1M TEAB缓冲液复溶，并加入41μL乙腈溶解的TMT标记试剂，室温下颠倒混匀反应2h。之后加入终浓度8％氨水终止反应，取等体积标记后的样品混合，除盐后冻干。

1.4馏分分离

配制流动相A液(2％乙腈、98％水，氨水调至pH＝10)和B液(98％乙腈、2％水)。用A液溶解混合冻干粉末，室温下12000g离心10min。使用L-3000HPLC系统，色谱柱为WatersBEH C18(4.6×250mm,5μm)，柱温设置为50℃，具体洗脱梯度如表8所示。每分钟收集1管，合并为10个馏分，冻干后各加入0.1％甲酸溶解。

表8多肽馏分分离液相色谱洗脱梯度表

1.5液质检测

配制流动相A液(100％水、0.1％甲酸)和B液(80％乙腈、0.1％甲酸)。每个馏分上清各取1μg进样，液质检测。使用EASY-nLCTM1200纳升级UHPLC系统，预柱为自制预柱(2cm×75μm,3μm)，分析柱为自制分析柱(15cm×150μm,1.9μm)，液相色谱洗脱条件如表9所示。使用Q ExactiveTM HF-X质谱仪，Nanospray Flex^TM(ESI)离子源，设定离子喷雾电压为2.3kV，离子传输管温度为320℃，质谱采用数据依赖型采集模式，质谱全扫描范围为m/z350-1500，一级质谱分辨率设为60000(200m/z)，C-trap最大容量为3×10⁶，C-trap最大注入时间为20ms；选取全扫描中离子强度TOP 40的母离子使用高能碰撞裂解(HCD)方法碎裂，进行二级质谱检测，10标二级质谱分辨率设为45000(200m/z)，C-trap最大容量为5×10⁴，C-trap最大注入时间为86ms，肽段碎裂碰撞能量设为32％，阈强度设为1.2×10⁵，动态排阻范围设为20s，生成质谱检测原始数据(raw)。

表9液相色谱洗脱梯度表

2、犬无症状二尖瓣粘液瘤样病变血浆蛋白质组学生信分析

基于质谱检测得到的Raw文件，进行对应数据库的搜索，然后基于数据库搜索的结果进行蛋白质鉴定，同时进行肽段、蛋白和母离子质量容差分布分析来评定质谱检测数据的质量；对鉴定到的蛋白进行常见功能数据库注释，包括GO数据库和KEGG数据库；接下来进行蛋白质的定量分析，包括鉴定到的蛋白质总体差异分析和差异蛋白的筛选及表达模式聚类分析；最后针对筛选出来的差异蛋白进行GO、KEGG功能富集分析等一系列的差异蛋白功能分析，具体步骤见下文。

2.1数据质控与鉴定情况

质谱下机数据需要进行蛋白数据库搜索，本次使用的数据库为：394576-X101SC20030647-Z01-CanFam3.1-NCBI.fasta(58774sequence)。表10为ProteomeDiscover 2.2的分析参数。为了提高分析结果质量，降低假阳性率，ProteomeDiscoverer2.2软件对检索结果做了进一步过滤：可信度在99％以上的谱肽(PeptideSpectrum Matches，简称PSMs)为可信PSMs，至少包含一个unique肽段(特有肽段)的蛋白为可信蛋白，我们只保留可信的谱肽和蛋白，并做FDR验证，去除FDR大于1％的肽段和蛋白。表11是鉴定到的肽段数和蛋白数总体情况。

表10 Proteome Discover 2.2分析参数

表11蛋白质鉴定总览

2.2蛋白定量分析

Proteome Discoverer2.2首先根据原始下机的谱图峰面积可以得到各个样品中每个PSM的相对定量值，再根据鉴定出的Unique肽段中所包含所有PSM的定量信息，校正得到Unique肽段的相对定量值，然后根据每个蛋白质包含的所有unique肽段的定量信息，校正得到每个蛋白的相对定量值。

2.3蛋白差异分析

蛋白差异分析首先挑出需要比较的样品对，将每个蛋白在比较样品对中的所有生物重复定量值的均值的比值作为差异倍数(Fold Change，FC)。为了判断差异的显著性，将每个蛋白在两个比较对样品中的相对定量值进行了T-test检验，并计算相应的P-value，本实验选择当FC＞1.2，同时P-value≤0.05，筛选上调表达蛋白，当FC≤0.8，同时P-value≤0.05。筛选下调表达蛋白。根据此条件筛选的上下调蛋白个数见表12。

表12蛋白差异分析结果

对每个样品中差异蛋白相对含量进行聚类分析，利用聚类热图观察不同蛋白在不同样品间比较时的上调、下调情况。每行进行了Z值校正，(观测值-行均值)/行标准差。由图5可见，差异蛋白聚类热图中显示：健康对照犬与无症状MMVD犬蛋白表达模式存在明显差异。

实施例4犬无症状二尖瓣粘液瘤样病变血浆转录组学和蛋白质组学关联分析

转录组学和蛋白质组学都是研究系统的生理化学状态的有用工具，是研究细胞功能的一个重要手段。虽然转录组和蛋白质组在实验方法上差异很大，但由于这两种方法的首要目的都是获得基因的表达情况，其间存在着某种共同之处。从生物学角度上看，mRNA水平代表了基因表达的中间状态，能代表潜在的蛋白质表达情况。转录组能在较低消耗下实现较高的通量，并能在某种程度上提供较详细的信息。蛋白质是直接的功能执行体，因而，对蛋白质表达水平的度量有着不可替代的优势。两组学的联合分析，不仅能在不同组学层次上透视生命活动的规律与本质，还能揭示二者之间的相互调控作用或者关联。由于转录组和蛋白质组的比较关联研究能揭示基因表达的转录后调控状态，因此，转录组和蛋白质组之间的关系很可能将是未来的系统生物学研究中不可忽略的一部分，下文将具体描述两组学关联分析内容。

1、转录组和蛋白质组表达调控分析

将转录组得到的mRNA信息，与蛋白质组鉴定到的蛋白质信息进行整合，找出对应关系，绘制成韦恩图，由图6可见，在转录组和蛋白组共同鉴定到301个基因(蛋白质)，其中有73个蛋白质在蛋白水平分析中差异表达，但其所对应的基因与健康对照组相比并未表现明显差异，31个基因在基因水平分析中差异表达，但其所对应的蛋白质与健康对照组相比并未表现明显差异，9个基因和所对应的蛋白质在转录组学和蛋白组学定量分析中，均与健康对照组存在显著差异。

2、转录组和蛋白质组基因(蛋白质)GO功能富集关联分析

在转录组和蛋白质组两方面进行GO富集分析，结果进行比较，可以分析两组学GO功能条目富集的差异性。图中红色柱子代表蛋白质组的GO富集结果，绿色柱子代表转录组的GO富集结果，横坐标为富集到的GO条目，纵坐标代表蛋白质组和转录组的富集蛋白质(基因)个数。提取差异蛋白质与差异基因各自对应的GO条目，利用wego(http://wego.genomics.org.cn/)进行图形的绘制。由图7可见，在细胞组分(Cellular Component)分析中，鉴定到的基因(蛋白质)主要富集在细胞部分(cell part)、细胞(cell)和细胞器(organelle)条目中；在分子功能(Molecular Function)分析中，鉴定到的基因(蛋白质)主要富集在催化活性(catalytic activity)、连接(binding)和分子功能调节(molecularfunction regulator)条目中；在生物过程(Biological Process)分析中，鉴定到的基因(蛋白质)主要富集在代谢过程(metabolic process)、细胞过程(cellular process)和刺激反应(response to stimulus)条目中。

3、转录组和蛋白质组基因(蛋白质)KEGG通路富集关联分析

将蛋白质组和转录组的差异蛋白质(基因)的KEGG富集结果绘制成KEGG通路富集聚类热图，并在蛋白质(基因)层面根据其差异表达倍数进行聚类，结果见图8。图中红色代表上调，蓝色代表下调，横向聚类为蛋白质在蛋白质组和转录组层面的表达情况的聚类，即一个cluster中蛋白质(基因)的表达模式类似。差异的条目以蛋白质为基准，由图可见，差异基因(蛋白质)主要富集在代谢通路(metabolic pathway)、致病性大肠杆菌感染(pathogenic escherichia coli infection)和阿尔茨海默氏病(Alzheimers disease)通路中。

4、转录组和蛋白质组差异表达基因(蛋白质)的功能分析

筛选出转录组学和蛋白质组学中均有显著差异的基因和蛋白质，见表13。并对差异基因(蛋白质)进行GO和KEGG富集分析。在GO功能富集分析中，可见差异基因(蛋白质)主要富集在连接(binding)、单有机体过程(single-organism process)和细胞过程(cellprocess)条目中，见图9。在KEGG通路富集分析中，可见差异基因(蛋白质)主要富集在代谢通路(metabolic pathway)致病性大肠杆菌感染(pathogenic escherichia coliinfection)和病毒致癌(viral carcinogenesis)通路中，见图10。

表13差异基因和蛋白质总结表

实施例5犬无症状二尖瓣粘液瘤样病变血浆候选生物标志物队列验证

1、动物入选

验证队列中，健康组(NC)和患病组(BG)的入选条件除品种不限和每组数量增加至55只犬以外，其余与发现队列一致。入选标准详情见实施例1。

2、验证候选标志物

2.1qPCR验证候选生物标志物

选取在转录组学和蛋白质组学分析中均表达差异显著的9个基因，包括serpinfamily H member1(SERPINH1)、异柠檬酸脱氢酶3-催化亚基(IDH3A)、膜棕榈化蛋白1(MPP1)、toll样受体2(TLR2)、色域解旋酶DNA结合蛋白4(CHD4)、钙结合蛋白(CANX)、己糖激酶2(HK2)、热休克蛋白家族60(HSPD1)、Attractin蛋白(ATRN)在验证队列中进行qPCR验证。使用TRIzol试剂(Invitgen,USA)，按照说明书提取总RNA(具体方法见实施例2“RNA提取与检测”)，然后使用HiScriptⅡ逆转录酶(Vazyme,Nanjing,China)逆转录成cDNA。将各样本提取的RNA经无RNA酶和DNA酶处理后，按照TOYOBO公司的First Strand cDNA SynthesisKit,cDNA第一链合成试剂盒说明书操作，反转录合成cDNA,用于qPCR实验。反转录过程分为两步，第一步为去除基因组DNA,具体反应体系见表14。将体系混合均匀后，设定PCR反应程序为42℃，2分钟，然后进行第二步体系，体系配制见表15。设定PCR反应程序50℃，15分钟，在进行85℃，5分钟，最后将cDNA产物存放在-20℃保存或进行qPCR验证实验。

表14反转录过程Ⅰ

表15反转录过程Ⅱ

将上述得到的cDNA为模板，扩增目的基因，qPCR实验在Stepone Plus Real-TimePCR系统(Roche LightCycler@96,USA)上运行。实验按照AceQ Universal SYBR greenMaster Mix试剂盒说明书进行qPCR，其反应体系见表16，qPCR反应的条件为，第一阶段，在95℃，反应3分钟；第二阶段，94℃变性30秒，60℃退火30秒，进行40个循环；第三阶段，95℃延伸15秒，60℃60秒，95℃15秒。程序执行完成后，每个样本计算3个复孔的平均Ct值。用2^-ΔΔCt方法将mRNA的相对表达量归一化为GAPDH。引物列表见表17。

表16 qPCR反应体系

表17引物序列

qPCR结果显示，HSPD1、SERPINH1和ATRN与对照组差异极显著(P＜0.01)，CANX、HK2和IDH3A差异显著(P＜0.05)，而MPP1、TLR2和CHD4与对照组相比差异不显著(P＞0.05)，验证结果与测序结果基本一致，其结果见图11。

2.2ROC验证候选生物标志物

应用受试者工作特征曲线(ROC)分析是评估生物标记物诊断效能的较为可靠的方法，通过ROC曲线分析评估上述候9个差异表达基因的敏感性和特异性。通过AUC(AreaUnder ROC Curve)了解差异基因诊断的准确性，HSPD1、IDH3A、CANX、HK2、SERPINH1和ATRN的AUC在0.7-0.9之间，表示具有一定准确性，而MPP1、TLR2和CHD4的AUC在0.5-0.7之间表示存在较低的准确性，结果见图12，具体AUC数值见表18。

表18 AUC值汇总表

综合qPCR和ROC验证结果，表明HSPD1、IDH3A、CANX、HK2、SERPINH1和ATRN可作为犬无症状二尖瓣粘液瘤样病变的血浆生物标志物。

上述实施例可以看出，本发明基于ACVIM对于犬MMVD的诊断指南，在临床收集自发性无症状MMVD患犬的血浆，采用转录组学及蛋白质组学的多组学测序方法，通过数据分析及样本队列数据库验证，寻找无症状MMVD相关的特异性、普适性的血浆生物标志物。本发明筛选生物标志物的方法相比现有技术具有如下优点：(1)相比于传统影像学检查的操作复杂且成本较高而言，血浆的获取则是较易获取的生物样品，且血浆是个体的状态或表型进行普遍反映，是临床分析中最普遍的诊断程序，一定程度上减少影像学检查时的主观影响。(2)本发明采用高通量测序手段，结合转录组学及蛋白质组学的多组学测序方法，提供了一种高分辨率和高精度的方法，为挖掘犬无症状二尖瓣粘液瘤样病变的生物标志物的开发提供研究基础和可行性指导。(3)在验证队列中采用多品种，大队列的验证，避免品种之间的差异，为寻求特异性、普适性的血浆生物标志物增加可行性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.生物标志物在制备用于确定受试者是否患有无症状二尖瓣粘液瘤样病变的产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物包括如下基因和/或蛋白中的至少一种：HSPD1、IDH3A、CANX、HK2、SERPINH1和ATRN；所述受试者为犬。

2.用于检测生物标志物表达水平的试剂在制备用于确定受试者是否患有无症状二尖瓣粘液瘤样病变的产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物包括如下基因和/或蛋白中的至少一种：HSPD1、IDH3A、CANX、HK2、SERPINH1和ATRN；所述受试者为犬。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述生物标志物为如下基因和/或蛋白组合：HSPD1、IDH3A、CANX、HK2、SERPINH1和ATRN。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂或者试剂盒。

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